ES2216163T3 - Ligandos modificados del receptor tie-2. - Google Patents

Ligandos modificados del receptor tie-2.

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ES2216163T3
ES2216163T3 ES97937086T ES97937086T ES2216163T3 ES 2216163 T3 ES2216163 T3 ES 2216163T3 ES 97937086 T ES97937086 T ES 97937086T ES 97937086 T ES97937086 T ES 97937086T ES 2216163 T3 ES2216163 T3 ES 2216163T3
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cells
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Samuel Davis
George D. Yancopoulos
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN LIGANDO MODIFICADO DE TIE2, QUE SE HA ALTERADO MEDIANTE LA ADICION, DELECION O SUSTITUCION DE UNO O VARIOS AMINOACIDOS, O MEDIANTE ETIQUETADO CON, POR EJEMPLO, LA FRACCION FC DE LA IGG-1 HUMANA, PERO QUE MANTIENE SU CAPACIDAD DE UNION AL RECEPTOR TIE-2. LA INVENCION PROPORCIONA TEMBIEN UN LIGANDO TIE-2 MODIFICADO, QUE ES UN LIGANDO TIE-2 QUIMERICO, EL CUAL COMPRENDE AL MENOS UNA FRACCION DE UN PRIMER LIGANDO TIE-2 Y UNA FRACCION DE UN SEGUNDO LIGANDO TIE-2, QUE ES DISTINTA DE LA PRIMERA. EN UNA REALIZACION ESPECIFICA DE LA INVENCION, SE PROPORCIONA UN LIGANDO TIE QUIMERICO QUE COMPRENDE AL MENOS UNA FRACCION DEL DEL PRIMER LIGANDO DE TIE-2 Y UNA FRACCION DEL SEGUNDO LIGANDO DE TIE-2. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA PARA LOS LIGANDOS DE TIE-2 MODIFICADOS, ASI COMO A COMPOSICIONES TERAPEUTICAS Y A UN PROCEDIMIENTO DE BLOQUEO DEL CRECIMIENTO DE LOS VASOS SANGUINEOS, A UN PROCEDIMIENTO PARA FAVORECER LANEOVASCULARIZACION, A UN PROCEDIMIENTO PARA FAVORECER EL CRECIMIENTO O LA DIFERENCIACION DE UNA CELULA QUE EXPRESA EL RECEPTOR TIE Y A UN PROCEDIMIENTO DE ATENUACION O PREVENCION DEL CRECIMIENTO TUMORAL EN HUMANOS.

Description

Ligandos modificados del receptor TIE-2.
Introducción
La presente invención se refiere en general al campo de la ingeniería genética y más particularmente a genes para quinasas de tirosina receptoras y sus ligandos afines, a su inserción en vectores de ADN recombinante y a la producción de las proteínas codificadas en cepas receptoras de microorganismos y células eucariotas receptoras. Más específicamente, la presente invención se dirige a un nuevo ligando de TIE-2 modificado que se une al receptor de TIE-2, así como a métodos para fabricar y usar el ligando modificado. La invención proporciona además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ligando modificado y a métodos para la generación de ácido nucleico que codifica el ligando modificado y el producto génico. El ligando de TIE-2 modificado, así como el ácido nucleico que lo codifica, pueden ser útiles en la diagnosis y tratamiento de ciertas enfermedades que implican células endoteliales y receptores de TIE asociados, tales como enfermedades neoplásticas que implican angiogénesis de tumores, curación de heridas, enfermedades tromboembólicas, arteriosclerosis y enfermedades inflamatorias. Además, el ligando modificado puede usarse para promover la proliferación y/o diferenciación de células cebada hematopoyéticas.
Más generalmente, el receptor que activa ligandos de TIE-2 modificados descritos aquí puede usarse para promover el crecimiento, supervivencia, migración y/o diferenciación y/o estabilización o desestabilización de células que expresan receptor de TIE. Puede usarse ligando de TIE-2 modificado biológicamente activo para el mantenimiento in vitro de células que expresan receptor de TIE en cultivo. Las células y tejidos que expresan receptor de TIE incluyen, por ejemplo, células endoteliales cardíacas y vasculares, epitelio del cristalino y epicardio de corazón y células hematopoyéticas tempranas. Alternativamente, tal ligando humano puede usarse para soportar células que se diseñan para expresar receptor de TIE. Además, el ligando de TIE-2 modificado y su receptor afín pueden usarse en sistemas de ensayo para identificar agonistas o antagonistas adicionales del receptor.
Fundamento de la invención
El comportamiento celular responsable del desarrollo, mantenimiento y reparación de células y tejidos diferenciados se regula, en gran parte, por señales intercelulares transportadas a través de factores de crecimiento y ligandos similares y sus receptores. Los receptores están situados en la superficie celular de células que responden y se unen a péptidos o polipéptidos conocidos como factores de crecimiento así como otros ligandos de tipo hormonas. Los resultados de esta interacción son cambios bioquímicos rápidos en las células que responden, así como un reajuste rápido y a largo plazo de la expresión génica celular. Pueden unirse a factores de crecimiento específicos varios receptores asociados con diversas superficies celulares.
La fosforilación de residuos de tirosina en proteínas por quinasas de tirosina es uno de los modos clave por el que se transducen señales a través de la membrana del plasma. Varios genes de quinasas de tirosina de proteínas conocidos actualmente codifican receptores transmembrana para factores de crecimiento de polipéptidos y hormonas tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, factor-I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-A y -B) y factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-556 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)). En cada caso, estos factores de crecimiento ejercen su acción uniéndose a la porción extracelular de sus receptores afines, lo que conduce a la activación de la quinasa de tirosina intrínseca presente en la porción citoplásmica del receptor. Los receptores de factores de crecimiento de células endoteliales son de particular interés debido a la posible implicación de factores de crecimiento en varios procesos fisiológicos y patológicos importantes, tales como vasculogénesis, angiogénesis, arteriosclerosis y enfermedades inflamatorias. (Folkman et al., Science, 235: 442-447 (1987)). También, los receptores de varios factores de crecimiento hematopoyéticos son quinasas de tirosina; éstos incluyen c-fms, que es el receptor de factor 1 estimulante de colonias, Sherr et al., Cell, 41: 665-676 (1985), y c-kit, un receptor de factor de crecimiento hematopoyético primitivo del que informan Huang et al., Cell, 63: 225-33 (1990).
Las quinasas de tirosina del receptor se han dividido en subfamilias evolutivas basadas en la estructura característica de sus ectodominios. (Ullrich et al. Cell, 61: 243-54 (1990)). Tales subfamilias incluyen quinasa de tipo receptor de EGF (subclase I) y quinasa de tipo receptor de insulina (subclase II), cada una de las cuales contiene secuencias ricas en cisteína homólogas repetidas en sus dominios extracelulares. Se encuentra también una región rica en cisteína simple en los dominios extracelulares de las quinasas de tipo eph. Hirai et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg et al., Mol. Cell. Biol., 10; 6316-24 (1990); Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). Los receptores de PDGF así como quinasas de tirosina de los receptores c-fms y c-kit pueden agruparse en la subclase III; mientras que los receptores de FGF forman la subclase IV. Son típicas para los miembros de ambas de estas subclases unidades de pliegue extracelulares estabilizadas por enlaces disulfuro intracadena. Estos pliegues denominados de tipo inmunoglobulina (Ig) se encuentran en las proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contiene una amplia variedad de otros receptores de la superficie celular que tienen ligandos unidos a células o solubles. Williams et al., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988).
Las quinasas de tirosina del receptor difieren en su especificidad y afinidad. En general, las quinasas de tirosina del receptor son glicoproteínas que consisten en (1) un dominio extracelular capaz de unirse al(a los) factor(es) de crecimiento específico(s); (2) un dominio transmembrana que es habitualmente una porción alfa-helicoidal de la proteína; (3) un dominio yuxtamembrana en el que puede regularse el receptor mediante, por ejemplo, fosforilación de proteína; (4) un dominio de quinasa de tirosina que es el componente enzimático del receptor; y (5) una cola carboxiterminal que en muchos receptores está implicada en el reconocimiento y unión de los sustratos para la quinasa de tirosina.
Se ha informado que procedimientos tales como empalme de exones alternativo y elección alternativa de promotor génico o lugares de poliadenilación son capaces de producir varios polipétidos distintos a partir del mismo gen. Estos polipéptidos pueden contener o no los diversos dominios listados antes. Como consecuencia, algunos dominios extracelulares pueden expresarse como proteínas segregadas separadas y algunas formas de los receptores pueden carecer del dominio de quinasa de tirosina y contener sólo el dominio extracelular insertado en la membrana del plasma a través del dominio transmembrana más una cola corta carboxi-terminal.
Se describió por Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917 (1990) un gen que codifica una quinasa de tirosina transmembrana de células endoteliales, identificada originalmente por RT-PCR como un fragmento de cADN homólogo de quinasa de tirosina desconocido de células de leucemia humana. Este gen y su proteína codificada se denominan "TIE" que es una abreviatura de "quinasa de tirosina con dominios de homología de Ig y EGF". Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992).
Se ha informado de que está presente mARN de tie en todos los tejidos fetales humanos y embriónicos de ratón. Por inspección, se ha localizado el mensaje de tie a las células endoteliales cardíacas y vasculares. Específicamente, se ha localizado mARN de tie a los endotelios de vasos sanguíneos y endocardio de embriones de ratón de 9,5 a 18,5 días de edad. Se mostró la expresión de tie aumentada durante la neovascularización asociada con folículos de ovario y tejido de granulación en desarrollo en heridas de la piel. Korhonen et al. Blood, 80: 2548-2555 (1992). Así, se ha sugerido que los TIEs juegan un papel en la angiogénesis, que es importante para desarrollar tratamientos para tumores sólidos y otras varias enfermedades dependientes de angiogénesis tales como retinopatía diabética, psoriasis, arteriosclerosis y artritis.
Se ha informado de que dos proteínas de receptor de TIE de rata relacionadas estructuralmente son codificadas por genes distintos con perfiles de expresión relacionados. Un gen, denominado tie-1, es el homólogo de rata de tie humano. Maisonpierre et al., Oncogene 8:1631-1637 (1993). El otro gen, tie-2, puede ser el homólogo de rata del gen tek de ratón, del que, como tie, se ha informado que se expresa en el ratón exclusivamente en células endoteliales y sus supuestos progenitores. Dumont et al. Oncogene 8: 1293-1301 (1993). El homólogo humano de tie-2 se describe en la Patente de los EE.UU. de Ziegler Nº 5.447.860, que se expidió el 5 de Septiembre de 1995 (en la que se hace referencia a él como "ork"), que se incorpora aquí en su integridad.
Se encontró que ambos genes se expresaban ampliamente en células endoteliales de tejidos embriónicos y postnatales. Estaban también presentes niveles significativos de transcriptos de tie-2 en otras poblaciones de células embriónicas, incluyendo epitelio del cristalino, epicardio de corazón y regiones de mesenquima. Maisonpierre et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993).
La expresión predominante del receptor de TIE en endotelios vasculares sugiere que el TIE juega un papel en el desarrollo y mantenimiento del sistema vascular. Esto podría incluir papeles en determinación de células endoteliales, proliferación, diferenciación y migración de células e imitación en elementos vasculares. Los análisis de embriones de ratón deficientes en TIE-2 ilustran su importancia en angiogénesis, particularmente para la formación de la red vascular en células endoteliales. Sato, T.N. et al., Nature 376: 70-74 (1995). En el sistema vascular maduro, los TIEs podrían funcionar en supervivencia de células endoteliales, mantenimiento y respuesta a influencias patógenas.
También se expresan los receptores de TIE en células cebada hematopoyéticas primitivas, células B y un subconjunto de células megacariocíticas, sugiriendo así el papel de los ligandos que se unen a estos receptores en hematopoyesis temprana, en la diferenciación y/o proliferación de células B y en la vía de diferenciación megacariocítica. Iwama et al., Biochem. Biophys. Research Communications 195: 301-309 (1993); Hashiyama et al., Blood 87:93-101 (1996); Batard et al., Blood 87: 2212-2220 (1996).
Sumario de la invención
La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que comprende un dominio N-terminal, un dominio doblemente arrollado y un dominio de tipo fibrinógeno, en la que al menos dos de dichos dominios se derivan de ligandos de TIE-2 diferentes seleccionados entre Ligando 1 de TIE-2, Ligando 2 de TIE-2, Ligando 3 de TIE y Ligando 4 de TIE:
En una realización, el ácido nucleico codifica un ligando de TIE-2 quimérico en el que el dominio N-terminal, el dominio doblemente arrollado y el dominio de tipo fibrinógeno se derivan de Ligando-1 de TIE-2 o Ligando-2 de TIE-2. La invención prevé otras combinaciones usando miembros de la familia de ligandos de TIE-2 adicionales.
El ácido nucleico aislado puede ser ADN, cADN o ARN. La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 modificado. La invención proporciona además un sistema de hospedante-vector para la producción en una célula hospedante adecuada de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un ligando de TIE-2 modificado. La célula hospedante adecuada puede ser bacteriana, de levadura, insecto o mamífero. La invención proporciona también un método para producir un polipéptido que tiene la actividad biológica de un ligando de TIE-2 modificado, que comprende desarrollar células del sistema hospedante-vector en condiciones que permiten la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido producido así.
La invención proporciona también ligandos de TIE-2 quiméricos codificados por un ácido nucleico de la invención.
La invención descrita aquí de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 quimérico proporciona además el desarrollo del ligando como un agente terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos que implican células, tejidos u órganos que expresan el receptor de TIE-2.
La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un ligando de TIE-2 quimérico como se describe aquí, y un excipiente aceptable farmacéuticamente. Tales composiciones pueden usarse para promover la neovascularización en un paciente. En realizaciones específicas, los ligandos de TIE-2 quiméricos de la invención pueden usarse para promover curación de heridas, o solos o en combinación con otros factores hematopoyéticos, para promover la proliferación o diferenciación de células cebada hematopoyéticas, células B o células megacarióticas.
La presente invención proporciona también un anticuerpo que se une específicamente a un ligando de TIE-2 quimérico como se describe aquí pero que no se une a ligando de TIE-2 nativo. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Así, la invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a un ligando de TIE-2 modificado, en un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tales composiciones pueden usarse para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos en un mamífero. Los anticuerpos específicos para el ligando de TIE-2 quimérico de la invención pueden usarse también para vigilar el motivo de la terapia usando el ligando de TIE-2 quimérico.
Alternativamente, la invención proporciona un ligando de TIE-2 quimérico de la invención conjugado a un agente citotóxico, y una composición farmacéutica preparada a partir de ellos.
Descripción breve de las figuras
Figuras 1A Y 1B - El cuerpo receptor de TIE-2 (TIE-2 RB) inhibe el desarrollo de vasos sanguíneos en la membrana corioalantoica de pollos embriónicos (CAM). Una pieza simple de espuma de gelatina resorbible (Gelfoam) empapada con 6 \mug de RB se insertó inmediatamente bajo la CAM de embriones de pollos de 1 día. Después de 3 días adicionales de incubación, se retiraron y examinaron embriones de 4 días de edad y la CAM circundante. Figura 1A: embriones tratados con EHK-1 RB (rEHK-1 ecto/hlgG1 Fc) eran viables y poseían vasos sanguíneos desarrollados normalmente en su CAM circundante. Figura 1B: todos los embriones tratados con TIE-2 RB (r TIE-2 ecto/hIgG1 Fc) estaban muertos, disminuidos de tamaño y estaban casi completamente exentos de vasos sanguíneos circundantes.
Figura 2 - Vector pJFE14.
Figura 3 - Mapa de restricción de \lambdagt10.
Figura 4 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos deducidos (código de letras simples) de ligando 1 de TIE-2 humano del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2.
Figura 5 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos deducidos (código de letras simples) de ligando 1 de TIE-2 humano del clon T98G.
Figura 6 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos deducidos (código de letras simples) de ligando 2 de TIE-2 humano del clon pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE 2 humano.
Figura 7 - Manchas de Western que muestran la activación de receptor de TIE-2 por ligando 1 de TIE-2 (Pista L1) pero no por ligando 2 de TIE-2 (Pista 2) o testigo (Mock).
Figura 8 - Manchas de Western que muestran que el tratamiento previo de células HAEC con ligando 2 de TIE-2 en exceso (Pista 2) antagoniza la capacidad subsiguiente de ligando 1 de TIE-2 diluido para activar al receptor de TIE-2 (TIE2-R) en comparación con el tratamiento previo de células HAEC con medio MOCK (Pista 1).
Figura 9 - Manchas de Western que demuestran la capacidad de TL2 para inhibir competitivamente la activación de TL1 del receptor de TIE-2 usando el linaje híbrido celular humano, EA.hy926.
Figura 10 - Representación en histograma de la unión a superficie inmovilizada de IgG de TIE-2 de rata por ligando de TIE-2 en medio acondicionado concentrado (10 x) de C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP y T98G. Se demuestra la unión específica de TIE-2 de rata (rTIE2) por la reducción significativa en la actividad de unión en presencia de 25 \mug/ml de RB de TIE-2 de rata soluble en comparación con una pequeña reducción en presencia de RB de trkB soluble.
Figura 11 - Unión de ligando 1 de TIE-2 humano (hTL1) y ligando 2 de TIE-2 humano (hTL2) recombinantes, en sobrenadantes de células COS, a una superficie inmovilizada de cuero receptor (RB) de TIE-2 humano. La unión específica de TIE-2 humano se determinó incubando las muestras con 25 \mug/ml de RB de TIE-2 humano soluble o RB de trkB; se observa una reducción significativa en la actividad de unión sólo para las muestras incubadas con RB de TIE-2 humano.
Figura 12 - Manchas de Western que muestran que el cuerpo receptor de TIE-2 (denotado RB de TIE-2 o, como aquí, TIE2-Fc) bloquea la activación de receptores de TIE-2 por ligando 1 de TIE-2 (TL1) en células HUVEC, mientras que un cuerpo receptor no relacionado (TRKB-Fc) no bloquea esta activación.
Figura 13 - Geles de agarosa que muestran diluciones en serie [sin diluir (1) hasta 10^{-4}] de los productos de RT-PCR de TL1 y TL2 obtenidos de hígado fetal de ratón E14.5 (Pistas 1 - total, Pistas 3 - enriquecido estromal, y Pistas 4 - células precursoras hematopoyéticas c-kit^{+}TER119) y timo fetal de ratón E14.5 (Pistas 2 - total).
Figura 14 - Geles de agarosa que muestran diluciones en serie [sin diluir (1) hasta 10^{-3}] de los productos de RT-PCR de TL1 y TL2 obtenidos de células estromales corticales de timo fetal de ratón E17.5 (Pistas 1 - CDR1+/A2B5-) y células estromales medulares (Pista CDR1-/A2B5+).
Figura 15 - Una representación esquemática del papel hipotético de ligandos de TIE-2/TIE en angiogénesis. TL1 está representado por (\bullet); TL2 está representado por (*), TIE-2 está representado (T), VEFG está representado por ([]) y flk-1 (un receptor de VEGF) está representado por (Y).
Figura 16 - Platinas de hibridación in situ que muestran el modelo de expresión temporal de TIE-2, TL1, TL2 y VEGF durante la angiogénesis asociada con desarrollo folicular y formación de corpus luteum en el ovario de una rata que se trató con suero de yegua preñada. Columna 1: folículo pre-ovulatorio temprano; Columna 2: folículo pre-ovulatorio; Columna 3: corpus luteum temprano; y Columna 4: folículo atrético; Fila A: campo brillante; Fila B: VEGF; Fila C: TL2; Fila D: TL1 y Fila E: receptor de TIE-2.
Figura 17 - Comparación de secuencias de aminoácidos de proteína de TL1 madura y proteína de TL2 madura. La secuencia de TL1 es la misma que la indicada en la Figura 4, excepto que se ha separado la secuencia líder putativa. De manera similar, la secuencia de TL2 es la misma que la indicada en la Figura 6, excepto que se ha separado la secuencia líder putativa. Las flechas indican residuos Arg49, Cys245 y Arg264 de TL1, que corresponden a los residuos de las posiciones de aminoácidos 69, 265 y 284, respectivamente, de TL1, como se indica en la Figura 4.
Figura 18 - Manchas de Western de la estructura multimérica covalente de TL1 y TL2 (Panel A) y la interconversión de TL1 y TL2 por la mutación de una cisteína (Panel B).
Figura 19 - Una curva típica de unión de TIE-2-IgG a TL1 inmovilizado en un ensayo de unión exenta de células cuantitativo.
Figura 20 - Una curva típica que muestra el cuerpo ligando de ligando 1 de TIE-2 que comprende el dominio de tipo fibrinógeno del ligando unido al dominio de Fc de IgG (TL1-fFc) que se une a ectodominio de TIE-2 inmovilizado en un ensayo de unión exenta de células cuantitativo.
Figura 21 - Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando-3 de TIE. La secuencia de codificación comienza en la posición 47. El dominio de tipo fibrinógeno comienza en la posición 929.
Figura 22 - Comparación de secuencias de aminoácidos de miembros de la familia de ligandos de TIE. mTL3 = ligando-3 de TIE de ratón; hTL1 = ligando 1 de TIE-2 humano; chTL1 = ligando 1 de TIE-2 de pollo; mTL1 = ligando 1 de TIE-2 de ratón; mTL2 = ligando 2 de TIE-2 de ratón; hTL2 = ligando 2 de TIE-2 humano. Las regiones en caja indican regiones de homología conservadas entre los miembros de la familia.
Figura 23 - Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando-4 de TIE. La flecha indica la posición de nucleótido 569.
Figura 24 - Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando de TIE quimérico denominado 1N1C2F (quimera 1). La secuencia líder putativa es codificada por los nucleótidos 1-60.
Figura 25 - Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando de TIE quimérico denominado 2N2C1F (quimera 2). La secuencia líder putativa es codificada por los nucleótidos 1-48.
Figura 26 - Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando de TIE quimérico denominado 1N2C2F (quimera 3). La secuencia líder putativa es codificada por los nucleótidos 1-60.
Figura 27 - Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida (código de letras simples) de ligando de TIE quimérico denominado 2N1C1F (quimera 4). La secuencia líder putativa es codificada por los nucleótidos 1-48.
Descripción detallada de la invención
Como se describe con mayor detalle después, los solicitantes han creado nuevos ligandos de TIE-2 modificados, quiméricos, que se unen al receptor de TIE-2. La presente invención proporciona una composición que comprende un ligando de TIE-2 quimérico sustancialmente exento de otras proteínas.
Los ligandos de TIE-2 quiméricos de la invención son ligandos de TIE-2 modificados que comprenden al menos una porción de un primer ligando de TIE-2 y una porción de un segundo ligando de TIE-2 que es diferente del primero. A modo de ejemplo no limitativo, el primer ligando de TIE-2 es TL1 y el segundo ligando de TIE-2 es TL2. La invención prevé otras combinaciones usando miembros de la familia de ligandos de TIE-2 adicionales. Por ejemplo, son posibles otras combinaciones para crear un ligando de TIE-2 quimérico, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, aquellas combinaciones en las que el primer ligando se selecciona del grupo constituido por TL1, TL2, TL3 y TL4, y el segundo ligando, diferente del primer ligando, se selecciona del grupo constituido por TL1, TL2, TL3 y TL4.
La presente invención comprende los ligandos de TIE-2 quiméricos modificados y sus secuencias de aminoácidos, así como variantes de los mismos equivalentes funcionalmente, así como proteínas o péptidos que comprenden sustituciones, supresiones o mutantes de inserción de las secuencias descritas, que se unen al receptor de TIE-2 y actúan como agonistas o antagonistas del mismo. Tales variantes incluyen aquellas en las que residuos de aminoácidos están sustituidos por residuos dentro de la secuencia que producen un cambio tácito. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden estar sustituidos por otro(s) aminoácido(s) de una polaridad similar que actúa(n) como un equivalente funcional, produciendo una alteración tácita. Pueden seleccionarse sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, la clase de aminoácidos no polares (hidrófobos) incluye alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
También se incluyen dentro del alcance de la invención proteínas o fragmentos o derivados de ellas, que presenten la misma o similar actividad biológica que los ligandos de TIE-2 modificados descritos aquí, y derivados que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Las moléculas equivalentes funcionalmente incluyen también moléculas que contienen modificaciones, incluyendo modificaciones N-terminales, que resultan de la expresión en un hospedante recombinante particular, tal como, por ejemplo, metilación N-terminal que tiene lugar en ciertos sistemas de expresión bacteriana (por ejemplo, E. Coli).
La presente invención abarca también las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas descritas aquí como ligandos de TIE-2 modificados, así como células hospedantes, incluyendo células de levadura, bacterias, virus y de mamífero, que se diseñen genéticamente para producir las proteínas, mediante, por ejemplo, transfección, transducción, infección, electroporación o microinyección de ácido nucleico que codifica los ligandos de TIE-2 modificados descritos aquí en un vector de expresión adecuado. La presente invención abarca también la introducción del ácido nucleico que codifica ligandos de TIE-2 modificados mediante técnicas de terapia génica tal como se describe, por ejemplo, en Finkel y Epstein FASEB J. 9:843-851 (1995); Guzman et al. PNAS (USA) 91:10732-10736 (1994).
Un experto en la técnica reconocerá también que la presente invención abarca secuencias de ADN y ARN que se hibridan a una secuencia de nucleótidos que codifica ligando de TIE-2 modificado, en condiciones de rigurosidad moderada, como se define en, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, págs. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Así, una molécula de ácido nucleico considerada por la invención incluye una que tiene una secuencia de nucleótidos deducida de una secuencia de aminoácidos de un ligando de TIE-2 modificado preparado como se ha descrito aquí, así como una molécula que tiene una secuencia de nucleótidos que se híbrida a tal secuencia de nucleótidos, y también una secuencia de nucleótidos que es degenerada de las anteriores secuencias como resultado del código genético, pero que codifica un ligando que se une a receptor de TIE-2 y que tiene una secuencia de aminoácidos y otras características primarias, secundarias y terciarias que son suficientemente duplicativas de un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí para conferir en la molécula la misma actividad biológica que el ligando de TIE-2 modificado descrito aquí.
La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 modificado que se une a y activa un receptor de TIE-2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ligando 1 de TIE-2, en el que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 2 de TIE-2. La invención proporciona también tal molécula de ácido nucleico, con una modificación adicional tal que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 2 de TIE-2.
La presente invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 modificado que se une a y activa un receptor de TIE-2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ligando 1 de TIE-2, en el que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 2 de TIE-2, y que está modificada adicionalmente para codificar un aminoácido diferente en lugar del residuo de cisteína codificado por los nucleótidos 784-787 como se señala en la Figura 27. Un residuo de serina sustituye preferiblemente al residuo de cisteína. En otra realización, la molécula de ácido nucleico está modificada adicionalmente para codificar un aminoácido diferente en lugar del residuo de arginina codificado por los nucleótidos 199-201 como se señala en la Figura 27. Un residuo de serina sustituye preferiblemente al residuo de arginina.
La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 modificado que se une a pero no activa receptor de TIE-2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ligando 1 de TIE-2, en el que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tipo fibrinógeno de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tipo fibrinógeno de ligando 2 de TIE-2. La invención proporciona también tal molécula de ácido nucleico modificada adicionalmente de manera que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 2 de TIE-2.
La invención proporciona además un ligando de TIE-2 modificado codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención.
La invención proporciona también una molécula de ácido nucleico que codifica un ligando de TIE quimérico como se señala en las Figuras 24, 25, 26 ó 27. La invención proporciona también un ligando de TIE quimérico como se señala en las Figuras 24, 25, 26 ó 27. La invención proporciona además un ligando de TIE quimérico como se señala en la Figura 27, modificado para tener un aminoácido diferente en lugar del residuo de cisteína codificado por los nucleótidos 784-787.
Puede usarse cualquiera de los métodos conocidos por un experto en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector, para construir vectores de expresión que codifiquen un ligando de TIE-2 modificado usando señales de control de transcripción/traducción apropiadas y las secuencias que codifican proteínas. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante y técnicas sintéticas in vitro y recombinaciones in vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ligando de TIE-2 modificado o fragmentos de péptidos del mismo puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico que está enlazada operativamente a la secuencia que codifica un ligando de TIE-2 modificado, de tal modo que la proteína o el péptido de ligando de TIE-2 modificado se exprese en un hospedante transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí puede controlarse por cualquier elemento promotor/mejorador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del ligando incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la repetición terminal larga como se describe en Squinto et al., (Cell 65:1-20 (1991)); la región de promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290:304-310), el promotor de CMV, la repetición terminal 5' de M-MuLV, el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:144-1445 (1981)), el promotor de adenovirus, las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procariota tales como el promotor de \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1978)), o el promotor de tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acadf. Sci. USA 80:21-25 (1983)), véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 242:74-94 (1980); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADH (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional de animales, que presentan especificidad para tejidos y se han utilizado en animales transgénicos; región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinarias pancreáticas (Swift et al. Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987); región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas [Hanahan, Nature 315:115-122 (1985)]; región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en cálulas testiculares, de pecho, linfoides y cebada (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control del gen de cadena-2 ligera de miosina que es activa en músculo del esqueleto (Shani, 1985, Nature 314:283-286) y región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378). La invención abarca además la producción de compuestos antisentido que son capaces de hibridarse específicamente con una secuencia de ARN que codifica un ligando de TIE-2 modificado para modular su expresión. Ecker, Patente de los EE.UU. Nº 5.166.195, expedida el 24 de Noviembre de 1992.
Así, según la invención, se usan vectores de expresión capaces de replicarse en un hospedante bacteriano o eucariótico que comprende un ácido nucleico que codifica un ligando de TIE-2 modificado como se describe aquí, para transfectar un hospedante y dirigir por ello la expresión de tal ácido nucleico para producir un ligando de TIE-2 modificado, que puede recuperarse después en una forma biológicamente activa. Según se usa aquí, una forma biológicamente activa incluye una forma capaz de unirse a receptor de TIE y causar una respuesta biológica tal como una función diferenciada o influir en el fenotipo de la célula que expresa el receptor. Tales formas activas biológicamente podrían, por ejemplo, inducir fosforilación del dominio de tirosina quinasa de receptor de TIE. Alternativamente, la actividad biológica puede ser un efecto como antagonista al receptor de TIE. En realizaciones alternativas, la forma activa de un ligando de TIE-2 modificado es una que puede reconocer al receptor de TIE y actuar por ello como agente de fijación de objetivo para el receptor, para su uso en diagnóstico y terapéutica. Según tales realizaciones, la forma activa no necesita conferir en cualquier célula que exprese TIE ningún cambio en el fenotipo.
Los vectores de expresión que contienen los inseros génicos pueden identificarse por cuatro métodos generales: (a) hibridación ADN-ADN, (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores", (c) expresión de secuencias insertadas y (d) detección de PCR. En el primer método, puede detectarse la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión por hibridación ADN-ADN usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen que codifica ligando de TIE-2 modificado insertado. En el segundo método, el sistema vector recombinante/hospedante puede identificarse y seleccionarse en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad de timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) causadas por la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si un ácido nucleico que codifica un ligando de TIE-2 modificado se inserta dentro de la secuencia génica marcadora del vector, pueden identificarse recombinantes que contienen el inserto por la ausencia de la función génica marcadora. En el tercer método, pueden identificarse vectores de expresión recombinantes ensayando el producto de genes extraños expresado por el recombinante. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de un producto génico de ligando de TIE-2 modificado, por ejemplo, por unión del ligando a receptor de TIE en una porción del mismo que puede marcarse, por ejemplo, con un anticuerpo detectable o una porción del mismo o por unión a anticuerpos producidos contra la proteína del ligando de TIE-2 modificado o una porción de la misma. Las células de la presente invención pueden expresar transitoriamente o, preferiblemente, constitutiva y permanentemente, un ligando de TIE-2 modificado como se describe aquí. En el cuarto método, pueden prepararse cebadores de nucleótidos de ADN correspondientes a una secuencia de ADN específica de tie. Estos cebadores podrían usarse para PCR un fragmento de gen de tie. (Métodos PCR: A Guide To Methods and Applications, Redactado por Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).
El ligando recombinante puede purificarse por cualquier técnica que permita la formación subsiguiente de una proteína estable, activa biológicamente. Preferiblemente, el ligando se segrega en el medio de cultivo del que se recupera. Alternativamente, el ligando puede recuperarse de células como proteínas solubles o como cuerpos de inclusión, de los que puede extraerse cuantitativamente por hidrocloruro de guanidinio 8 M y diálisis según metodología bien conocida. Con el fin de purificar adicionalmente el ligando, pueden usarse cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico convencional, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa o filtración en gel.
En realizaciones adicionales de la invención, como se describe con mayor detalle en los Ejemplos, puede usarse un gen que codifica ligando de TIE-2 modificado para inactivar o "suprimir" un gen endógeno por recombinación homóloga, y crear por ello una célula, tejido o animal deficiente en ligando de TIE . Por ejemplo, y no a modo de limitación, el gen que codifica ligando-4 de TIE recombinante puede diseñarse para contener una mutación insercional, por ejemplo, el gen de neo, que inactivaría el gen que codifica ligando-4 de TIE nativo. Tal construcción, bajo el control de un promotor adecuado, puede introducirse en una célula, tal como una célula cebada embriónica, por una técnica tal como transfección, transducción o inyección. Las células que contienen la construcción pueden seleccionarse después por resistencia a G418. Las células que carecen de un gen que codifica ligando-4 de TIE intacto pueden identificarse después, por ejemplo, por manchas de Southern, detección de PCR, manchas de Northern o ensayo de expresión. Las células que carecen de un gen que codifica ligando-4 de TIE intacto pueden fusionarse después a células embriónicas tempranas para generar animales transgénicos deficientes en tal ligando. Tal animal puede usarse para definir procedimientos in vivo específicos, dependientes normalmente del ligando.
La presente invención proporciona también anticuerpos para un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí que son útiles para la detección del ligando en, por ejemplo, aplicaciones de diagnóstico. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un ligando de TIE-2 modificado, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por linajes celulares continuos en cultivo. Por ejemplo, están dentro del alcance de la presente invención la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy"; Alan R. Liss, Inc. Págs. 77-96) y similares.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales humanos-de ratón (u otras especies) quiméricos. Pueden fabricarse anticuerpos monoclonales humanos por cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Pueden prepararse moléculas de anticuerpos quiméricos que contengan un dominio de unión a antígeno de ratón con regiones constantes humanas (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).
Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales para epítopes de un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí. Para la producción de anticuerpo, pueden inmunizarse diversos animales hospedantes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, conejos, ratones y ratas, por inyección con un ligando de TIE-2 modificado, o un fragmento o derivado del mismo. Pueden usarse diversos coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedantes, e incluyendo aunque sin limitarse a ellos medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianinas de lapa bocallave, dinitrofenol y coadyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacille Calmette-Gurin) y Corynebacterium parvum.
Puede prepararse por técnicas conocidas un clon molecular de un anticuerpo para un epítope seleccionado de un ligando de TIE-2 modificado. Puede usarse metodología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) para construir secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen una molécula de anticuerpo monoclonal, o una región de unión a antígeno de la misma.
La presente invención proporciona moléculas de anticuerpo así como fragmentos de tales moléculas de anticuerpo. Pueden generarse por técnicas conocidas fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen aunque sin limitarse a ellos: el fragmento de F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos de Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento de F(ab')_{2} y los fragmentos de Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse por técnicas conocidas, por ejemplo, cromatografía de inmunoabsorción o inmunoafinidad, métodos cromatográficos tales como HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) o una combinación de ellas.
La presente invención abarca también un inmunoensayo para medir la cantidad de un ligando de TIE-2 modificado en una muestra biológica
a)
poniendo en contacto la muestra biológica con al menos un anticuerpo que se une específicamente a un ligando de TIE-2 modificado de manera que el anticuerpo forme un complejo con cualquier ligando de TIE-2 modificado presente en la muestra; y
b)
midiendo a cantidad del complejo y midiendo por ello la cantidad del ligando de TIE-2 modificado en la muestra biológica.
La invención abarca además un ensayo par medir la cantidad de receptor de TIE en una muestra biológica
a)
poniendo en contacto la muestra biológica con al menos un ligando de la invención de manera que el ligando forme un complejo con el receptor de TIE; y
b)
midiendo la cantidad del complejo y midiendo por ello la cantidad del receptor de TIE en la muestra biológica.
La presente invención proporciona también la utilización de un ligando de TIE-2 modificado que activa al receptor de TIE-2 como se describe aquí, para soportar la supervivencia y/o crecimiento y/o migración y/o diferenciación de células que expresan receptor de TIE-2. Así, el ligando puede usarse como suplemento para soportar, por ejemplo, células endoteliales en cultivo.
Además, la creación por los solicitantes de un ligando de TIE-2 modificado para el receptor de TIE-2 permite la utilización de sistemas de ensayo útiles para la identificación de agonistas o antagonistas del receptor de TIE-2. Tales sistemas de ensayo serían útiles para identificar moléculas capaces de promover o inhibir angiogénesis. Por ejemplo, en una realización, pueden identificarse antagonistas del receptor de TIE-2 como moléculas de ensayo que son capaces de interferir con la interacción del receptor de TIE-2 con un ligando de TIE-2 modificado que se une al receptor de TIE-2. Tales antagonistas se identifican por su capacidad para 1) bloquear la unión de un ligando de TIE-2 modificado activo biológicamente al receptor, medida, por ejemplo, usando tecnología de biosensor BIAcore (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ); o 2) bloquear la capacidad de un ligando de TIE-2 modificado activo biológicamente para causar una respuesta biológica. Tales respuestas biológicas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, fosforilación del receptor de TIE o componentes aguas abajo de la vía de transducción de la señal de TIE, o supervivencia, crecimiento o diferenciación de las células que llevan receptor de TIE.
En una realización, células diseñadas para expresar el receptor de TIE pueden depender para el crecimiento de la adición de un ligando de TIE-2 modificado. Tales células proporcionan sistemas de ensayo útiles para identificar agonistas adicionales del receptor de TIE, o antagonistas capaces de interferir con la actividad del ligando de TIE-2 modificado en tales células. Alternativamente, células autocrinas, diseñadas para ser capaces de co-expresar un ligando de TIE-2 modificado y un receptor, puede proporcionar sistemas útiles para ensayar agonistas o antagonistas potenciales.
Por tanto, la presente invención proporciona la introducción de un receptor de TIE-2 en células que no expresan normalmente este receptor, permitiendo así a estas células presentar respuestas profundas y fácilmente distinguibles a un ligando que se une a este receptor. El tipo de respuesta obtenida depende de la célula utilizada, y no el receptor específico introducido en la célula. Pueden escogerse linajes celulares apropiados para producir una respuesta de la mayor utilidad para ensayar, así como descubrir, moléculas que pueden actuar en receptores de tirosina quinasa. Las moléculas pueden ser cualquier tipo de molécula, incluyendo aunque sin limitarse a ellas moléculas de péptidos y no péptidos, que actuarán en sistemas a describir de una manera específica para el receptor.
Uno de los sistemas más útiles a explotar implica la introducción de un receptor de TIE (o un receptor quimérico que comprenda el dominio extracelular de otra tirosina quinasa receptora tal como, por ejemplo, trkC y el dominio intracelular de un receptor de TIE) en un linaje celular de fibroblastos (por ejemplo, células NIH3T3), así, tal receptor que no media normalmente en respuestas proliferativas u otras puede, tras la introducción en fibroblastos, ser ensayado sin nada por una variedad de métodos bien establecidos para cuantificar los efectos de factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, incorporación de timidina u otros tipos de ensayos de proliferación; véase van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors" en Progress Factor Research, Vol. 2, págs. 131-152; Zhan y M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Vol. 6, págs. 3541-3544). Estos ensayos tienen la ventaja añadida de que puede ensayarse cualquier preparación en el linaje celular que tiene el receptor introducido y en el linaje celular progenitor que carece del receptor; sólo se juzgarían como mediados por el receptor introducido efectos específicos en el linaje celular con el receptor. Tales células pueden diseñarse adicionalmente para expresar un ligando de TIE-2 modificado, creando así un sistema autocrino útil para ensayar moléculas que actúan como antagonistas/agonistas de esta interacción. Así la presente invención proporciona células hospedantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un ligando de TIE-2 modificado y un ácido nucleico que codifica receptor de TIE.
La interacción receptor de TIE/ligando de TIE-2 modificado proporciona también un sistema útil para identificar agonistas o antagonistas de pequeñas moléculas del receptor de TIE. Por ejemplo, pueden identificarse fragmentos, mutantes o derivados de un ligando de TIE-2 modificado que se unen al receptor de TIE pero no inducen ninguna otra actividad biológica. Alternativamente, la caracterización de un ligando de TIE-2 modificado permite la caracterización adicional de porciones activas de la molécula. Además, la identificación de un ligando permite la determinación de la estructura cristalina por rayos X del complejo receptor/ligando, permitiendo así la identificación del lugar de unión en el receptor. El conocimiento del lugar de unión proporciona una intuición útil en el diseño racional de nuevos agonistas y antagonistas.
La unión específica de una molécula de ensayo a un receptor de TIE puede medirse de un cierto número de formas. Por ejemplo, la unión real de una molécula de ensayo a células que expresan TIE puede detectarse o medirse detectando o midiendo (i) una molécula de ensayo unida a la superficie de células intactas; (ii) una molécula de ensayo reticulada a proteína de TIE en lisados de células; o (iii) una molécula de ensayo unida a TIE in vitro. La interacción específica entre la molécula de ensayo y TIE puede evaluarse usando reactivos que demuestren las propiedades únicas de esa interacción.
Como ejemplo específico, no limitativo, pueden usarse los métodos de la invención como sigue. Considérese un caso en el que ha de medirse un ligando de TIE-2 modificado en una muestra. Pueden exponerse diluciones variables de la muestra (la molécula de ensayo), en paralelo con un testigo negativo (NC) que contiene actividad de ligando de TIE-2 no modificado y un testigo positivo (PC) que contiene una cantidad conocida de un ligando de TIE-2 modificado, a células que expresan TIE en presencia de un ligando de TIE-2 modificado marcado detectablemente (en este ejemplo, ligando radioyodado). Puede evaluarse la cantidad de ligando de TIE-2 modificado en la muestra de ensayo determinando la cantidad de ligando de TIE-2 modificado marcado con ^{125}I que se une a los testigos y en cada una de las diluciones, y comparando después los valores de la muestra con una curva estándar. Cuanto más ligando de TIE-2 modificado haya en la muestra, menos ^{125}I-ligando se unirá a TIE.
La cantidad de ^{125}I-ligando unido puede determinarse midiendo la cantidad de radioactividad por célula, o reticulando un ligando de TIE-2 modificado a proteínas de la superficie celular usando DSS, como se describe en Meakin y Shooter, 1991, Neuron 6:153-163, y detectando la cantidad de proteína marcada en extractos de células usando, por ejemplo, electroforesis en gel de SDS poliacrilamida, que puede revelar una proteína marcada que tenga un tamaño correspondiente a receptor de TIE/ligando de TIE-2 modificado. La interacción específica molécula de ensayo/TIE puede ensayarse adicionalmente añadiendo a los ensayos diversas diluciones de un ligando testigo no marcado que no se une al receptor de TIE y no tendría por tanto efecto sustancial en la competencia entre ligando de TIE-2 modificado marcado y molécula de ensayo para unirse a TIE. Alternativamente, una molécula que se sabe capaz de romper la unión de receptor de TIE/ligando de TIE-2 modificado, tal como, aunque sin limitarse a ellas, anticuerpo anti-TIE o cuerpo receptor de TIE como se describe aquí, puede esperarse que interfiera con la competencia entre ^{125}I -ligando de TIE-2 modificado y molécula de ensayo para unirse al receptor de TIE.
El ligando de TIE-2 modificado marcado detectablemente incluye, aunque sin limitarse a ellos, un ligando de TIE-2 modificado enlazado covalentemente o no covalentemente a una sustancia radioactiva, una sustancia fluorescente, una sustancia que tenga actividad enzimática, una sustancia que pueda servir como sustrato para una enzima (se prefieren enzimas y sustratos asociados con reacciones detectables colorimétricamente) o a una sustancia que pueda reconocerse por una molécula de anticuerpo que sea preferiblemente una molécula de anticuerpo marcada detectablemente.
Alternativamente, la unión específica de molécula de ensayo a TIE puede medirse evaluando los efectos biológicos secundarios de una unión de ligando de TIE-2 modificado/receptor de TIE, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, crecimiento de células y/o diferenciación o expresión génica temprana inmediata o fosforilación de TIE. Por ejemplo, puede ensayarse la capacidad de la molécula de ensayo para inducir diferenciación en células que carecen de tie y en células comparables que expresan tie; la diferenciación en células que expresan tie pero no en células comparables que carecen de tie sería identificativa de una interacción específica molécula de ensayo/TIE. Podría realizarse un análisis similar detectando inducción génica temprana inmediata (por ejemplo, fos y jun) en células faltas de tie y con tie, o detectando fosforilación de TIE usando ensayos de fosforilación estándares conocidos en la técnica. Tal análisis podría ser útil para identificar agonistas o antagonistas que no se unan competitivamente a TIE.
De modo similar, la presente invención proporciona un método para identificar una molécula que tiene la actividad biológica de un ligando de TIE-2 modificado que comprende (i) exponer una célula que expresa tie a una molécula de ensayo y (ii) detectar la unión específica de la molécula de ensayo a receptor de TIE, en el que la unión específica a TIE se correlaciona positivamente con actividad de tipo TIE. La unión específica puede detectarse ensayando la unión directa o los efectos biológicos secundarios de la unión, como se ha comentado antes. Tal método puede ser particularmente útil para identificar nuevos miembros de la familia de ligandos de TIE o, en la industria farmacéutica, para examinar en un gran conjunto de moléculas de péptidos y no péptidos (por ejemplo, peptidomiméticos) la actividad biológica asociada a TIE. En una realización preferida, específica, no limitativa, de la invención, puede prepararse una gran parrilla de pocillos de cultivo que contengan, en filas alternativas, células PC12 (o fibroblastos, véase después) que sean faltas de tie o se diseñen para ser con tie. Puede añadirse después una variedad de moléculas de ensayo de tal modo que cada columna de la parrilla, o una porción de ella, contenga una molécula de ensayo diferente. Podría registrarse después en cada pocillo la presencia o ausencia de crecimiento y/o diferenciación. Podría registrarse para tal actividad de esta manera un número extremadamente grande de moléculas de ensayo.
En realizaciones adicionales, la invención proporciona métodos para detectar o medir la actividad de tipo ligando de TIE o identificar una molécula que tenga tal actividad que comprenden (i) exponer una molécula de ensayo a una proteína de receptor de TIE in vitro en condiciones que permitan que tenga lugar la unión y (ii) detectar la unión de la molécula de ensayo a la proteína de receptor de TIE, en los que la unión de la molécula de ensayo a receptor de TIE se correlaciona con la actividad de tipo ligando de TIE. Según tales métodos, el receptor de TIE puede o no purificarse sustancialmente, puede añadirse a un soporte sólido (por ejemplo, como una columna de afinidad o como un ensayo ELISA), o puede incorporarse a una membrana artificial. La unión de molécula de ensayo a receptor de TIE puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica. En realizaciones preferidas, puede detectarse o medirse la unión de la molécula de ensayo evaluando su capacidad para competir con ligandos de TIE conocidos marcados detectablemente para la unión a receptor de TIE.
La presente invención proporciona también un método para detectar la capacidad de una molécula de ensayo para funcionar como antagonista de la actividad de tipo ligando de TIE que comprende detectar la capacidad de la molécula para inhibir un efecto de unión de ligando de TIE a receptor de TIE en una célula que expresa el receptor. Tal antagonista puede o no interferir con la unión de receptor de TIE/ligando de TIE-2 modificado. Los efectos de unión de ligando de TIE-2 modificado a receptor de TIE son preferiblemente efectos biológicos o bioquímicos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, supervivencia o proliferación de células, transformación de células, inducción génica temprana inmediata o fosforilación de TIE.
La invención proporciona además un método para identificar anticuerpos u otras moléculas capaces de neutralizar el ligando o bloquear la unión al receptor, así como las moléculas identificadas por el método. A modo de ejemplo no limitativo, el método puede realizarse mediante un ensayo que sea conceptualmente similar a un ensayo ELISA. Por ejemplo, el cuerpo receptor de TIE puede estar unido a un soporte sólido, tal como una placa de pocillos múltiples de plástico. Como testigo, puede introducirse después en el pocillo una cantidad conocida de un ligando de TIE-2 modificado que se haya marcado con Myc y puede identificarse después cualquier ligando de TIE-2 modificado marcado que se una al cuerpo receptor mediante un anticuerpo informador dirigido contra la marca de Myc. Este sistema de ensayo puede usarse después para examinar en muestras de ensayo moléculas que sean capaces de i) unirse al ligando marcado o ii) unirse al cuerpo receptor y bloquear por ello la unión al cuerpo receptor por el ligando marcado. Por ejemplo, puede introducirse en el pocillo una muestra de ensayo que contenga una molécula putativa de interés junto con una cantidad conocida de ligando marcado y puede medirse la cantidad de ligando marcado que se une al cuerpo receptor. Comparando la cantidad de ligando marcado unido en la muestra de ensayo con la cantidad en el testigo, pueden identificarse muestras que contengan moléculas que sean capaces de bloquear la unión del ligando al receptor. Las moléculas de interés identificadas así pueden aislarse usando métodos muy conocidos por un experto en la técnica.
Una vez encontrado un bloqueador de la unión de ligando, un experto en la técnica sabría realizar ensayos secundarios para determinar si el bloqueador se une al receptor o al ligando, así como ensayos para determinar si la molécula bloqueadora puede neutralizar la actividad biológica del ligando. Por ejemplo usando un ensayo de unión que emplee tecnología de biosensor BIAcore (o equivalente), en el que el cuerpo receptor de TIE o un ligando o cuerpo ligando de TIE-2 modificado esté incorporado a un soporte sólido (por ejemplo, carboximetildextrano en una superficie de oro), un experto en la técnica sería capaz de determinar si la molécula bloqueadora se une específicamente al ligando, al cuerpo ligando o al cuerpo receptor. Para determinar si la molécula bloqueara puede neutralizar la actividad biológica del ligando, un experto en la técnica podría realizar un ensayo de fosforilación (véase Ejemplo 5) o, alternativamente, un bioensayo funcional, tal como un ensayo de supervivencia, utilizando cultivo primarios de, por ejemplo, células endoteliales. Alternativamente, una molécula bloqueadora que se une al cuerpo receptor podría ser un agonista y un experto en la técnica sabría cómo determinar esto realizando un ensayo apropiado para identificar agonistas adicionales del receptor de TIE.
El ligando 1 de TIE-2 contiene un dominio "doblemente arrollado" (comenzando en el extremo 5' y extendiéndose hasta el nucleótido en aproximadamente la posición 1160 de la Figura 4 y aproximadamente la posición 1157 de la Figura 5) y un dominio de tipo fibrinógeno (que está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Figura 4 que comienza en aproximadamente la posición 1161 y aproximadamente la posición 1158 de la Figura 5). El dominio de tipo fibrinógeno del ligando 2 de TIE-2 se cree que comienza en o alrededor de la misma secuencia de aminoácidos que en el ligando 1 (FRDCA) que es codificada por nucleótidos que comienzan alrededor de 1197 de la Figura 6. El dominio de tipo fibrinógeno del ligando 3 de TIE se cree que comienza en o alrededor de la secuencia de aminoácidos que es codificada por nucleótidos que comienzan alrededor de la posición 929 como se indica en la Figura 21.
La presente invención proporciona además el desarrollo del ligando, un fragmento o derivado del mismo, u otra molécula que sea un agonista o antagonista del receptor, como un agente terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos que implican células, tejidos u órganos que expresan el receptor de TIE. Tales moléculas pueden usarse en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal, o en un método de diagnosis.
Puesto que el receptor de TIE se ha identificado en asociación con células endoteliales y, como se demuestra aquí, el bloqueo del ligando 1 de TIE-2 parece prevenir la vascularización, los solicitantes esperan que un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí pueda ser útil para inducir la vascularización en enfermedades o trastornos en los que está indicada tal vascularización. Tales enfermedades o trastornos incluirían curación de heridas, isquemia y diabetes. Los ligandos pueden ensayarse en modelos de animales y usarse terapéuticamente como se describe para otros agentes, tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), otro factor específico para células endoteliales que es angiogénico. Ferrara et al., Patente de los EE.UU. Nº 5.332.671 expedida el 26 de Julio de 1994. La referencia de Ferrara, así como otros estudios, describen estudios in vitro e in vivo que pueden usarse para demostrar el efecto de un factor angiogénico para aumentar el flujo sanguíneo a miocardio isquémico, mejorar la curación de heridas y en otros marcos terapéuticos en los que se desea neoangiogénesis [véase Sudo et al., Solicitud de Patente Europea 0 550 296 A2, publicada el 7 de Julio de 1993; Banai et al. Circulation 89:2183-2189 (1994); Unger et al. Am. J. Physiol. 266:H1588-H1595 (1994); Lazarous et al. Circulation 91:145-153 (1995)]. Según la invención, un ligando de TIE-2 modificado puede usarse solo o en combinación con uno o más compuestos activos farmacéuticamente adicionales tales como, por ejemplo, VEGF o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), así como citoquinas, neurotrofinas, etc.
A la inversa, antagonistas del receptor de TIE, tales como ligandos de TIE-2 modificados que se unen pero no activan al receptor como se describe aquí, cuerpos receptores como se describe aquí en los Ejemplos 2 y 3, y ligando 2 de TIE-2 como se describe en el Ejemplo 9, serían útiles para prevenir o atenuar la vascularización, previniendo así o atenuando, por ejemplo, el crecimiento de tumores. Estos agentes pueden usarse solos o en combinación con otras composiciones, tales como anticuerpos anti-VEGF, que se han mostrado útiles para tratar condiciones en las que el intento terapéutico es bloquear angiogénesis. Los solicitantes esperan que un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí pueda usarse también en combinación con agentes, tales como antagonistas de citoquina tales como antagonistas de IL-6, que se sabe que bloquean la inflamación.
Por ejemplo, los solicitantes han determinado que ligandos de TIE se expresan en células dentro de, o estrechamente asociados con, tumores. Por ejemplo, el ligando 2 de TIE-2 parece estar estrechamente asociado con células endoteliales de tumores. Por consiguiente, él y otros antagonistas de TIE pueden ser útiles también para prevenir o atenuar, por ejemplo, crecimiento de tumores. Además, pueden ser útiles ligandos o cuerpos ligandos de TIE para la entrega de toxinas a una célula que lleva receptor. Alternativamente, pueden entregarse a una célula que lleva receptor de TIE otras moléculas tales como factores de crecimiento, citoquinas o nutrientes, mediante ligandos o cuerpos ligandos de TIE. Los ligandos o cuerpos ligandos de TIE tales como ligando de TIE-2 modificado descrito aquí, pueden usarse también como reactivos de diagnóstico para receptor de TIE, para detectar al receptor in vivo o in vitro. Cuando el receptor de TIE está asociado con un estado de enfermedad, ligandos o cuerpos ligandos de TIE tales como ligando de TIE-2 modificado pueden ser útiles como reactivos de diagnóstico para detectar la enfermedad mediante, por ejemplo, coloración de tejidos o formación de imagen de cuerpo completo. Tales reactivos incluyen radioisótopos, fluorocromos, colorantes, enzimas y biotina. Tales agentes de diagnóstico o de fijación de objetivo pueden prepararse como se describe en Alitalo et al., documento WO 95/26364, publicado el 5 de Octubre de 1995, y Burrows, F. Y P. Thorpe, PNAS (USA) 90:8996-9000 (1993), que se incorporan aquí en su integridad.
En otras realizaciones, los ligandos de TIE, un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí que activa receptor, se usan como factores hematopoyéticos. Una variedad de factores hematopoyéticos y sus receptores están implicados en la proliferación y/o diferenciación y/o migración de los diversos tipos de células contenidos dentro de la sangre. Puesto que los receptores de TIE se expresan en células hematopoyéticas tempranas, se espera que los ligandos de TIE jueguen un papel comparable en la proliferación o diferenciación o migración de estas células. Así, por ejemplo, composiciones que contienen TIE pueden prepararse, ensayarse, examinarse en sistemas biológicos in vitro e in vivo y usarse terapéuticamente como se describe en alguna de las siguientes referencias: Sousa, Patente de los EE.UU. Nº 4.810.643, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985), Wong et al., Science, 228:810-814 (1985); Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:1070 (1984); Bosselman et al., documento WO 9105795, publicado el 2 de Mayo de 1991 titulado "Stem Cell Factor" y Kirkness et al., documento WO 95/19985 publicado el 27 de Julio de 1995 titulado "Hematopoietic Maturation Factor". Por consiguiente, puede usarse ligando de TIE-2 modificado que activa receptor para diagnosticar o tratar condiciones en las que se suprime la hematopoyesis normal, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, anemia, trombocitopenia, leucopenia y granulocitopenia. En una realización preferida, el ligando de TIE-2 modificado que activa receptor puede usarse para estimular diferenciación de precursores de células sanguíneas en situaciones en las que un paciente tiene una enfermedad, tal como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que haya causado una reducción en los niveles de células sanguíneas normales, o en marcos clínicos en los que se desea el aumento de poblaciones hematopoyéticas, tal como conjuntamente con trasplante de médula ósea, o en el tratamiento de aplasia o mielosupresión causada por radiación, tratamiento químico o quimioterapia.
Los ligandos de TIE-2 modificado que activan receptor de la presente invención pueden usarse solos, o en combinación con otro agente activo farmacéuticamente tal como, por ejemplo, citoquinas, neurotrofinas, interleuquinas, etc. En una realización preferida, los ligandos pueden usarse conjuntamente con cualquiera entre un cierto número de los factores a que se ha hecho referencia antes, que se sabe que inducen proliferación de células cebada u otro precursor hematopoyético, o factores que actúan en células más tardías en la vía hematopoyética, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, factor de maduración hematopoyética, trombopoyetina, factor de células cebada, eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, etc.
En una realización alternativa, se usan antagonistas de receptor de TIE para diagnosticar o tratar pacientes en los que el resultado deseado es la inhibición de una vía hematopoyética, tal como para el tratamiento de trastornos mieloproliferativos u otros proliferativos de órganos formadores de sangre tales como trombocitemias, policitemias y leucemias. En tales realizaciones, el tratamiento puede comprender el uso de una cantidad eficaz terapéuticamente del ligando de TIE-2 modificado, anticuerpo de TIE o un conjugado de un ligando de TIE-2 modificado, como se describe aquí.
La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un ligando de TIE-2 modificado descrito aquí, en un vehículo aceptable famacológicamente, que pueden administrarse sistémicamente o localmente. Puede usarse cualquier modo apropiado de administración conocido en la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, intravenoso, intratecal, intraarterial, intranasal, oral, subcutáneo, intraperitoneal o por inyección local o implante quirúrgico. También se proporcionan formulaciones de liberación sostenida.
La presente invención proporciona también un anticuerpo que se une específicamente a tal molécula terapéutica. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La invención proporciona también un método de utilización de tal anticuerpo monoclonal o policlonal para medir la cantidad de la molécula terapéutica en una muestra tomada de un paciente con fines de vigilancia del transcurso de la terapia.
La invención proporciona además un método para purificar un ligando de TIE-2 modificado que comprende:
a)
acoplar al menos un sustrato de unión a TIE a una matriz sólida;
b)
incubar el sustrato de a) con un lisado de células de manera que el sustrato forme un complejo con cualquier ligando de TIE-2 modificado del lisado de células;
c)
lavar la matriz sólida; y
d)
eluir el ligando de TIE-2 modificado del sustrato acoplado.
El sustrato puede ser cualquier sustancia que se una específicamente al ligando de TIE-2 modificado. En una realización, el sustrato se selecciona del grupo constituido por anicuerpo anti-ligando de TIE-2 modificado, receptor de TIE y cuerpo receptor de TIE.
La invención proporciona también una composición terapéutica que comprende un ligando de TIE-2 modificado que activa receptor en un vehículo aceptable farmacéuticamente, que puede usarse para promover neovascularización en un paciente.
Además, la presente invención proporciona un método para identificar una célula que expresa receptor de TIE, que comprende poner en contacto una célula con un ligando de TIE-2 modificado marcado detectablemente en condiciones que permiten la unión del ligando marcado detectablemente al receptor de TIE y determinar si el ligando marcado detectablemente está unido al receptor de TIE, identificando por ello la célula como una que expresa el receptor de TIE. La presente invención proporciona también una composición terapéutica que comprende un ligando de TIE-2 modificado y un agente citotóxico conjugado a él. El agente citotóxico puede ser un radioisótopo o toxina.
La invención proporciona también un método para detectar la expresión de un ligando de TIE-2 modificado por una célula, que comprende obtener mARN de la célula, poner en contacto el mARN obtenido así con una molécula de ácido nucleico marcada que codifica un ligando de TIE-2 modificado, en condiciones de hibridación, determinar la presencia de mARN hibridado a la molécula marcada, y detectar por ello la expresión de un ligando de TIE-2 modificado en la célula.
La invención proporciona además un método para detectar la expresión de un ligando de TIE-2 modificado en secciones de tejido, que comprende poner en contacto las secciones de tejido con una molécula de ácido nucleico marcada que codifica un ligando de TIE-2 modificado, en condiciones de hibridación, determinar la presencia de mARN hibridado a la molécula marcada, y detectar por ello la expresión de un ligando de TIE-2 modificado en secciones de tejido.
Ejemplo 1 Identificación del linaje celular ABAE como células informadoras para el receptor de TIE-2
Están registradas células BAE adultas en el Depósito de Cultivos de Células Europeo, como ECACC#92010601. (Véase PNAS 75:2621 (1978)). Análisis de Northern (ARN) reveló niveles moderados de transcriptos de tie-2 en el linaje celular ABAE (endotelial arterial de bovino adulto), consistente con resultados de hibridación in situ que demostraron una localización casi exclusiva de ARNs de tie-2 a células endoteliales vasculares. Los inventores examinaron por tanto en lisados de células la presencia de proteína de TIE-2, así como la extensión en la que esta proteína de TIE-2 está fosforilada con tirosina en condiciones de crecimiento normales frente a privadas de suero. Se cosecharon lisados de células ABAE y se sometieron a inmunoprecipitación, seguida por análisis de manchas de Western de proteínas inmunoprecipitadas con antisueros específico para TIE-2 y específico para fosfotirosina. La omisión o inclusión de péptidos de TIE-2 como moléculas de bloqueo específicas durante la inmunoprecipitación de TIE-2 permitió una identificación inequívoca de TIE-2 como una proteína detectable moderadamente de \sim150 kD cuyos niveles de fosfotirosina en estado estable disminuyen hasta niveles casi indetectables mediante privación previa de suero de las células.
El cultivo de células ABAE y la cosecha de lisados de células se hizo como sigue. Se pusieron en placa células ABAE de número de paso bajo como una monocapa con una densidad de 2 x 10^{6} células/placa petri de plástico de 150 mm (Falcon) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero de becerro fetal (10% de BCS), L-glutamina 2 mM (Q) y 1% cada una de penicilina y estreptomicina (P-S) en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Antes de cosechar los lisados de células, las células se privaron de suero durante 24 horas en DMEM/Q/P-S, seguido por aspiración del medio y enjuague de las placas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo suplementada con ortovanadato sódico, fluoruro sódico y benzamidina sódica. Se lisaron las células en un pequeño volumen de este tampón de enjuague que se había suplementado con 1% de detergente NP40 y los inhibidores de proteasa PMSF y aprotinina. El residuo insoluble se separó de los lisados de células por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos, a 4ºC, y los sobrenadantes se sometieron a inmunoprecipitación con antisueros específicos para receptor de TIE-2, con o sin presencia de péptidos de bloqueo añadidos a razón de \sim20 \mug/ml de lisado. Las proteínas inmunoprecipitadas se resolvieron por PAGE (7,5% de gel de Laemmli) y se electrotransfirieron después a membrana PVDF y se incubaron con diversos antisueros específicos para TIE-2 o para fosfotirosina. La proteína de TIE-2 se visualizó por incubación de la membrana con antisueros secundarios enlazados a HRP seguida por tratamiento con reactivo ECL (Amersham).
Ejemplo 2 Clonación y expresión de cuerpo receptor de TIE-2 para estudio basado en afinidad de interacciones de ligando de TIE-2
Se creó una construcción de expresión que produciría una proteína segregada consistente en la porción extracelular completa del receptor de TIE-2 de rata fusionada a la región constante de inmunoglobulina gamma-1 (IgG1 Fc) humana. Esta proteína de fusión se denomina un "cuerpo receptor" (RB) de TIE-2, y se esperaría normalmente que existiera como un dímero en solución en base a la formación de enlaces disulfuro entre colas de IgG1 Fc individuales. La porción de Fc del RB de TIE-2 se preparó como sigue. Un fragmento de ADN que codifica la porción de Fc de IgG1 humana que se extiende desde la región de articulación hasta el término carboxi de la proteína, se multiplicó a partir de cADN de placenta humana por PCR con oligonucleótidos correspondientes a la secuencia publicada de IgG1 humana; el fragmento de ADN resultante se clonó en un vector plásmido. Se ligaron fragmentos de restricción de ADN apropiados de un plásmido que codifica el receptor de TIE-2 de longitud completa y del plásmido de IgG1 Fc humano en algún lado de un fragmento derivado de PCR corto que se diseñó para fusionar, en marco, las secuencias que codifican proteína de TIE-2 e IgG1 Fc humana. Así, la proteína de fusión de ectodominio de Tie-2-Fc resultante sustituyó con precisión la IgG1 Fc en lugar de la región que se extiende sobre los dominios transmembrana y citoplásmico de TIE-2. Un método alternativo para preparar RBs se describe en Goodwin et al. Cell 73:447-456 (1993).
Se obtuvieron cantidades de miligramos de RB de TIE-2 clonando el fragmento de ADN de RB de TIE-2 en el vector de baculovirus pVL1393 e infectando a continuación el linaje celular de insecto SF-21AE de Spodoptera frugiperda. Alternativamente, puede usarse el linaje celular SF-9 (Nº de Admisión ATCC CRL-1711) del linaje celular BTI-TN-5b1-4. El ADN que codifica el RB de TIE-2 se clonó como un fragmento de Eco RI-Notl en el plásmido de transferencia de baculovirus pVL1393. El ADN plásmido purificado por centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio se recombinó en ADN vírico mezclando 3 \mug de ADN plásmido con 0,5 \mug de ADN Baculo-Gold (Pharminigen), seguido por introducción en liposomas usando 30 \mug de Lipofectina (GIBCO-BRL). Se añadieron las mezclas ADN-liposomas a células SF-21AE (2 x 10^{6} células/placa de 60 mm) en medio TMN-FH (Medio de células de insecto de Grace modificado) (GIBCO-BRL) durante 5 horas a 27ºC, seguido por incubación a 27ºC durante 5 días en medio TMN-FH suplementado con 5% de suero de becerro fetal. Se cosechó el medio de cultivo de tejidos por purificación en placa de virus recombinantes, que se realizó usando métodos descritos previamente (O'Reilly, D.R., L.K. Miller y V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual, 1992, New York: W.H. Freeman) excepto que la capa superpuesta de agarosa contenía 125 \mug/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido; GIBCO-BRL). Después de 5 días de incubación a 27ºC, se registraron placas no recombinantes por reacción cromogénica positiva al sustrato de X-gal, y se marcaron sus posiciones. Se visualizaron después placas recombinantes por adición de una segunda capa superpuesta que contenía 100 \mug/ml de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; Sigma). Se escogieron placas de virus recombinantes putativos por aspiración de tapón, y se purificaron por ciclos múltiples de aislamiento de placas para asegurar la homogeneidad. Se generaron materiales de virus por paso de baja multiplicidad en serie de virus purificados en placas. Se produjeron materiales de paso bajo de un clon de virus (cuerpo receptor de vTIE-2).
Se cultivaron células SF-21AE en medio exento de suero (SF-900 II, Gibco BRL) que contenía solución 1X de antibiótico/antimicótico (Gibco BRL) y 25 mg/l de Gentamicina (Gibco BRL). Se añadió Pluronic F-68 como un tensioactivo hasta una concentración final de 1 g/l. Se criaron cultivos (4 l) en un biorreactor (Artisan Cell Station System) durante al menos tres días antes de la infección. Se desarrollaron células a 27ºC, con gasificación hasta el 50% de oxígeno disuelto, con un caudal de gas de 80 ml/min (aireación con un anillo rociador). La agitación fue mediante una rueda de paletas marina con una velocidad de 100 rpm. Las células se cosecharon en fase de crecimiento semilogarítmica (\sim2x 10^{6} células/ml), se concentraron por centrifugación y se infectaron con 5 unidades de formación de placas de cuerpo receptor de vTIE-2 por célula. Las células y el inóculo se llevaron a 400 ml con medio reciente y se absorbió el virus durante 2 horas a 27ºC en un matraz rotativo. Se resuspendió después el cultivo en un volumen final de 8 l con medio exento de suero reciente y se incubaron las células en el biorreactor usando las condiciones descritas previamente.
Se recogió medio de cultivo de células SF21AE infectadas con cuerpo receptor de vTIE-2 por centrifugación (500 x g, 10 minutos) a las 72 horas post-infección. Los sobrenadantes de células se llevaron a pH 8 con NaOH, se añadió EDTA hasta una concentración final de 10 mM y se reajustó el pH del sobrenadante en 8. Se filtraron los sobrenadantes (0,45 \mum, Millipore) y se cargaron en una columna de proteína A (flujo rápido de sepharose 4 de proteína A o proteína A de HiTrap, ambos de Pharmacia). La columna se lavó con PBS que contenía NaCl 0,5 M hasta disminuir la absorbancia a 280 nm a la línea de base. Se lavó la columna en PBS y se eluyó con ácido acético 0,5 M. Las fracciones de la columna se neutralizaron inmediatamente eluyendo en tubos que contenían Tris 1 M pH 9. Las fracciones de pico que contenían el cuerpo receptor de TIE-2 se agruparon y dializaron frente a PBS.
Ejemplo 3 Demostración de que TIE-2 tiene un papel crítico en el desarrollo de la vasculatura
Se consiguió una idea de la función de TIE-2 por introducción de cuerpo receptor de TIE-2 (TIE-2 RB) soluble "en exceso" en un sistema en desarrollo. La capacidad potencial de TIE-2 RB para unirse a, y neutralizar por ello, ligando de TIE-2 disponible podría producir una ruptura observable de desarrollo vascular normal y caracterización del ligando. Para examinar si podía usarse TIE-2 RB para romper el desarrollo vascular en embriones de pollo tempranos, se empaparon pequeñas piezas de una espuma reasorbible biológicamente con TIE-2 RB y se insertaron inmediatamente debajo de la membrana corioalantoica en posiciones inmediatamente laterales al embrión primitivo.
Se desarrollan embriones de pollo tempranos encima de la yema desde un pequeño disco de células que está cubierto por la membrana corioalantoica (CAM). Las células endoteliales que llegan a revestir la vasculatura en el embrión proceden de fuentes celulares extra e intraembriónicas. Las células endoteliales derivadas extraembriónicamente, que proceden en su origen principal de células endoteliales del embrión, se originan de acreciones de mesénquima que están situadas lateralmente alrededor del propio embrión, justo debajo de la CAM. A medida que maduran estas células de mesénquima, dan lugar a un progenitor común de linajes celulares endotelial y hematopoyético, denominado el hemangioblasto. A su vez, el hemangioblasto da lugar a una población mezclada de angioblastos (el progenitor de células endoteliales) y hematoblastos (el precursor hematopoyético pluripotencial). La formación de rudimentos del sistema circulatorio comienza cuando la progenie de células endoteliales se segrega para formar una vesícula del espesor de una célula que rodea a las células sanguíneas primitivas. La proliferación y migración de estos componentes celulares produce eventualmente una vasta red de microvasos llenos de sangre bajo la CAM que invaden finalmente el embrión para unirse con elementos vasculares derivados intraembriónicamente limitados.
Se incubaron a 37,5ºC y 55% de humedad relativa huevos de pollo recién fertilizados obtenidos de Spafas, Inc. (Boston, MA). Con aproximadamente 24 h de desarrollo, se limpió la cáscara del huevo con etanol del 70% y se usó un taladro de dentista para hacer un agujero de 1,5 cm en la punta obtusa de cada huevo. Se separó la membrana de la cáscara para revelar un espacio de aire directamente encima del embrión. Se cortaron con un escalpelo pequeñas piezas rectangulares de Gelfoan estéril (Upjohn) y se empaparon en concentraciones iguales de cuerpo receptor de TIE-2 o EHK-1. Se hizo cuerpo receptor de EHK-1 como se indica en el Ejemplo 2 usando el dominio extracelular de EHK-1 en lugar del dominio extracelular de TIE-2 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993). Cada pieza de Gelfoam absorbió aproximadamente 6 \mug de proteína en 30 \mul. Se usaron fórceps de relojeros estériles para hacer una pequeña rasgadura en la CAM en una posición varios milímetros lateral al embrión primitivo. La mayoría de la pieza de Gelfoam empapada en RB se insertó bajo la CAM y se cerró sobre ella la cáscara del huevo con una pieza de cinta adhesiva. Se trataron otros huevos organizados de manera similar en paralelo con RB de la tirosina quinasa de receptor expresada neuronalmente, no relacionada, EHK-1 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993). Se dejó transcurrir el desarrollo durante 4 días y se examinaron después los embriones por inspección visual. Se separaron los embriones rompiendo cuidadosamente las cáscaras en placas de PBS calentado y separando cuidadosamente el embrión con CAM circundante. De 12 huevos tratados con cada RB, 6 embriones tratados con TIE-2 RB y 5 con EHK-1 RB se habían desarrollado más allá de la fase observada al comienzo del experimento. Se vio una diferencia drástica entre estos embriones desarrollados, como se muestra en las Figuras 1A y 1B. Los tratados con EHK-1 RB parecían haberse desarrollado de manera relativamente normal. Cuatro de los cinco embriones de EHK-1 eran viables según se juzgó por la presencia de un corazón latiendo. Además, la vasculatura extraembriónica, que es obvia visualmente debido a la presencia de glóbulos rojos, era profusa y se extendía varios centímetros lateralmente baja la CAM. Como contraste, los tratados con TIE-2 RB estaban gravemente mal desarrollados, variando entre 2 y 5 mm de diámetro, en comparación con más de 10 mm de diámetro para los embriones de EHK-1 RB. Todos los embriones tratados con TIE-2 RB murieron y sus CAMs estaban desprovistas de vasos sanguíneos. La capacidad de TIE-2 RB para bloquear el desarrollo vascular en el pollo demuestra que es necesario el ligando de TIE-2 para el desarrollo de la vasculatura.
Ejemplo 4 Identificación de una actividad de unión específica para TIE-2 en medio acondicionado del linaje celular de mioblastos de ratón C2C12 transformado con el oncogen ras
El examen en medios acondicionados para células concentrados diez veces (10X CCM) de diversos linajes celulares de la presencia de actividad de unión específica para TIE-2 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) reveló actividad de unión en medio exento de suero de células C2C12 transformadas con ras oncogénico (C2C12-ras), RAT 2-ras (que es un linaje celular de fibroblastos transformados con ras), T98G de glioblastoma humano y el linaje celular de neuroblastoma humano conocido como SHEP-1.
El C2C12-ras 10X CCM se originó de un linaje transfectado establemente de mioblastos C2C12 que se transformó oncogénicamente por transfección con el mutante T-24 de H-ras por métodos basados en fosfato cálcico estándares. Se enlazó físicamente un plásmido de expresión con resistencia a neomicina basado en SV40 con el plásmido de expresión de ras con el fin de permitir la selección de clones transfectados. Las células ras-C2C12 resistentes a G418 resultantes se mantuvieron rutinariamente como una monocapa en placas de plástico en DMEM/glutamina/penicilina-estreptomicina suplementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS). Se hizo C2C12-ras 10X CCM exento de suero poniendo en placa las células con 60% de confluencia en un medio definido exento de suero durante 12 horas. [Zhan y Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6:3541-3544 (1986)); Zhan et al. Oncogene 1:369-376 (1987)]. Se desechó el medio y se sustituyó por DMEM/Q/P-S reciente durante 24 horas. Se cosechó este medio y se realimentaron las células con DMEM/Q/P-S reciente, que se cosechó también después de 24 horas más. Estos CCM se suplementaron con los inhibidores de proteasa PMSF (1 mM) y aprotinina (10 \mug/ml), y se concentraron diez veces en membranas de exclusión por tamaño estériles (Amicon). La actividad de unión de TIE-2 podía neutralizarse por incubación del medio con un exceso de TIE-2 RB, pero no por incubación con EHK-1 RB, antes del análisis de BIAcore.
Se midió la actividad de unión del 10X CCM usando tecnología de biosensor (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) que vigila interacciones moleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón superficial. Se acopló covalentemente TIE-2 RB purificado a través de aminas primarias a la capa de carboximetildextrano de un chip sensor de calidad investigación CM5 (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). La superficie del chip sensor se activó usando una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), seguido por inmovilización de TIE-2 RB (25 \mug/ml, pH 4,5) y desactivación de lugares no reaccionados con etanolamina 1,0 M (pH 8,5). Se preparó de manera similar una superficie de testigo negativo del cuerpo receptor de EHK-1.
El tampón de funcionamiento usado en el sistema fue HBS (Hepes 10 mM, EDTA 3,4 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de Tensioactivo P2O, pH 7,4). Las muestras de 10X CCM se centrifugaron durante 15 min a 4ºC y se clarificaron adicionalmente usando un filtro de 0,45 \mum de unión a proteína baja, estéril (Millipore; Bedford, MA). Se añadieron a cada muestra de CCM dextrano (2 mg/ml) y tensioactivo P2O (0,005%). Se inyectaron a través de la superficie inmovilizada partes alícuotas de 40 \mul (TIE-2 o EHK-1) con un caudal de 5 \mul/min y se vigiló la unión del receptor durante 8 min. La actividad de unión (unidades de resonancia, UR) se midió como la diferencia entre un valor de línea de base determinado 30 s antes de la inyección de la muestra y una medición tomada a los 30 s post-inyección. La regeneración de la superficie se consiguió con una impulsión de 12 \mul de MgCl_{2} 3 M.
El nivel de ruido del instrumento es 20 UR; por tanto, cualquier actividad de unión con una señal por encima de 20 UR puede interpretarse como una interacción real con el receptor. Para medios acondicionados con C2C12-ras, las actividades de unión estuvieron en el intervalo de 60-90 UR para la superficie inmovilizada con TIE-2 RB. Para las muestras ensayadas en una superficie inmovilizada con EHK-1 RB, las actividades medidas fueron menos de 35 UR. Se evaluó la unión específica al cuerpo receptor de TIE-2 incubando las muestras con un exceso de TIE-2 o EHK-1 RB soluble antes de ensayar la actividad de unión. La adición de EHK-1 RB soluble no tuvo efecto en la actividad de unión de TIE-2 de ninguna de las muestras, mientras que en presencia de TIE-2 soluble la unión a la superficie es dos tercios menos que la medida en ausencia de TIE-2. Un ensayo de repetición usando C2C12-ras CCM concentrado >50x produjo un aumento de cuatro veces sobre el fondo de la señal de unión específica de TIE-2.
Ejemplo 5 C2C12-ras CCM contiene una actividad que induce fosforilación con tirosina de receptor de TIE-2
Se examinó la capacidad de C2C12-ras 10X CCM para inducir fosforilación con tirosina de TIE-2 en células ABAE. Se incubaron brevemente células ABAE privadas de suero con C2C12-ras CCM, se lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación y análisis de Western como se ha descrito antes. La estimulación de células ABAE privadas de suero con C2C12-ras 10X CCM exento de suero se hizo como sigue. El medio de células ABAE privadas como se ha descrito antes se retiró y sustituyó con medio definido o con 10X CCM que se había precalentado a 37ºC. Después de 10 minutos, se separaron los medios y las células se enjuagaron dos veces en hielo con un exceso de PBS enfriado suplementado con ortovanadato/NaF/benzamidina. La lisis de células e inmunoprecipitación específica para TIE-2 se hizo como se ha descrito antes.
Las células ABAE incubadas durante 10 minutos con medio definido no mostraron inducción de fosforilación con tirosina de TIE-2, mientras que la incubación con C2C12-ras CCM estimuló al menos un aumento de 100X en la fosforilación de TIE-2. Esta actividad se agotó casi totalmente por preincubación del C2C12-ras 10X CCM durante 90 minutos a temperatura ambiente con 13 \mug de TIE-2 RB acoplado a perlas de G-Sepharose de proteína. El medio incubado con G Sepharose de proteína sola no estaba agotado de esta actividad fosforilante.
Ejemplo 6 Clonación de expresión de ligando de TIE-2
Se cultivaron células COS-7 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero de bovino fetal (FBS), 1% cada una de penicilina y estreptomicina (P/S) y glutamina 2 mM en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Se cultivó el linaje celular C2C12 ras de mioblasto de ratón en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con 10% de FBS, (P/S) y glutamina 2 mM. Se obtuvieron clones de cADN de ligando de TIE-2 de ratón de longitud completa examinando una genoteca de cADN de C2C12 ras en el vector pJFE14 expresado en células COS. Este vector, como se muestra en la Figura 2, es una versión modificada del vector pSR_{\alpha} (Takebe et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472). La genoteca se creó usando los dos lugares de restricción de BSTX1 en el vector pJFE14.
Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con la genoteca de pJFE14 o con vector testigo por el método de transfección con DEAE-dextrano. Brevemente, se pusieron en placa células COS-7 con una densidad de 1,0 x 10^{6} células/placa de 100 mm 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se cultivaron las células en DMEM exento de suero que contenía 400 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 1 \muM y glutamina 2 mM, y 1 \mug del ADN apropiado durante 3-4 horas a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Los medios de transfección se aspiraron y sustituyeron por PBS con 10% de DMSO durante 2-3 min. Tras este "choque" con DMSO, se pusieron las células COS-7 en DMEM con 10% de FBS, 1% cada una de penicilina y estreptomicina, y glutamina 2 mM durante 48 horas.
Puesto que el ligando de TIE-2 se segrega, era necesario permeabilizar las células para detectar la unión de la sonda de cuerpo receptor al ligando. Dos días después de la transfección, se enjuagaron las células con PBS y se incubaron después con PBS que contenía 1,8% de formaldehído durante 15-30 min a temperatura ambiente. Se lavaron después las células con PBS y se incubaron durante 15 min con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 y 10% de Suero de Becerro Fetal para permeabilizar las células y bloquear lugares de unión no específicos.
El examen se realizó por localización directa de coloración usando un cuerpo receptor (RB) de TIE-2, que consistía en el dominio extracelular de TIE-2 fusionado a la región constante de IgG1. Este cuerpo receptor se preparó como se indica en el Ejemplo 2. Se sondó una placa de 100 mm de células COS transfectadas, fijadas y permeabilizadas incubándolas durante 30 min con TIE-2 RB. Se lavaron después las células dos veces con PBS y se incubaron durante 30 min más con PBS/10% de Suero de Becerro Fetal/conjugado de IgG anti-humana-fosfatasa alcalina. Después de tres lavados con PBS, se incubaron las células en sustrato de fosfatasa alcalina durante 30-60 min. Se inspeccionó después en la placa microscópicamente la presencia de células coloreadas. Para cada célula coloreada, se desechó de la placa una pequeña área de células incluyendo la célula coloreada usando una punta de pipeta de plástico y se salvó después ADN plásmido y usó para electroporar células bacterianas. Se escogieron colonias bacterianas simples resultantes de la electroporación y se usó ADN plásmido preparado a partir de estas colonias para transfectar células COS-7 en las que se sondó la expresión de ligando de TIE-2 como se evidencia por la unión a cuerpos receptores de TIE-2. Esto permitió la identificación de clones simples que codifican ligando de TIE-2. La confirmación de la expresión de ligando de TIE-2 se obtuvo por fosforilación del receptor de TIE-2 usando el método indicado en el Ejemplo 5. Un clon plásmido que codifica el ligando de TIE-2 se depositó en la ATCC el 7 de Octubre de 1994 y se denominó "pJFE14 que codifica ligando de TIE-2" con el Nº de Admisión ATCC 75910.
Ejemplo 7 Aislamiento y determinación de la secuencia de clon de cADN de longitud completa que codifica ligando de TIE-2 humano
Se obtuvo una genoteca de cADN de pulmón fetal humano en lambda gt-10 (véase Figura 3) de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Se pusieron en placas con una densidad de 1,25 x 10^{6}/placa de 20 x 20 cm, y se tomaron filtros réplicas siguiendo procedimientos estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
El aislamiento de clones de ligandos de tie-2 humano se realizó como sigue. Un fragmento de XhoI de 2,2 kb del clon de ligando de tie-2 depositado (ATCC Nº 75910 - véase el anterior Ejemplo 6) se marcó por cebado aleatorio hasta una actividad específica de aproximadamente 5 x 10^{8} cpm/ng. La hibridación se realizó a 65ºC en solución de hibridación que contenía 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Los filtros se lavaron a 65ºC en 2 x SSC, 0,1% de SDS y se expusieron a película Kodak XAR-5 durante la noche a -70ºC. Los fagos positivos se purificaron en placa. Se usaron lisados de fagos de título elevado de fago puro para aislamiento de ADN mediante una columna Qiagen usando técnicas estándares (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, catálogo de 1995, página 36). El ADN de fago se digirió con EcoRI para liberar el fragmento de cADN clonado para subclonación siguiente. Un vector de fago lambda que contenía ADN de ligando de tie-2 humano se depositó en la ATCC el 26 de Octubre de 1994 con la designación \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2 (Nº de Admisión ATCC 75928). El ADN del fago puede someterse directamente a análisis de secuencia de ADN por el método de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467).
La subclonación del ADN de ligando de tie-2 humano en un vector de expresión de mamífero puede conseguirse como sigue. El clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2 contiene un lugar de EcoRI situado 490 pares de bases aguas abajo del comienzo de la secuencia de codificación para el ligando de TIE-2 humano. La región de codificación puede excindirse usando lugares de restricción únicos aguas arriba y aguas abajo de los codones iniciador y de detención respectivamente. Por ejemplo, pueden usarse un lugar de SpeI, situado 70 pb 5' hacia el codón iniciador, y un lugar de Bpu1102i (también conocido como Blpl), situado 265 pb 3' hacia el codón de detención, para excindir la región de codificación completa. Ésta puede subclonarse después en el vector de clonación pJFE14, usando los lugares de XbaI (compatible con el saliente de SpeI) y de PstI (los lugares de PstI y Bpu1102i se hicieron ambos de extremos romos).
Se determinó la secuencia de la región de codificación del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2 usando el determinador de secuencias de ADN ABI 373A y el Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida de ligando de TIE-2 humano del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2 se muestra en la Figura 4.
Además, se obtuvieron clones de cADN de ligando de tie-2 humano de longitud completa examinando una genoteca de cADN de glioblastoma humano T98G en el vector pJFE14. Se identificaron clones que codifican ligando de TIE-2 humano por hibridación de ADN usando un fragmento de XhoI de 2,2 kb del clon de ligando de tie-2 depositado (ATCC Nº 75910) como sonda (véase anterior Ejemplo 6). Se determinó la secuencia de la región de codificación usando el determinador de secuencias de ADN ABI 373A y el Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Esta secuencia era casi idéntica a la del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2. Como se muestra en la Figura 4, el clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2 contiene un residuo de glicina adicional que es codificado por los nucleótidos 1114-1116. La secuencia de codificación del clon de T98G no contiene este residuo de glicina pero es idéntica por lo demás a la secuencia de codificación del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2. La Figura 5 indica la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida de ligando de TIE-2 humano del clon de T98G.
Ejemplo 8 Aislamiento y determinación de la secuencia de un segundo clon de cADN de longitud completa que codifica ligando de TIE-2 humano
Se obtuvo una genoteca de cADN de pulmón fetal humano en lambda gt-10 (véase Figura 3) de ClonTech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Se pusieron en placas con una densidad de 1,25 x 10^{6}/placa de 20 x 20 cm, y se tomaron filtros réplicas siguiendo procedimientos estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Se examinaron filtros duplicados con baja rigurosidad (2 x SSC, 55ºC) con sondas fabricadas para la secuencia de ligando 1 de TIE-2 humano. Uno de los filtros duplicados se sondó con una sonda 5', que codifica los aminoácidos 25-265 de ligando 1 de TIE-2 humano como se indica en la Figura 4. El segundo filtro duplicado se sondó con una sonda 3', que codifica los aminoácidos 282-498 de secuencia de ligando 1 de TIE-2 humano (véase Figura 4). Ambas sondas se hibridaron a 55ºC en solución de hibridación que contenía 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Los filtros se lavaron en 2 x SSC a 55ºC, y se expusieron durante la noche a película de rayos X. Además, se hibridaron también filtros duplicados con rigurosidad normal (2 x SSC, 65ºC) a la sonda de codificación de longitud completa de ligando 1 de TIE-2 de ratón (F3-15, inserto de XhoI). Se escogieron tres clones positivos que cumplían los siguientes criterios: i. no se había visto hibridación a la sonda de longitud completa (ratón) con rigurosidad normal, y ii. la hibridación se vio con baja rigurosidad a las sondas 5' y 3'. La digestión con EcoRI de ADN fago obtenido de estos clones indicó dos clones independientes con tamaños de insertos de aproximadamente 2,2 kb y aproximadamente 1,8 kb. El inserto de EcoRI de 2,2 kb se subclonó en los lugares de EcoRI de pBluescript KS (Stratagene) y de un vector de expresión de mamífero adecuado para su uso en células COS. Se identificaron dos orientaciones para el vector de expresión de mamífero. El inserto de 2,2 kb en pBluescript KS se depositó en la ATCC el 9 de Diciembre de 1994 y se denominó pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE 2 humano. El lugar de comienzo de la secuencia de codificación de ligando 2 de TIE-2 está aproximadamente 355 pares de bases aguas abajo del lugar de EcoRI de pBluescript.
Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con el vector de expresión o con vector testigo por el método de transfección con DEAE-dextrano. Brevemente, se pusieron en placa células COS-7 con una densidad de 1,0 x 10^{6} células/placa de 100 mm 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se cultivaron las células en DMEM exento de suero que contenía 400 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 1 \muM y glutamina 2 mM, y 1 \mug del ADN apropiado durante 3-4 horas a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Los medios de transfección se aspiraron y sustituyeron por solución salina tamponada con fosfato con 10% de DMSO durante 2-3 min. Tras este "choque" con DMSO, se pusieron las células COS-7 en DMEM con 10% de FBS, 1% cada una de penicilina y estreptomicina, y glutamina 2 mM durante 48 horas.
Puesto que el ligando de TIE-2 se segrega, era necesario permeabilizar las células para detectar la unión de la sonda de cuerpo receptor al ligando. Las células COS-7 transfectadas se pusieron en placa con una densidad de 1,0 x 10^{6} células/placa de 100 mm. Se enjuagaron las células con PBS y se incubaron después con PBS que contenía 1,8% de formaldehído durante 15-30 min a temperatura ambiente. Se lavaron después las células con PBS y se incubaron durante 15 min con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 y 10% de Suero de Becerro Fetal para permeabilizar las células y bloquear lugares de unión no específicos. El examen se realizó por localización directa de coloración usando un cuerpo receptor de TIE-2, que consistía en el dominio extracelular de TIE-2 fusionado a la región constante de IgG1. Este cuerpo receptor se preparó como se indica en el Ejemplo 2. Las células COS transfectadas se sondaron incubándolas durante 30 min con cuerpo receptor de TIE-2. Se lavaron después las células dos veces con PBS, se fijaron con metanol y se incubaron después durante 30 min más con PBS/10% de Suero de Becerro Fetal/conjugado de IgG anti-humana-fosfatasa alcalina. Después de tres lavados con PBS, se incubaron las células en sustrato de fosfatasa alcalina durante 30-60 min. Se inspeccionó después en la placa microscópicamente la presencia de células coloreadas. Se vio que las células que expresan una orientación del clon, pero no la otra orientación, se unen al cuerpo receptor de TIE-2.
Un experto en la técnica verá fácilmente que pueden usarse los métodos descritos para identificar adicionalmente otros miembros relacionados de la familia de ligandos de TIE.
Se determinó la secuencia de la región de codificación del clon pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE-2 humano usando el determinador de secuencia de ADN ABI 373A y el Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos deducida de ligando de TIE-2 humano del clon pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE-2 humano se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 9 El ligando 2 de TIE-2 es un antagonista de receptor
Se comparó la capacidad de medios acondicionados de células COS que expresan ligando 2 de TIE-2 (TL2) o ligando 1 de TIE-2 (TL1) para activar receptores de TIE-2 presentes naturalmente en linajes celulares endoteliales humanos.
Se usaron reactivo lipofectamina (GIBCO-BRL, Inc.) y métodos recomendados para transfectar células COS-7 con el vector de expresión pJFE14 solo, vector pJFE14 que contenía el cADN de ligando 1 de TIE-2 humano, o con un vector de expresión pMT21 (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693) que contenía el cADN de ligando 2 de TIE-2 humano. Se cosecharon los medios de COS que contenían ligandos segregados después de tres días y se concentraron 20 veces por diafiltración (membranas de ultrafiltración DIAFLO, Amicon, Inc.). Se determinó la cantidad de ligando 1 de TIE-2 y ligando 2 de TIE-2 activos presentes en estos medios y se expresó como la cantidad (en unidades de resonancia, UR) de actividad de unión específica de receptor de TIE-2 medida por un ensayo de unión BIAcore.
Los análisis de Northern (ARN) revelaron niveles significativos de transcriptos de TIE-2 en células endoteliales primarias humanas HAEC (célula endotelial aórtica humana) (Clonetics, Inc.). Por tanto, se usaron estas células para examinar si el receptor de TIE-2 está fosforilado con tirosina cuando se expone a medios de COS que contienen los ligandos de TIE-2. Las células HAEC se mantuvieron en un medio de crecimiento de células endoteliales completo (Clonetics, Inc.) que contenía 5% de suero bovino fetal, extracto de cerebro de bovino soluble, 10 ng/ml de EGF humano, 1 mg/ml de hidrocortisona, 50 mg/ml de gentamicina y 50 ng/ml de anfotericina-B. La valoración de si TL1 y TL2 podían activar receptor de TIE-2 en las células HAEC se hizo como sigue. Se privaron de suero células HAEC semiconfluentes durante dos horas en MEM de Dulbecco con alto contenido de glucosa y L-glutamina y penicilina-estreptomicina añadidas a 37ºC, seguido por sustitución del medio de privación con medios de COS acondicionados que contenían ligando durante 7 minutos a 37ºC en un incubador con 5% de CO_{2}. Las células se lisaron a continuación y se recuperó proteína de receptor de TIE-2 por inmunoprecipitación de los lisados con antisuero de péptido de TIE-2, seguido por manchas de Western con antisuero antifosfotirosina, exactamente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 7. Se indujeron los niveles de fosfotirosina en el receptor de TIE-2 (TIE-2-R) por tratamiento de células HEAC con medios de COS acondicionados de ligando 1 de TIE-2 (Pista L1) pero no por ligando 2 de TIE-2 (Pista 2). MOCK es medios acondicionados de COS transfectadas con vector vacío JFE14.
Se demostró la evidencia de que TL1 y TL2 se unen específicamente al receptor de TIE-2 usando un BIAcore para ensayar las actividades de unión específica de receptor de TIE-2 en medios de COS transfectadas y por inmunocoloración de células COS que expresan TL1 y TL2 con cuerpos receptores de TIE-2.
Puesto que TL2 no activaba al receptor de TIE-2, los solicitantes dispusieron determinar si TL2 podía ser capaz de servir como antagonista de la actividad de TL1. Se realizaron ensayos de fosforilación de HAEC en los que se incubaron primero células con un "exceso" de TL2, seguido por adición de TL1 diluido. Se razonó que la ocupación previa de receptor de TIE-2 debida a altos niveles de TL2 podía impedir la estimulación subsiguiente del receptor tras la exposición a TL1 presente en una concentración limitante.
Se privaron de suero células HAEC semiconfluentes como se ha descrito antes y se incubaron después durante 3 min a 37ºC con 1-2 ml de medio acondicionado de 20X COS/JFE14-TL2. Se trataron placas testigo con medio 20X COS/JFE14 sólo (MOCK). Se separaron las placas del incubador y se añadieron después diversas diluciones de medio COS/JFE14-TL1, seguido por incubación adicional de las placas durante 5-7 minutos a 37ºC. Las células se enjuagaron a continuación, se lisaron y se examinó la fosforilación con tirosina específica para TIE-2 en los lisados por inmunoprecipitación de receptor y manchas de Western, como se ha descrito antes. Se hicieron diluciones de TL1 usando medio 20X COS/JFE14-TL1 diluido a 2X, 0,5X, 0,1X o 0,02X por adición de medio 20X COS/JFE14 solo. Un ensayo de los medios de COS 20X TL1 y 20X TL2 iniciales usando tecnología de biosensor BIAcore indicó que contenían magnitudes similares de actividades de unión específicas para TIE-2, es decir, 445 UR y 511 UR para TL1 y TL2 respectivamente. Los resultados de la mancha de Western antifosfotirosina, mostrados en la Figura 8, indican que, cuando se comparan con tratamiento previo de células HAEC con medio MOCK (pista 1), el tratamiento previo de células HAEC con ligando 2 de TIE-2 en exceso (pista 2) antagoniza con la capacidad subsiguiente de ligando 1 de TIE-2 diluido para activar el receptor de TIE-2 (TIE-2-R).
Se demostró adicionalmente la capacidad de TL2 para inhibir competitivamente la activación de TL1 del TIE-2-R usando el linaje híbrido celular humano EA.hy926 (véase el Ejemplo 21 para tener una descripción detallada de este linaje celular y su mantenimiento). Se realizaron experimentos en los que medios de células COS no concentrados que contenían TL1 se mezclaron en diluciones variables con medios acondicionados con MOCK o TL2 y se pusieron en monocapas de células EA.hy926 privadas de suero durante 5 minutos a 37ºC. Se retiraron después los medios, se cosecharon las células por lisis y se examinó la fosforilación con tirosina específica para TIE-2 por manchas de Western, como se ha descrito antes. La Figura 9 muestra un experimento que contiene tres grupos de tratamientos, visto de izquierda a derecha. Como se muestra en las cuatro pistas de la izquierda, el tratamiento de las células EA.hy926 con 1x COS-TL1 solo activó fuertemente el TIE-2-R endógeno en estas células, mientras que el medio 1x TL2 COS era inactivo. Sin embargo, la mezcla de TL1 con MOCK o TL2 demostró que TL2 puede bloquear la actividad de TL1 de una manera dependiente de la dosis. En los tres pares centrales de pistas, se disminuyó la relación de TL2 (o MOCK) mientras que se aumentó en correspondencia la cantidad de TL1 en la mezcla de 0,1x a 0,3x. Con cualquiera de estas relaciones de mezcla, las pistas de TL1:TL2 mostraron un nivel reducido de fosforilación de TIE-2-R en comparación con el de las pistas de TL1:MOCK correspondientes. Cuando se mantuvo constante la cantidad de TL1 y se disminuyó la cantidad de TL2 (o MOCK), no obstante, (mostrado en los tres pares de pistas de la derecha), se alcanzó un punto en el que el TL2 de la mezcla era demasiado diluido para inhibir eficazmente la actividad de TL1. La cantidad relativa de cada ligando presente en estos medios de COS acondicionados podía estimarse a partir de sus unidades de unión medidas por el ensayo BIAcore y a partir de manchas de Western de los medios de COS con anticuerpos específicos para el ligando. En consecuencia, se puede inferir que sólo se requiere un exceso en moles de pocas veces de TL2 para bloquear eficazmente la actividad de TL1 in vitro. Esto es significativo, porque se han observado ejemplos distintos in vivo (véanse Ejemplo 17 y Figura 16) en los que mARNs de TL2 consiguen una abundancia considerable con relación a los de TL1. Así, puede hacerse servir a TL2 un papel fisiológico importante en señalar un bloqueo eficaz por el TIE-2-R en estos lugares.
Tomados conjuntamente estos datos confirman que, a diferencia de TL1, TL2 es incapaz de estimular TIE-2-R expresado endógenamente en células endoteliales. Además, con un exceso en moles de pocas veces TL2 puede bloquear la estimulación de TL1 del receptor de TIE-2, indicando que TL2 es un antagonista de receptor de TIE-2 de origen natural.
Ejemplo 10 Identificación de la actividad de unión específica para TIE-2 en medio acondicionado y sobrenadantes de células COS
La actividad de unión de 10x CCM de los linajes celulares C2C12-ras, Rat2 ras, SHEP y T98G, o sobrenadantes de células COS tras transfección con ligando 1 de TIE-2 humano (hTL1) o ligando 2 de TIE-2 humano (hTL2) se midió usando tecnología de biosensor (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) que vigila interacciones biomoleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Se acopló covalentemente TIE-2 RB de rata o humano purificado a través de aminas primarias a la capa de carboximetildextrano de un chip sensor de calidad investigación CM5 (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). La superficie del chip sensor se activó usando una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), seguido por inmovilización de TIE-2 RB (25 \mug/ml, pH 4,5) y desactivación de lugares no reaccionados con etanolamina 1,0 M (pH 8,5). En general, se acoplaron 9.000-10.000 UR de cada cuerpo receptor al chip sensor.
El tampón de funcionamiento usado en el sistema fue HBS (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de tensioactivo P2O, pH 7,4). Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 4ºC y se clarificaron adicionalmente usando un filtro de 0,45 \mum de unión a proteína baja, estéril (Millipore; Bedford, MA). Se añadieron a cada muestra dextrano (2 mg/ml) y tensioactivo P2O (0,005%). Se inyectaron a través de la superficie inmovilizada partes alícuotas de 40 \mul (TIE-2 de rata o humano) con un caudal de 5 \mul/min y se vigiló la unión del receptor durante 8 min. La actividad de unión (unidades de resonancia, UR) se midió como la diferencia entre un valor de línea de base determinado 30 s antes de la inyección de la muestra y una medición tomada a los 30 s post-inyección. La regeneración de la superficie se consiguió con una impulsión de 15 \mul de MgCl_{2} 3 M.
Las muestras de CCM (C2C12-ras, Rat2 ras, SHEP, T98G) se ensayaron en la superficie inmovilizada de TIE-2 RB de rata, mientras que el hTL1 y hTL2 recombinantes se ensayaron en la superficie inmovilizada de TIE-2 RB humano. En cada caso, se evaluó la unión específica al cuerpo receptor de TIE-2 incubando las muestras con 25 \mug/ml de TIE-2 soluble (rata o ser humano) RB o trkB RB antes de ensayar la actividad de unión. Como se muestra en las Figuras 10 y 11, la adición de trkB RB soluble causa una ligera disminución de la actividad de unión de TIE-2, mientras que la adición de TIE-2 RB soluble reduce significativamente la actividad de unión en comparación con la medida en ausencia de TIE-2 RB.
Ejemplo 11 TIE-2 RB bloquea específicamente la activación del receptor de TIE-2 por ligando 1 de TIE-2
Los solicitantes buscaron determinar si puede servir TIE-2 RB soluble como inhibidor competitivo para bloquear la activación de receptor de TIE-2 por ligando 1 de TIE-2 (TL1). Para hacer esto, medios de COS que contenían TL1 se preincubaron con TIE-2- o TrkB-RB y se comparó después su capacidad para activar receptores de TIE-2 presentes naturalmente en un linaje celular endotelial humano.
Se generaron medios de COS acondicionados a partir de células COS-7 transfectadas con el vector de expresión pJFE14 solo (MOCK) o vector pJFE14 que contenía el cADN de ligando 1 de TIE-2 humano (TL1) y se cosecharon como se describe en el anterior Ejemplo 9, con la excepción de que los medios eran filtrados estériles pero no concentrados. La cantidad de TL1 se determinó y expresó como la magnitud (en unidades de resonancia, UR) de actividad de unión específica para receptor de TIE-2 medida por ensayo de unión BIAcore.
Los análisis de Northern (ARN) revelaron niveles significativos de transcriptos de tie-2 en células endoteliales primarias humanas HUVEC (célula endotelial de la vena umbilical humana) (Clonetics, Inc.). Por tanto, se usaron estas células para examinar si puede fosforilarse con tirosina receptor de TIE-2 cuando se expone en presencia de TIE-2- o TrkB-BRs a medios de COS que contienen TL1. Se mantuvieron células HUVEC a 37ºC y 5% de CO_{2} en un medio de crecimiento de células endoteliales completo (Clonetics, Inc.) que contenía 5% de suero de bovino fetal, extracto de cerebro de bovino soluble con 10 \mug/ml de heparina, 10 ng/ml de EGF humano, 1 \mug/ml de hidrocortisona, 50 \mug/ml de gentamicina y 50 ng/ml de anfotericina-B. La valoración de si TL1 podía activar receptor de TIE-2 en las células HUVEC se hizo como sigue. Se privaron de suero placas confluentes de células HUVEC durante dos a cuatro horas en MEM de Dulbecco con bajo contenido de glucosa a 37ºC y 5% de CO_{2}, seguido por incubación de 10 minutos en medio de privación que incluía ortovanadato sódico 0,1 mM, un potente inhibidor de fosfotirosina fosfatasas. Entre tanto, se preincubaron medios de COS acondicionados 30 min a temperatura ambiente con TIE- 2- o TrkB-RB añadido hasta 50 \mug/ml. Se separó después el medio de privación de las placas de HUVEC y se incubaron con los medios de COS que contenían RB durante 7 minutos a 37ºC. Se lisaron a continuación células HUVEC y se recuperó proteína de receptor de TIE-2 por inmunoprecipitación con antisuero de péptido de TIE-2, seguida por manchas de Western con un anticuerpo anti-fosfotirosina, como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 12. Se indujeron niveles de fosfotirosina en el receptor de TIE-2 por tratamiento de células HUVEC con ligando 1 de TIE-2 (TL1) con relación a los vistos con medio testigo (MOCK) y esta inducción se bloquea específicamente por incubación previa con TIE-2-RB (TIE-2-Fc) pero no por incubación con TrkB-RB (TrkB-Fc). Estos datos indican que TIE-2 RB soluble puede servir como inhibidor selectivo para bloquear la activación de receptor de TIE-2 por ligando 1 de TIE-2.
Ejemplo 12 Construcción de cuerpos ligandos de TIE-2
Se creó una construcción de expresión que produciría una proteína segregada consistente en la secuencia de codificación completa de ligando 1 de TIE-2 (TL1) o ligando 2 de TIE-2 (TL2) humanos fusionada a la región constante de inmunoglobulina gamma-1 (IgG1 Fc) humana. Estas proteínas de fusión se denominan "cuerpos ligandos" de TIE-2 (TL1-Fc o TL2-Fc). La porción de Fc de TL1-Fc y TL2-Fc se preparó como sigue. Un fragmento de ADN que codifica la porción de Fc de IgG1 humana que se extiende desde la región de articulación hasta el término carboxi de la proteína, se multiplicó a partir de cADN de placenta humana por PCR con oligonucleótidos correspondientes a la secuencia publicada de IgG1 humana; el fragmento de ADN resultante se clonó en un vector plásmido. Se ligaron fragmentos de restricción de ADN apropiados de un plásmido que codifica TL1 o TL2 de longitud completa y del plásmido de IgG1 Fc humano en algún lado de un fragmento derivado de PCR corto que se diseñó para fusionar, en marco, TL1 o TL2 con las secuencias que codifican proteína de IgG1 Fc humana.
Se obtuvieron cantidades de miligramos de TL2-Fc clonando el fragmento de ADN de TL2-Fc en el vector de baculovirus pVL1393 e infectando a continuación el linaje celular de insecto SF-21AE de Spodoptera frugiperda. Alternativamente, puede usarse el linaje celular SF-9 (Nº de Admisión ATCC CRL-1711) o el linaje celular BTI-TN-5b1-4. El ADN que codifica el TL2-Fc se clonó como un fragmento de Eco RI-Notl en el plásmido de transferencia de baculovirus pVL1393. El ADN plásmido se recombinó en ADN vírico mezclando 3 \mug de ADN plásmido con 0,5 \mug de ADN Baculo-Gold (Pharminigen), seguido por introducción en liposomas usando 30 \mug de lipofectina (GIBCO-BRL). Se añadieron las mezclas ADN-liposomas a células SF-21AE (2 x 10^{6} células/placa de 60 mm) en medio TMN-FH (Medio de células de insecto de Grace modificado) (GIBCO-BRL) durante 5 horas a 27ºC, seguido por incubación a 27ºC durante 5 días en medio TMN-FH suplementado con 5% de suero de becerro fetal. Se cosechó el medio de cultivo de tejidos por purificación en placa de virus recombinantes, que se realizó usando métodos descritos previamente (O'Reilly, D.R., L.K. Miller y V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual, 1992, Nwy York: W.H. Freeman) excepto que la capa superpuesta de agarosa contenía 125 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido; GIBCO-BRL). Después de 5 días de incubación a 27ºC, se registraron placas no recombinantes por reacción cromogénica positiva al sustrato de X-gal, y se marcaron sus posiciones. Se visualizaron después placas recombinantes por adición de una segunda capa superpuesta que contenía 100 mg/ml de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; Sigma). Se escogieron placas de virus recombinantes putativos por aspiración de tapón, y se purificaron por ciclos múltiples de aislamiento de placas para asegurar la homogeneidad. Se generaron materiales de virus por paso de baja multiplicidad en serie de virus purificados en placas. Se produjeron materiales de paso bajo de un clon de virus (clon 7 de vTL2-Fc).
Se cultivaron células SF-21AE en medio exento de suero (SF-900 II, Gibco BRL) que contenía solución 1X de antibiótico/antimicótico (Gibco BRL) y 25 mg/l de Gentamicina (Gibco BRL). Se añadió Pluronic F-68 como un tensioactivo hasta una concentración final de 1 g/l. Se criaron cultivos (4 l) en un biorreactor (Artisan Cell Station System) durante al menos tres días antes de la infección. Se desarrollaron células a 27ºC, con gasificación hasta el 50% de oxígeno disuelto, con un caudal de gas de 80 ml/min (aireación con un anillo rociador). La agitación fue mediante una rueda de paletas marina on una velocidad de 100 rpm. Las células se cosecharon en fase de crecimiento semilogarítmica (\sim2x 10^{6} células/ml), se concentraron por centrifugación y se infectaron con 5 unidades de formación de placas de vTL2-Fc por célula. Las células y el inóculo se llevaron a 400 ml con medio reciente y se absorbió el virus durante 2 horas a 27ºC en un matraz rotativo. Se resuspendió después el cultivo en un volumen final de 8 l con medio exento de suero reciente y se incubaron las células en el biorreactor usando las condiciones descritas previamente.
Se recogió medio de cultivo de células SF21AE infectadas con vTL2-Fc por centrifugación (500 x g, 10 minutos) a las 72 horas post-infección. Los sobrenadantes de células se llevaron a pH 8 con NaOH. Se añadió EDTA hasta una concentración final de 10 mM y se reajustó el pH del sobrenadante en 8. Se filtraron los sobrenadantes (0,45 \mum, Millipore) y se cargaron en una columna de proteína A (flujo rápido de sepharose 4 de proteína A o proteína A de HiTrap, ambos de Pharmacia). La columna se lavó con PBS que contenía NaCl 0,5 M hasta disminuir la absorbancia a 280 nm a la línea de base. Se lavó la columna en PBS y se eluyó con ácido acético 0,5 M. Las fracciones de la columna se neutralizaron inmediatamente eluyendo en tubos que contenían Tris 1 M pH 9. Las fracciones de pico que contenían el TL2-Fc se agruparon y dializaron frente a PBS.
Ejemplo 13 Expresión de TIE-1, TIE-2, TL1 Y TL2 en carcinoma de células renales
Se realizaron experimentos de hibridación in situ en tejido de tumor carcinoma de células renales humanas usando sondas de cADN de TIE-1, TIE-2, TL1 y TL2. La expresión de TIE-1, TIE-2, TL1 y TL2 estaba regulada hacia arriba en la vasculatura del tumor. La expresión del ligando parecía estar localizada hacia las células endoteliales vasculares (TL2) o muy cera de las células endoteliales vasculares en el mesénquima (TL1). Se ha demostrado que VEGF está drásticamente regulado hacia arriba en este tejido de tumor. Brown et al., Am. J. Pathol. 143:1255-1262 (1993).
Ejemplo 14 Expresión de TIE-1, TIE-2, TL1 Y TL2 en curación de heridas
Se realizaron experimentos de hibridación in situ en rebanadas de tejido en corte transversal obtenidas de un modelo de herida cutánea de rata usando sondas de cADN de TIE-1, TIE-2, TL1 y TL2. El modelo de curación de herida implica presionar una pequeña perforación de corcho contra la piel de una rata y separar un pequeño tapón cilíndrico de piel. Como la curación comienza en la base de la herida, se toma una rebanada vertical de tejido y se usa para hibridación in situ. En la muestra de tejido ensayada, TL1 y TL2 aparecían estar ligeramente regulados hacia arriba a los cuatro días tras la herida. Como contraste con la expresión ligeramente regulada hacia arriba de TL1 y TL2 en este tejido, la expresión de VEGF, que puede preceder a la expresión de TL1 y TL2, está drásticamente regulada hacia arriba.
Ejemplo 15 Expresión de ligandos de TIE en hígado y timo fetal
Se realizó transcripción inversa-PCR (RT-PCR) en hígado fetal de ratón E14.5 y timo fetal de ratón E17.5. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de RT-PCR reveló que, en el hígado fetal de ratón, el ARN de ligando 1 de TIE-2 (TL1) está enriquecido en la región estromal, pero está ausente en células precursoras hematopoyéticas c-kit^{+}TER119. En este mismo tejido, el ARN de ligando 2 de TIE-2 (TL2) está enriquecido en las células estromales, pero está ausente en células precursoras hematopoyéticas (Figura 13). En el timo fetal de ratón, TL2 está enriquecido en las células estromales (Figura 14).
Ejemplo 16 El sistema receptor/ligando de TIE en angiogénesis
Aunque el sistema TIE-2/ligando de TIE parece jugar un papel importante en la biología de células endoteliales, no se ha demostrado que juegue un papel activo significativo en las fases de tempranas a intermedias de la vascularización (por ejemplo, proliferación y migración de angioblastos o células endoteliales, formación de túbulos y otros sucesos de fase temprana en la modelación vascular). En contraste con los receptores y factores que se sabe que median en estos aspectos del desarrollo vascular, el modelo tardío temporalmente de expresión de TIE-2 y TL1 en el transcurso de la vascularización sugiere que este sistema juega un papel distinto en el desarrollo vascular de últimas fases, incluyendo la diferenciación estructural y funcional y la estabilización de nuevos vasos sanguíneos. El modelo de expresión de TIE-2/TL1 también es consecuente con un papel de continuación en el mantenimiento de la integridad estructural y/o las características fisiológicas de una vasculatura establecida.
El ligando 2 de TIE (TL2) parece ser un inhibidor competitivo de TL1. Las características espaciotemporales de expresión de TL2 sugieren que esta molécula inhibidora simple puede jugar papeles múltiples, dependientes del contexto, esenciales para un desarrollo o remodelación vascular apropiados (por ejemplo, des-estabilización/des-diferenciación de células endoteliales maduras que permiten la formación de nuevos vasos a partir de la vasculatura existente, inhibición de la formación de vasos sanguíneos inapropiados y regresión/involución de vasos sanguíneos maduros). La Figura 15 es una representación esquemática del papel hipotético de los TIE-2/ligandos de TIE en angiogénesis. En esta figura, TL1 está representado por (\bullet), TL2 está representado por (*), TIE-2 está representado por (T), VEGF está representado por ([]) y flk-1 (un receptor de VEGF) está representado por (Y).
Ejemplo 17 Expresión de ligandos de TIE en el sistema reproductivo de la hembra: expresión en el ovario
Las observaciones preliminares hechas en experimentos que examinan la expresión de los receptores y ligandos de TIE en el sistema reproductivo de la hembra son consecuentes con la hipótesis de que el TL1 juega un papel en neovascularización que sigue temporalmente al de VEGF. El modelo de expresión de TL2 también es consecuente con un antagonismo de la acción de TL1, y un papel específico en regresión vascular. Para verificar esto, puede examinarse la expresión de mARNs relevantes tras la inducción experimental de desarrollo folicular y luteal, de manera que pueda definirse más claramente su relación temporal con diversos aspectos de la neovascularización/regresión vascular (por ejemplo, en conjunción con coloración de células endoteliales, rellenos vasculares). Se siguió la angiogénesis asociada con desarrollo folicular y formación de corpus luteum en ovarios graduados de ratas hembras maduras o tras la ovulación inducida en animales pre-pubertales usando hibridación in situ. La Figura 16 contiene fotografías de platinas de hibridación in situ que muestran el modelo de expresión temporal de TIE-2, TL1, TL2 y VEGF durante el ciclo ovárico (Columna 1: folículo pre-ovulatorio temprano; Columna 2: folículo pre-ovulatorio; Columna 3: corpus luteum temprano; y Columna 4: folículo atrético; Fila A: campo brillante; Fila B: VEGF; Fila C: TL2; Fila D: TL1 Y Fila E: receptor de TIE-2). Estos estudios revelaron que VEGF, TL1 y TL2 se expresan de una manera coordinada temporal y espacialmente con respecto al desarrollo y regresión de la vasculatura en el ovario, específicamente con respecto al establecimiento del sistema vascular que se genera en el transcurso de la conversión de un folículo de ovario en un corpus luteum (CL).
Brevemente, la expresión de VEGF aumenta en la capa de gránulos foliculares antes de su vascularización durante el proceso de luteinización. Durante el proceso de formación de CL, son evidentes los niveles más altos de expresión de VEGF en el centro del CL en desarrollo en la proximidad de células luteinizantes que no están aún vascularizadas. Los niveles de VEGF permanecen moderadamente altos y están distribuidos difusamente en el CL desarrollado. Como contraste, la expresión aumentada sensiblemente de ligando 1 de TIE-2 tiene lugar sólo tarde en el proceso de formación de CL, después de haberse establecido un plexo vascular primario. Más tarde, la expresión de TL1 es evidente por todo el CL, en cuyo momento se ha establecido la red capilar definitiva del CL.
TL2 presenta un modelo de expresión más complejo que VEGF o TL1. En el CL en desarrollo, TL2 se expresa en los niveles más altos frente al plexo capilar en desarrollo- entre la región vascular central del CL donde la expresión de VEGF es más alta, y la porción más periférica del CL en la que la expresión de TL1 es dominante y en la que el proceso de luteinización es completo y el sistema vascular es más maduro. TL2 también parece expresarse en altos niveles en la capa folicular de grandes folículos que están experimentando atresia. Mientras que TL1 también es evidente en folículos atréticos, VEGF no se expresa.
El modelo de expresión descrito antes es más consecuente con un papel para VEGF en la iniciación de la angiogénesis, actuando TL1 tarde en este proceso por ejemplo, en modelación y/o estabilización de la red vascular definitiva. Como contraste, TL2 está presente en áreas de expansión activa de una red vascular de nueva formación (durante la formación de CL) y en regiones que no establecen una nueva vasculatura y está en marcha una regresión vascular (folículos atréticos). Esto sugiere un papel más dinámico y complejo para TL2, que implica posiblemente desestabilización de vasculatura existente (necesaria para la regresión) o vasculatura en desarrollo (necesaria para la modelación dinámica de vasos de formación reciente).
Ejemplo 18 Un ensayo de unión de cuerpo receptor y un ensayo de unión y competición de ligando
Se ha desarrollado un ensayo de unión exento de células cuantitativo con dos formatos alternativos para detectar unión de cuerpo receptor o unión y competición de ligando de TIE-2. En la versión de unión de cuerpo receptor del ensayo, se revisten en una placa de ELISA ligandos de TIE-2 (purificados o parcialmente purificados; TL1 o TL2). Se añade después cuerpo receptor en concentraciones variables, que se une al ligando inmovilizado de una manera dependiente de la dosis. Al cabo de 2 horas, se separa por lavado cuerpo receptor en exceso, y se informa después de la cantidad unida a la placa usando un anticuerpo anti Fc humano que está marcado con fosfatasa alcalina. Se separa por lavado el anticuerpo informador en exceso y se desarrolla después la reacción de AP usando un sustrato coloreado. El ensayo se cuantifica usando un espectrofotómetro. La Figura 19 muestra una curva de unión TIE-2-IgG típica. Se ha usado este ensayo para evaluar la integridad de TIE-2-IgG tras inyección en ratas y ratones. El ensayo también puede usarse en este formato como un ensayo de competición de ligandos, en el que ligandos de TIE purificados o parcialmente purificados compiten con ligando inmovilizado por cuerpo receptor. En la versión de unión y competición de ligando del ensayo de unión, se reviste ectodominio de TIE-2 sobre la placa de ELISA. Los fragmentos de dominio tipo fibrinógeno marcados con Fc de los ligandos de TIE (TL1-fFc y TL2-fFc) se unen después al ectodominio, y pueden detectarse usando el mismo anticuerpo anti-Fc humano descrito antes. La Figura 20 muestra un ejemplo de unión de TL1-fFc al ectodominio de TIE-2. Esta versión del ensayo puede usarse también para cuantificar niveles de TL1-fFc en suero u otras muestras. Si se añade al mismo tiempo que el TL1-fFc ligando no marcado (de nuevo, purificado o no purificado), se establece una competición entre fragmento de ligando marcado y ligando de longitud completa. El ligando de longitud completa puede desplazar al fragmento marcado con Fc, y se genera una curva de competición.
Ejemplo 19 El linaje celular EA.hy926 puede usarse como linaje celular informador para la actividad del ligando
EA.hy926 es un linaje híbrido celular que se estableció por fusión de HUVEC con el linaje derivado de carcinoma de pulmón humano A549 [Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 3734-3737 (1983)]. Se ha encontrado que las células EA.hy926 expresan niveles significativos de proteína de receptor de TIE-2 con bajos niveles de fosfotirosina basal. La densidad a la que se hacen pasar las células EA.hy926 antes de su uso para ensayos de receptor, así como su grado de confluencia en el momento del ensayo, pueden afectar a la abundancia de receptor de TIE-2 y a la inducibilidad relativa en respuesta a tratamiento con ligando. Adoptando el siguiente régimen para desarrollar estas células, el linaje celular EA.hy926 puede usarse como sistema seguro para ensayo de actividades de ligando de TIE-2.
Se sembraron células EA.hy926 a razón de 1,5 x 10^{6} células en matraces T-75 (Falconware) y se realimentaron todos los demás días con MEM de Dulbecco con alto contenido de glucosa, 10% de suero de bovino fetal, L-glutamina, penicilina-estreptomicina y 1x hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT, Gibco/BRL). Después de tres a cuatro días de crecimiento, se hicieron pasar las células una vez de nuevo a razón de 1,5 x 10^{6} células por matraz T-75 y se cultivaron de tres a cuatro días más. Para ensayos de fosforilación, se privaron de suero células preparadas como se ha descrito antes por sustitución del medio de cultivo con DMEM de alto contenido de glucosa e incubación durante 2-3 horas a 37ºC. Este medio se aspiró del matraz y se añadieron al matraz muestras de medios acondicionados o ligando purificado en un volumen total de 1,5 ml seguido por incubación a 37ºC durante 5 minutos. Se separaron los matraces del incubador y se pusieron en un lecho de hielo. Se separó el medio y se sustituyó con 1,25 ml de Tampón de Lisis que contenía 1% de nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato sódico, 0,1% de SDS en Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, ortovanadato sódico 1 mM, benzamidina 5 mM y EDTA 1 mM que contenía los inhibidores de proteasa PMSF, aprotinina y leupeptina. Después de 10 minutos en hielo para permitir la solubilización de membrana, se desecharon las placas y se clarificaron lisados de células por microcentrifugación a velocidad máxima durante 10 minutos a 4ºC. Se inmunoprecipitó receptor de TIE-2 del sobrenadante clarificado por incubación en frío con un antisuero policlonal anti-TIE-2 y perlas de Sepharose conjugadas a Proteína G. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis de células frío y se hirvieron 5 minutos en tampón de muestras de Laemmli, que se cargó después en geles de 7,5% de SDS-poliacrilamida. Las proteínas resueltas se electrotransfirieron a membrana de PVDF (Lamblia-P) y se sometieron después a análisis de manchas de Western usando un anticuerpo anti-fosfotirosina y el reactivo ECL. Se hizo una comparación subsiguiente de niveles de proteína de TIE-2 totales en las mismas manchas quitando el anticuerpo anti-fosfotirosina y reincubando con un antisuero policlonal específico para el ectodominio de TIE-2.
Ejemplo 20 Aislamiento y determinación de secuencia de clon de CADN de longitud completa que codifica ligando-3 de TIE de mamífero
Se clonó ligando-3 de TIE (TL3) de una genoteca BAC de ratón (Research Genetics) hibridando duplicados de genoteca, con sondas TL1 de ratón o TL2 de ratón correspondientes a la secuencia de codificación completa de esos genes. Cada copia de la genoteca se hibridó usando tampón fosfato a 55ºC durante la noche. Después de hibridar, se lavaron los filtros usando 2xSSC, 0,1% de SDS a 60ºC, seguido por exposición a los filtros de película de rayos X. Se identificaron señales de hibridación fuertes correspondientes a TL1 de ratón y TL2 de ratón. Además, se identificaron señales que se hibridaban débilmente a TL1 de ratón y TL2 de ratón. Se purificó ADN correspondiente a estos clones, se digirió después con enzimas de restricción y dos fragmentos que se hibridaban a las sondas originales se subclonaron en un plásmido bacteriano y se determinó su secuencia. La secuencia de los fragmentos contenía dos exones con homología a TL1 de ratón y TL2 de ratón. Se usaron cebadores específicos para estas secuencias como cebadores de PCR para identificar tejidos que contenían transcriptos correspondientes a TL3. Se identificó una banda de PCR correspondiente a TL3 en una genoteca de cADN de útero de ratón en lambda gt-11 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA).
Se pusieron en placas con una densidad de 1,25 x 10^{6}/placa de 20 x 20 cm, y se tomaron filtros réplicas siguiendo procedimientos estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Se examinaron filtros duplicados con rigurosidad "normal" (2 x SSC, 65ºC) con una sonda radioactiva de PCR de 200 pb hecha para la secuencia de TL3 de ratón. La hibridación fue a 65ºC en una solución que contenía 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Los filtros se lavaron en 2 x SSC a 65ºC y se expusieron durante 6 horas a película de rayos X. Se escogieron dos clones positivos que se hibridaron en duplicado. La digestión con EcoRI de ADN de fago obtenido de estos clones indicó dos clones independientes con tamaños de inserto de aproximadamente 1,2 kb y aproximadamente 2,2 kb. El inserto de EcoRI de 2,2 kb se subclonó en el lugar de EcoRI de pBluescript KS (Stratagene). El análisis de la secuencia mostró que el clon más largo carecía de una metionina iniciadora y péptido señal pero codificaba por lo demás una sonda homóloga a TL1 de ratón y TL2 de ratón.
Se sintetizaron después como sigue dos cebadores de PCR específicos para TL3:
US2: cctctgggctcgccagtttgttagg
US1: ccagctggcagatatcagg
Se realizaron las siguientes reacciones de PCR usando genotecas de expresión derivadas de los linajes celulares de ratón C2C12ras y MG87. En la reacción de PCR principal, el cebador específico US2 se usó conjuntamente con oligos específicos para el vector para permitir la multiplicación en cualquier orientación. El PCR estaba en un volumen total de 100 ml usando 35 ciclos de 94ºC, 1 min; 42ºC o 48ºC durante 1 min; 72ºC, 1 min. La reacción de PCR secundaria incluía el segundo cebador específico, US1, que está contenido dentro del producto de PCR principal, conjuntamente con el mismo vector oligos. Las reacciones secundarias fueron durante 30 ciclos, usando las mismas temperaturas y tiempos previos. Los productos de PCR se aislaron en gel y se sometieron a análisis de secuencias. Sobre la base de secuencias obtenidas de un total de cuatro reacciones de PCR independientes usando dos genotecas de cADN diferentes, se dedujo el extremo 5' de la secuencia de TL3. El análisis de Northern reveló niveles de moderados a bajos de transcripto de TL3 de ratón en placenta de ratón. La expresión de TL3 de ratón consistía en un transcripto de aproximadamente 3 kb. La secuencia que codifica TL3 de longitud completa se indica en la Figura 21.
La secuencia de TL3 de ratón puede usarse después para obtener un clon humano que contiene la secuencia de codificación de TL3 humano hibridando una genoteca humana o de cADN con una sonda correspondiente a TL3 de ratón como se ha descrito previamente, por ejemplo, en el anterior Ejemplo 8.
Ejemplo 21 Aislamiento de un clon genómico de longitud completa que codifica ligando-4 de TIE humano
Se clonó ligando-4 de TIE (TL4) de una genoteca de BAC de ratón (BAC HUMAN (II), Genome Systems Inc.) hibridando duplicados de genoteca, con una sonda radioactiva de TL1 humano correspondiente a la secuencia de codificación de fibrinógeno completa de TL1 (nucleótidos 1153 a 1806 de la Figura 4) o con una sonda radioactiva de TL3 de ratón correspondiente a un segmento de 186 nucleótidos de la región de fibrinógeno de TL3 de ratón (nucleótidos 1307 a 1492 de la Figura 21). Se marcó cada sonda por PCR usando oligonucleótidos exactos y condiciones de PCR estándares, excepto que se sustituyó dCTP por P^{32}dCTP. La mezcla de PCR se hizo pasar después a través de una columna de filtración de gel para separar la sonda de P^{32}dCTP libre. Cada copia de la genoteca se hibridó usando tampón fosfato, y sonda radioactiva a 55ºC durante la noche usando condiciones de hibridación estándares. Tras la hibridación, se lavaron los filtros usando 2xSSC, 0,1% de SDS a 55ºC, seguido por exposición a película de rayos X. Se observaron fuertes señales de hibridación correspondientes a TL1 humano. Además, se identificaron señales que hibridaban débilmente a TL1 humano y TL3 de ratón. El ADN correspondiente a estos clones se purificó usando procedimientos estándares, se digirió después con enzimas de restricción y se subclonó en un plásmido bacteriano un fragmento que se hibridaba a las sondas originales y se determinó la secuencia. La secuencia de los fragmentos contenía un exón con homología a TL1 humano y TL3 de ratón y otros miembros de la familia de ligandos de TIE. Pueden usarse cebadores específicos para estas secuencias como cebadores de PCR para identificar tejidos que contienen transcriptos correspondientes a TL4.
La secuencia completa de TL4 humano puede obtenerse determinando la secuencia del clon de BAC total contenido en las células bacterianas depositadas. Pueden identificarse exones por homología a miembros conocidos de la familia de ligandos de TIE tales como TL1, TL2 y TL3. Puede determinarse después la secuencia de codificación total de TL4 empalmando entre sí los exones del clon genómico de TL4, que puede usarse a su vez para producir la proteína de TL4. Alternativamente, pueden usarse los exones como sondas para obtener un clon de cADN de longitud total, que puede usarse después para producir la proteína de TL4. Pueden identificarse también exones de la secuencia del clon de BAC por homología a dominios de proteínas tales como dominios de fibrinógeno, dominios doblemente arrollados o señales de proteínas tales como secuencias de péptidos señal. Pueden obtenerse exones que faltan del clon de BAC por identificación de clones de BAC contiguos, por ejemplo, usando los extremos del clon de BAC depositado como sondas para examinar una genoteca humana tal como la usada aquí, usando la secuencia de exones contenida en el clon de BAC para examinar una genoteca de cADN, o realizando un procedimiento RACE 5' o 3' usando cebadores de oligonucleótidos basados en las secuencias de exones de TL4.
Identificación de miembros de la familia de ligandos de TIE adicionales
La nueva secuencia de ligando-4 de TIE puede usarse en una búsqueda racional de miembros adicionales de la familia de ligandos de TIE usando un método que se aprovecha de la existencia de segmentos conservados de fuerte homología entre los miembros de la familia conocidos. Por ejemplo, un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los ligandos de TIE muestra varias regiones de secuencia conservada (véanse regiones en caja de la Figura 22). Pueden usarse oligonucleótidos degenerados basados esencialmente en estas cajas en combinación con segmentos conocidos previamente o de homología de ligandos de TIE nuevos para identificar nuevos ligandos de TIE.
Las regiones altamente conservadas entre TL1, TL2 y TL3 pueden usarse para diseñar cebadores de oligonucleótidos degenerados con los que cebar reacciones de PCR usando cADNs. Pueden generarse plantillas de cADN por transcripción inversa de ARNs de tejidos usando oligo d(T) u otros cebadores apropiados. Pueden someterse después partes alícuotas de las reacciones de PCR a electroforesis en un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN multiplicados resultantes pueden clonarse por inserción en plásmidos, determinarse las secuencias y compararse las secuencias de ADN con las de todos los ligandos de TIE conocidos.
Pueden clonarse en plásmidos fragmentos de ADN multiplicados de tamaño seleccionado de estas reacciones de PCR, introducirse en E. Coli por electroporación y ponerse en placas transformantes en agar selectivo. Pueden analizarse colonias bacterianas de transformación de PCR determinando las secuencias de ADNs plásmidos que se purifican por procedimientos de plásmidos estándares.
Pueden usarse fragmentos clonados que contienen un segmento de un nuevo ligando de TIE como sondas de hibridación para obtener clones de cADN de longitud total de una genoteca de cADN. Por ejemplo, puede usarse la secuencia genómica de TL4 humano para obtener un clon de cADN humano que contenga la secuencia de codificación completa de TL4 humano hibridando una genoteca de cADN humano con una sonda correspondiente a TL4 humano como se ha descrito previamente.
Ejemplo 22 Clonación de la secuencia de codificación completa de hTL4
Se obtuvo la secuencia de codificación 5' y 3' del clon de TL-4 humano genómico que codifica ligando-4 de TIE humano (hTL-4, Nº de Admisión ATCC 98095) por digestión con enzima de restricción, manchas de Southern e hibridación del clon de hTL-4 a secuencias de codificación de TL3 de ratón, seguido por subclonación y determinación de la secuencia de los fragmentos que se hibridan. Se usaron secuencias de codificación correspondientes a los aminoácidos N-terminal y C-terminal de hTL4 para diseñar cebadores de PCR (mostrados después), que se usaron a su vez para multiplicación por PCR de TL4 de cADN de ovario humano. Se identificó una banda de PCR como correspondiente a TL4 humano por determinación de la secuencia de ADN usando el determinador de secuencias de ADN ABI 373A y Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La banda de PCR se subclonó después en vector pCR-script y se analizaron varios clones plásmidos determinando la secuencia. La secuencia de codificación de TL4 humano completa se recopiló después como se muestra en la Figura 23. En otra realización de la invención, el nucleótido en posición 569 se cambia de A a G, produciendo un cambio de aminoácidos de Q a R.
Los cebadores de PCR usados como se ha descrito antes se diseñaron como sigue:
1
Las letras minúsculas indican secuencias de "cola" añadidas a los cebadores de PCR para facilitar la clonación de los fragmentos de PCR multiplicados.
Ejemplo 23 Construcción y caracterización de ligandos de TIE modificados
Se emprendió un análisis genético de ligando-1 de TIE-2 y ligando-2 de TIE-2 (TL1 y TL2) para profundizar en un cierto número de sus propiedades observadas. Aunque TL1 y TL2 comparten una homología estructural similar, presentan diferentes propiedades físicas y biológicas. El aspecto más notable que distingue a los dos ligandos es que aunque ambos se unen al receptor de TIE-2, TL1 es un agonista mientras que TL2 es un antagonista. Bajo condiciones electroforéticas no reductoras, ambas proteínas presentan estructuras multímeras covalentes. TL1 se produce como una mezcla de multímeros reticulados con disulfuro, principalmente trímeros y especies de orden superior, sin ninguna especie dímera. Pero TL2 se produce casi exclusivamente como una especie dímera. También, mientras que TL2 se produce bien en muchos sistemas de expresión, TL1 se expresa escasamente y es difícil de producir en grandes cantidades. Finalmente, las condiciones de producción y purificación parecen también predisponer a TL1 a inactivación por escisión proteolítica en algún lugar cerca del término amino.
Para estudiar estas diferencias, se construyeron como sigue varios ligandos modificados.
23.1 Sustitución de cisteína - Las investigaciones sobre qué factores podrían contribuir a las diferentes propiedades físicas y biológicas de las dos moléculas revelaron la presencia en TL1 de un residuo de cisteína (CYS 265 en la Figura 4; CYS 245 en la Figura 17) que precede al dominio de tipo fibrinógeno en TL1 pero está ausente en TL2 -es decir, no había un residuo de cisteína correspondiente en TL2. El residuo de CYS265 en TL1 está codificado por TGC y está situado en aproximadamente los nucleótidos 1102-1104 (véase Figura 4) en la conexión aproximada entre los dominios doblemente arrollado y de tipo fibrinógeno. Puesto que los residuos de cisteína están implicados generalmente en la formación de enlaces disulfuro, cuya presencia puede contribuir a la estructura terciaria y a las propiedades biológicas de una molécula, se pensó que quizás la presencia del residuo de CYS265 en TL1 podría ser al menos parcialmente responsable de las diferentes propiedades de las dos moléculas.
Para ensayar esta hipótesis, se construyó un plásmido de expresión que contenía una mutación en TL1 en la que el CYS (residuo 265 en la Figura 4; residuo 245 en la Figura 17) se sustituyó con un aminoácido (serina) que no forma enlaces disulfuro. Además de este TL1/CYS-mutante, se construyó un segundo plásmido de expresión que mutaba la posición correspondiente aproximadamente en TL2 (Met247 en la Figura 17), de modo que este residuo era ahora una cisteína. Ambos plásmidos de expresión no mutado y mutado de TL1 y TL2 se transfectaron transitoriamente en células COS7, se cosecharon los sobrenadantes de células que contenían las proteínas recombinantes y se sometieron muestras a electroforesis de SDS/PAGE reductora y no reductora y subsiguientes manchas de Western.
La Figura 18 muestra las manchas de Western en condiciones no reductoras de ambas proteínas de TL1 y TL2 no mutadas y mutadas, revelando que el mutante TL1/CYS^{-} se conduce como un dímero muy parecido a TL2 y que el mutante TL2/CYS^{+} es capaz de formar un trímero, así como multímeros de orden superior, más como TL1. Cuando se ensayó la capacidad de las dos proteínas mutantes para inducir fosforilación en células que expresan TIE-2, el mutante TL1/CYS^{-} era capaz de activar al receptor de TIE-2, mientras que el mutante TL2/CYS^{+} no.
Así, cuando el residuo de cisteína (residuo 265 en la Figura 4; residuo 245 en la Figura 17) de TL1 era alterado genéticamente a una serina, se encontró que la estructura covalente de TL1 se hace similar a la de TL2, es decir, principalmente dímera. La molécula de TL1 modificado se comportaba aún como un agonista, por lo que la estructura trímera y/o multímera de orden superior no era el factor determinante que da a TL1 la capacidad de activar. Aunque la separación de la cisteína hizo una molécula con propiedades más deseables, no mejoró el nivel de producción de TL1.
23.2. Supresiones de dominios - Las secuencias de nucleótidos que codifican TL1 y TL2 comparten una estructura genética que puede dividirse en tres dominios, basados en las secuencias de aminoácidos de las proteínas maduras. Los últimos aproximadamente 215 residuos de aminoácidos de cada proteína madura contienen seis cisteínas y tienen un fuerte parecido a un dominio de fibrinógeno. Esta región se denominó así el dominio "de tipo fibrinógeno" o "dominio F". Una región central de la proteína madura que contiene aproximadamente 205 residuos tenía una alta probabilidad de adoptar una estructura "doblemente arrollada" y se denominó el dominio "doblemente arrollado" o "dominio C". Los aproximadamente 55 residuos amino-terminales de la proteína madura contenían dos cisteínas y tenían una alta probabilidad de tener una estructura doblemente arrollada. Esta región se denominó el dominio "N-terminal" o "dominio N". Los ligandos modificados descritos aquí se denominan usando una terminología en la que N = dominio N-terminal, C = dominio doblemente arrollado, F = dominio de tipo fibrinógeno y los números 1 y 2 se refieren a TL1 y TL2 respectivamente. Así, 1N indica el dominio N-terminal de TL1, 2F indica el dominio de tipo fibrinógeno de TL2, etc.
Con el fin de ensayar si el dominio de tipo fibrinógeno (dominio F) de los ligandos de TIE-2 contenía actividad de activación de TIE-2, se construyeron plásmidos de expresión que suprimían los dominios doblemente arrollado y N-terminal, dejando sólo la porción de la secuencia de ADN que codifica el dominio F (para TL1, que comienza en la Figura 4 en aproximadamente el nucleótido 1159, residuo de aminoácido ARG284; para TL2, correspondiente a aproximadamente el nucleótido 1200 en la Figura 6, residuo de aminoácido 282). Esta construcción mutante se transfectó después transitoriamente en células COS. Se cosechó el sobrenadante que contenía la proteína recombinante. Se ensayó la capacidad del mutante de TL1/dominio F para unirse al receptor de TIE-2. Los resultados mostraron que, como monómero, el mutante de TL1/dominio F no era capaz de unirse a TIE-2 en un nivel detectable.
Pero cuando el monómero de TL1/dominio F se marcó con myc y se agrupó a continuación con un anticuerpo dirigido contra la marca myc, presentó una unión detectable a TIE-2. Sin embargo, el mutante de TL1/dominio F agrupado con anticuerpo no era capaz de inducir fosforilación en un linaje celular que expresa TIE-2.
Se determinó así que el dominio F de los ligandos de TIE-2 está implicado en la unión al receptor pero que un truncamiento consistente únicamente en el dominio F solo no es suficiente para unión a receptor. Esto aumentó la posibilidad de que el dominio doblemente arrollado fuera responsable de mantener juntos varios dominios de tipo fibrinógeno, que podrían ser esenciales para la unión a receptor. En un intento por confirmar esta hipótesis, se fusionó el dominio F con la sección Fc de anticuerpo IgG1 humano. Puesto que las secciones Fc se dimerizan por expresión por células de mamíferos, estas proteínas recombinantes que imitaban la configuración teórica de los dominios F eran los ligandos nativos a dimerizar. Esta construcción de dominio F-Fc se unía pero no activaba el receptor. Aparentemente, la multimerización causada por otras regiones de los ligandos es necesaria para permitir a los ligandos unirse al receptor de TIE-2. Además, algunos otros factores fuera del dominio F deben contribuir a la fosforilación del receptor.
Se construyeron después mutantes que carecían del dominio de tipo fibrinógeno, y contenían por tanto sólo los dominios N-terminal y doblemente arrollado. No eran capaces de unirse al receptor. Para valorar el papel del dominio N-terminal en la unión y activación del receptor, se truncaron los ligandos hasta justo sus dominios C y F y se marcaron con una marca FLAG en el término N, creando construcciones denominadas FLAG-1C1F y FLAG-2C2F. Aunque estas moléculas se coloreaban fuertemente en células COS7 transfectadas transitoriamente para expresar el receptor de TIE-2, no respondieron en un ensayo de fosforilación. Así, el dominio N contiene un factor esencial para la activación del receptor aunque, como se describe después, la capacidad de la molécula quimérica 2N2C1F para activar el receptor muestra que incluso el dominio N de un ligando inactivo puede desempeñar ese papel.
Las diferencias de comportamiento entre el truncamiento del dominio F marcado con myc y el truncamiento del dominio F marcado con Fc descritos previamente sugirió que los ligandos de TIE sólo pueden unirse en formas dímeras o multímeras superiores. Realmente, la SDS-PAGE no reductora mostró que los ligandos de TIE existen naturalmente en formas dímera, trímera y multímera. Que los truncamientos de FLAG-1C1F y FLAG-2C2F puedan unirse al receptor de TIE-2 sin dimerización por una marca sintética (tal como Fc), mientras que los truncamientos de F no pueden, sugiere que la región C es al menos parcialmente responsable de la agregación de los dominios F.
23.3. Construcciones de intercambio (quimeras)
Los solicitantes han observado que el nivel de producción de TL1 en células COS7 era aproximadamente diez veces más bajo que la producción de TL2. Por tanto, se construyeron quimeras de TL1 y TL2 en un intento por explicar esta diferencia y también para caracterizar adicionalmente la actividad agonista de TL1 en comparación con la actividad antagonista de TL2.
Se construyeron cuatro quimeras en las que se intercambió el dominio N-terminal o el dominio fibrinógeno entre TL1 y TL2 y se designaron usando la terminología descrita previamente de tal modo que, por ejemplo, 1N1C2F se refiere a una quimera que tiene los dominios N-terminal y doblemente arrollado de TL1, junto con el dominio de tipo fibrinógeno de TL2. Se construyeron las cuatro quimeras como sigue:
quimera 1 - 1N1C2F
quimera 2 - 2N2C1F
quimera 3 - 1N2C2F
quimera 4 - 2N1C1F
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las quimeras 1-4 se muestran en las Figuras 24-27 respectivamente.
Cada quimera se insertó en un vector de expresión separado pJFE14. Se transfectaron después las quimeras en células COS7, junto con el vector pJFE14 vacío, TL1 nativo y TL2 nativo, como testigos, y se recogieron los sobrenadantes de cultivo.
Con el fin de determinar cómo afectaba el intercambio al nivel de expresión de los ligandos, se mancharon en nitrocelulosa una dilución 1:5 y una dilución 1:50 de los sobrenadantes de COS7. Tres ligandos que contenían el dominio N de TL1 (es decir, TL1 nativo, 1N2C2F y 1N1C2F) se sondaron después con un anticuerpo de conejo específico para el término N de TL1. Tres ligandos que contenían el dominio N de TL2 (es decir, TL2 nativo, 2N1C1F y 2N2C1F) se sondaron con un anticuerpo de conejo específico para el término N de TL2. Los resultados demostraron que las células COS7 expresaban cualquier molécula que contuviera el dominio N de TL2 en aproximadamente diez veces el nivel de cualquier molécula que contuviera el dominio N de TL1, independientemente de la composición del resto de la proteína. La conclusión fue que el dominio N debe controlar principalmente el nivel de expresión del ligando.
La siguiente cuestión a la que se dirigió fue la capacidad o incapacidad de las quimeras para activar el receptor de TIE-2. Se probaron células EAhy926 con las cuatro quimeras, así como TL1 como testigo positivo para la fosforilación y TL2 o un sobrenadante de células COS7 transfectadas con pJFE14 vacío como testigos negativos para la fosforilación. Se lisaron las células, y se inmunoprecipitó el receptor de TIE-2 fuera del lisado de células y se probó en una SDS-PAGE. Las muestras se mancharon con Western y se sondaron con un anticuerpo anti-fosfotirosina para detectar cualesquiera receptores que se hayan fosforilado. Sorprendentemente, sólo las construcciones que contenían el dominio de tipo fibrinógeno de TL1 (2N1C1F y 2N2C1F) podían fosforilar el receptor de TIE-2. Así, aunque la región N-terminal de TL1 es esencial para la activación, puede sustituirse por la región N-terminal de TL2, es decir, la información que determina si el ligando es un agonista o un antagonista está contenida realmente en el dominio de tipo fibrinógeno.
Se determinó así que el dominio F, además de unirse al receptor de TIE-2, es responsable de la actividad de fosforilación de TL1. Además, cuando TL2, una molécula por lo demás inactiva, se alteró sustituyendo su dominio F con el dominio F de TL1, el TL2 alterado actuó como un agonista.
La construcción 2N1C1F era no obstante algo más eficaz. La señal causada por la quimera 2N1C1F parecía ligeramente más fuerte que la de la quimera 2N2C1F, conduciendo a la especulación de que el dominio C de TL1, aunque no es crucial para la fosforilación, podría aumentar la eficacia de TL1. Sin embargo, puesto que las muestras usadas para el ensayo de fosforilación no estaban normalizadas en términos de la concentración de ligando, era posible que una señal de fosforilación más fuerte sólo indicara la presencia de más ligando. Se repitió por tanto el ensayo de fosforilación con cantidades variables de ligando para determinar si las quimeras activas presentaban diferentes eficacias. La concentración de ligando en los sobrenadantes de COS7 de transfecciones de ligando se determinó mediante tecnología de biosensor BIAcore según los métodos descritos previamente (Stitt, T.N. et al. (1995) Cell 80:661-670). BIAcore midió la actividad de unión de un sobrenadante al receptor de TIE-2 en unidades arbitrarias denominadas unidades de resonancia (UR). Se ha observado generalmente una correlación bastante buena entre URs y concentración de ligando, correspondiendo 400 UR de actividad a aproximadamente 1 \mug de proteína por ml de sobrenadante. Se diluyeron muestras a concentraciones de 100 UR, 20 UR y 5 UR cada una y se repitió el ensayo de fosforilación. Los resultados demostraron que la quimera 2N2C1F era claramente más eficaz que el TL1 nativo o la quimera 1N1C2F en las mismas concentraciones.
Otro aspecto interesante de estas construcciones de intercambio está en sus niveles de expresión. Se ensayó en cada una de las cuatro quimeras su nivel de producción en células COS, su capacidad para unirse a TIE2 y su capacidad para fosforilar TIE2. Los resultados de estos experimentos mostraron que las quimeras 1 y 3 se producían en niveles comparables a TL1, mientras que las quimeras 2 y 4 se producían en niveles comparables a TL2. Así, un alto nivel de producción de proteína estaba correlacionado con el dominio N-terminal de TL2. Adicionalmente, cuando se ensayaron en células EAhy926 endoteliales, las quimeras 2 y 4 eran activas, mientras que las 1 y 3 no lo eran. Así, la actividad (fosforilación del receptor) se correlaciona con el dominio de tipo fibrinógeno de TL1. Las quimeras 2 y 4 tenían cada una por tanto las propiedades deseables de altos niveles de producción así como actividad agonista.
23.4 Construcciones resistentes proteolíticas - En base a la observación de que una gran fracción de preparaciones de TL1 era escindida a menudo proteolíticamente cerca del término N, se propuso que un residuo de arginina situado en posición 49 de la proteína madura (véase Figura 17) era un lugar de escisión candidato que podría estar implicado en la regulación de la actividad de la proteína in vivo, y que sustituir la arginina con una serina (R49\rightarrowS) podría aumentar la estabilidad de la proteína sin afectar necesariamente a su actividad. Se construyó tal mutante de TL1 y se encontró que era aproximadamente tan activo como el TL1 nativo pero no presentaba resistencia a la escisión proteolítica.
23.5 Mutantes de combinación - La más eficaz de las construcciones quiméricas, 2N1C1F, se alteró dicionalmente de manera que se convirtió en una serina la cisteína codificada por los nucleótidos 784-787 como se muestra en la Figura 27. Esta molécula (denominada 2N1C1F (C246S)) se expresaba bien, activaba potencialmente el receptor, era resistente a escisión proteolítica y era principalmente dímera, en lugar de multímera de orden superior. Así, el dominio 2N parecía conferir resistencia a proteasa en la molécula. Finalmente, esta molécula se alteró adicionalmente para eliminar el lugar potencialmente sensible a proteasa codificado por los nucleótidos 199-201 como se muestra en la Figura 27, para dar una molécula (denominada 2N1C1F (R51->S,C246->S)) de la que se esperaba que fuera activante, bien expresada, dímera y resistente a proteasa.
La Tabla 1 resume las construcciones de ligandos de TIE-2 modificados que se hicieron y caracteriza cada una de ellas en términos de capacidad para unirse al receptor de TIE-2, capacidad para activar el receptor de TIE-2, el tipo de estructura formada (monómero, dímero, etc.) y sus niveles de producción relativa. Se muestran TL1 no modificado (liso) y TL2 (rayado) con los tres dominios como cajas. Así, cajas rayadas indican dominios de TL2. La cisteína situada en posición 245 de la proteína de TL1 madura está indicada por una "C". Una "X" por la "C" indica que ese residuo de cisteína se sustituyó por otro aminoácido como en, por ejemplo, el mutante TL1 CYS^{-}. De manera similar, una "X" por la "R" en la última construcción indica la sustitución por un residuo de Arg en posición 49 de la proteína de TL1 madura. La "C" está presente en una construcción de TL2 modificado que muestra el mutante TL2 CYS^{+}. Se indican también construcciones que tienen colas de Fc o marcación con FLAG.
En base a las presentes enseñanzas, un experto en la técnica puede ver fácilmente que pueden hacerse construcciones adicionales con el fin de crear ligandos de TIE-2 modificados y quiméricos adicionales que tienen propiedades alteradas. Por ejemplo, uno puede crear una construcción constituida por el dominio N-terminal de TL2 y el dominio F de TL1 fusionados con la sección Fc de anticuerpo IgG1 humano. Sería de esperar que esta construcción se uniera y activara al receptor de TIE-2. De modo similar, pueden crearse otras construcciones usando las presentes enseñanzas y se considera que están por tanto dentro del alcance de esta invención.
23.6 Materiales y métodos Construcción de quimeras
Se insertaron construcciones de intercambio en un vector pJFE14 en el que se había cambiado el lugar de XbaI a un lugar de AscI. Este vector se digirió después con AscI y NotI produciendo una cadena principal de AscI-NotI. Se generaron fragmentos de ADN para las quimeras por PCR usando oligonucleótidos apropiados.
Los insertos FLAG-1C1F y FLAG-2C2F se subclonaron en una cadena principal de vector pMT21 que se había digerido con EcoRI y NotI. Los truncamientos "CF" se obtuvieron mediante PCR, y la marca FLAG y una secuencia de señalización de tripsina precedente se construyeron reanillando oligonucleótidos sintéticos.
Transfecciones
Todas las construcciones se transfectaron transitoriamente en células COS7 usando DEAE-Dextrano o lipofectamina según métodos estándares. Los cultivos de células se cosecharon 3 días después de la transfección y se centrifugaron a 1000 rpm durante 1 minuto, y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se guardaron a -20ºC.
Coloración de células transfectadas con FLAG-1C1F y transfectadas con FLAG-2C2F
Se transfectaron transitoriamente con el receptor de TIE-2 placas de 6 pocillos de células COS7. El sobrenadante de COS7 de diversas transfecciones de ligandos se incubó en las células durante 30 minutos, seguido por dos lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin magnesio o calcio. Se fijaron las células en metanol a -20ºC durante 3 minutos, se lavaron una vez con PBS y se incubaron con anticuerpo anti-FLAG M2 (IBI; dilución 1:3000) en PBS/10% de suero de becerro fetal (BCS) durante 30 minutos. Las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con anticuerpo conjugado de IgG anti-ratón de cabra fosfatasa alcalina (AP) (Promega, 1:1000) en PBS/10% de BCS. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con el sustrato de fosfato, BCIP/NBT, con levamisol 1 mM.
Ensayos de fosforilación
La dilución de sobrenadantes de COS7 para el estudio de respuesta a la dosis se hizo en los sobrenadantes de células COS7 transfectadas con el vector vacío pJFE14. Se privaron durante >2 horas en medio exento de suero células EA, que expresan naturalmente el receptor de TIE-2, seguido por prueba con el sobrenadante de COS7 apropiado durante 10 minutos a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Se enjuagaron después las células en PBS enfriada con hielo y se lisaron con tampón de lisis de 1% de NP40 que contenía inhibidores de proteasa (10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, PMSF 1 mM) seguido por inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para el receptor de TIE-2. Se sometieron después muestras a análisis de inmunomanchas, usando anticuerpos anti pTyr.
Manchas
Se aplicaron muestras a una membrana de nitrocelulosa, que se bloqueó y sondó con los anticuerpos apropiados.
23.7 Producción de ligando de TIE-2 quimérico a partir de células CHO y de insecto infectadas con baculovirus Producción de virus
El gen para el ligando quimérico (denominado 2N1C1F (C246S)) se manejó en un plásmido de expresión de baculovirus y se recombinó con ADN vírico para generar baculovirus recombinante, se multiplicó y se cosechó usando métodos descritos previamente (O'Reilly, D.R., L.K. Miller y V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A laboratory Manual 1992, New York: W.H. Freeman). Células de insecto SF21 (Spodoptera frugiperda) obtenidas de Invitrogen se adaptaron y expandieron a 27ºC en medio exento de suero Gibco SF900 II. Las células no infectadas se desarrollaron hasta una densidad de 1 x 10^{6} células/ml. La densidad de células se determinó contando células viables usando un hemacitómetro. El material de virus para el ligando se añadió al biorreactor con una multiplicidad baja, 0,01-0,1 UFP/célula, para comenzar la infección. Se permitió continuar el proceso de infección durante 3-4 días permitiendo una replicación de virus máxima sin incurrir en lisis de células sustancial. Se dividió en partes alícuotas asépticamente la suspensión de células en botellas de centrífuga estériles y se separaron las células por centrifugación (1600 rpm, 30 min). El sobrenadante exento de células se recogió en botellas estériles y se guardó a 4ºC en ausencia de luz hasta un uso ulterior.
El título de virus se determinó por ensayo en placa como se describe por O'Reilly, Miller y Luckow. El método se realiza en placas de cultivo de tejidos de 60 mm que se siembran con 1,5 x 10^{6} células. Se añaden diluciones en serie del material de virus a las células adjuntas y se incuba la mezcla con oscilación para permitir absorber el virus células individuales. Se añade una capa superpuesta de agar y se incuban placas durante 5 días a 27ºC. Se colorean células viables con rojo neutro revelando placas circulares que se contaron para dar el título de virus expresado en unidades de formación de placa por mililitro (UFP/ml).
Infección de células para producción de proteína
Se desarrollaron células SF21 no infectadas en placas de cultivo de tejidos, y se añadió virus que contenía el gen de ligando quimérico con una multiplicidad de 1-10 ufp/célula. Se permitió absorber al virus durante 90 minutos a 27ºC con oscilación suave, tras lo que se realimentaron las células con nuevas cantidades de medio exento de suero Sf-900 II. Después de 3 días de crecimiento a 27ºC, se cosecharon fluidos de cultivo de tejidos, y se detectó el ligando por inmunomanchas.
Expresión de CHO de quimeras de ligando de Tie-2
Se clonaron quimeras de ligando de Tie-2 en alguno de varios vectores de expresión de células de mamífero, incluyendo (aunque sin limitarse a ellos) pJFE, pcDNA3, pMT21, PED u otros. Se transfectaron plásmidos en células CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, L.A. 1980, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220; Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A.M. y Chasin, L.A. 1983. Deletion of the diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells. Cell 33:405-412) por precipitación con fosfato cálcico o liposomas catiónicos. En el caso de vectores carentes de un marcador seleccionable dhfr, el plásmido pSV2.dhfr se cotransfectó en una relación en moles del 20% al plásmido que contenía la quimera de ligando de TIE. Se seleccionaron células DHFR+ por crecimiento en medio de selección (un medio carente de nucleósidos y nucleótidos que contenía 10% de suero de becerro fetal dializado) y se examinó en clones la producción de ligandos de TIE quiméricos por inmunomanchas con un cuerpo receptor de TIE2. Los clones que expresan la proteína deseada se sometieron a varios ciclos de multiplicación de genes usando concentraciones graduadas de metotrexato en medio de selección. Se identificaron genes que expresan elevadamente tras multiplicación de genes por técnicas de inmunomanchas similares.
Se cultivaron linajes celulares que expresan ligandos de TIE quiméricos en monocapas, matraces de suspensión, botellas rotativas y biorreactores en medio de selección o en medio carente de selección, y pueden desarrollarse en formulaciones de medio exento de suero.
TABLA 1 Análisis de mutación de ligandos de TIE
2
Depósitos
Los siguientes se han depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 de acuerdo con el Tratado de Budapest. Un clon plásmido que codifica ligando de TIE-2 se depositó en la ATCC el 7 de Octubre de 1994 y se denominó "pJFE14 que codifica ligando de TIE-2" con el Nº de Admisión ATCC 75910. Un baculovirus de Autographa californica recombinante que codifica cuerpo receptor de TIE-2 se depositó en la ATCC el 7 de Octubre de 1994 y se denominó "cuerpo receptor de vTIE-2" con el Nº de Admisión ATCC VR2484. Un vector de fago lambda que contiene ADN de ligando de tie-2 humano se depositó en la ATCC el 26 de Octubre de 1994 y se denominó "Igt10 que codifica ligando 1 de htie-2" con el Nº de Admisión ATCC 75928. Un clon plásmido que codifica un segundo ligando de TIE-2 se depositó en la ATCC el 9 de Diciembre de 1994 y se denominó "pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE 2 humano" con el Nº de Admisión ATCC 75963. La cepa de E. Coli DH10B que contiene plásmido pBeLoBac11 con un inserto de gen de TL-4 humano que codifica ligando-4 de TIE humano se depositó en la ATCC el 2 de Julio de 1996 y se denominó "hTL-4" con el Nº de Admisión ATCC 98095.
La presente invención no está limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas aquí. Realmente, diversas modificaciones de la invención además de las descritas aquí resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras que se acompañan. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
54 
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Documento adjunto Nº REG 333-PCT
Solicitud Internacional Nº: NO CONOCIDO TODAVÍA
FECHA DE PRESENTACIÓN INTERNACIONAL: PRESENTADA CON ÉSTA
Título: NUEVOS LIGANDOS MODIFICADOS
Hoja suplementaria a la casilla B del formato PCT/RO/134
Identificación de depósitos adicionales - Además del depósito indicado en el formato adjunto PCT/RO/134, el solicitante identifica los siguientes depósitos hechos en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. y solicita que puedan también ponerse a disposición sólo por entrega de una muestra a un experto nombrado por el solicitante como se indica en el formato adjunto:
Fecha de depósito Número de admisión
7 de Octubre de 1994 VR2484
26 de Octubre de 1994 75928
9 de Diciembre de 1994 75963
2 de Julio de 1996 90895
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS LIGANDOS MODIFICADOS
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 777 Old Saw Mill Road
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Tarrytown
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: NY
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
ZIP: 10591
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Diskette
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: FatSEQ Version 2.0
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: NO CONOCIDO AÚN
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: PRESENTADA CON ÉSTA
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/740.223
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 de Octubre de 1996
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/022/999
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 de Agosto de 1996
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Cobert, Robert J
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.108
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: REG 333
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 914-345-7400
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 914-345-7721
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2149 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 310.....1803
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 1 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
LOCALIZACIÓN: 1.....2149
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 498 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 1 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....498
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: del clon \lambdagt10 que codifica ligando 1 de htie-2
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2146 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:310.....1800
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 1 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....2146
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: de clon T98G
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
10 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 497 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(V)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 1 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....2146
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: de clon T98G
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2282 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 357.....1844
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 2 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....2282
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: de clon pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE 2 humano
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12
13
14 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 2 de TIE-2 humano
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....496
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: de clon pBluescript KS que codifica ligando 2 de TIE 2 humano
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 478 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Proteína de TL1 madura
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....478
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 480 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Proteína de TL2 madura
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....480
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1849 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 47.....1573
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando 3 de TIE
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1849
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: El dominio de tipo fibrinógeno empieza en posición 929
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 509 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando-3 de TIE
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....509
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
22
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 503 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mTL3
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....503
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando-3 de TIE de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 490 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: hTL1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....490
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando 1 de TIE-2 humano
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
25
250 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 491 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: chTL1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....491
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando 1de TIE-2 de pollo
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
26
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 497 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mTL1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....497
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando 1 de TIE-2 de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mTL2
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....496
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando 2 de TIE-2 de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: hTL2
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....496
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Ligando 2 de TIE-2 humano
\vskip0.666000\baselineskip
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
31 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1512 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1509
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando-4 de TIE
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1512
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
32
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 503 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Ligando-4 de TIE
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....503
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
35
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1497 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1494
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 1N1C2F (quimera 1)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1497
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....60
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Es codificada una secuencia líder putativa por los nucleótidos 1-60
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 498 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 1N1C2F (quimera 1)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....498
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1491 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1488
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 2N2C1F (quimera 2)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1491
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....48
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Es codificada una secuencia líder putativa por los nucleótidos 1-48
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
40
41
42 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 2N2C1F (quimera 2)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....496
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1500 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1497
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 1N2C2F (quimera 3)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1500
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....60
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Es codificada una secuencia líder putativa por los nucleótidos 1-60
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
45
46 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 499 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 1N2C2F (quimera 3)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
47
48 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1488 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1485
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 2N1C1F (quimera 4)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....1488
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.....48
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Secuencia líder putativa
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
49
50
51 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 495 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: 2N1C1F (quimera 4)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1....495
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
52
53 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: hTL4atg
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1....47
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1....20
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: secuencias de "cola" añadidas al cebador de PCR para facilitar la clonación de los fragmentos de PCR multiplicados
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATGCTATC TCGAGCCACC ATGCTCTCCC AGCTAGCCAT GCTGCAG 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: hTL4not
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1....55
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Otro
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1....28
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: secuencia de "cola" añadida a los cebadores de PCR para facilitar la clonación de los fragmentos de PCR multiplicados
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGTCGACCC GGCCGCTCTA GATCAGACTT AGATGTCCAA AGGCCGTATC ATCAT 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (33)

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que comprende un dominio N-terminal, un dominio doblemente arrollado y un dominio de tipo fibrinógeno, en el que al menos dos de dichos dominios se derivan de diferentes ligandos de TIE-2 seleccionados entre Ligando 1 de TIE-2, Ligando 2 de TIE-2, Ligando 3 de TIE y Ligando 4 de TIE.
2. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico en el que el dominio N-terminal, el dominio doblemente arrollado y el dominio de tipo fibrinógeno se derivan de Ligando-1 de TIE-2 o Ligando-2 de TIE-2.
3. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que se une a, y activa, un receptor de TIE-2, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ligando 1 de TIE-2, en el que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio N-terminal de ligando 2 de TIE-2.
4. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3ª, en la que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 2 de TIE-2.
5. Una molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 3ª o 4ª, que está modificada para codificar un aminoácido diferente en lugar del residuo de cisteína codificado por los nucleótidos 784-786 como se indica en la Figura 27.
6. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5ª, que está modificada de tal modo que se codifica un residuo de serina en lugar del residuo de cisteína.
7. Una molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 5ª o 6ª, que está modificada adicionalmente para codificar un aminoácido diferente en lugar del residuo de arginina codificado por los nucleótidos 199-201 como se indica en la Figura 27.
8. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7ª, que está modificada de tal modo que se codifica un residuo de serina en lugar del residuo de arginina.
9. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 27.
10. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 25.
11. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2ª, que codifica un ligando de TIE-2 modificado que se une a, pero no activa, un receptor de TIE-2, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ligando 1 de TIE-2, en el que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tipo fibrinógeno de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tipo fibrinógeno de ligando 2 de TIE-2.
12. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11ª, en la que la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 1 de TIE-2 está sustituida por una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio doblemente arrollado de ligando 2 de TIE-2.
13. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 24.
14. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12ª, que codifica un ligando de TIE-2 quimérico que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 26.
15. Un ligando de TIE-2 quimérico codificado por una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
16. Un ligando de TIE quimérico según la reivindicación 15ª, que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en las Figuras 24, 25, 26 ó 27.
17. Un ligando de TIE quimérico según la reivindicación 15ª, que tiene la secuencia indicada en la Figura 27, pero modificada para tener un aminoácido diferente en lugar del residuo de cisteína codificado por los nucleótidos 784-786.
18. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1ª a 14ª.
19. Un vector según la reivindicación 18ª, en el que la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a una secuencia de control de expresión capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante.
20. Un vector según las reivindicaciones 18ª o 19ª, que es un plásmido.
21. Un sistema hospedante-vector para la producción de un ligando quimérico según las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª, que comprende una célula hospedante y un vector según las reivindicaciones 18ª, 19ª o 20ª.
22. Un sistema hospedante-vector según la reivindicación 21ª, en el que la célula hospedante es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero.
23. Un método para producir un ligando como se define en las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª, que comprende desarrollar células de un sistema hospedante-vector según las reivindicaciones 21ª o 22ª, en condiciones que permitan la producción del ligando, y recuperar el ligando producido así.
24. Un anticuerpo que se une específicamente al ligando de una cualquiera de las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª, y que no se une a ligando de TIE-2 nativo.
25. Un anticuerpo según la reivindicación 24ª, que es un anticuerpo monoclonal.
26. Un conjugado que comprende un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª y, conjugado a él, un agente citotóxico.
27. Un conjugado según la reivindicación 26ª, en el que el agente citotóxico es un radioisótopo o toxina.
28. Una composición farmacéutica que comprende un ligando quimérico según las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª, y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
29. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según las reivindicaciones 24ª o 25ª, y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
30. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado según las reivindicaciones 26ª o 27ª, y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
31. Un ligando según las reivindicaciones 15ª, 16ª o 17ª, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal o un método de diagnosis.
32. Un anticuerpo según la reivindicación 24ª, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal o un método de diagnosis.
33. Un conjugado según la reivindicación 26ª, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal o un método de diagnosis.
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