MXPA99001210A - Ligandos del receptor tie-2 modificados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un ligando modificado TIE-2 el cual ha sido alterado por la adición, eliminación substitución de uno o más aminoácidos, o por medio del marcado, con por ejemplo, la porción Fc de la IgG-1 humana pero el cual retiene su capacidad para enlazar al receptor TIE-2. La invención además se proporciona para un ligando TIE-2 modificado el cual es un ligando TIE-2 quimérico comprende al menos una porción de un primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 el cual es diferente del primero. En una modalidad especifica la invención además se proporciona un ligando TIE quimérico que comprende al menos una porción de ligando 1 TIE-2 y una porción de ligando 2 TIE-2. Además la presente invención se proporciona para una molécula deácido nucleico aislado que codifica ligandos TIE-2 modificados ya descritos. La invención también se proporciona para composiciones terapéuticas asítambién como un método de bloquear el crecimiento de los vasos sanguíneos, un método para promover la neovascularización, un método de promover el crecimiento o diferenciación de una expresión célular del receptor TIE, un método de bloquear el crecimiento o diferenciación de una expresión celular del receptor TIE y un método para atenuar o prevenir el crecimiento del tumor en un humano.

Description

LIGANDOS DEL RECEPTOR TIE-2 MODIFICADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de la ingeniería genética y más particularmente a los genes para el receptor de las tirosinas cinasas y sus ligandos afines, su inserción en los vectores DNA recombinantes, y la producción de las proteínas codificadas en recipientes con cepas de microorganismos y recipientes de células eucarióticas. Más específicamente, la presente invención se dirige a un novedoso ligando modificado TI-E que enlaza al receptor TIE-2, así también como a métodos para elaborar y usar el ligando modificado. La invención además proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica al ligando modificado, y los métodos para la generación de ácido nucleico que codifica al ligando modificado y el producto del gen. El ligando TIE-2 modificado, así como también el ácido nucleico que lo codifica, pueden emplearse en la diagnosis y el tratamiento de ciertos padecimientos que involucran células endoteliales y receptores TIE asociados, tales como padecimientos neoplásticos que involucran el tumor de angiogénesis, cicatrización de heridas, padecimientos trombóticos, arteroesclerosis y padecimientos inflamatorios. Además, el ligando modificado puede usarse para promover la proliferación y/o diferenciación de células de origen hematopoyetico. Más en general, el receptor que activa a los ligandos TIE-2 modificado descrito aquí, puede usarse para promover el crecimiento, sobrevivencia, migración y/o diferenciación y/o estabilización o desestabilización de las células que expresan al receptor TIE. Puede usarse el ligando TIE-2 modificado biológicamente activo para mantener in vitro al receptor TIE que expresa las células en el cultivo. Las células y tejidos que expresan el receptor TIE incluyen por ejemplo, células endoteliales vasculares y cardiacas, células de epitelio ocular y del epicardio del corazón y hematopoyeticas tempranas. Alternativamente, pueden usarse tales ligandos humanos para soportar células las cuales están diseñadas para expresar al receptor TIE. Además, el ligando TIE-2 modificado y su receptor similar pueden usarse en sistemas de valoración para la identificación de agonistas o antagonistas adicionales del receptor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El responsable de la conducta celular para el desarrollo, mantenencia y reparación de las células y tejidos diferenciados se regula en gran parte por las señales intercelulares transportadas vía factores de crecimiento y ligandos similares y sus receptores. Los receptores están localizados en la superficie celular de las células de respuesta y se enlazan a los péptidos o polipéptidos conocidos como factores de crecimiento, así también como a otros ligandos similares a la hormona. Los resultados de esta interacción son cambios bioquímicamente rápidos en las células de respuesta, así también como un reajuste de largo término de la expresión celular del gen. Varios receptores asociados con varias superficies celulares pueden enlazar a factores del crecimiento específicos. La fosforilación de los residuos de las tirosinas en las proteínas por las tirosinas cinasas es uno de los modos claves por los cuales las señales son transducidas a través de la membrana del plasma. Varios genes de la proteína tirosina cinasa conocidos actualmente, codifican a los receptores de la transmembrana por las hormonas y polipéptidos del factor de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidemial (EGF) , insulina, factor-I de crecimiento similar a la insulina (IGF-I), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-A y -B) , y factores del crecimiento de fibroblastos (FGFs) . (Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich, et al., Cell, 61: 243-54 (1990)). En cada caso, estos factores de crecimiento ejercen su acción por el enlace a la porción extracelular de sus receptores parecidos, los cuales conducen a la activación de la tirosina cinasa intrínseca presentes en la porción citoplásmica del receptor. Los receptores del factor de crecimiento de las células endoteliales son de particular interés debido al posible envolvimiento de los factores de crecimiento en varios procedimientos patológicos y fisiológicos importantes, tales como vasculogenesis, angiogénesis, arteroesclerosis y padecimientos inflamatorios (Folkman, et al. Science, 235: 442-447 (1987)). También, los receptores de varios factores de crecimiento hematopoyeticos son las tirosinas cinasas; estas incluyen c-fms, las cuales son las colonias que estimulan el receptor del factor 1 de estimulación de la colonia, Sherr, et al., Cell, 41: 665-676 (1985), y c-kit, un receptor del factor de crecimiento hematopoyetico primitivo reportado en Huang, et al., Cell, 63: 225-33 (1990) . Los receptores de las tirosinas cinasas se han divido en subfamilias evolucionarías basadas en las estructuras características de sus ectodominios, (Ullrich, et al. Cell, 61: 243-54 (1990)). Tales subfamilias incluyen, la cinasa similar al receptor EGE (subclase I) y la cinasa similar al receptor de la insulina (subclase II), cada uno de los cuales contienen secuencias ricas en cisteína homologas repetidas en sus dominios extracelulares. Se encuentra también una sola región enriquecida en cisteína en los dominios extracelulares de las cinasas similares al eph. Hirai, et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg, et al. Mol. Cell. Biol., 10:6316-24 (1990); Lhotak, et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). Los receptores PDGF así también como las tirosinas cinasas del receptor c-kit y c-fms pueden agruparse en la subclase III; mientras que los receptores FGF forman la subclase IV. Típicas para los miembros de ambas de estas subclases son las unidades de pliegues extracelulares estabilizadas por los enlaces disulfuro intracadenas. Estos así llamados pliegues similares a la inmunoglobulina (Ig) se encuentran en las proteínas de la superfamilia de la inmunoglobulina la cual contiene una amplia variedad de otros receptores de la superficie celular que tienen ya sea enlaces celulares o ligandos solubles. Williams, et al., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988). El receptor de la tirosina cinasa difiere en su especificidad y afinidad. En general, los receptores de las tirosinas cinasas son glucoproteínas las cuales consisten de (1) un dominio extracelular capaz de enlazar al (los) factor (es) de crecimiento específicos; (2) un domino de transmembrana el cual usualmente es una porción alfahelicoidal de la proteína; (3) un dominio de la juxtamembrana en donde los receptores pueden regularse en, por ejemplo, la fosforilación de la proteína; (4) un dominio de la tirosina cinasa la cual es el componente enzimático del receptor; y (5) un extremo carboxiterminal el cual en muchos receptores está involucrado en el reconocimiento y enlace de los substratos para la tirosina cinasa. Los procedimientos tales como la unión del exon y la selección alternativa del gen promotor o sitios de poliadenilación han sido reportados por ser capaces de producir varios distintos polipéptidos a partir del mismo gen. Estos polipéptidos pueden o no contener los varios dominios listados arriba. Como una consecuencia, algunos dominios extracelulares pueden expresarse como proteínas secretadas, separadas y algunas formas de receptores pueden carecer del dominio de la tirosina cinasa y contener solamente el dominio extracelular insertado en la membrana del plasma vía el dominio excedente de la transmembrana un extremo carboxiterminal corto.

Un gen que codifica una tirosina cinasa de la transmembrana de las células endoteliales, originalmente identificados por RT-PCR como un fragmento de cDNA de la tirosina cinasa homólogo desconocido a partir de células humanas de leucemia, se describe por Partanen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917 (1990). Este gen y su proteina codificada es llamado "TIE" el cual es una abreviación para la "tirosina cinasa con dominios de homología EGF y Ig". Partanen, et al. Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992). Se ha reportado que el mRNA tie está presente en todos los tejidos embriónicos de ratones y fetos humanos. Sobre inspección, el mensaje tie se ha localizado en las células endoteliales vasculares y cardiacas. Específicamente, el mRNA tie se ha localizado en el endotelio de los vasos sanguíneos y el endocardio de embriones de ratones de 9.5 a 18.5 días de edad. La expresión del tie incrementada se muestra durante la neovascularización asociada con el desarrollo de folículo de ovario y tejidos de granulación en piel herida. Korhonen, et al. Blood 80: 2548-255 (1992). Además, el TIEs se ha sugerido por jugar un papel en la angiogénesis, la cual es importante para desarrollar tratamientos para tumores sólidos y varios otros padecimientos dependientes de la angiogénesis tales como la renipatía diabética, soriasis, artereoesclerosis y artritis. Se han reportado dos proteínas del receptor TIE en ratas, relacionadas estructuralmente, codificadas por distintos genes con perfiles relacionados de la expresión. Un gen, de termino tie-1 es el homólogo rata del tie humano. Maisonpierre, et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). El otro gen tie-2, puede ser él homologo rata del gen tek murina, en el cual el tie es similar, se han reportado por expresarse en el ratón exclusivamente en células endoteliales y sus progenitores presuntivos. Du ont, et al, Oncogene 8: 1293-1301 (1993). El homólogo humano de tie-2 se describe en Ziegler, Patente Norteamericana No. 5,447,860 la cual se publicó el Septiembre 5, 1995 (en donde es referido como "ork"), el cual está incorporado aquí en su totalidad. Ambos genes se encuentran ampliamente expresados en células endoteliales y tejidos postnatales. Niveles significantes de transcriptores tie-2 se encuentran también presenten en otras poblaciones celulares embriónicas incluyendo epitelios oculares, epicardio del corazón y regiones de mesénquimas. Maisonpierre, et al. Oncogene 8: 1631.1637 (1993). La expresión predominante del receptor TIE en endotelios vasculares sugiere que el TIE juega un papel en el desarrollo y mantenimiento del sistema vascular. Esto puede incluir papeles en la determinación de células endoteliales, proliferación, diferenciación y migración celular y ejemplificación en modelos vasculares. El análisis de embriones de ratón deficientes en TIE-2 ilustra esta importancia en la angiogénesis, particularmente para la formación del retículo vascular en células endoteliales. Sato, T.N., et al., Nature 376:70-74 (1995). En el sistema vascular maduro el TIEs puede funcionar en la supervivencia de células endoteliales, mantenimiento y respuesta a las influencias patogénicas . Los receptores TIE están también expresados en células de origen hematopoyetico primitivas, células B y una subserie de células de megacariocíticas, además se sugiere el papel de los ligandos los cuales enlazan estos receptores en hematopoiesis tempranas, en la diferenciación y/o proliferación de células B, y en la forma de diferenciación megacariocitica. Iwama, et al. Biochem, Biophys. Research Communications 195:301-309 (1993); Hashiyama, et al. Blood 87:93-101 (1996). Batard, et al. Blood 87:2212-2220 (1996).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se proporciona para una composición que comprende un ligando modificado TIE substancialmente libre de otras proteínas. Como se usó aquí, el ligando modificado TIE-2 se refiere a un ligado de la familia TIE de los ligandos, cuyos representativos comprenden ligandos TL1, TL2, TL3 y TL4 como se describe aquí, los cuales han sido alterados por la adición, supresión o substitución de uno o más aminoácidos, o por medio del etiquetado con por ejemplo, la porción Fc del IgG-1 humano, pero el cual retiene su capacidad para enlazar al receptor TIE-2. El ligando modificado TIE-2 también incluye un ligando TIE-2 quimérico que comprende, al menos, una porción de un primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 el cual es diferente del primero. Por medio de un ejemplo no limitante, el ligando TIE-2 es TL1 y el segundo ligando es TL2. La invención prevé otras combinaciones usando además, miembros de la familia del ligando TIE-2. Por ejemplo, otras combinaciones para crear un ligando TIE-2 quimérico son posibles, incluyendo pero no limitando a aquellas combinaciones en donde el primer ligando se selecciona a partir del grupo que consiste de TL1, TL2, TL3 y TL4, y el segundo ligando, diferente del primer ligando, se selecciona a partir del grupo que consiste de TL1, TL2, TL3 y TL4. La invención también se proporciona para una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un ligando TIE modificado. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada codifica un ligando TIE de la familia TIE de los ligandos, cuyos representativos comprenden ligandos TL1, TL2, TL3 y TL4 como se describió aquí, los cuales han sido alterados por la adición, supresión o substitución de uno o más aminoácidos, o por medio del etiquetado con por ejemplo, la porción Fc del IgG-1 humano, pero el cual retiene su capacidad para enlazar al receptor TIE-2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada codifica un ligando modificado TIE-2 el cual es un ligando quimérico TIE-2 que comprende al menos, una porción de un primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 la cual es diferente del primero. Por medio de los ejemplos no limitativos, el primer ligando TIE-2 es TL1 y el segundo ligando TIE-2 es TL2. La invención prevé otras combinaciones usando además, miembros de la familia del ligando TIE-2. Por ejemplo, son posibles otras combinaciones, incluyendo pero no limitando a aquellas combinaciones en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un ligando modificado TIE-2 el cual es un ligando quimérico TIE-2 que comprende una porción de un primer ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de TL1, TL2, TL3 y TL4, y una porción de un segundo ligando, diferente del primer ligando, seleccionada a partir del grupo que consiste de TL1, TL2, TL3 y TL4. El ácido nucleico aislado puede ser DNA, cDNA o RNA. La invención también se proporciona para un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando TIE-2 modificado. La invención además se proporciona para un sistema de vector hospedero para la producción en una célula huésped adecuada de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un ligando TIE-2 modificado. La célula huésped adecuada puede ser bacterial, levadura, insecto o mamífero. La invención también se proporciona para un método para producir un polipéptido que tiene la actividad biológica de un ligando TIE-2 modificado el cual comprende el crecimiento celular del sistema del vector huésped bajo condiciones que permiten la producción del polipéptido y la recuperación del polipéptido así producido. La invención aquí descrita de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un ligando TIE-2 modificado, además se proporciona para el desarrollo del ligando como un terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen de alteraciones que involucran células, tejidos u órganos los cuales expresan al receptor TIE-2. La presente invención también se proporciona para un anticuerpo el cual enlaza específicamente como tal a una molécula terapéutica. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La invención también se proporciona para un método de emplear tal anticuerpo monoclonal o policlonal midiendo la cantidad de la molécula terapéutica en una muestra tomada a partir de un paciente para propósitos de monitorear el curso de la terapia. La presente invención también se proporciona para un anticuerpo el cual enlaza específicamente un ligando TIE-2 modificado como se describe aquí. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Además, la invención se proporciona adicionalmente para composiciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo el cual enlaza específicamente un ligando TIE-2 modificado, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se proporciona para un método de crecimiento bloqueando vasos sanguíneos en un mamífero, por la administración de una cantidad efectiva de una composición terapéutica que comprende un anticuerpo el cual enlaza específicamente a un receptor que activa al ligando modificado TIE-2 como se describe aquí, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención además se proporciona para composiciones terapéuticas que comprenden un ligando TIE- 2 modificado como se describe aquí, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se proporciona para un método de promover la neovascularización en un paciente por la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición terapéutica que comprende un receptor que activa al ligando modificado TIE-2 como se describe aquí, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el método puede usarse para promover la cicatrización de heridas. En otra modalidad, el método puede usarse para tratar la isquemia. En otra modalidad aún, se usa un receptor que activa al ligando modificado TIE-2 como se describe aquí, solo o en combinación con otros factores hematopoyéticos, para promover la proliferación o diferenciación de las células de origen hematopoyéticas, células B o células megacariocíticas . Alternativamente, la invención proporciona que un ligando modificado TIE-2 pueda conjugarse a un agente citotóxico y una composición terapéutica preparada a partir de eso. La invención además se proporciona para un cuerpo receptor el cual específicamente enlaza a un ligando modificado TIE-2. La invención además se proporciona para composiciones terapéuticas que comprenden un cuerpo receptor el cual enlaza específicamente a un ligando modificado TIE-2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se proporciona para un método de crecimiento bloqueando vasos sanguíneos en un mamífero por la administración de una cantidad efectiva de una composición terapéutica que comprende un anticuerpo receptor el cual enlaza específicamente un ligando modificado TIE-2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también se proporciona para un antagonista receptor de TIE-2 así como también un método de inhibir la actividad biológica de TIE-2 en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista TIE-2. De conformidad con la invención, el antagonista puede ser un ligando modificado TIE-2 como se describe aquí, el cual enlaza, pero no activa al receptor de TIE-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURAS ÍA y IB- El cuerpo receptor IE-2 (TIE-2 RB) inhibe el desarrollo de los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoica de embrión de pollito (CAM) . Una sola pieza de la espuma de gelatina resorbable (Gelfoam) se remoja con 6 µg de RB se insertan inmediatamente bajo el CAM de embriones de pollo de 1 día. Después de 3 días de incubación, embriones de 4 días de edad y rodeados de CAM se removieron y examinaron. FIGURA ÍA: los embriones tratados con RB EHK-1 (rEHK-1 ecto/hlgGl Fc) fueron viables y tuvieron vasos sanguíneos desarrollados normalmente en sus CAM de los alrededores. FIGURA IB: todos los embriones tratados con RB TIE-2 (r TIE-2 ecto /h IgGl Fc), se murieron, disminuyeron en tamaño y fueron al menos completamente libres de vasos sanguíneos redondeantes.

FIGURA 2- Vector pJFE14.

FIGURA 3- Mapa de restricción de ?gtlO.

FIGURA 4- Secuencias de ácido nucleico y aminoácido derivado (código de una letra) del ligando 1 TIE-2 humano a partir del clon ?gtlO que codifica al ligando 1 htie-2.

FIGURA 5 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos (código de una letra) del ligando 1 TIE-2 humano a partir del clon T98G.

FIGURA 6 - Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos (código de una letra) del ligando TIE-2 humano a partir del clon KS pBluescript que codifica al ligando 2 TIE humano .

FIGURA 7 - El manchado Western muestra la activación del receptor TIE-2 por el ligando 1 TIE-2 (fila Ll) pero no por el ligando 2 TIE-2 (fila L2) o control (simulado) .

FIGURA 8 - El manchado Western muestra el tratamiento previo de células HAEC con excesos del ligando 2 TIE-2 (fila 2) antagonizando la capacidad subsecuente de diluir al ligando 1 TIE-2 para activar al receptor TIE-2 (TIE2-R) comparada con el tratamiento anterior de las células HAEC con un medio Simulado (Fila 1).

FIGURA 9. La mancha Western demuestra la capacidad de TL2 para inhibir competitivamente la activación TL1 del receptor TIE-2 usando la línea híbrida de células humanas, EA.hy926.

FIGURA 10 - Histograma de representación del enlace al IgG TIE-2 de rata en una superficie inmobilizada por el ligando TIE-2 en C2C12, Rat2 ras, SHEP, y un medio acondicionado concentrado (lOx) de T98G. Los enlaces específicos de TIE-2 de rata (rTIE2) están demostrados por la reducción significante en la actividad enlazante en la presencia de 25 µg/ml de TIE-2 RB soluble como la comparada a una reducción menor en la presencia de trkB RB soluble.

FIGURA 11- Enlace del ligando 1 TIE-2 (hTLl) humano recombinante y el ligando 2 TIE-2 (hTL2) humano, en sobrenadantes de células COS a una superficie inmobilizada (RB) de un cuerpo receptor de TIE-2 humano. El enlace específico TIE-2 humano se determino por la incubación de las muestras con 25 µg/ml de ya sea TIE-2 RB humano soluble o trkB RB; la reducción significante en la actividad enlazante se observa solamente por las muestras incubadas con TIE-2 RB humano.

FIGURA 12- Las manchas Western mostraron que el cuerpo receptor de TIE-2 (denotado por TIE-2 RB o, como aquí, TIE2-Fc) bloquea la activación de los receptores TIE-2 por el ligando 1 TIE-2 (TLl) en células HUVEC, mientras no se refiera al cuerpo receptor (TRKB-Fc) no se bloquea esta activación.

FIGURA 13- Los geles de agarosa mostraron diluciones en serie [(1) a 10~4 no diluidos] de los productos TLl y TL2 RT-PCR obtenidos a partir de hígado fetal de ratones (filas 1- total, filas 3- estroma enriquecido, y filas 4- c-kit+TER119 células precursoras hematopoyeticas) y timo fetal de ratón (filas 2- total) E14.5.

FIGURA 14 - Los geles de agarosa muestran diluciones en serie [ (1) a 10"3 no diluidas] de los productos TLl y TL2 RT-PCR obtenidos a partir de las células del estroma cortical del ti us fetal de ratón (filas 1- CDR1+/A2B5-) y células medularmente estromales (fila CDR1-/A2B5+) .

FIGURA 15. Una representación esquemática del papel hipotetizado de los ligandos TIE-2/TIE en angiogénesis. El TLl está representado por (•) , el TL2 está representado por (*) , el TIE-2 está representado por (T) , el VEGF está representado por ([]), y el flk-1 (un receptor VEGF) está representado por (Y) .

FIGURA 16 - El deslizamiento de la hibridación in situ muestra el modelo de expresión temporal de TIE-2, TLl. TL2 y VEGF durante la angiogénesis asociada con el desarrollo folicular y la formación del lúteo corporal del ovario de una rata que se trató con suero de yegua preñada. Columna 1: folículo pre-ovulatorio temprano; Columna 2: folículo pre-ovulatorio; Columna 3: lúteo corporal temprano; y Columna 4; folículo artrítico; Hilera A: campo brillante; Hilera B: VEGF; Hilera C: TL2; Hilera D: TLl e Hilera E: receptor TIE-2.

FIGURA 17 - Comparación de las secuencias de aminoácidos de la proteína TLl madura y la proteína TL2 madura. La secuencia TLl es la misma como la expuesta en la Figura 4, excepto que la secuencia líder putativa ha sido removida. De manera similar, la secuencia TL2 es la misma como la expuesta en la Figura 6, excepto que la secuencia líder putativa ha sido eliminada. Las flechas indican los residuos Arg49, Cys245 y Arg264 de TLl, los cuales corresponden a los residuos en las posiciones de los aminoácidos 69, 265 y 284, respectivamente, del TLl como se expone en la Figura 4.

FIGURA 18- El manchado Wesrtern de la estructura multimérica covalente de TLl y TL2 (Panel A) y la interconversión de TLl y TL2 por la mutación de una cisteína (Panel B) .

FIGURA 19 - Una curva típica del enlace TIE-2-IgG para el TLl inmovilizado en un ensayo cuantitativo de enlace libre de células.

FIGURA 20- Una curva típica mostrando el cuerpo ligando del ligando 1 TIE-2 que comprende el dominio similar al fibrinógeno del enlace del ligando al dominio Fc del enlace IgG (TLl-fFc) para el ectodominio de TIE-2 inmovilizado en un ensayo cuantitativo de enlace libre de células.

FIGURA 21 - Secuencias de nucleótidos y derivados de aminoácidos (código de una sola letra) del ligando 3 TIE. La secuencia codificante inicia en la posición 47. El dominio similar al fibrinogeno inicia en la posición 929.

FIGURA 22 - Comparación de las secuencias de Aminoácidos de los miembros de la familia del ligando TIE, mTL3 = ligando 3 TIE de ratón; hTLl = ligando 1 TIE-2 humano; chTLl = ligando 1 TIE-2 de pollito; mTLl = ligando 1 TIE-2 de ratón; mTL2 = ligando 2 TIE-2 de ratón; hTL2 = ligando 2 TIE-2 humano. La.s regiones encasilladas indican las regiones conservadas de la homología entre los miembros de las familias.

FIGURA 23- Secuencias de nucleótidos y derivados de amino ácidos (código de una sola letra) del ligando-4 TIE. Las flechas indican la posición 569 del nucleótido.

FIGURA 24- Las secuencias de nucleótidos y derivados de aminoácidos (código de una sola letra) del ligando TIE quimérico se designan 1N1C2F (espectro 1) . La secuencia líder putativa está codificada por los nucleótidos 1-60.

FIGURA 25- Las secuencias de nucleótidos y derivados de aminoácidos (código de una sola letra) del ligando TIE quimérico se designa 2N2C1F (espectro 2) . La secuencia líder putativa está codificada por los nucleótidos 1-48.

FIGURA 26- Las secuencias de nucleótidos y derivados de aminoácidos (código de una sola letra) del ligando TIE quimérico se designan 1N2C2F (químero 3) . La secuencia líder putativa está codificada por los nucleótidos 1-60.

FIGURA 27- Las secuencias de nucleótidos y derivados de aminoácidos (código de una sola letra) del ligando TIE quimérico se designa 2N1C1F (químero 4). La secuencia líder putativa está codificado por los nucleótidos 1-48.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describe en gran detalle a continuación, los solicitantes han creado novedosos ligandos modificados TIE-2 que enlazan al receptor TIE-2. La presente invención se proporciona para una composición que comprenden un ligando modificado TIE-2 substancialmente libre de otras proteínas. Como se usó aquí, el ligando modificado TIE-2 se refiere a un ligando de la familia TIE de ligandos, cuyos representantes comprenden ligandos TLl, TL2, TL3, y TL4 como se describió aquí, el cual ha sido alterado por la adición, supresión o substitución de uno o más aminoácidos, o por medio del etiquetado con por ejemplo, la porción Fc del IgG-1, pero los cuales retienen su capacidad para enlazar al receptor TIE—2. El ligando modificado TIE-2 también incluye un ligando TIE-2 quimérico al menos una porción del primer ligando TIE-2 y una porción del segundo ligando TIE-2 la cual es diferente del primero. Por medio del ejemplo no limitativo, el primer ligando TIE-2 es TLl y el segundo ligando TIE-2 es TL2. La invención prevé otras combinaciones usando los miembros de la familia del ligando TIE-2 adicional. Por ejemplo, otras combinaciones para crear un ligando quimérico TIE-2 son posibles, incluyendo pero no limitando a aquellas combinaciones en donde el primer ligando se selecciona a partir del grupo que consiste de TLl, TL2, TL3 y TL4, y el segundo ligando, diferente del primer ligando, se selecciona a partir del grupo que consiste de TLl, TL2, TL3 y TL4.

La invención también se proporciona para una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un ligando modificado TIE-2. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislado codifica a un ligando TIE-2 de la familia TIE de los ligandos, cuyos representativos comprenden ligandos TLl, TL2, TL3 y TL4 como se describe aquí, los cuales han sido alterados por la adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos, o por medio del etiquetado, con por ejemplo, la porción Fc del IgG-i humano, pero el cual retiene su capacidad para enlazar al receptor TIE-2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un ligando TIE-2 el cual es un ligando quimérico TIE-2 que comprende al menos una porción de un primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 la cual es diferente del primero. Por medio de un ejemplo no limitativo, el primer ligando TIE-2 es TLl y el segundo ligando TIE-2 es TL2. La invención prevé otras combinaciones usando a los miembros de la familia del ligando adicional TIE-2. Por ejemplo, son posibles otras combinaciones, incluyendo pero no limitando a aquellas combinaciones en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica a un ligando modificado TIE-2 el cual es un ligando quimérico TIE-2 que comprende una porción de un primer ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de TLl, TL2, TL3 y TL4, y una porción de un segundo ligando diferente del primer ligando, seleccionado a partir del grupo que consiste de TLl, TL2, TL3 y TL4. La presente invención comprende los ligandos modificados TIE-2 y sus secuencias de aminoácidos, así también como las variantes funcionalmente equivalente de las mismas, así también como proteínas o péptidos que comprenden substituciones, supresiones o mutantes insersionales de las secuencias descritas, las cuales enlazan al receptor TIE-2 y actúan como agonistas o antagonistas del mismo. Tales variantes incluyen aquellas en las cuales los residuos aminoácidos son substituidos por residuos dentro de la secuencia resultante en un cambio inactivo. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden ser substituidos por cualquier otro(s) aminoácido (s) de una polaridad similar los cuales actúan como un equivalente funcional, resultando en una alteración inactiva. Los substitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar a partir de otros miembros de la clase a la cual los aminoácidos pertenecen. Por ejemplo, la clase de los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluye alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, trionina, cisteína, tirosina, aspargina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. También incluidas dentro del ámbito de la invención están las proteínas o fragmentos o derivados de las mismas, las cuales exhiben la misma o similar actividad biológica corno la de los ligandos modificados TIE-2 descritos aquí, y derivados de los cuales están diferencialmente modificados durante o después de la translación, por ejemplo, por glicosilación, desdoblamiento proteolítico, enlace a un anticuerpo molecular u otros ligandos celulares, etc. Las moléculas funcionalmente equivalentes también incluyen aquellas que contienen modificaciones, incluyendo modificaciones N-terminales, las cuales resultan a partir de la expresión de un hospedero particular recombinante, tal como por ejemplo, metilación N-terminal, la cual ocurre en ciertos sistemas de expresión bacterial (por ejemplo E. coli) . La presente invención también está abarcada por las secuencias nucleótidas que codifican a las proteínas descritas aquí así como a los ligandos modificados TIE-2, como también a las células hospederas, que incluyen levaduras, bacterias, virus y células de mamíferos, las cuales están genéticamente diseñadas para producir las proteínas, por ejemplo transfección, transducción, infección, electroporación, o microinyección del ácido nucleico que codifica a los ligandos modificados TIE-2 descritos aquí, en un vector de expresión adecuado. La presente invención también está abarcada por la introducción del ácido nucleico que codifica los ligandos modificados TIE-2 mediante técnicas de terapias de gen tales como se describen, por ejemplo, en Finkel y Epstein FASEB J. 9:843-851 (1995); Guzman, et al. PNAS (USA) 91:10732-0736 (1994) . Un experto en la técnica también reconocerá que la presente invención esta abarcada por las secuencias DNA y RNA que hibridizan a un ligando modificado TIE-2 que codifica una secuencia nucleótida, bajo condiciones de estrigencia moderada, como se definió en, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloniong: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1 pp, 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Además, una molécula de ácido nucleico contemplada por la invención incluye una que tiene una secuencia nucleótida derivada de una secuencia de aminoácidos de un ligando TIE-2 modificado preparada como se describe aquí, así también como una molécula que tiene una secuencia de nucleótidos que hibridiza como tal una secuencia de nucleótidos, y también una secuencia nucleótida la cual se degenera de las secuencias anteriores como un resultado del código genético, pero la cual codifica un ligando que enlaza al receptor TIE-2 y el cual tiene una secuencia de aminoácidos y otras características primarias, secundarias y terciarias que son suficientemente duplicativas de un ligando modificado TIE-2 descrito aquí así como para conferir en la molécula la misma actividad biológica como la del ligando modificado TIE-2 descrita aquí. La presente invención se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un ligando modificado TIE-2 que enlaza y activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2, en donde la porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica al dominio N-terminal del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucieótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 2 TIE-2. La invención también se proporciona para tal molécula de ácido nucleico, con una modificación adicional tal que la porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica al dominio de rollo enroscado del ligando 1 TIE-2 es reemplazado por una secuencia nucleótida que codifica al dominio de rollo enroscado del ligando 2 TIE-2.

La presente invención también se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un ligando modificado TIE-2 que enlaza y activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2 en donde la porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica al dominio N-terminal del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 2 TIE-2 y el cual es además modificado por codificar un aminoácido diferente en vez del residuo de cisteína codificado por los nucleótidos 784-787 como se expuso en la figura 27. Un residuo serina es preferiblemente substituido por el residuo de cisteína. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico es además modificada por codificar un aminoácido diferente en vez del residuo de arginina codificado por los nucleótidos 199-201 como se expuso en la Figura 27. Un residuo serina es substituido preferiblemente por el residuo arginina.

La presente invención también se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un ligando modificado TIE-2 que enlaza y activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2, la cual está modificada para codificar un aminoácido diferente en vez del residuo cisteína a la posición de aminoácido 245. Un residuo serina es preferiblemente substituido por el residuo cisteína.

La invención también se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un ligando modificado TIE-2 que enlaza pero no activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2 en donde la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 1 TIE-2 es eliminada. La invención también se proporciona para tal molécula de ácido nucleico además modificado de manera que la porción de la secuencia nucleótida que codifica al domino de rollo-enroscado del ligando 1 TIE-2 es eliminada y la porción que codifica al dominio parecido al fibrinógeno es fusionado en la estructura a una secuencia nucleótida que codifica una región constante gamma 1 de inmunoglobulina humana (IgGl Fc) . La invención además se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un ligando TIE-2 modificado que enlaza pero no activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 2 TIE-2 en donde la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 2 TIE-2 es eliminada. La invención también se proporciona para tal molécula de ácido nucleico además modificada de manera que la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio de rosca enroscada del ligando 2 TIE-2 es eliminada y la porción que codifica al dominio similar al fibrinogeno es fusionada en estructura a una secuencia nucleótida que codifica una región constante gamma-1 de inmunoglobulina humana (IgGl Fc) .

La invención además se proporciona para una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un ligando modificado TIE-2 que enlaza pero no activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2 en donde la porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica al dominio similar al fibrinógeno del ligando TIE-1 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio similar al fibrinógeno del ligando 2 TIE-2. La invención también se proporciona para tal molécula de ácido nucleico además modificada de manera que la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio de rosca enroscado del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio de rosca enroscada del ligando 2 TIE-2.

La invención además se proporciona para un ligando TIE-2 modificado que codifica por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

La presente invención también se proporcionara para un ligando quimérico TIE-2 que comprende al menos una porción del primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 el cual es diferente del primero, en donde el primer y segundo ligando TIE-2 están seleccionados a partir del grupo que consiste del ligando 1 TIE-2, ligando 2 TIE-2, ligando 3 TIE y ligando 4 TIE. Preferiblemente, el ligando quimérico TIE comprende al menos una porción del ligando 1 TIE-2 y una porción del ligando 2 TIE 2.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un ligando quimérico TIE como se expone en la figura 24, 25, 26 o 27. La invención también proporciona un ligando quimérico TIE como se expuso en la Figura 24, 25, 26 o 27. La invención además proporciona un ligando quimérico TIE como se expuso en la figura 27, modificado para tener un aminoácido diferente en vez de 1 residuo cisteína codificado por los nucleótidos 784-787- Cualquiera de los métodos conocidos para un experto en la técnica para la insersión de los fragmentos DNA en un vector pueden usarse para construir los vectores de expresión que codifican un ligando modificado TIE-2 usando señales de control transcripcional/translaoional apropiadas y las secuencias de codificación de proteínas. Estos métodos pueden incluir DNA recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recimbinaciones in vivo (recombinación genética) . La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ligando modificado TIE-2 o fragmentos péptidos del mismo pueden regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico la cual está enlazada operablemente al ligando modificado TIE-2 que codifica la secuencia de manera que el ligando modificado TIE-2 proteína o péptido está expresado en un hospedero transformado con la molécula DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de un ligando modificado TIE-2 descrito aquí, puede controlarse por cualquier elemento promotor/incrementador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para control de la expresión del ligando incluyen, pero no están limitados para repetir la longitud terminal como se describe en Squinto et al., (Cell 65:1-20 (1991)); la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310) , el promotor CMV, la terminal repetida 5' M-MuLV, el promotor contenido en la terminal larga 3' repetida del virus del sarcoma Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980) el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 78: 144-145 (1981)), el promotor del adenovirus, las secuencias reguladoras del gen metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procariotica tales como el promotor ß-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 25:3727-3731 (1978)), o el promotor tac (DeBoer, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:21-25 (1983)), ver también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 242:74-94 (1980); elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADH (alcohol deshidrogenasa) , promotor PGK (fosfoglicerol cinasa), promotor fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional animal, los cuales presentan la especificidad del tejido y han sido utilizadas en los aminales trangénicos; región de control del gen elastasa 1 el cual es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987); región de control del gen de insulina el cual está activo en la células beta pancreáticas [Hanahan, Nature 315:115-122 (1985)]; región de control del gen de inmunoglobulina el cual está activo en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell _38_: 647-658; Adames et al., 1985,, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7_:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario en ratón, el cual está activo en las células linfoides y mast, del pecho y testiculares (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), región de control del gen albúmina, el cual está activo en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1:268-276), región de control del gen alfa-fetoproteína el cual está activo en el hígado (Krumlauf et al., 1985. Mol. Cell. Biol. 5 l639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58) ; región de control del gen alfa 1-antitripsina, el cual está activo en el hígado (Kelsey et al, 1987, Genes y Devel. V161-171), región del control del gen beta-globina el cual está activo en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 4 :89-94); región del control del gen de la proteína básica mielina el cual está activo en los oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell _48_: 703-712) ; región de control del gen ligero de cadena 2 miosina el cual está activo en el músculo esqueleto (Shani, 1985, Nature 314:283-286), y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica el cual está activo en el hipotálamo (Masón et al., 1986; Science 234:1372-1378). La invención también está abarcada por la producción de compuestos antisensores los cuales son capaces de hibridizar específicamente con una secuencia de RNA que codifica un ligando modificado TIE-2 para modular su expresión. Ecker, Patente Norteamericana No. 5,166,195, publicada el 24 de Noviembre de 1992. Además, de conformidad con la invención, los vectores de expresión capaz de ser replicados en un hospedero bacterial o eucariótico comprenden un ácido nucleico que codifica un ligando modificado TIE-2 como.se describe aquí, son usados para transfectar un hospedero y con ello la expresión directa de tal ácido nucleico para producir un ligando modificado TIE-2, el cual puede ser entonces recuperado en una forma biológicamente activa. Como se usó aquí, una forma biológicamente activa incluye una forma capaz de enlazar al receptor TIE y causar una respuesta biológica a tal como una función diferenciada o influenciando el fenotipo del receptor de expresión celular. Tales formas biológicamente activas pueden, por ejemplo, inducir fosforilación del dominio de la tirosina cinasa del receptor TIE. Alternativamente, la actividad biológica puede ser un efecto como un antagonista al receptor TIE. En modalidades alternativas, la forma activa de un ligando modificado TIE-2 es uno que puede reconocer al receptor TIE y con ello, actuar como un agente objetivo para el receptor para usar en ambos, diagnósticos y terapéuticos. De conformidad con tales modalidades, la forma activa no necesita conferir sobre cualquier célula de expresión del TIE cualquier cambio en el fenotipo. Los vectores de expresión que contienen los genes insertos pueden ser identificados por cuatro propuestas en general: (a) hibridación DNA-DNA, (b) presencia o ausencia de las funciones del gen "marcador", (c) expresión de las secuencias insertadas y (d) detección PCR. En la primera propuesta, la presencian de un gen extraño o ajeno insertado en un vector de expresión puede detectarse por la hibridación DNA-DNA usando pruebas que comprenden secuencias que son homologas a un ligando modificado TIE-2 insertado que codifica un gen. En la segunda propuesta, el sistema recombinante vector/hospedero puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del "marcador" de gen (por ejemplo, actividad timidina cinasa, resistencia a antibióticos , fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc . ) causada por la insersión de genes extraños o ajenos en el vector. Por ejemplo, si un ácido nucleico que codifica un ligando modificado TIE-2 se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen el inserto pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. En la tercera propuesta, los vectores de expresión recombinante pueden identificarse por la valoración del producto de gen extraño o ajeno expresado por el recombinante. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de un producto de gen de ligando modificado TIE-2, por ejemplo, por el enlace del ligando al receptor TIE o una porción del mismo el cual puede ser marcado con, por ejemplo, un anticuerpo detectable o una porción del mismo o por el enlace a los anticuerpos producidos contra la proteína del ligando modificado TIE-2 o una porción del mismo. Las células de la presente invención pueden temporalmente o, preferiblemente, constitutivamente y permanentemente expresar un ligando modificado TIE-2 como se describe aquí. En las cuatro propuestas, los sebadores nucleótidos DNA pueden prepararse correspondientes a una secuencia DNA tie especifica enlazada. Estos sebadores pueden entonces usarse a PCR a un fragmento de gen enlazante tie (protocolos PCR: A Guide To Methods and Applications, Edi ted by Michael A. Innis et al . , Academic Press ( 1990 ) ) .

El ligando recombinante puede purificarse por cualquier técnica la cual permita la formación subsecuente de una proteína estable, biológicamente activa. Preferiblemente, el ligando es secretado en el medio de cultivo a partir del cual es recuperado. Alternativamente, el ligando puede recuperarse a partir de células ya sea como proteínas solubles o como cuerpos de oclusión, a partir del cual pueden extraerse cuantitativamente por el clorhidrato de guanidina 8M y diálisis de conformidad con la metodología bien conocida. A fin de purificar adicionalmente al ligando, se pueden usar la cromatografía de afinidad, cromatografía convencional de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de fase inversa o filtración en gel.

En modalidades adicionales de la invención, como se describe en mayor detalle en los Ejemplos, un ligando modificado TIE-2 que codifica un gen puede usarse para inactivar o "golpear" un gen endógeno por la recombinación homologa, y con ello crear una célula, tejido o animal deficiente del ligando TIE. Por ejemplo, y no por medido de limitación, el ligando 4 TIE recombinante que codifica un gen puede modificarse por contener una mutación insersional, por ejemplo el gen neo, el cual puede inactivar el ligando 4 TIE nativo que codifica al gen. Tal estructura, bajo el control de un promotor adecuado, puede introducirse en una célula, tal como una célula contenida en un embriónico, por una técnica tal como transfección, transducción o inyección. Las células que contienen la estructura pueden entonces seleccionarse por la resistencia G418. Las células que carecen de un ligando-4 TIE intacto que codifican un gen pueden entonces identificarse por ejemplo, por manchado Southern, detecció PCR, manchado Northen o ensayo de expresión. Las células que carecen de un ligando-4 TIE intacto que codifica un gen puede entonces ser fusionadas a las células de embriones tempranos para generar animales transgénicos deficientes en tales ligandos. Tales animales pueden usarse para definir procedimientos específicos in vivo dependientes normalmente del ligando.

La presente invención también se proporciona para anticuerpos a un ligando modificado TIE-2 descrito aquí el cual es empleado para la detección del ligando en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas. Para la preparación de los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un ligando modificado TIE-2, se puede usar cualquier técnica que se proporcione para la producción de las moléculas de anticuerpos por las líneas celulares continuas en cultivos. Por ejemplo, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kolher y Milsteim (1975, Nature 256: 495-497) , así también como la técnica trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas. (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma EBV para producir los anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., 1985, en "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", Alan R. Liss, Inc. Pp. 77-96) y los similares están dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos de humanos-ratones (o de otras especies) . Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser elaborados por cualquiera de las numerosas técnicas conocidas en el arte (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, I munology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Las moléculas de los anticuerpos quiméricos pueden prepararse conteniendo un dominio de enlace antígeno de ratón con regiones constantes humanas (Morrison et al., 1984,, Proc. Natl: Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452). Se pueden usar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales a epitopes de un ligando modificado TIE-2 descrito aquí. Para la producción de anticuerpos, varios animales hospederos incluyendo pero no limitando a los conejos, ratones, ratas pueden inmunizarse por inyección con un ligando modificado TIE-2, o un fragmento o derivado del mismo. Varios adyuvantes pueden usarse para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo en las especies hospederas, e incluyendo pero no limitando a geles minerales de Freund (completos e incompletos) , tales como hidróxido de aluminio, substancias activas de la superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceites, hemocianinas de puntas de minas magnéticas, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente empleados tales como BCG (Bacillo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Un clon molecular de un anticuerpo para una selección de un epitope de ligando modificado TIE-2, puede prepararse por técnicas conocidas. La metodología de DNA recombinante (ver por ejemplo., Maniatis et al., 1982, Molecular Clonging A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) puede usarse para construir secuencias de ácido nucleico las cuales codifican una molécula de anticuerpo monoclonal o una región de enlace antígeno del mismo. La presente invención proporciona para moléculas de anticuerpo así también como fragmentos de tales moléculas de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos los cuales contienen el idiotipo de la molécula puede generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a: el fragmento F(ab')2 el cual puede producirse por la digestión de pepsina de la molécula del anticuerpo; los fragmentos Fab' pueden generarse por la reducción de los puentes de disulfuro del fragmento F(ab')2, y los fragmentos Fab los cuales pueden generarse por el tratamiento de la molécula del anticuerpo con papaína y un agente reductor. Las moléculas de los anticuerpos pueden purificarse por técnicas conocidas, por ejemplo, inmunoabsorción, cromatografía de inmunoafinidad, métodos cromatográficos, tal como HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), o una combinación del mismo. La presente invención además abarca un inmunoensayo para medir la cantidad de un ligando modificado TIE-2 en una muestra biológica para a) contactar la muestra biológica con al menos un anticuerpo el cual enlaza específicamente a un ligando modificado TIE-2 de manera que el anticuerpo forma un complejo con cualquier ligando modificado TIE-2 presente en la muestra y; b) medir la cantidad del complejo y con ello medir la cantidad del ligando modificado TIE-2 en la muestra biológica.

La invención además abarca un ensayo para medir ia cantidad del receptor TIE en una muestra biológica por a) contactar la muestra biológica con al menos un ligando de la invención, de manera que el ligando forma un complejo con el receptor TIE, y b) medir la cantidad del complejo y con ello medir la cantidad del receptor TIE en la muestra biológica.

La presente invención también proporciona para la utilización de un ligando TIE-2 modificado el cual activa al receptor TIE-2 como se describe aquí, para soportar la supervivencia y/o crecimiento y/o migración y/o la diferenciación del receptor TIE-2 que expresa a las células. Además, el ligando puede usarse como un suplemento o complemento para soportar, por ejemplo células endoteliales en cultivos. Además, la creación por los solicitantes de un ligando modificado TIE-2 para el receptor TIE-2 permite la utilización de los sistemas de ensayos empleados para la identificación de agonistas o antagonistas del receptor TIE-2. Tales sistemas de ensayo podrán emplearse en moléculas de identificación capaces de promover o inhibir la angiogénesis. Por ejemplo, en una modalidad, los antagonistas del receptor TIE-2 pueden identificarse como moléculas de prueba que son capaces de interferir con la interacción del receptor TIE-2 con un ligando modificado TIE-2 que enlaza al receptor TIE-2. Tales antagonistas son identificados por su capacidad para 1) bloquear el enlace de un ligando modificado TIE-2 biológicamente activo al receptor como medida, por ejemplo, usando la tecnología Biosensora BIAcore (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) ; o 2) bloquear la capacidad de un ligando modificado TIE-2 biológicamente activo para causar una respuesta biológica. Tal respuesta biológica incluye, pero no está limitada a, la fosforilación del receptor TIE o los componentes corrientes abajo descendente del camino de la señal TIE, o supervivencia, crecimiento o diferenciación de la células portadoras del receptor TIE. En una modalidad, las células diseñadas para expresar al receptor TIE pueden ser dependientes para el crecimiento en la adición de un ligando modificado TIE-2. Tales células proporcionan sistemas de ensayos empleados para la identificación adicional de agonistas del receptor TIE, o antagonistas capaces de interferir con la actividad del ligando modificado TIE-2 en tales células.

Alternativamente, las células autocrinas, diseñadas para ser capaz de co-expresar en ambas un ligando modificado TIE-2 y un receptor, pueden proporcionar sistemas útiles para agonistas o antagonistas potenciales experimentados. Por lo tanto, la presente invención se proporciona para introducción de un receptor TIE-2 en células que no expresan normalmente este receptor, además, permiten a estas células exhibir profundas y fáciles respuestas distinguibles a un ligando que enlaza a este receptor. Ei tipo de respuesta producida depende de la célula utilizada, y no del receptor específico introducido en las células. Las líneas celulares apropiadas pueden ser elegidas para obtener una respuesta de la mayor utilidad para ensayar, así también como para descubrir moléculas que pueden actuar en los receptores de la tirosina cinasa. Las moléculas pueden ser cualquier tipo de molécula incluyendo pero no limitando a las moléculas péptidas y no péptidas, que actuarán en los sistemas para ser descritos en un receptor en una manera específica. Uno de los sistemas más empleados para ser explotado involucra la introducción de un receptor TIE (o un receptor quimérico que comprende el dominio extracelular de otro receptor de la tirosina cinasa tal como por ejemplo, trkC y el dominio intracelular de un receptor TIE) en una línea celular de fibroblastos (por ejemplo, células NIH3T3) además tal receptor el cual no es proliferativo normalmente mediato a otras respuestas, puede, siguiendo la introducción en fibroblastos, no obstante ensayarse por una variedad de métodos bien establecidos para cuantificar los efectos de los factores de crecimiento de los fibroblastos (por ejemplo, incorporación de la timidina o de otros tipos de ensayos de proliferación; ver van Zoelen, 1990; "The use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors" en Progress Factor Research, Vol. 2, pp. 131-152; Zhan y M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pp. 3541-3544) . Estos ensayos tienen las ventajas adicionales que cualquier preparación, puede ensayarse ambas en las líneas celulares que tienen el receptor introducido así también como la línea celular parenteral carente del receptor; podrán juzgarse solamente efectos específicos en la línea celular con el receptor, al ser mediadas a través del receptor introducido. Tales células pueden ser diseñadas además para expresar un ligando TIE-2 modificado, además de crear un sistema autocrino empleado para la valoración para moléculas que actúan como antagonistas/agonsitas de esta interacción. Además, la presente invención se proporciona para células hospederas que comprenden ácido nucleico que codifica un ligando modificado TIE-2 y un ácido nucleico que codifica un receptor TIE. La interacción del receptor TIE/ligando modificado TIE-2 también proporciona un sistema empleado para identificar pequeñas moléculas agonistas o antagonistas del receptor TIE. Por ejemplo, fragmentos mutantes o derivados de un ligando modificado TIE-2 pueden identificarse porque enlazan al receptor TIE pero no inducen cualquier otra actividad biológica. Alternativamente, la caracterización de un ligando TIE-2 modificado permite la caracterización adicional de las porciones activas de la molécula. Además, la identificación de un ligando permite la determinación de la estructura de cristal de rayos X del complejo ligando/receptor, además permite la identificación del sitio de enlace en el receptor. Conociendo el sitio de enlace se proporcionará discernimiento empleado en el diseño racional de los nuevos agonistas y antagonistas. El enlace específico de una molécula de prueba al receptor TIE puede medirse en un número de formas. Por ejemplo, el enlace actual de la molécula de prueba a las células que expresan TIE pueden detectarse o medirse al detectar o medir (i) el enlace de la molécula de prueba a la superficie de las células intactas; (ii) las moléculas de prueba reticuladas a la proteína TIE en células disueltas; o (iii) la molécula de prueba enlazada al TIE in vitro. La interacción específica entre la molécula de prueba y el TIE pueden evaluarse por el uso de reactivos que demuestran las propiedades únicas de tal interacción. Como un ejemplo específico no limitativo, los métodos de la invención pueden usarse como siguen. Considere un caso en el cual un ligando modificado TIE-2 en un muestra es medido. Variando las diluciones de la muestra, (la molécula de prueba) , en paralelo con un control negativo (NC) que contiene una actividad de ligando no modificado TIE-2, y un control positivo (PC) que contiene una cantidad conocida de un ligando TIE-2 modificado, puede exponerse a las células que expresan TIE en la presencia de un ligando modificado TIE-2 detectablemente etiquetado (en este ejemplo, ligando radioiodinado) . La cantidad del ligando modificado TIE-2 en la muestra experimental puede evaluarse por la determinación de la cantidad del ligando modificado TIE-2 125I-etiquetado que enlaza a los controles y en cada una de las diluciones, y después comparar los valores de las muestras en una curva estándar. El ligando más modificado TIE-2 en la muestra, el ligando 125I menor enlazará al TIE. La cantidad del enlace 12II-ligando puede determinarse al medir la cantidad de la radiactividad por célula, o por enlaces reticulados de un ligando modificado TIE-2 a las proteínas de la superficie celular usando DDS, como se describe en Meakin y Shooter, 1991, Neuron 6:153-163, y detectar la cantidad de la proteína etiquetada en los extractos celulares usando, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, los cuales pueden revelar una proteína etiquetada que tiene un tamaño correspondiente al receptor TIE/ligando modificado TIE-2. La molécula de prueba específica/interacción TIE puede además ser experimentada por la adición a los ensayos de varias diluciones de un ligando de control sin etiquetar que no enlaza al receptor TIE y por lo tanto, no deberá tener un efecto substancial en la competencia entre el ligando modificado TIE-2 etiquetado y la molécula de ensayo para enlazar a TIE. Alternativamente, una molécula conocida por se capaz de enlazar al receptor TIE/ligando TIE-2 modificado, tal como, pero no limitando al, anticuerpo anti-TIE, o al cuerpo receptor TIE como se describe aquí, puede esperarse por interferir con la competencia entre el ligando 125I-modificado TIE-2 y la molécula de prueba para el enlace del receptor TIE. El ligando modificado detectablemente etiquetado incluye, pero no está limitado a un ligando modificado TIE-2 enlazado covalentemente o no covalentemente a una substancia radioactiva, una substancia fluorescente, una substancia que tiene actividad enzimática, una substancia que puede servir como un substrato para una enzima (se prefieren enzimas y substratos asociados con reacciones colorimétricamente detectables) o a una sustancia que pueda ser reconocida por una molécula de anticuerpo que es preferiblemente una molécula de anticuerpo detecablemente etiquetado. Alternativamente, el enlace específico de la molécula de prueba al TIE puede ser medida por la evaluación de los efectos secundarios de un ligando modificado TIE-2/enlazante del receptor TIE-2, incluyendo pero no limitando al, crecimiento celular y/o diferenciación o la expresión del gen temprano inmediato o la fosforilación de TIE. Por ejemplo, la habilidad de la molécula de prueba para inducir la diferenciación puede ser probada en células que carecen del tie y en células comparables que expresan el tie; diferenciación en las células que expresan el tie pero no en células comparables que carecen de tie podrá ser indicativo de una molécula de prueba especifica/interacción TIE. Un análisis similar puede ser realizado por la detección de la inducción del gen temprano inmediato (por ejemplo, fos y jun) en células tie-menos y tie-más, o por la detección de la fosforilación del TIE usando ensayos de fosforilación estándares conocidos en la técnica. Tales análisis pueden emplearse en la identificación de agonistas o antagonistas que no enlazan competitivamente a TIE. De manera similar, la presente invención se proporciona para un método de identificar una molécula que tiene la actividad biológica de un ligando modificado TIE-2 que comprende (i) exposición de una célula que expresa tie a una molécula de prueba y (ii) detectar el enlace específico de la molécula de prueba al receptor TIE, en el cual el enlace específico a TIE está correlacionado positivamente con la actividad similar a TIE. El enlace específico puede detectarse por cualquiera de los ensayos para enlace directo o los efectos biológicos secundarios del enlace como se discutió arriba. Tal método puede emplearse particularmente en la identificación de nuevos miembros de la familia del ligando TIE o, en la industria farmacéutica, en la protección de grandes órdenes de moléculas péptidas y no péptidas (por ejemplo peptidomiméticos) para la actividad biológica asociada. En una modalidad no limitante, especifica, preferida de la invención, puede prepararse una rejilla larga de pozos de cultivos que contiene en filas alternas, células PC12 (o fibroflastos, ver inferior) que son ya sea tie-menos o diseñadas por ser tie-más. Una variedad de moléculas de prueba pueden entonces agregarse de manera que cada columna de la rejilla, o una porción de la misma, contenga una molécula de prueba diferente. Cada uno de los pozos puede entonces ser registrado por la presencia o ausencia del crecimiento y/o diferenciación. Un número extremadamente amplio de las moléculas de prueba pueden ser protegidos de esta manera, por tal actividad. En modalidades adicionales, la invención se proporciona para métodos para detectar o medir la actividad similar al ligando TIE, o identificar una molécula como la que tiene tal actividad que comprende (i) exposición de una molécula de prueba a una proteína del receptor TIE in vitro bajo condiciones que permiten enlazar u ocurrir y (ii) detectar el enlace de la molécula de prueba a la proteína del receptor TIE, en el cual enlazando la molécula de prueba al receptor TIE se correlaciona con la actividad similar al ligando TIE. De conformidad con tales métodos, el receptor TIE puede o no ser substancialmente purificado, puede fijarse a un soporte sólido (por ejemplo, como una columna de afinidad o como un ensayo de ELISA) , o puede incorporarse en una membrana artificial. El enlace de la molécula de prueba al receptor TIE puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica. En modalidades preferidas, el enlace de una molécula de prueba puede detectarse o medirse por la evaluación de su habilidad para competir con los ligandos TIE conocidos detectablemente marcados para el enlace del receptor TIE. La presente invención también se proporciona para un método de detectar la capacidad de una molécula de prueba para funcionar como un antagonista de la actividad similar al ligando TIE que comprende detectar la habilidad de la molécula para inhibir un efecto del enlace dei ligando TIE al receptor TIE en una célula que exprese el receptor. Tal antagonista puede o no interferir con el receptor TIE/enlace del ligando modificado TIE-2. Los efectos de un ligando TIE-2 modificado enlazante al receptor TIE son preferiblemente efectos biológicos o bioquímicos, incluyendo pero no limitando a, supervivencia o proliferación celular, transformación celular, inducción del gen temprano inmediato o la fosforilación TIE. La invención además se proporciona para ambos un método de identificación de anticuerpo o de otras moléculas capaces de neutralizar al ligando o bloquear el enlace al receptor, así como también las moléculas identificadas por el método. Por medio de los ejemplos no limitativos, el método puede ser realizado vía un ensayo en cual es conceptualmente similar a un ensayo de ELISA.

Por ejemplo, el cuerpo receptor TIE puede enlazar a un soporte sólido, tal como una placa de pozos múltiples de plástico. Como un control, una cantidad conocida de un ligando modificado TIE-2 el cual ha sido etiquetado con Myc, pueden entonces ser introducido al pozo y cualquier ligando modificado TIE-2 etiquetado que enlace al cuerpo receptor puede entonces identificarse por medio de un anticuerpo reportado directo contra la etiqueta-Myc. El sistema de ensayo puede entonces ser usado para proteger las muestras de prueba para las moléculas las cuales son capaces de i) enlazar al ligando etiquetado o ii) enlazar al cuerpo receptor y con ello bloquear el enlace al cuerpo receptor por el ligando etiquetado. Por ejemplo, una muestra de prueba que contiene una molécula putativa de interés junto con una cantidad conocida de un ligando etiquetado puede introducirse a la celda o pozo y la cantidad del ligando etiquetado el cual enlaza al cuerpo receptor puede medirse. Por la comparación de la cantidad del ligando etiquetado enlazado en la muestra de prueba a la cantidad en el control, las muestras que contienen las moléculas las cuales son capaces de bloquear el enlace ligando al receptor pueden identificarse. Las moléculas de interés identificadas pueden aislarse usando métodos bien conocidos para un experto en la técnica. Una vez que un bloqueador de enlaces ligandos se encuentra, un experto en la técnica podrá conocer, al realizar ensayos secundarios para determinar si el bloqueador se enlaza al receptor o al ligando, así también como los ensayos para determinar si la molécula bloqueadora puede neutralizar la actividad biológica del ligando. Por ejemplo por el uso de un ensayo de enlace el cual emplea la tecnología biosensora BIAcore (o el equivalente), en el cual ya sea el cuerpo receptor TIE o un ligando modificado TIE-2 o un cuerpo ligando está unido covaientemente a un soporte sólido (por ejemplo dextra de carboximetilo o una superficie dorada) , un experto en la técnica deberá ser capaz de determinar si la molécula bloqueadora se enlaza específicamente al ligando, cuerpo ligando o al cuerpo receptor. Para determinar si la molécula bloqueadora puede neutralizar la actividad biológica del ligando, un experto en la técnica deberá realizar un ensayo de fosforilación (ver por Ejemplo 5) o alternativamente, un bioensayo funcional, tal corno un ensayo de supervivencia, por el uso de cultivos primarios de, por ejemplo, células endoteliales. Alternativamente, una molécula bloqueadora la cual enlaza al cuerpo receptor puede ser un agonista y un experto en la técnica podrá conocer como determinar esto por la realización de un ensayo apropiado para identificar agonistas adicionales del receptor TIE.

Además, la invención contempla adicionalmente, las composiciones en donde el ligando TIE es el dominio del enlace del receptor de un ligando TIE-2 descrito aquí. Por ejemplo, el ligando 1 TIE-2 contiene un dominio de rosca enroscada (comenzando en el extremo 5 y que se extiende al nucleófilo a aproximadamente la posición 1160 de la figura 4 y aproximadamente en la posición 1157 de la figura 5) y un dominio similar al fibrinógeno (el cual está codificado por la secuencia nucleótida de la figura 4 comenzando aproximadamente en la posición 1161 y aproximadamente en la posición 1158 de la figura 5) . El dominio similar al fibrinógeno del ligando 2 TIE-2 se cree comienza en o alrededor de la misma secuencia de aminoácidos como en el ligando 1 (FRDCA) el cual está codificado por los nucleótidos comenzando alrededor 1197 de la figura 6. El dominio similar al fibrinógeno del ligando 3 TIE se cree comienza en o alrededor de la secuencia de aminoácido la cual es codificada por nucleótidos que comienzan alrededor de la posición 929 como se expone en la Figura 21. La multimerización del dominio de rosca enroscado durante la producción de la purificación obstaculiza al ligando. Como se describe en el ej emplo 19, los solicitantes han descubierto sin embargo que, el dominio similar al fibrinogeno comprende el dominio del enlace del receptor TIE-2 . Las formas monoméricas del dominio similar al fibrinógeno, sin embargo, no parece enlazar al receptor. Los estudios que utilizan el dominio similar al fibrinogeno etiquetado myc, el cual ha sido "agrupado" usando anticuerpos anti-myc, enlazan al receptor TIE-2. [Métodos de producción de los "ligandos agrupados y cuerpos de ligandos son descritos en Davis, et al. Science 266:816-819 (1994)]. Basados en estos hallazgos, los solicitantes producen "cuerpos ligandos" los cuales comprenden el dominio similar al fibrinógeno de los ligandos TIE-2 acoplados al dominio Fc del IgG ("fFc's"). Estos cuerpos ligandos, en los cuales forman dímeros, eficientemente enlazan al receptor TIE-2. En consecuencia, la presente invención contempla la producción de los cuerpos de ligandos modificados TIE, los cuales pueden ser usados como agentes objetivos, en diagnósticos o en aplicaciones terapéuticas, tales como agentes objetivos para tumores y/o vasculaturas asociadas en donde se indica un antagonista TIE. La invención aquí además se proporciona para el desarrollo del ligando, un fragmento o derivado del mismo, u otra molécula la cual es un receptor agonista o antagonista, como un terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen de alteraciones que involucran células, tejidos u órganos los cuales expresan al receptor TIE. Tales moléculas pueden ser usadas en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal, o en un método de diagnosis. Debido a que el receptor TIE ha sido identificado en asociación con las células endoteliales y, como se demostró aquí, el bloqueo del ligando 1 TIE-2 parece prevenir la vascularización, los solicitantes esperan que in ligando modificado TIE-2 descrito aquí, pueda emplearse para la inducción de la vascularización en padecimientos o alteraciones en donde se indica tal vascularización. Tales padecimientos o alteraciones podrán incluir la cicatrización de heridas, isquemia y diabetes. Los ligandos pueden ser probados en modelos animales y usados terapéuticamente como se describen por otros agentes, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , otro factor específico celular endotelial que es angiogénico. Ferrara et al. Patente Norteamericana No. 5,332,671 publicada el 26 de julio de 1994. La referencia de ferrara, así también como otros estudios, describen estudios in vitro y en vivo que pueden usarse para demostrar el efecto de un factor angiogénico en la incrementación del flujo sanguíneo al miocardio isquémico, incrementador de la cicatrización de heridas y en otras colocaciones terapéuticas, en donde se desea la angiogénesis. [ver Sudo, et al. Soliciud de Patente Europea 0 550 296 A2 publicada el 7 Julio 1993; Banai et al. Circulation 89:2183-2189 (1994); Unger, et al. Am, J. Physiol. 266 :H1588-H1595 (1994); Lazarous, et al. Circulation 91:145-153 (1995)). De conformidad con la invención, un ligando modificado TIE-2 puede usarse solo o en combinación con uno o más compuestos adicionales farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, VEGF o factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF) , así también como citocinas, neurotrofinas, etc. Contrariamente, los agonistas del receptor TIE, tal como los ligandos modificados TIE los cuales enlazan pero no activan al receptor como se describe aquí, los cuerpos receptores como se describe aquí en los Ejemplos 2 y 3, y el ligando 2 TIE-2 como se describe en el Ejemplo 9, podrán emplearse para prevenir o atenuar la vascularización, además de prevenir o atenuar por ejemplo, el crecimiento del tumor. Estos agentes pueden usarse solos o en combinación con otras composiciones, tales como los anticuerpos anti-VEGF, que han sido mostrados por ser empleados en el tratamiento de las condiciones en las cuales el intento terapéutico es bloquear la angiogenesis. Los solicitantes esperan que un ligando modificado TIE-2 descrito aquí, pueda también usarse en combinación con agentes, tales como los antagonistas de la citocina tal como los antagonistas IL-6, que son conocidos por bloquear la inflamación.

Por ejemplo, los solicitantes han determinado que los ligandos TIE están expresados en células dentro o cercanamente asociados con tumores. Por ejemplo, el ligando 2 TIE-2 parece estar estrechamente asociado con las células endoteliales del tumor. En consecuencia, este y el otro antagonista puede también emplearse en la prevención o atenuación por ejemplo, del crecimiento del tumor. Además, los ligandos TIE o cuerpos de ligandos pueden emplearse para la liberación de las toxinas a un receptor de células acompañantes. Alternativamente, otras moléculas, tal como los factores de crecimiento, citocinas o nutrientes, pueden ser liberados a un receptor celular acompañante TIE vía los ligandos TIE o cuerpos de ligandos. Los ligandos TIE o los cuerpos de ligandos tales como los ligandos modificados TIE-2 descritos aquí, pueden también ser usados como reactivos de diagnóstico para el receptor TIE, para detectar el receptor in vivo o in vitro. Cuando el receptor TIE está asociado con un estado de padecimiento, los ligandos o cuerpos ligandos TIE tales como un ligando modificado TIE-2 pueden emplearse como reactivos de diagnostico para detectar los padecimientos con por ejemplo, manchado de tejido o la imagen del cuerpo completo. Tales reactivos incluyen radioisótopos, fluorocromos, marcadores, enzimas y biotinas. Tales agentes de diagnóstico u objetivos pueden prepararse como se describe en Alitalo, et al. WO 95/26364 publicado el 5 de octubre de 1995, y Burrows, F. y P. Thorpe, PNAS (USA) 90:8996-9000 (1993) el cual se incorpora aquí en su totalidad. En otras modalidades, los ligandos TIE, un receptor que activa al ligando modificado TIE-2 descrito aquí son usados como factores hematopoyeticos . Una variedad es factores hematopoyeticos y sus receptores están involucrados en la proliferación y/o diferenciación y/o migración de los varios tipos de células contenidas dentro de la sangre. Debido a que los receptores TIE están expresados en células hematopoyeticas tempranas, los ligandos TIE son esperados por jugar un papel comparable en la proliferación o diferenciación o migración de estas células. Además, por ejemplo, las composiciones que contienen TIE pueden ser preparadas, experimentadas, examinadas en sistemas biológicos in vitro y in vivo y usadas terapéuticamente como se describen en cualquiera de los siguientes: Sousa, Patente Norteamericana No. 4,810,643. Lee, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985) Wong et al. Science, 228:810-814 (1985); Yokota et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81:1070 (1984); Bosselman, et al. WO 9105795 publicada el 2 Mayo de 1991, titulada "Stem Cell Factor" y Kirkness, et al. WO 95/19985 publicada el 27 de julio, 1995 titulado "Haemopoieitc Macturation Factor". En consecuencia, el receptor que activa al ligando modificado TIE-2 puede ser usado para la diagnosis o tratar condiciones en las cuales la hematopoiesis normal es suprimida, incluyendo pero no limitando a la anemia, trombocitopenia, leucopeia y granulocitopenia. En una modalidad preferida, el receptor que activa al ligando modificado TIE-2 puede usarse para estimular la diferenciación de los precursores celulares sanguíneos en situaciones en donde un paciente tiene un padecimiento, tal como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS) el cual ha causado una reducción en los niveles normales de las células sanguíneas, o en marcados clínicos en el cual el incremento de las poblaciones hematopoyeticas es deseado, tal como en conjunto con el transplante de la médula espinal; o en el tratamiento de la aplasia o mielosupresión causada por la radiación, tratamiento químico o quimioterapia. El receptor que activa a los ligandos modificados TIE-2 de la presente invención puede usarse solo o en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, citocinas, neurotrofinas, interleucinas, etc. En una modalidad preferida, los ligandos pueden ser usados en conjunto con cualquier número de los factores de referencia anteriores, los cuales son conocidos por inducir las células detenidas u otra proliferación de precursores hematopoyeticos, o factores que actúan en células posteriores en el camino hematopoyetico, pero que no están limitadas al, factor de maduración hematopoyetico, trombopoietina, factor de células retardadas, eritropoietina, G-CSF, GM-CSF, etc. En una modalidad alternativa, los antagonistas del receptor TIE son usados para la diagnosis para tratar pacientes en los cuales el resultado deseado es la inhibición de una forma hematopoyetica, tal como para el tratamiento mieloproliferativo u otras alteraciones proliferativas de los órganos formadores de la sangre tal como trombocitemias, policitemias y leucemias. En tales modalidades, el tratamiento puede comprender el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando modificado TIE-2, un anticuerpo TIE, un anticuerpo receptor TIE, un conjugado de un ligando modificado TIE-2 o un cuerpo ligando o fFC como se describe aquí. La presente invención también se proporciona para composiciones farmacéuticas que comprenden un ligando modificado TIE-2 o cuerpos ligandos descritos aquí, fragmentos péptidos del mismo, o derivados en un vehículo farmacológicamente aceptable. Las proteínas del ligando modificado TIE-2, fragmentos péptidos o derivados pueden administrarse sistémicamente o localmente. Cualquier modo apropiado de administración conocido en la técnica pueden usarse, incluyendo pero no limitando a, intravenosa, intratecal, intraarterial, intranasal, oral, subcutánea, intraperitoneal, o por inyección local o implante quirúrgico. Formulaciones de liberación sostenida son también proporcionadas. La presente invención también se proporciona para un anticuerpo el cual enlaza específicamente tales moléculas terapéuticas. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La invención también se proporciona para un método de usar tal anticuerpo monoclonal o policlonal para medir la cantidad de la molécula terapéutica en una muestra tomada a partir de un paciente para propósitos de monitorear el curso de la terapia. La invención además se proporciona para una composición terapéutica que comprende un ligando modificado TIE-2 o un cuerpo ligando o un agente citotóxico conjugado del mismo. En una modalidad, el agente citotoxico puede ser un radioisótopo o toxina. La invención también se proporciona para un anticuerpo el cual enlaza específicamente a un ligando modificado TIE-2. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal.

La invención además se proporciona para un método de purificar un ligando TIE-2 modificado que comprende; a) acoplar al menos un substrato enlazante TIE a una matriz sólida. b) incubar el substrato de a) con un célula disgregada de manera que el substrato forme un complejo con cualquier ligando modificado TIE-2 en la célula disgregada; c) lavar la matriz sólida; y d) eluir el ligando dosificado TIE-2 a partir del substrato acoplado.

El substrato puede ser cualquier substancia que enlaza específicamente al ligando modificado TIE-2. En una modalidad, el substrato se selecciona a partir del grupo que consiste del anticuerpo del ligando TIE-2 antimodificado, el receptor TIE y el cuerpo receptor TIE. La invención también se proporciona para un cuerpo receptor e*l cual enlaza específicamente a un ligando modificado TIE-2, así también como una composición terapéutica que comprende el cuerpo receptor en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un método de bloquear el crecimiento del vaso sanguíneo en un humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición terapéutica. La invención también se proporciona para una composición terapéutica que comprende un receptor que activa al ligando modificado TIE-2 o un cuerpo ligando en un vehículo farmacéuticamente aceptable, así también como un método de promover la neovasoularizaoión en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la composición terapéutica. Además, la presente invención se proporciona para un método para identificación de una célula la cual expresa al receptor TIE el cual comprende contactar una célula con un ligando modificado TIE detectablemente marcado o un cuerpo ligando, bajo las condiciones que permiten enlazar al ligando detectablemente marcado al receptor TIE y determinar si el ligando detectablemente marcado está enlazado al receptor TIE, con ello identificar las células como las que expresan al receptor TEI. La presente invención también se proporciona para una composición terapéutica que comprende un ligando modificado TIE-2 o un cuerpo ligando y un agente citotoxico conjugado con eso. El agente citotoxioo puede ser un radioisótopo o una toxina. La invención también proporciona un método para detectar la expresión de un ligando modificado TIE-2 por una célula la cual comprende obtener mRNA a partir de la célula, contactando el mRNA así obtenido con una molécula de ácido nucleico marcada que codifica un ligando modificado TIE-2, bajo condiciones hibridizantes, determinando la presencia del mRNA híbrido a la molécula marcada, y con ello, detectar la expresión de un ligando modificado TIE-2 en la célula. La invención además proporciona un método para detectar la expresión de un ligando modificado TIE-2 en secciones del tejido las cuales comprenden contactar las secciones del tejido con una molécula de ácido nucleico etiquetada que codifica un ligando modificado TIE-2 bajo condiciones hibridizantes, determinando la presencia del mRNA híbrido a la molécula marcada, y con ello detectar la expresión de un ligando modificado TIE-2 en las secciones de los tejidos.

EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN DE LAS LINEAS CELULARES ABAE COMO CÉLULAS REPORTERAS PARA EL RECEPTOR TIE-2 Las células BAE adultas están registradas en el Repository Culture Cell European, bajo ECACC#92010601 (ver PNAS 75:2621 (1978)). Los análisis Northern (RNA) revelaron niveles moderados de los transcriptos tie-2, en la línea celular ABAE (endotelio arterial de bovino adulto) , consistente con hibridación in situ resultado que casi demuestra la localización exclusiva de los RNAs tie-2 en células endoteliales vasculares. Se examinaron por lo tanto, células ABAE disgregadas, por la presencia de la proteína TIE-2, así también como el grado en el cual esta proteína TIE es tirosina-fosforilada bajo condiciones de crecimiento privadas del suero contra las normales. Las células disgregadas ABAE fueron cosechadas y sometidas a inmunoprecipitación, seguidas del análisis del manchado de Western de proteínas inmunoprecipitadas con TIE-2 especifico y antisera de fosfotirosina especifica. La omisión O la inclusión de los péptidos TIE-2 como moléculas bloqueadoras específicas durante la inmunoprecipitación de TIE-2 seguida por la identificación no ambigua del TIE-2 como una proteína moderadamente detectable de ~150 kD cuyos niveles de fosfotirosina en estado estable disminuye a niveles cercanos no detectables por la inanición de suero previo a las células. Los cultivos de las células ABAE y las cosechas de las células disgregadas se hizo como sigue. Las células ABAE de bajo número de transición se blindaron con una monocapa a una densidad de 2 x 106 células/placa de petri plástica 150 mm (Falcon) y cultivadas en un medio de águila Dulbecco modificado (DMEM) que contiene 10% de suero de cría de bovino (10% BCS), 2 mM de L-glutamina (Q) y 1% de cada uno de penicilina y estreptomicina (P-S) en una atmósfera de 5% de C02. Previo a la recolección de las células disgregadas, las células carecieron de suero por 24 horas en DMEM/Q/P-S, seguido por la aspiración del medio y el enjuague de las placas con fosfato salino amortiguado (PBS), enfriado en hielo complementado con ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio y benzamidina de sodio. Las células se disgregaron en un pequeño volumen de este amortiguador de enjuague que ha sido complementado con 1% de detergente NP40 y los inhibidores de proteasa PMFS y aprotinina. Los desechos insolubles se eliminaron a partir de las células disgregadas por centrifugación a 14,000 x G por 10 minutos, a 4°C y los sobrenadantes se sometieron a inmunoprecipitación con un antisuero especifico para el receptor TIE-2, con o sin la presencia de los péptidos bloqueadores agregados a ~20 µ g/ml disgregado. Las proteínas inmunoprecipitadas se resolvieron por PAGE (7.5% gel Laemmli), y después electrotransferidos a la membrana PVDF e incubados ya sea con varios TIE-2 o con antisueros de fosfotirosina específicos. La proteína TIE- 2 se visualizó por la incubación de la membrana con un antisuero secundario enlazado a HRP seguido por el tratamiento con el reactivo ECL (7Amersham) EJEMPLO 2 EXPRESIÓN Y CLONACIÓN DEL CUERPO RECEPTOR TIE-2 POR EL ESTUDIO EN BASE A LA AFINIDAD DE LAS INTERACCIONES DEL LIGANDO TIE-2 Se creó una estructura de expresión para poder obtener una proteína secretada que consiste de la porción extracelular completa del receptor TIE-2 de rata fusionada a la región constante gama-1 de la inmunoglobulina humana (IgGl Fc) . Esta proteína de fusión es llamada un "cuerpo receptor" TIE-2 (RB) , y podrá ser normalmente esperada por existir como un dímero en una solución basada en la formación de los enlaces de disulfuro entre los extremos IgGl Fc individuales. La porción Fc del RB TIE-2 se preparó como sigue. Un fragmento DNA que codifica la porción FC del IgGl humano que abarca a partir de la región esencial al término carboxi de la proteína se amplificó a partir del cDNA de placenta humana por PCR con oligonucleótidos que corresponden a la secuencia publicada del IgGl humano; el fragmento DNA resultante se clona en un vector plasmidio. Los fragmentos de restricción de DNA apropiados a partir de un plasmidio que codifican la longitud completa del receptor TIE-2 y del plasmidio Fc IgGl humano se ligan en cualquier lado de un fragmento corto PCR derivado que se asigno así como para fusionar, en estructura, las secuencias que codifican a las proteínas TIE-2 y IgGl Fc humana. Además, la proteína de fusión del ectodominio FC TIE-2 resultante, precisamente substituida al IgGl en lugar de la región esencial de la transmembrana TIE-2 y de los dominios citoplásmicos. Un método alternativo de preparar RBs se describe en Goodwin, et al. Cell 73:447-456 (1993). Las cantidades en miligramo de los TIE-2 RB se obtuvieron por la clonación del fragmento DNA TIE-2 RB en el vector baculovirus pVL1393 y subsecuentemente infección en la línea celular de insecto SF-21AE Spodoptera frugiperda. Alternativamente, se pueden usar la línea celular SF-9 (ATCC Aceso No. CRL-1711) o la línea celular BTI-TN5bl-4. El DNA que codifica al TIE-2 RB se clonó como un fragmento EcoRI-Notl en el baculovirus del plásmidio de transferencia pVL1393. El plásmidio DNA purificado por centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio se recombinó en un DNA viral por el mezclado de 3 µg de DNA de plásmidio con 0.5 µg de DNA Báculo-dorado (Pharminigen) , seguido por la introducción en las liposomas usando 30 µg de Lipofectina (GIBCO-BRL) . Las mezclas de liposomas DNA se agregaron a las células SF-21AE (2 x 106 células/60 mm platos) en un medio TMN-FH (medio de células de insecto Grace modificado (GIBCO-BRL) por 5 horas a 27 °C, seguido por la incubación a 27 °C por 5 días en un medio TMN-FH complementado con 5% de suero de crías fetales. El medio de cultivo del tejido se cosechó por la purificación de la placa del virus recombinante, la cual se realizó usando métodos previamente descritos (O'Reilly, D.R., L.K. Miller y V.A.. Luckow, Vectores de expresión del Baculovirus - Manual de laboratorio 1992, New York: W.H. Freeman) excepto que la cubierta de agarosa contenía 125 µg/mL X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-ß-D-galactoripanosido; GIBCO-BRL) . Después de 5 días de incubación a 21 ° C, las placas no recombinantes se registraron por reacción cromogénica positiva al substrato X-gal, y sus posiciones marcadas. Las placas recombinantes fueron entonces visualizadas por la adición de una segunda cubierta que contiene 100 µg/mL MTT (bromuro de 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5, difeniltetxazülio; Sigrpa). Las placas de virus recombinantes putativos se perforaron por la aspiración del obturador, y se purificaron por rodeos múltiples del aislamiento de las placas para asegurar la homogeneidad. Las pilas de virus se generaron por series, transitando en multiplicidad lenta de los virus de las placas purificados. Se produjeron las pilas de tránsito lento de un clon de virus (cuerpo receptor vTIE-2) . Las células SF-21AE se cultivaron en un medio libre de suero (SF-900 II, Gibco BRL) que contienen una solución antibiótica/antimicotina 1 X (Gibco BRL) y 25 mg/L de Gentamicina (Gibco BRL) . Se agregó F-68 plurónico como un surfactante a una concentración final de Ig/L. Los cultivos (4L) se enjuagaron en un bioreactor (Sistema de estación de células Artisan) por lo menos tres días antes de la infección. Las células crecieron a 27°C con saturación por gas a 50% disuelto en oxígeno, a una relación de flujo de gas de 80 mL/min (aireación a un anillo de resorte) . Se agitó por medio de un propulsor marino a una relación de 100 rpm. Las células se cosecharon en una fase de crecimiento medio logarítmico (~2 X 106 células / mL) , concentradas por centrifugación, e infectadas con 5 unidades que forman placas del cuerpo receptor vTIE-2 por células. Las células y los inóculos se llevaron a 400 mL con un medio fresco, y los virus se absorbieron por 2 horas a 27°C en un matraz giratorio.

El medio de cultivo se resuspendió en un volumen final de 8L con un medio fresco libre de suero y las células incubadas en el bioreactor usando las condiciones descritas previamente. El medio de cultivo de las células del cuerpo receptor vTIE-2 infectadas SF21AE se colectaron por centrifugación (500 x g, 10 minutos) a 72 horas posteriores a la infección. Los sobrenadantes celulares se llevaron a un pH 8 con NaOH. El EDTA se agregó a la concentración final de 10 mM y el pH del sobrenadante se reajustó a 8. Los sobrenadantes se filtraron (0.45 µm, Miliporo) y se cargaron en una columna A de proteína (proteína A sefarosa 4 flujo rápido o proteína A HiTrap, ambas de Pharmacia) . La columna se lavó con PBS que contiene 0.5 M NaCl hasta la absorbencia a 280 nm disminuyó a una línea base. La columna se lavó en PBS y se eluyó con ácido acético 0.5 M. Las fracciones de las columnas se neutralizaron inmediatamente por la elución en los tubos que contienen Tris pH 9 1 M. La fracciones de los picos que contienen el cuerpo receptor TIE-2 fueron vertidas y dializadas contra el PBS EJEMPLO 3 DEMOSTRACIÓN DE QUE EL TIE-2 TIENE UN PAPEL CRITICO EN EL DESARROLLO DE LA VASCULATURA.

La penetración en la función del TIE-2 se aprovechó por la introducción del "exceso" del cuerpo receptor TIE-2 soluble (RB TIE-2) en un sistema desarrollado. La capacidad potencial del RB TIE-2 para enlazar, y con ello neutralizar el ligando TIE-2 disponible puede resultar en una disrupción observable del desarrollo vascular normal y la caracterización del ligando. Para examinar si el RB TIE-2 puede ser usado para la disociación vascular del desarrollo en embriones de pollo tempranos, piezas pequeñas de una espuma biológicamente resorbida se sacudieron con RB TIE-2 y se insertaron inmediatamente debajo de la membrana corioalantoica a las posiciones laterales al embrión primitivo. Los embriones de pollos tempranos desarrollados encima de la yema de huevo a partir de un disco pequeño de células que están cubiertas por la membrana corioalantoica (CAM) . Las células endoteliales que llegarán a la línea de la vasculatura en los embriones elevados de ambas fuentes celulares extra e intra embriónicas. Las células endoteliales extra-embriónicamente derivadas, las cuales proporcionan la mayor fuente de las células endoteliales en el embrión, originadas a partir de acrecentamientos del mesénquima que están situados lateralmente alrededor del la característica embrionaria, justo por debajo del CAM. Como estas células del mesénquima maduro, dan origen a un progenitor común de ambos linajes de células endoteliaies y hematopoyeticas, terminando el hemangioblasto. En turno, el hemangioblasto da origen a una población mezclada de angioblastos (progenitor de las células endoteliales) y hematoblastos (precursor hematopoyetico pluripotencial ) . La formación de los rudimentos del sistema circulatorio es cuando la progenie de células endoteliales se segrega para formar una vesícula de una célula gruesa que redondea a las células sanguíneas primitivas. La proliferación y migración de estos componentes celulares eventualmente produce un retículo vasto de los microvasos llenos de sangre bajo el CAM que finalmente invadirán el embrión para juntarse con los elementos vasculares limitados, intra-embriónioamente derivados. Los huevos de pollos fertilizados recientemente, obtenidos a partir de Spafas, Inc.

(Boston, MA) se incubaron a 99.5°F, 55% de humedad relativa. A aproximadamente 24 horas del desarrollo, las cascaras de huevo se limpiaron en forma descendente con 70% de etanol y se usó un taladro de dentista para hacer un agujero de 1.5 cm en el ápice obtuso de cada huevo. La membrana de la cascara se eliminó para revelar un espacio de aire directamente arriba del embrión. Las piezas pequeñas rectangulares de la espuma de gel (Gelfoam) estéril (Upjohn) se cortaron con un escarpelo y se sacudieron en concentraciones iguales a cualquiera de los cuerpos receptores TIE-2 o EHK-1. El cuerpo receptor EHK-1 se elaboró como se expone en el Ejemplo 2 usando el dominio extracelular EHK-1 en vez del dominio extracelular TIE-2 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993) . Cada pieza de espuma de gel se absorbió aproximadamente a 6 µg de proteína en 30 µl . Los fórceps o pinzas marcadoras de tiempo se usaron para elaborar un rasgado pequeño en el C7AM a una posición de varios milímetros laterales al embrión primitivo. La mayoría de las piezas de la espuma de gel RB sacudidas, se insertaron bajo el CAM y la cascara de huevo se sellaron con una pieza de cinta adhesiva. Otros huevos de etapas similares se trataron en paralelo con RB de la tirosina cinasa del receptor neuronalmente expresado no relacionado, EHK-1 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993). El desarrollo se dejó proceder por 4 días y después los embriones se examinaron por inspección visual. Los embriones se eliminaron por el rompimiento cuidadoso de las cascaras en platos de PBS calentados y cortados cuidadosamente lejos del embrión con CAM redondeando. De los 12 huevos tratados uno con RB, 6 con TIE-2 RB y 5 con RB EHK-1, los embriones tratados se desarrollaron más allá del estado observado al inicio del experimento. Una diferencia dramática se observó entre estos embriones desarrollados, como se muestra en las Figuras ÍA y IB. Aquellas tratadas con RN EHK-1 parecen haberse desarrollado relativamente de manera normal. Cuatro de cinco embriones EHK-1 fueron viables como los juzgados por la presencia de los latidos del corazón. Además, la vasculatura extra-embriónica, la cual es visualmente obvia debido a la presencia de las células de glóbulos rojos, fue profusa y se extendieron varios centímetros lateralmente bajo el CAM. Por el contraste, aquellas tratadas con RB TIE-2 fueron sacudidas severamente en el rango de 2-5 mm de diámetro, como se comparó con mas de 10 mm de diámetro de los embriones RB EHK-1. Todos los embriones tratados RB TIE-2 se murieron y sus CAMs se libraron de los vasos sanguíneos. La capacidad del RB TIE-2 para bloquear el desarrollo vascular en los pollitos demuestra que el ligando TIE-2 es necesario para el desarrollo de la vasculatura.

EJEMPLO 4 IDENTIFICACIÓN DE UNA ACTIVIDAD ENLAZANTE ESPECIFICA DE TIE-2 EN UN MEDIO ACONDICIONADO A PARTIR DEL ONCOGEN TRANSFORMADO ras DE LA LINEA CELULAR DE MIOBLASTO DE RATÓN C2C12 Los desechos de un medio celular acondicionado de 10 pliegues concentrados (10 X CCM) a partir de varias líneas celulares por la presencia de la actividad enlazante especifica TIE-2 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) reveló la actividad enlazante en un medio libre de suero a partir de células oncogénicas transformadas C2C12 (C2C12-ras) , RAT 2-ras (el cual es una línea celular de fibroblastos transformados ras), el T98G glioblastoma humano y la línea celular del neuroblastoma humano se conocen como SHEP-1. El C2C12-ras 10X CCM originado a partir de una línea transfectada estable de los mioblastos C2C12 que son oncogénicamente transformadas por la transfección con el mutante T-24 del H-ras por los métodos estándares a base de fosfato de calcio. Un plasmidio de expresión de la neomicina de resistencia de base SV40 se enlazó físicamente con el plasmidio de expresión ras a fin de permitir la selección de los clones transfectados. Las células ras-C2C12 G418 que resultaron resistentes se mantuvieron rutinariamente como monocapas en platos de plástico en DMEM/glutamina/penicilin-estreptomicina complementado con 10% de suero de cría fetal (FCS) . El suero libre C2C12-ras 10X CCM se elaboró por el laminado de las células a 60% de confluencia en un medio definido libre de suero por 12 horas. [Zhan y Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6: 3541-3544 (1986)); Zhan, et al. Oncogene 1: 369-376 (1987) ] . El medio se descargó y se reemplazó con DMEM/Q/P-S fresco por 24 horas. Este medio se cosechó y las células se re-alimentaron con DMEM/Q/P-S fresco, el cual también se cosechó después de unas 24 horas adicionales. Estos CCM se complementaron con los inhibidores de la proteasa PSMF (lmM) y la aprotinina (lOµg/ml), y se concentraron 10 pliegues en membranas de tamaño de exclusión estériles (Amicon) . La actividad enlazante TIE-2 puede neutralizarse por la incubación del medio con un exceso de RB TIE-2, pero no por la incubación con RB EHK-1, previo al análisis BIAcore. La actividad enlazante del CCM 10X se midió usando la tecnología biosensora (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway; NJ) , en la cual las interacciones biomoleculares se monitorearon en tiempo real vía la superficie de resonancia de plasma. El RB TIE-2 purificado se acopló covalentemente a través de aminas primarias a la capa de dextran de carboximetilo de un chip sensor con grado de búsqueda CM5 (Pharmacia Biosensor; Piscataway; NJ) . La superficie del chip sensor se activó usando una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), seguido por la inmovilización del RB TIE-2 (25 µg/mL, pH 4.5) y la desactivación de los sitios sin reaccionar con 1.0 M de etanolamina (pH 8.5). Una superficie de control negativo del cuerpo receptor EHK-1 se preparó de una manera similar. El amortiguador corrido usado en el sistema fue HBS (10 mM hepes, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.005% surfactante P20, pH 7.4). Las muestras de CCM lOx se centrifugaron por 15 minutos a 4°C y además se clarificaron usando un filtro de 0.45 µm enlazante de baja proteína estéril (Miliporo; Bedford, MA) . Se agregó el Dextran (2mg/ml) y el surfactante P20 (0.005%) a cada muestra de CCM. Las alícuotas de 40 µL se inyectaron transversalmente a la superficie inmovilizada (ya sea TIE-2 o EHK-1) a una relación de flujo de 5 µL/min y el enlazante receptor se monitoreó por 8 minutos. La actividad enlazante (unidades de resonancia, RU) se midió como la diferencia entre un valor de línea base determinado 30 s previo a la muestra de inyección y se tomó una medida al 30 s posterior a la inyección. La regeneración de la superficie se acompañó con un pulso 12 µL de 3 M MgCl2. El nivel del instrumento de propagación es de 20 RU; por lo tanto, cualquier actividad enlazante con una señal superior a 20 RU puede interpretarse como una interacción real con el receptor. Para el medio acondicionado C2C12-ras, las actividades enlazantes fueron del rango de 60-90 RU para la superficie inmovilizada RB TIE-2. Por las mismas muestras ensayadas en una superficie inmovilizada RB EHK-1, las actividades medidas fueron menores de 35 RU. El enlace específico al cuerpo receptor TIE-2 se evaluó por la incubación de las muestras con un exceso de cualquiera de TIE-2 o RB EHK-1 solubles previos a los ensayos de la actividad enlazante. La adición del RN EHK-1 soluble no tuvo efecto en la actividad enlazante TIE-2 de cualquiera de las muestras, mientras en la presencia del enlace TIE-2 soluble a la superficie es dos a tres veces menor que aquellos medios en la ausencia de TIE-2. Un ensayo repetido usando CCM C2C12-ras >50x concentrado resultó en cuatro pliegues incrementados sobre los antecedentes de la señal enlazante específica de TIE-2.

EJEMPLO 5 EL CCM C12C12-ras CONTIENE UNA ACTIVIDAD QUE INDUCE LA FOSFORILACIÓN DE LA TIROSINA DEL RECEPTOR TIE-2, El CCM C2C12-ras. 10X se examinó por su capacidad para inducir la fosforilación de tirosina de TIE-2 en las células ABAE. Las células ABAE privadas de suero se incubaron brevemente con CCM C2C12-ras_, se disgregaron y se sometieron a inmunoprecipitación y a análisis Western como se describen arriba. La estimulación de las células ABAE privadas de suero, con suero libre C2C12ras lOx CCM se hizo como sigue. El medio de células ABAE privadas como se describe arriba se eliminaron y reemplazaron con ya sea un medio definido o CCM xlO que ha sido pre-calentado a 37°C. Después de 10 minutos, el medio se eliminó y las células se enjuagaron dos veces en hielo con un exceso de PBS frío, complementado con ortovanadato/NaF/benzamidina. La segregación de células y la inmunoprecipitación específica TIE-2 se hizo como se describió arriba. Las células ABAE incubadas por 10 minutos con el medio definido no mostraron inducción de la fosforilación de la tirosina TIE-2, mientras la incubación con CCM C2C12-ras estimuló al menos un incremento de 100 X en la fosforilación TIE-2. Esta actividad fue casi totalmente reducida por la pre- incubación del C2C12-ras CCM 10X por 90 minutos a temperatura ambiente con 13 µg del RB TIE-2 acoplados a las camas de la proteína G-sefarosa. El medio incubado con la proteína sefarosa G sola no se eliminó de esta actividad de fosforilación.

EJEMPLO 6 CLONACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL LIGANDO TIE-2 Las células COS-7 se cultivaron en un medio Eagle o de águila, modificado Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de bovino fetal (FBS), 1% de cada uno de penicilina y estreptomicina (P/S) y 2 mM de glutamina en una atmósfera del 5% de C02. La línea celular C2C12-ras del mioblasto de ratón se cultivó en un medio mínimo esencial Eagle o de águila (EMEM) con 10% de FBS, (P/S) y 2 mM de glutamina. La longitud completa de los clones cDNA del ligando TIE-2 de ratón se obtuvieron por la protección de una biblioteca cDNA C2C12-ras en el vector pJFE14 expresado en las células COS. Este vector, como se muestra en la Figura 2, es una versión modificada del vector pSRa (Takebe et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472) . La biblioteca se creó usando los dos sitios de restricción B?TX1 en el vector pJFEl4. Las células COS-7 se transfectaron temporalmente con cualquiera de las bibliotecas pJFE14 o el vector de control por el protocolo de transfección DEAE dextran. Brevemente, las células COS-7 fueron laminadas a una densidad de 1.0 x 106 células/100 mm placa 24 horas antes de la transfección. Por transfección, la células se cultivaron en DMEM libre de suero que contiene 400 µg/ml de DEAE dextran, 1 µM de cloroquina, y 2 Mm de glutamina, y 1 µg/ml del DNA apropiado por 3-4 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02. El medio de transfección se aspiró y se reemplazó con PBS con 10% de DMSO por 2-3 minutos. Siguiendo esta "pila" DMSO, las células COS-7 se colocaron en DMEM con 10% de DBS, 1% cada uno de penicilina y estreptomicina, y 2 mM de glutamina por 48 horas. Debido a que el ligando TIE-2 es secretado, fue necesario impermeabilizar las células para detectar el enlace del cuerpo receptor probado para el ligando. Dos días después de la transfección las células se enjuagaron con PBS y después se incubaron con PBS que contenía 1.8% de formaldehido por 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron entonces lavadas con PBS e incubadas por 15 minutos con PBS que contenía 0.1% de Tritón X-100 y 10% de suero de cría de bovino para permeabilizar las células y bloquear los sitios enlazantes no específicos. Los desechos se condujeron para la localización directa del manchado usando un cuerpo receptor TIE-2 (RB), el cual consistió del dominio extracelular del TIE-2 fusionado en la región constante IgGl. Este cuerpo receptor se preparó como en el Ejemplo 2. Un plato de 100 mm con células COS transfectadas, fijadas y permeabilizadas se probaron por la incubación de las mismas por 30 minutos con RB TIE-2. Las células fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas por unos 30 minutos adicionales con PBS/10%/suero de cría de bovino/conjugados de fosfatasa IgG anti-humano alcalino. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron en substratos de f?sfatasa alcalina por 30-60 minutos. El plato fue entonces inspeccionado microscópicamente por la presencia de células teñidas. Para cada célula teñida, un área pequeña de células que incluyen las células teñidas se rasparon a partir del plato usando una pipeta de punta de plástico y un DNA plasmidio fue entonces rascado y usado para las células bacteriales electroporadas. Las colonias bacteriales individuales que resultaron de la electroporación fueron perforadas y el DNA plasmidio preparado a partir de estas colonias se usó para las células COS-7 transfectadas las cuales fueron probadas por la expresión del ligando TIE-2 como evidencia para enlazar a los cuerpos receptores TIE-2. Esta identificación permitió a los clones individuales codificar al ligando TIE-2. La confirmación de la expresión del ligando TIE-2 se obtuvo por la fosforilación del receptor TIE-2 usando el método expuesto en el Ejemplo 5. Un clon plasmidio que codifica el ligando TIE-2 se depositó con el ATCC en octubre 7, 1994 y se designó como "el ligando TIE-2 que codifica al pJFE14" bajo ATCC acceso No. 75910.

EJEMPLO 7 AISLAMIENTO Y SECUENCIAS DE LA LONGITUD COMPLETA DEL CLON CDNA QUE CODIFICA AL LIGANDO HUMANO TIE-2.

Una biblioteca cDNA de pulmón fetal humano en lambda gt-10 (ver figura 3) se obtuvo de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Las placas se laminaron a una densidad de 1.25 x 10d/20x20 cm placa, y los filtros de réplica se tomaron siguiendo los procedimientos estándares (Sambrook et al Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd. Ed., página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York) . El aislamiento de los clones de ligados humanos tie-2 se realizó como sigue. Un fragmento 2.2 kb Xhol a partir del clon del ligando depositado tie-2 (ATCC No. 75910- ver Ejemplo 6 arriba) se etiquetó por la impresión aleatoria de una actividad específica de aproximadamente 5 x 108cpm/ng. La hibridación se realizó a 65°C en una solución de hibridación que contenía 0.5 mg/ml de DNA de esperma de salmón. Los filtros se lavaron a 65°C en 2 x SSC, 0.1% de SDS y se expusieron a una película Kodak XAR-5 durante la noche a -70°C. La fase positiva de las placas se purificó. La alta segregación de la fase del título se usó para el aislamiento del DNA vía una columna Qiagen usando técnicas estándares (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995 catalogo, página 36). La pase DNA se digirió con EcoRI para liberar el fragmento cDNA clonado para la subclonación subsecuente. Un vector de fase lambda que contiene el DNA del ligando humano tie-2, depositadas con el ATCC en octubre 26, de 1994, bajo la desginación de ?gtlO que codifica al ligando 1 htie-2 (ATCC Acceso No. 75928) . Lafpase de DNA puede someterse directamente al análisis de las secuencias de DNA por el método de terminación de la cadena didesoxi (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci: U.S.A 74: 5463-5467). La subclonación del DNA del ligando humano tie- 2 en un vector de expresión de mamífero puede abarcarse como sigue. El clon ?gtlO que codifica al ligando htie-2 contiene un sitio EcoRI localizado corriente debajo de 490 pares base a partir del inicio de la secuencia de códigos para el ligando humano TIE-2. La región de códigos puede escindirse usando sitios de restricción únicos corriente arriba y corriente abajo de los codones de detención respectivamente. Por ejemplo, un sitio Spel, localizado en 5' 70 bp al codon iniciador, y un sitio Bpull02i (también conocido como Blpl) , localizado al 3' 265 bp al codon de detención, puede usarse para escindir la región de códigos completa. Este puede ser subclonado en el vector de clonación pJFE14, usando los sitios Xbal (compatibles al saliente Spel) y al Pstl (el Pstl y los sitios Bpull02i son ambos elaborados en terminaciones directas) . La región de codificación del clon ?gtlO que codifican al ligando 1 htie-2 fue secuenciada usando el secuenciador DNA ABI 373A y el equipo terminador de ciclos de secuencias Didesoxi Taq (Biosistemas aplicados, Inc. Foster City, CA) . La secuencia nucleótida y derivada del aminoácido del ligando TIE-2 humano a partir del clon ?gtlO que codifica al ligando 1 htie-2 se muestra en la figura 4. Además, la longitud completa de los clones cDNA del ligando TIE-2 humano se obtuvo por los desechos de una biblioteca cDNA del glioblastoma humano T98G en el vector pJFE 14. Los clones que codifican al ligando humano TIE-2 se identificaron por la hibridación DNA usando un fragmento Xhol de 2.2 kb. A partir del clon del ligando tie-2 depositado (ATCC No. 75910) como una prueba (ver Ejemplo 6 arriba) . La región de códigos fue secuenciada usando el secuenciador DNA ABI 373A y el equipo terminador del ciclo secuenciador taq didesoxi (Biosistemas Aplicados, Inc., Foster City, CA) . Esta secuencia fue idéntica cercanamente a aquella del clon ?gtlO que codifica al ligando 1 htie-2. Como se muestra en la figura 4, el clon ?gtlO que codifica al ligando 1 tie-2 contiene un residuo glicina adicional el cual está codificado por los nucleótidos 1114-1116. La secuencia de códigos del clon T98G no contiene este residuo glicina pero de otro modo es idéntica a la secuencia de códigos del clon ?gtlO que codifica al ligando 1 htie-2. La figura 5 expone la secuencia de nucelótidos y aminoácidos derivados del ligando humano TIE-2 a partir del clon T98G.

EJEMPLO 8 AISLAMIENTO Y SECUENCIAS DE LA SEGUNDA LONGITUD COMPLETA DEL CLON DNA UNO QUE CODIFICA AL LIGANDO TIE-2 HUMANO.

Una biblioteca cDNA de pulmón fetal humano en lambda gt-10 (ver figura 3) se obtuvo de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Las placas se laminaron a una densidad de 1.25 x 106/20x20 cm placa, y los filtros de réplica se tomaron siguiendo los procedimientos estándares (Sambrook et al Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd. Ed., página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York) . Los filtros duplicados se protegieron a baja astringencia (2 x SSC, 55°C) con pruebas elaboradas a la secuencia del ligando 1 TIE-2 humano. Uno de los filtros duplicados se probó con una prueba 5' que codifica a los aminoácidos 25-265 del ligando 1 humano TIE-2 como se expuso en la Figura 4. El segundo filtro duplicado se probó con una prueba 3', que codifica a los aminoácidos 282-498 de la secuencia del ligando TIE-2 humano (ver figura 4) . Ambas pruebas fueron híbridas a 55°C en una solución de hibridación que contiene 0.5 mg/ml de DNA de esperma de salmón. Los filtros se lavaron en 2 x SSC a 55°C y se expusieron durante la noche a una película de rayos X.

Además, los filtros duplicados se hibridizaron también a astringencia normal (2 x SSC, 65°C) , a la longitud completa del código de prueba del ligando 1 ITE-2 de ratón (F3-15, inserto Xhol) . Los tres clones positivos se perforaron hasta que se completó en su totalidad el siguiente criterio: i. la hibridación no ha sido vista a la longitud completa (ratón) de prueba a astringencia normal y ii. la hibridación se observó a baja astringencia a ambas pruebas 5' y 3' . La digestión EcoRI de la fase DNA obtenida a partir de estos clones indicó dos clones independientes con los tamaños de insertos de aproximadamente 2.2 b y aproximadamente 1.8 kb. El inserto EcoRI 2.2kb se subclonó en los sitios EcoRI de ambos KS pBluescript (Estratagen) a un vector de expresión de un mamífero adecuado para el uso en las células COS. Dos orientaciones se identificaron para la expresión del vector del mamífero. El inserto 2.2 kb en el KS pBluescript se depositó con el ATCC el 9 de diciembre de 1994 y se desigó como el KS pBluescript que codifica al ligando 2 TIE-2 humano. EL sitio inicial del ligando 2 TIE-2 del código de secuencia es aproximadamente de 355 pares base corriente abajo del sitio EcoRI pBluescript. Las células COS-7 se transfectaron temporalmente con cualquiera de los vectores de expresión o vectores de control por el protocolo de transfección DEAE dextran. Brevemente las células COS-7 se colocaron a una densidad de 1.0 x 10d células/100 mm placa 24 horas antes de la trasnfección. Para la transfección, las células se cultivaron en DMEM libre de suero que contiene 400 µg/ml de DEAE dextran, 1 µM de cloroquina, y 2 mM de glutamina, y 1 µg del DNA apropiado por 3-4 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02. El medio de transfección se aspiró y reemplazó con fosfato amortiguador salino con 10% DE DMSO por 2-3 minutos. Seguido de esto el DMSO "golpeado" de las células COS-7 se colocó en DMEM con 10% de FBS, 1% cada uno de penicilina y estreptomicina, y 2 mM de glutamina por 48 horas . Debido a que el ligando TIE-2 es secretado, es necesario permeabilizar las células para detectar el enlace de la prueba del cuerpo receptor al ligando. Las células COS-7 transfectadas se colocaron a una densidad de 1.0 x 106 células/100 mm placa. Las células se enjuagaron con PBS y luego se incubaron con PBS que contiene 1.8% de formaldehido por 15-30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS y se incubaron por 15 minutos con PBS que contiene 0.1% de Tritón y 10% de suero de cría de bovino para permeabilizar las células y bloquear los sitios de enlace no específicos. La protección se condujo por la localización directa del teñido usando un cuerpo receptor TIE-2, el cual consiste del dominio extracelular del TIE-2 fusionado a la región constante IgGl. Este cuerpo receptor se preparó como se expone en el Ejemplo 2. Las células transfectadas se probaron por la incubación de las mismas por 30 minutos con el cuerpo receptor TIE-2. Las células fueron entonces lavadas dos veces con PBS, fijadas con metanol y luego incubadas por un adicional de 30 minutos con PBS/10%/suero de cría de bovino/conjugado de fosfatadas anti-humano IgG alcalina. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron en substratos de fosfatasa alcalina por 30-60 minutos. El plato se inspeccionó microscópicamente por la presencia de células teñidas. Las células que expresan una orientación del clon, pero no la otra orientación, se observaron por enlazar al cuerpo receptor TIE-2. Un experto en la técnica observará rápidamente que los métodos descritos pueden usarse para identificar adicionalmente a otros miembros relacionados a la familia del ligando TIE. La región que codifica para el clon KS pBluescript que codifica al ligando 2 TIE-2 humano se secuenció usando el secuenciador ADN ABI 373A y el kit terminador de ciclos de secuencias Taq dideoxi (Biosistemas aplicados, Inc., Foster City, CA) . La secuencia nucleótida y el aminoácido derivado del ligando TIE-2 humano a partir del clon KS pBluescript que codifica al ligando 2 TIE-2 humano está mostrada en la figura 6.

EJEMPLO 9 EL LIGANDO TIE-2 ES UN ANTAGONISTA RECEPTOR.

El medio acondicionado de células COS que expresan ya sea al ligando 2 (TL2) TIE-2 o al ligando 1 (TLl) TIE 1 (TLl) fueron comparadas por su capacidad para activar a los receptores TIE-2 presentes de manera natural en las líneas celulares endoteliales de humanos. El reactivo lipofectamina (GIBCO-BRL, Inc) y los protocolos recomendados se usaron para las células COS-7 transfectadas con cualquiera de los vectores de expresión pJFE14 solos, o vectores pJFE14 que contienen el cDNA ligando 1 TIE-2 humano, o un vector de expresión pMT21 (Kaufman, R.J. 1985, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 82: 689-693) que contiene el cDNA lignado 2 TIE-2 humano. El medio COS que contiene los ligandos secretados se cosecharon tres días después y se concentraron 20 pliegues por filtración (DIAFLO membranas de ultrafiltración, Amicon, Inc) . La cantidad del ligando 1 TIE-2 activo y el ligando 2 TIE-2 presente en este medio se determinó y se expresó como la cantidad (en unidades de resonancia; R:U) de la actividad de enlace específico del receptor TIE medida por un ensayo de enlace BIAcore. Los análisis Northern (RNA) revelaron niveles significantes de las transcripciones TIE-2 en células endoteliales primarias de humanos (Célula endotelial aórtica humana) HAEC (Clonetics, Inc.). Por lo tanto, estas células se usaron para examinar si el receptor TIE-2 es la tirosina fosforilada entonces expuesta a un medio COS que contienen los ligandos TIE-2. Las células HAEC se mantuvieron en un medio de crecimiento celular endotelial completo (Clonetics, Inc.) que contenía 5% del suero de bovino fetal, extracto de cerebro de bovino soluble, 10 ng/ml EGF humano, 1 mg/ml hidrocortisona, 50 mg/l gentamicina y 50 ng/ml amfotericina B. La valoración de que si TLl y TL2 pueden activar al receptor TIE-2 en las células HAEC se hizo como sigue. Las células HAEC semi confluentes se privaron de suero por dos horas en MEM Dulbecco de alta glucosa con L-glutamina y penicilina-estreptomicina a 37°C seguido por el reemplazo del medio de inanición con ligandos que contienen un medio COS acondicionado por 7 minutos a 37 °C en un incubador con 5% de C02. Las células fueron subsecuentemente disgregadas y la proteína del receptor TIE-2 se recuperó por la inmunoprecipitación de los disgregados con el antisuero péptido TIE-2 seguido por el manchado Western con el antisuero antifosfotirosina exactamente como se describe en el ejemplo 1. Los resultados están mostrados en la Figura 7. Los niveles de fosfotirosina en el receptor TIE-2 (TIE-2-R) se indujeron por el tratamiento de células HEAC con el ligando 1 TIE-2 (fila Ll) pero no por el medio COS acondicionado (fila L2) del ligando 2 TIE-2. El medio simulado o MOCK es acondicionado a partir de las COS transfectadas con el vector a vacío JFE14. La evidenica de que ambos TLl y TL2 enlazan específicamente al receptor TIE-2 se demostró por el uso de un BIAcore para valorar las actividades enlazantes específicas del receptor TIE-2 en el medio COS transfectadas y por el inmuno teñido de TLl y TL2 que expresan células COS con los cuerpos receptores TIE-2. Debido a que el TL2 no activa al receptor TIE-2 los solicitantes pretenden determinar si el TL2 puede ser capaz de servir como un antagonista de la actividad TLl. Los ensayos de fosforilación HAEC se realizaron en las células que fueron primero incubadas con un "exceso" de TL2 seguido por la adición del TLl diluido. Se razona que la ocupación previa del receptor TIE-2 debido a los niveles altos del TL2 se podrá prevenir la estimulación subsecuente del receptor siguiendo a la exposición al TLl presente a una concentración limitante. Las células HAEC semiconfluentes fueron privadas del suero como se describe arriba y después se incubaron por 3 minutos, a 37 °C con 1-2 ml de un medio acondicionado COS 20 X/JFE14-TL2. Las placas de control se trataron solamente con un medio COS 20X/JFE14 (MOCK o simulado) . Las placas se eliminaron a partir del incubador y varias diluciones del medio COS/JFE14-TL1 se agregaron después, seguida de la incubación adicional de las placas por 5-7 minutos a 37 °C. Las células se enjuagaron subsecuentemente, se disgregaron y la fosforilación de la tirosina específica tie-2 en las disgregaciones se examinó por la inmunoprecipitación del receptor y del manchado Western, como se describe arriba. Las diluciones TLl se elaboraron usando un medio COS 20x/JFE14-TLl diluido con 2X, 0.5X, 0.1X, o 0.02X por la adición dé un medio COS 20X/JFE14-solo. Un ensayo del medio inicial TLl 20X y COS TL2 20X usando tecnología biosensora BIAcore indicó que contenían cantidades similares a las actividades enlazantes específicas TIE-2, es decir, 445 R.U. y 511 R.U. por TLl y TL2 respectivamente. Los resultados del manchado Western de la antifosfotirosina mostrado en la figura 8, indican que cuando se comparan al tratamiento previo, de las células HAEC, con el medio MOCK o simulado (fila 1) previo al tratamiento de las células HAEC con excesos de TIE-2 ligando 2 (fila 2), antagonizan la subsecuente capacidad de diluir al ligando 1 TIE-2 activo al receptor TIE-2 (TIE-2-R) . La capacidad del TL2 para inhibir completamente la activación TLl del TIE-2-R se demostró además usando la línea híbrida de células humanas, EA.hy926 (ver Ejemplo 21 para la descripción detallada de esta línea celular y su mantenencia) . Los experimentos se realizaron en el cual, los medios de células COS no concentrados que contienen TLl, se mezclaron a diluciones variantes con un medio acondicionado ya sea MOCK o simulado o TL2 y se colocaron en monocapas de células EA.hy926 privadas de suero por 5 minutos a 37°C. El medio se eliminó entonces, las células se cosecharon por la disgregación y la fosforilación de la tirosina específica TIE-2- se examinó por los machados Wester, como se describe arriba. La figura 9 muestra un experimento el cual contiene tres grupos de tratamientos, como los vistos de izquierda a derecha. Como se muestra en las cuatro filas a la izquierda, el tratamiento de las células EA.hy926 con 1 x COS-TL1 solos robustamente activan a los endógenos TIE-2-R en estas células, mientras el medio COS TL2 IX es inactivo. Sin embargo, la mecía de TLl con ya sea MOCK o TL2 demostró que el TL2 puede bloquear la actividad de TLl en una forma de dosis dependientes. En los tres pares centrales de lineas, la relación de TL2 (o MOCK) disminuyó mientras la cantidad de TLl en la mezcla fue correspondientemente disminuida a partir de 0.1 a 0.3 X. En cualquiera de estas mezclas las relaciones de las filas TL1:TL2 mostraron un nivel reducido de fosforilación TIE-2-R comparado con aquel de las correspondientes filas TLl:Mock. Cuando la cantidad TLl fue calentada permanentemente y la cantidad de TL2 (O mock) disminuyó, sin embargo (mostrado en los tres pares de filas a la derecha) , se alcanzó un punto al cual el TL2 en la muestra se diluyó también para inhibir efectivamente la actividad TLl. La cantidad relativa de cada ligando presente en estos medios COS acondicionados puede estimarse a partir de sus unidades enlazantes como las medidas por el ensayo BIAcore y a partir de los teñidos Western del medio COS con anticuerpos del ligando específico. Consecuentemente, se puede inferir que solamente un exceso molar de pliegues, casi de TL2 se requiere para bloquear efectivamente la actividad de TLl in vitro. Esto es significante puesto que se han observado distintos ejempos in vivo (ver ejemplo 17 y figura 16) en donde el TL2 mRNA alcanza abundancia considerable relativa a aquellos de TLl. Además, el TL2 puede servir como un papel fisiológico importante en el bloqueo efectivamente del señalamiento por el TIE-2-R a estos sitios. Tomando juntos estos datos, se confirma que, de manera distina TLl, T12 no son capaces de estimular endógenamente el TIE-2-R expresado en células endoteliales. Además, a un exceso molar de unos cuantos pliegues, el TL2 puede bloquear la estimulación TLl del receptor TIE-2 indicando que el TL2 es un receptor antgonista TIE-2 que ocurre de manera natural.

EJEMPLO 10 IDENTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENLAZANTE ESPECIFICA DE TIE-2- EN UN MEDIO ACONDICIONADO Y CÉLULAS COS SOBRENADANTES La actividad enlazante de CCM lOx a partir de las líneas celulares C2C12-ras Rat-ras, SHEP, y T98G, o sobrenadantes de células COS después de la transfección con ya sea el ligando 1 TIE-2 humano (hTLl) o ligando 2 TIE-2 humano (hTL2) se midió usando la tecnología de biosensor (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway; NJ) , en la cual las interacciones biomoleculares monitoreadas en tiempo real vía la superficie de resonancia del plasma (SPR) . El TIE-2 RB humano o de rata se acoplaron covalentemente a través de aminas primarias a la capa de dextran de carboximetilo de un chip de sensor de grado de búsqueda CM5 (Pharmacia Biosensor; Piscataway N.J.) La superifice del chip sensor se activó usando una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N' (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), seguido por la inmobilización del RB TIE-2 (25 µg/mL, pH 4.5) y la desactivación de los sitios sin reaccionar con 1.0 m de etanolamina (pH 8.5) . En general, 9000-10000 RU de cada cuerpo receptor se acopló al chip sensor. El amoriguador corrido en el sistema fue HBS (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.005% surfactante P20, pH 7.4). Las muestras se centrifugaron por 15 minutos a 4°C y se clarificaron además usando un filtro 0.45 µm enlazante de baja proteína (Milliporo, Bedfor MA) . El dextran (2 mg/ml) y el surfactante P20 (0.005%) se agregaron a cada muestra. Las alícuotas de 40 µL fueron inyectadas a través de la superficie inmovilizada (ya sea TIE-2 de rata o humano) a una relación de flujo de 5 µL/min y el enlazante receptor se monitoreo por 8 minitos. La actividad enlazante (unidades de resonancia; RU) se midió como la diferencia entre un valor de línea base determinado 30 s previo a la muestra de inyección y a una medida tomada a 30 s posterior a la inyección. La regeneración de la superficie se acompletó con un pulso 15-µL de 3 M de MgCl2. Las muestras CCM (C2C12-ras, SHEP T98G) se probaron en la superficie inmobilizada RB TIE-2 de rata, mientras el hTLl y hTL2 recombinantes fueron valorados en laa superifice inmovilizada RB TIE-2 humano. En cada caso, el enlzace específico al cuerpo receptor TIE-2 se evaluó por la incubación de las muestras con 35 µg/ml de cualquiera de TIE-2 (rata o humano) soluble o RB trk previo a la valoración de la actividad enlazante. Como se muestra en las figuras 10 y 11, la adición de RB trkB soluble causa una ligera disminución en la actividad enlazante TIE-2, mientras la adición del RB TIE-2 soluble reduce significativamente la actividad enlzante como la comparada a la medida en la ausencia de RB TIE-2.

EJEMPLO 11 ACTIVACIÓN DE LOS BLOQUES ESPECÍFICAMENTE RB TIE-2, DEL RECEPTOR TIE-2 POR EL LIGANDO 1 TIE-2.

Los aplicantes deberán determinar si el RB TIE-2 soluble puede servir como un inhibidor competitivo para bloquear la activación del receptor TIE-2 por el ligando 1 TIE-2 (TLl) . Para hacer esto, el medio COS que contiene TLl se pre-incubó con ya sea TIE-2 o TrkB-RB y después se comparó por su capacidad para activar a los receptores TIE-2 presentes de manera natural en una línea celular endotelial humana. El medio COS acondicionado se generó a partir de las células COS-7 transfectadas con ya sea el vector de expresión pJFE14 solo (MOCK) o el vector pJFE14 que contiene el DNA ligando 1 TIE-2 humano (TLl) y se cosechó como se describe en el ejemplo 9 aquí anteriormente, con la excepción que el medio filtrado es estéril pero no concentrado. La cantidad de TLl se determina y se expresa como la cantidad (en unidades de resonancia R.U.) de la actividad enlazante específica del receptor TIE-2 medida por el ensayo de enlace BIAcore. Los análisis de Northen (RNA) revelaron niveles significantes de transcriptores tie-2 en HUVEC (células endoteliades de la vena umbilical humana) células endoteliales primarias humanas (Clonetics, Inc. Por lo tanto, estas células se usaron para examinar si el receptor TIE-2 puede ser la tirosina fosforilada cuando se expone en la presencia de TIE-2 o TrkB-RBs al medio COS que contiene TLl. Las células HUVEC se mantuvieron a 37 °C, 5% C02 en un medio de crecimiento celular endotelial completo (Clonetics, Inc), que contiene 5% de suero de bovino fetal, extracto de cerebro de bovino soluble con 10 µg/ml heparina, lOng/ml de EGF humano, 1 ug/ml hidrocortisona, 50 µg/ml de gentamicina y 50 ng/ml de anfotericina-B. La valoración de si TLl podrá activar al receptor en las células HUVEC se hizo como sigue. Los platos confluentes de células HUVEC fueron limitados de suero de dos a cuatro horas en MEM dulbecco bajo en glucosa a 37 °C, 5% de C02, seguido por 10 minutos de incubación en un medio de privación que incluye 0.1 mM de ortovanadato de sodio, un inhibidor potente de las fosfatasas fosfotirosina. Mientras tanto, a un medio COS acondicionado, preincubado 30 minutos a temperatura ambiente con ya sea TIE-2 o TrkB-RB se le agregó a 50 µg/ml. El medio de limitación fue entonces eliminado de los platos HUVEC e incubado con el medio COS que contiene RB por 7 minutos a 37 °C. Las células HUVEC fueron subsecuentemente disgregadas y la proteína del receptor TIE se recuperó por inmunoprecipitación con el antisuero peptido TIE-2, seguido por el manchado western con un anticuerpo antifosfotirosina, como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados están mostrados en la figura 12. Los niveles de fosfotirosina en el receptor TIE-2 fueron inducidos por el tratamiento de las células HUVEC con el ligando 1 TIE-2 (TLl) relativo a aquel observado con el medio de control (MOCK) y esta inducción se bloquea específicamente por la incubación previa con TIE-2-RB pero no por la incubación den TrkB-RB (TkrB-Fc) . Estos datos indican que el RB TIE—2- soluble puede servir como un inhibidor selectivo para bloquear la activación del receptor TIE-2- por el ligando 1 TIE-2-.

EJEMPLO 12 CONSTRUCCIÓN DE CUERPOS LIGANDOS DE TIE-2 Una estructura de expresión se creó para poder obtener una proteína secretada que consiste de la secuencia de códigos completa del ligando 1 TIE-2 humano (TLl) o el ligando 2 TIE-2 (TL2) fusionado a la región constante gama-1 de inmunoglobulina humana. Estas proteínas de fusión son llamadas "cuerpos ligandos" TIE-2 (TLl-Fc o TL2-FC) . La porción Fc del TLl-Fc y el TL2-Fc se preparó como sigue. Un fragmento de ADN que codifica la porción Fc del IgGl humano que es esencial a partir de la región giratoria al término carboxi de la proteína, se amplificó a partir del cDNA de placenta humana por el PCR con oligonucleótidos que corresponden a la secuencia publicada del IgGl humano; el fragmento DNA resultante se clonó en un vector plásmidio. Los fragmentos de restricción de ADN apropiados a partir de una longitud competa TLl o TL2 que codifica un palsmidio y a partir del plasmido IgGl Fc humano se ligaron con cualquier lado de un fragmento corto PCR derivado que se designó para fusionarse, en estructura, TLl o TL2 con las secuencias de código de proteínas IgGl y Fc. Las cantidades en miligramos de TL2-Fc se obtuvieron por la clonación del gragmento DNA TL-2- Fc en el vector Baculovirus pVL1939 y subsecuentemente infección de la línea celular del insecto Spodoptera frugiperda SF-21AE. Alternativamente, la línea celular SF.9 (ATCC Aceso No. CRL 1711) o la línea celular BTI-TN-5bl-4 pueden usare. EL DNA que codifica al TL2-Fc se clonó como un fragmento Eco RI-Notl en los plásmidos de transferencia del baculovirus pVL1393. El plásmidio DNA se recombinó en el DNA viral por el mezclado de 3 µg del DNA plasmidio con 0.5 µg de DNA Báculo-dorado (Pharminigen) , seguido por la introducción en los liposomas usando 30 µg de lipofectina (GIBCO-BRL) . Las mezclas de liposomas DNA se agregaron a las células SF- 21AE (2x 106 células/60 mm plato) en un medio TMN-TH (medio celular de insecto Grace modificado (GIBCO-BRL) por 5 horas a 27°C, seguido por la incubación a 27°C por 5 días en un medio TMN-FH complementado con suero de cría fetal 5%. El medio de cultivo de tejidos se cosechó por la purificación de la placa de los virus recombinantes, los cuales se realizaron completamente usando métodos descritos previamente (O'Reilly, D.R., L.K. Miller y V.A. Luckow, Vectores de la cubierta de expresión del vaculovirus - Un laboratorio manual, 1992, New York: W.H. Freeman) excepto que la agarosa de cubierta contenía 125 mg/mL X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b—D-galctopiranosido; GIBCO-BRL) . Después de 5 días de incubación a 27 °C, las placas no recombinantes se registraron por la reacción cromatogénica positiva al substrato X-gal, y sus posiciones marcadas. Las placas recombinantes fueron entonces visualizadas por la adición de una segunda' cubierta que contiene 100 mg/mL de MTT (bromuro de 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5, difeniltetrazolio; Sigma). La recombinación putativa de las placas de virus fueron perforadas por la aspiración del obturador, y purificadas por rondas múltiples del aislamineto de la placa para asegurar la homogeneidad. Las pilas de virus se generaron por series, de transiciones de baja multiplicidad del virus de la placa purificada. Se produjo la pila de transición lenta de un clon del virus (vTL2-Fc Clon #7) . Las células SF-217?E se cultivaron en un medio libre de suero (SF-900 II, Gibco BRL) que contiene una solución antibiótica lX/antimicóticas (Gibco BRL) y 25 mg/L de gentamicina (Gibco BRL) . Se agregó F-68 plurónico como un surfactante a una concentración final de 1 g/L. Los cultivos (4L) se enjuagaron en un bioreactor (Sistema de Estación de células Artisan) por al menos tres días antes de la infección. Las células crecieron a 27°C, con saturación de gas a 50% de oxígeno disuelto, a una relación de flujo de gas de 80 mL/min (aireación a un anillo de resorte) . La agitación fue por medio de un impulsor marino a una relación de 100 rpm. Las células se cosecharon en una fase de medio de crecimiento logarítmico (~2xl06 células/mL) , concentradas por centrifugación, e infectadas con 5 placas formando unidades de vTL2-Fc por célula. Las células y los inóculos fueron llevados a 400 mL con un medio fresco, y los virus se adsorbieron por 2 horas a 27 °C en un matraz. El cultivo fue entonces resuspendido en un volumen final de 8L con un medio fresco libre de suero, y las células se incubaron en un bioreactor usando las condiciones descritas previamente. El medio de cultivo de las células SF217AE vTL2-Fc infectadas se colectaron por centrifugación (500x g, 10 minutos) a 72 horas después de la inyección. Los sobrenadantes celulares se llevaron a pH 8 con NaOH. Se agregó EDTA a una concentración final de 10 mM y el pH del sobrenadante se ajustó a 8 . Los sobrenadantes se filtraron ( 0 . 45 µm, Miliporo ) y se cargaron en una columna de proteína A ( sefarosa proteína A fluj o rápido o proteina A HiTrap, ambas de Pharmacia) . La columna se lavó con PBS que contiene o . 5 M de NaCl hasta que la absrobencia a 280 nm disminuyó a un linea base . La columna se lavó con PBS y eluyó con ácido acético 0. 5M . Las fracciones de la columna se neutralizaron inmediatamente por la elución en los tubos que contienen ÍM de tris a pH 9. Las fracciones de los picos que contienen el TL2-Fc se virtieron y analizaron contra el PBS .

EJEMPLO 13 EXPRESIÓN DE TIE-1, TIE-2, TLl, Y TL2 EN CARCINOMA DE CÉLULAS RENALES.

Los experimentos de hibridación in situ se realizaron en tejidos de tumor de carcinoma de células renales en humanos usando pruebas de cDNA TIE-1, TIE-2, TLl y TL2. Todas las expresiones TIE-2, TIE-1, TLl y TL2 se regularon en la vasculatura del tumor. La expresión del ligando pareció localizarse en cualquiera de las células endoteliales vasculares (TL2) o muy cerca de las células endoteliales vasculares en el mesénquima (TLl) . El VEGF ha sido mostrado por ser dramáticamente sobre regulado en este tejido del tumor. Brown et, al. Am, J. Pathol. 143:1255-1262 (1993).

EJEMPLO 14 EXPRESIÓN DE TIE-1, TIE-2, TLl Y TL2 EN HERIDAS SANGRANTES .

Los experimentos de hibridación in situ se realizaron cortes de tejidos en secciones transversales obtenidos a partir de un modelo de herida cutánea en rata usando pruebas de cDNA de TIE-1, TIE-2, TLl y TL2. Los modelos de heridas sangrantes involucraron la presión de un pequeño corte realizado contra la piel de una rata y eliminando una pequeña obturación cilindrica de la piel. Como el sangrado es en la base de la herida, se toma un corte vertical del tejido y se usa para la hibridación in situ. En la muestra del tejido de prueba, TLl y TL2 parecen estar ligeramente regulados por cuatro días posteriores al daño. En contraste a la ligera regulación de la expresión de TLl y TL2 en este tejido, la expresión del VEGF, puede parecer a la expresión TLl y TL2 dramáticamente regulada.

EJEMPLO 15 EXPRESIÓN DE LOS LIGANDOS TIE EN HÍGADO Y TIMUS FETALES.

La transcripción PCR inversa (RT-PCR) se realizó en un hígado fetal E14.5 de ratón y en timus fetal E17.5. la electroforesis en gel de agarosa de los productos RT-PCR reveló que en el hígado fetal de ratón, el ligando 1 TIE-2 (TLl) el RNA está enriquecido en la región estromal, pero está ausente en las células precursoras hematopoyeticas c-kit+TER119. En este mismo tejido, el ligando 2 TIE-2 (T12) RNA está enriquecido en las células estromales, pero ausente en las células precursoras hematopoyeticas (Figura 13) . En el timus fetal de ratón, el TL2 está enriquecido en las células estromales (Figura 14) .

EJEMPLO 16 EL SISTEMA RECEPTOR TIE/LIGANDO EN LA ANGIOGENESIS A pesar de que el sistema de ligando TIE-2/tie parece jugar un papel importante en la bilogía de las células endoteliales, este no se ha mostrado por jugar un papel activo, significante, en la formación en los estados intermediarios de la vascularización (por ejemplo proliferación celular endotelial o angioblastos y migración, formación de tubulo, y otros eventos de fases tempranas en el modeado vascular) . En contrate a los receptores y los factores conocidos para mediar estos aspectos del desarrollo vascular, el modelo final temporal de la expresión de TIE-2 y TLl en el curso de la vascualrización sugiere que este sistema juegue un papel distinto en el desarrollo vascular de las últimas estapas, incluyendo las diferenciaciones y estabilización estructural y funcional de los nuevos vasos sanguíneos. Los modelos de expresión del TIE-2/TL1 también son consistentes con un papel continuo en el mantenimiento de la integridad estructural y/o características físicas de una vasculatura establecida. El ligando 2 TIE (TL2) parece ser un inhibidor competitivo de TLl. Las características de espectro temporal de la expresión de TL2 sugieren que esta molécula inhibitoria individual juegue papeles múltiples en el contexto dependiente, esenciales para el desarrollo vascular apropiado o la remodelación (por ejemplo desestabilización/de la diferenciación de las células endoteliales maduras permitiendo la formación de nuevos vasos a partir de las vasculatura existente, inhibición de la formación de los vasos sanguíneos inapropiados, y la regresión/involucración de los vasos sanguíneos maduros) . La figura 15 es una representación esquemática de un papel hipotético de los ligandos TIE-2/TIE en la angiogénesis. En esta figura, el TLl está representado por (•) , TL2 está representado por (*), TIE-2 está representado por (T), VEGF está representado por ([]), y flk-1 (un receptor VEGF) está representado por (Y) • EJEMPLO 17 EXPRESIÓN DE LOS LIGANDOS EN EL SISTEMA REPRODUCTIVO FEMENINO: EXPRESIÓN EN EL OVARIO.

Las observaciones preliminares elaboradas en examinaciones experimentales en la expresión de los recpetores TIE y ligandos en el sistema reproductivo femenino son consistentes con la hipótesis de que el TLl juega un papel en la neovascularización la cual temporalmente sigue del VEGF. El modelo de la expresión de TL2 es también consistente con un antagonismo de la acción de TLl, y un papel específico en la regresión vascular. Para verificar esto, la expresión de mRNAs relevante puede examinarse siguiendo la inducción experimental del desarrollo folicular y luteal de manera que su relación temporal a varios aspectos de la regresión neovascularización/vascular puedan ser definidos más claramente (por ejemplo en conjunto con el teñido de células endoteliales, rellenos vasculares) . La angiogenesis asociada con el desarrollo folicular y la formación de cuerpos lúteos en estado de ovario en ratas hembras maduras o siguiendo la ovulación inducidad en animales pre-pubertales se siguió usando en la hibridación in situ. La figura 16 contiene fotografías de los cortes de hibridación in situ mostrando el modelo de expresión temporal del TIE-2, TLl, TL2 y VEGF durante el ciclo de ovario [Columna 1: folículo temprano preovulatorio; Columna 2: folículo preovulatorio; Columna 3: cuerpo lúteo temprano; y columna 4: folículo atrético; hilera A; campo de luz; hilera B; VEGF; hilera C; TL2; hilera DTL1 e hilera E; receptor TIE-2] . Estos estudios revelan que el VEGF, TLl y TL2 están expresados en modas cordinadas espacial y temporamlmente con respecto al desarrollo y regresión de la vasculatura en el ovario, específicamente con respecto al establecimiento del sistema vascular el cual es generado en el curso de la conversión de un folículo ovario a un cuerpo lúteo (CL) . Brevemente, la expresión VEGF se incrementa en la capa de grano folicular previa a su vascularización durante el proceso de luteinización. Durante el proceso de la formación CL, niveles elevados de la expresión VEGF son aparentes en el centro del desenvolvimiento o desarrollo en CL en la vecindad de las células luteinizantes las cuales no están aún vascularizadas . Los niveles VEGF pemanecen moderadamente altos y están dstribuidos difusamente en el CL desarrollado. En contraste, la expresión aumentada notablemente del ligando 1 TIE-2 ocurre solamente al final del procedimiento de la formación CL, después que un plexus vascular primario ha sido establecido. Después, la expresión TL 1 es aparente a através del CL al tiempo del cual el retículo capilarmente definitivo del CL ha sido establecido. EL TL2 exhibe un modelo más complejo de expresión que su VEGF o TLl. En el desarrollo de CL, el T12 está expresado a niveles superiores al frente del plexus capilarmente desarrollado entre la región vascular central del CL donde la expresión VEGF es superior, y la porción más peritoneal del CL en donde la expresión TLl es dominante, y en donde el procedimiento de luteinización se completa y el sistema vascular es más maduro. El TL2 también parece expresarse a elevados niveles en la capa folicular de los folículos grandes los cuales están sometidos a atresia. Mientras el TLl es también aparente en los folículos atréticos, el VEGF no está expresado. El modelo de expresión descrito arriba es más consistente con un papel para VEGF en la iniciación de la angiogenesis, con TLl actuando al final de este procedimiento por ejemplo en el moldeado y/o la estabilización del retículo vascular definitivo. En contraste, el T12 está presente ya sea en áreas de expresión activa de un recientemente formando retículo vascular (durante la formación de CL) , y en regiones las cuales fallan por establecer una nueva vasculatura y regresión vascular en progreso (folículos atréticos) . Esto sugiere un papel más dinámico y compelto para T12, posiblemente involucrando desestabilización de la vasculatura existente (necesaria para la regresión) o vasculatura desarrollada (necesaria para el moldeado dinámico de los vasos saguíneos formados nuevamente) .

EJEMPLO 18 UN ENSAYO DE ENLACE DE UN CUERPO RECEPTOR Y UN ENSAYO DE ENLACE Y COMPETENCIA DEL LIGANDO.

Un ensayo de enlace cuantitativo libre de células con dos formatos alternos ha sido desarrollado para detectar cualquier cuerpo receptor TIE-2 enlazante o de enlace y competencia del ligando. En la versión enlazante del cuerpo receptor del ensayo, los ligandos TIE-2 (purificados o parcialmente purificados; ya sea TLl o TL2) son revestidos en una placa de ELISA. El cuerpo receptor a concentraciones variantes es entonces agregado, el cual enlazan al ligando inmobilizado a manera de dosis dependiente. Al final de las 2 horas, el cuerpo receptor en exceso es lavado a distancia, entonces la cantidad el enlace a la plaqueta es reportada usando un anticuerpo especifico antihumano Fc el cual es un objetivo fosfatasa alcalina. El anticuepro reportado en exceso es lavado a distancia entonces la reacción de AP se desarrolla usando un sustrato coloreado. El ensayo es cuantificado usando un espectrofotometro. La figura 19 muesrta una curva en el enlace típico TIE-2IgG. Este ensayo ha sido usado para evaluar la integridad del TIE-2 IgG después de la inyección en ratas y ratones. El ensayo puede también ser usado en este formato como un ensayo de competición de ligando en el cual, los ligandos purificados o parcialmente purificados compiten con un ligando inmobilizado para el cuerpor receptor. En el enlace ligando y la versión de competición del ensayo de enlace, el ectodominio TIE-2 es revestido en la placa ELISA. Los fragmentos de dominio similares al fibrinógeno Fc-objetivo de los ligandos TIE (TLl, fFc y TL2-ÍFC) después enlazan al ectodominio y pueden ser eliminados usando el mismo aticuerpo antihumano Fc como se describe arriba. La figura 20 muestra un ejemplo de enlace TLl-fFc al ectodominio TIE-2. Esta versión del ensayo puede ser usada a niveles cuantitativos del TLl-fFc en el suero u otras muestras. Si el ligando no objetivo (nuevamente, ya sea purifcado o no purifcado) se agrega al mismo tiempo como el TLl-fFc, entonces, una comptencia se expone entre el fragmento ligando objetivo y la longitud completa del ligando. En la longitud completa el ligando puede desplazarse al fragmento Fc objetivo, y generar una curva de competencia.

EJEMPLO 19.

LINEAS CELULARES EA.hy926 PUEDEN USARSE COMO LINEAS CELULARES REPORTADAS PARA LA ACTIVIDAD DEL LIGANDO TIE.

La línea E.A.hy926 es una línea híbrida que se establece por la fusión de HUVEC con la línea derivada de carcinoma de pulmón humano, A548 [Edgell, et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 80, 3734-3737 (1983). Las Células EA.hy926 han sido encontradas por expresar niveles significantes de la proteína del receptor TIE-2 con niveles de fosfotirosina basal baja. La densidad a la cual las células EA.hyp926 son pasadas previo a su uso para los ensayos receptores, así también como el grado de confluencia al tiempo del ensayo, pueden efectuar abundancia del receptor TIE-2 e inducibilidad relativa en la respuesta al tratamiento con el ligando. Al adoptar el siguiente régimen para el crecimiento de estas células, se puede usar la línea celular EA.hy926 como un sistema dependiente para el ensayo de las actvidades del ligando TIE-2. Las células EA.hy926 son sembradas a 1.5 x 106 células en matraces T-75 ( Falconware) y re-alimentadas completamente otro día con MEM dulbecco de alta glucosa, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina, penicilina-estreptomicina, y hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT, Gibco/BRL) . Después de tres a cuatro días de crecimiento, estas células son pasadas una vez nuevamente a 1.5 x 106 células por matraz T-75 y cultivadas unos tres a cuatro días adicionales. Para los ensayos de fosforilación, las células preparadas como se describe arriba fueron privadas de suero por el reemplazo del medio de cultivo con alta glucosa DMEM e incubación por 2-3 horas a 37 °C Este medio de aspiró a partir del matraz y las muestras del medio acondicionador o ligando purificado y se agregaron al matraz en un volumen total del 1.5 ml seguido por la incubación a 37°C por 5 minutos. Los matraces fueron eliminados del incubador y colocados en una burbuja de hielo. El medio se eliminó y se colocó nuevamente con 1.25 mL de amortiguador Lisis que contiene 1% de nonidet P-40 0.5% de desoxicolato de sodio, 0.1% SDS en 20 mM de Tris, a pH 7.6, 150 mM de NaCl, 50 mM de NaF, ortovanadato de sodio 1 mM, 5 mM de benzanidina, y 1 mM de EDTA que contiene los inhibidores proteasa PMSF, aprotinina y leupeptina. Después de 10 minutos en hielo para permitir la solubilización de la membrana, las placas se raspan y las células disgregadas se clarificaron por la microcentrifugación a velocidad superior por 10 minutos a 4°C. El receptor TIE-2 se inmunoprecipitó del sobrenadante clarificado por la incubación en frío con un anticuerpo policlonal anti TIE-2 y burbujas de sefarosa de Proteína G conjugada. Las burbujas se lavaron tres veces con amortiguador de la lisis de células frías y se calentaron 5 minutos en el amortiguador de la muestra, el cual se cargó en 7.5% de geles de poliacrilamida SDS. Las proteínas resueltas se electrotransfirieron a la membrana PVDF (Lamblia-P) y después sometidas a teñidos Western usando anticuerpos antifosfotirosina y el reactivo Ecl . La comparación subsecuente de los niveles totales de la proteína TIE-2 en los mismos teñidos se hizo por el corte del anticuerpo antifosfotirosina y se reincubaron con un antisuerpo policlonal específico al ectodominio de TIE-2.

EJEMPLO 20 AISLAMIENTO Y SECUENCIACIQN DE LA LONGITUD COMPLETA DEL CLON cDNA QUE CODIFICA AL MAMÍFERO DEL LIGANDO 3 TIE.

El ligando 3 (TL3) se clonó a partir de una biblioteca genómica BAC (Genetics Research) por los duplicados de bibliotecas hibridizantes, en ya sea TL-1 de ratón o TL2 de ratón, en pruebas que corresponden a la secuencia de códigos completa de aquellos genes. Cada copia de la biblioteca se hibridizo usando amortiguador fosfato a 55°C durante la noche. Después de la hibridación, los filtros se lavaron usando 2xSSC, 0.1% de SDS a 60°C, seguido por la exposición de la película de rayos X a los filtros. Las señales fuertes de hibridación se identificaron correspondientes a TLl de ratón y TL2 de ratón. Además, las señales se identificaron en las cuales se hibridizaron escasamente a ambos TLl y TL2 de ratón. El ADN que corresponde a estos clones se purificó, luego se digirió con las enzimas de restricción, y dos fragmentos los cuales hibridizaron a las pruebas originales, se subclonaron en un plasmido bacterial y se secuenciaron. La secuencia de los fragmentos contiene dos exones con homología a ambos TLl y TL2 de ratón. Los sebadores específicos de estas secuencias se usaron como sebadores PCR para identificar tejidos que contienen transcriptos que corresponden al TL3. Una banda PCR que corresponde al TL3 se identificó en una biblioteca cDNA de útero de ratón en el gt-11 lambda (Clontech Laboratorios; Inc., Palo Alto, CA) .

Las placas se laminaron a una densidad de 1.25 x 106/20x20 cm placa y los filtros de réplica tomados siguieron los procedimientos estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da. Edición, página 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, New York) . Los filtros duplicados se protegieron a estrigencia "normal" (2 x SSC, 65°C) con una prueba radioactiva PCR 200 bp elaborada de la secuencia TL3 de ratón. La hibridación se hizo a 65°C en una solución que contiene DNA de esperma de salmón 0.5 mg/ml. Los filtros se lavaron en 2 x SSC a 65°C y se expusieron por 6 horas a película de rayos X. Dos clones positivos que se hibridizaron en duplicado se perforaron. La digestión EcoRI de la fase DNA obtenida a partir de estos clones indicó dos clones independientes con tamaños de insertos de aproximadamente 1.2 kb y aproximadamente 2.2 kb. El inserto EcoRI 2.2kb se subclonó en el sitio EcORI del KS pBluescript (estratagene) . El análisis de la secuencia mostró que los clones largos carecen de una metionina iniciadora y una señal peptida pero en otra forma, codifican una prueba homologa a ambos TLl y TL2 de ratón.

Dos sebadores PCR TL-3 específicos se sintetizaron posteriormente como sigue: US 2: cctctgggctcgccagtttgttagg US 1 : ccagctggcagatatcagg Las siguientes reacciones PCR se realizaron usando las bibliotecas de expresión derivadas de las líneas celulares de ratón C2C12-ras y MG87. En la reacción PCR primera, el sebador específico US2 se uso en conjunto con los oligos del vector específico para permitir la amplificación en sus orientaciones. El PCR fue de un volumen total de 100 ml usó 35 ciclos de 94°C, 1 minuto; 42°C o 48°C por 1 minuto; 72°C, 1 minuto.

La reacción PCR secundaria incluye el segundo sebador específico, US1, el cual está contenido dentro del producto primario PCR, en conjunto con los mismos vectores oligos. Las reacciones secundarias fueron de 30 ciclos usando las mismas temperaturas y tiempos como se previo. Los productos PCR fueron gei aislado y sometidos para análisis de secuencias. En la base de las secuencias obtenidas a partir de un total de cuatro reacciones independientes PCR usando dos bibliotecas cDNA diferentes, se derivó el extremo 5 de la secuencia TL3. El análisis Northern reveló niveles bajos moderados del transcripto TL3 de ratón en placenta de ratón. La expresión dei TL3 de ratón consistió de un transcripto de aproximadamente 3 kb. La longitud completa de ia secuencia del código TL3 está expuesta en la Figura 21.

La secuencia TL3 de ratón puede usarse para obtener un clon humano que contiene la secuencia de códigos del TL3 humano para hibridizar ya sea a una biblioteca cDNa o genómico humano, con una prueba que corresponde a un TL3 de ratón, como se ha descrito previamente, por ejemplo, en el Ejemplo 8 anterior.

EJEMPLO 21 AISLAMIENTO DE LA LONGITUD COMPLETA DEL CLON GENOMICO QUE CODIFICA AL LIGANDO 4 TIE HUMANO.

El ligando 4 TIE (TL4) se clonó a partir de una biblioteca genómica RAC de ratón (RAC HUMANO (TT), Sistemas Genoma Inc.) al hibridizar duplicados de bibliotecas, con ya sea una prueba radiactiva TL 1 humano que corresponde a la secuencia de códicos de fibrinogeno total del TLl (nucleótidos 1153 a 1806 de la figura 4) o una prueba radioactiva TL3 de ratón que corresponde a un segmento de nucleótidos de 186 a partir de la región de fibrinógeno del TL3 de ratón (nucleótidos 1307 a 1492 de la figura 21) . Cada prueba fue marcada por el PCR que usa los oligonucleótidos y condiciones PCR estándares, excepto que el dCTP se reemplazo por P32dCTP. La mezcla ha pasado luego a través de una columna de filtración de gei para separar ia prueba a partir del dCTP P32 libre. Cada una de las copias de la biblioteca se hibridizó usando amortiguador de fosfato, y la prueba radiactiva a 5°C durante la noche usó condiciones de hibridación estándares. Después de la hibridación, los filtros se lavaron usando 2xSSC, 0.1% de SDS a 55°C seguido por la exposición de película de rayos X. Las señales fuertes de hibridación se observaron que corresponden al TLl humano. Además, las señales que se identificaron hibridizaron escasamente a ambos TLl humano y TL3 de ratón. El DNA que corresponde a estos clones se purificó usando procedimientos estándares, luego se digirieron con enzimas de restricción, y un fragmento el cual hibridizó a las pruebas originales se subclonó en un plasmidio bacterial y se secuenciaron. La secuencia de los fragmentos contenia un exon con homología a ambos TLl humano y TL3 de ratón y otros miembros de la familia del ligando TIE. Los sebadores específicos de estas secuencias pueden usarse como sebadores PCR para identificar tejidos que contienen transcriptos que corresponden al TL4. La secuencia completa del TL4 humano puede obtenerse por la secuenciación del clon BAC completo contenido en las células bacteriales depositadas. Los exones pueden identificarse por la homología conocida por los miembros de la familia del ligando TIE, tal como TLl, TL2 y TL3. La secuencia de códigos completa del TL4 puede entonces determinarse por la unión junto a los exones a partir del clon genómico TL4 el cual, en turno, puede usarse para producir la proteína TL4. Alternativamente, los exones pueden usarse como pruebas para obtener un clon cDNA de longitud completa, los cuales pueden usarse alineación de las secuencias de aminoácidos de los ligandos TIE muestra varias regiones de secuencias conservadas (ver regiones marcadas de la figura 22) . Los oligonucleótidos degenerados esencialmente basados en estos cuadros en combinación con cualquier segmento de homología del ligando TIE novedoso o previamente conocidos, pueden usarse para la identificación de nuevos ligandos .

Las regiones altamente conservadas entre TLl, TL2, y TL3 pueden usarse en la desingnación de los sebadores de oligonucleotidos degenerados al sebador PCR de reacción usando cDNAs . Los modelos de cDNA pueden generarse por la transcripción inversa del tejido RNAs usando oligos d(T) u otros sebadores apropiados. Las alícuotas de las reacciones PCR pueden entonces someterse a electroforesis en un gel de agarosa. Los fragmentos DNA amplificados resultantes pueden clonarse por la inserción en plasmidos, secuenciados y las secuencias DNA comparadas con aquellas bien conocidas de los ligandos TIE. Los fragmentos DNA amplificados de tamaños seleccionados a partir de estas reacciones PCR pueden clonarse en plasmidos, introducidos en E.coli por la electroporación, y las placas transformadas en agar selectivo. Las colonias bacteriales de la transformación de PCR pueden analizarse por la secuenciación del DNAs plasmidio que es purificada por los procedimientos de plasmidios estándares.

Los segmentos clonados que contienen un segmento de un nuevo ligando TIE pueden usarse como pruebas de hibridación para obtener clones de longitud completa cDNA a partir de una biblioteca cDNA por ejemplo, la secuencia genómica TL4 humana puede usarse para obtener un clon cDNA humano que contiene la secuencia de códigos completa del TL4 humano por la hibridación de una biblioteca cDNA humana con una prueba correspondiente al TL4 humano como se ha descrito previamente. EJEMPLO 22 CLONACIÓN DE LA SECUENCIA DE CÓDIGOS COMPLETA DE hTL4 Ambas secuencias de códigos 5' y 3' a partir del clon TL4 humano genómico que codifica al ligando 4 TIE humano (ATCC hTL-4 Acceso No. 98095) se obtuvieron por la digestión de la enzima de restricción, manchado Southern y la hibridación del clon hTL-4 a los códigos de secuencias a partir del TL3 de ratón, seguido por la subclonación y secuenciación de los fragmentos hibridizantes. Las secuencias de códigos que corresponden a los aminoácidos N-terminal y C-terminal de hTL4 se usaron para designar los sebadores PCR (mostrados abajo) , en el cual en turno, se usaron para la amplificación PCR del TL4 a partir de cDNA de ovario humano. Una banda PCR se identificó como el correspondiente al T14 humano por las secuenciación DNA usando el secuenciador DNA ABI 373A y el quit secuenciador terminador de ciclo secuenciador Taq didesoxi (Biosistemas Aplicados, Inc. Foster City; CA) . La banda PCR fue entonces subclonada en un vector pCR-escrip y varios clones plasmidios se analizaron por las secuencias. Las 'secuencia de códigos TL4 humano completa se copilo entonces y se muestra en la figura 23. En otra modalidad de la invención, el nucleótido en la posición 569 se cambia de A a G, resultando en un cambio de aminoácido de Q a R. Los sebadores PCR usados como se describe arriba se designaron como sigue: hTL4atg 5'-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3' . hTL4not 5'-gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3' Las letras minúsculas indican las secuencias "finales" agregadas a los sebadores PCR. Para facilitar la clonación de los fragmentos PCR amplificados.

EJEMPLO 23 CONSTRUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS LIGANDOS MODIFICADOS TIE Un análisis genético del ligando 1 TIE-2 y ligando TIE-2 (TLl y TL2 ) se sobre tomaron para aumentar la penetración de un número de sus propieades observadas. A través de TLl y TL2 se encuentra una homología estructural similar, se exhiben diferentes propiedades biológicas y físicas. La característica más prominente que distingue los dos ligandos es a través de ambos enlaces al receptor TIE-2, el TLl es un agonista mientras el TL2 es un antagonista. Bajo condiciones electroforéticas no reductoras, ambas proteínas exhiben estructuras multiméricas covalente. EL TLl se produce como una mezcla de disulfuro de multimeros enlazados transversalmnete, trímeros principales y otras especies superiores, sin cualquier especie dimérica. Pero el TL2 se produce al menos exclusivamente como una especie dimérica. También, mientras el TL2 se produce bien entre más sistemas de expresión, el TLl se expresa pobremente y es difícil producir en grandes cantidades. Finalmente, la producción y las condiciones de purificación también parecen predisponer el TLl a la inactivación por el desdoblamiento proteolítico a un sitio cercano al termino amino . Para estudiar estas diferencias, varios ligandos modificados fueron construidos como siguen: 23.1. Substitución de cisteina- las investigaciones en las que los factores podrán contribuir a las diferentes propiedades físicas y biológicas de las dos moléculas revelaron la presencia del TLl de un residuo de cisteína (CYS 265 en la Figura 4; CYS 245 en la Figura 17) precediendo el dominio similar al fibrinógeno en TLl pero ausente en TL2- es decir, no correspondiente al residuo cisteina en TL2. El residuo CYS265 en TLl es codificado por TGC y se localiza en aproximadamente los nucleotidos 1102-1104 (ver figura 4) a la unión aproximada entre los dominios de resortes enrrollados y similares al fibrinógeno. Debido a que los residuos de cisteina están involucrados en general en la formación de enlaces disulfuros, la presencia de tal puede contribuir en ambas, la estructura terciaria y las propiedades biológicas de una molécula, se piensa que quizás la presencia del residuo CYS265 en TLl podrá ser al menos parcialmente responsable por las propiedades diferentes de las dos moléculas. A esta prueba de hipótesis, se construyó un plasmidio de expresión, el cual contenía una mutación en TLl en la cual el CYS (residuo 265 en la figura 4; residuo 245 en la Figura 17) se reemplazo con un aminoácido (serina) el cual no forma enlaces disulfuro. Además a este mutante TLl/CYS, se construyó una segunda expresión de plasmidio la cual fue mutante en la posición aproximadamente correspondiente en TL2 (Met247 en la Figura 17) de manera que este residuo es ahora una cisteína. Ambos plasmidios de expresión mutante y no mutantes del TLl y TL2 se transfectaron temporalmente en células COS7, células sobrenadantes que contienen las proteínas recombinantes se cosecharon, y las muestras se sometieron a reducción y no reducción de SDS/electroforesis PAGE y a un subsecuente manchado Western. La figura 18 muestra los manchados Western bajo condiciones no reductoras de ambas proteínas TLl y TL2 no mutantes y mutantes revelan que el mutante TL2/CYS" corre como un dímero de manera similar al TL2 y que el mutante TL2/CYS+ es capaz de formar un trímero, así también como los multimeros de alto orden, más parecidos a TLl. Cuando las dos proteínas mutantes se probaron por su capacidad para inducir ia fosforilación en las células que expresan TIE-2, el mutante TLl/CYS" fue capaz de activar al receptor TIE-2, mientras el mutante TL2/CYS+ no.

Además, cuando el residuo cisteina (residuo 26b en la figura 4; residuo 245 en la figura 17) del TLl fue genéticamente alterado a una serina, se encontró que la estructura covalente del TLl fue similar a aquella de TL2, es decir, principalmente dimérico. La molécula TLl modificada aún se comporta como un agonista, además la estructura multimérica de alto orden/ y trimérica no es el factor determinante dada la capacidad de TLl para activarse. Aunque ia eliminación de la cisteina produce una molécula con mas propiedades deseables, y no mejora la producción de los niveles de TLl. 23.2 Eliminación de dominios. Las secuencias nucleótidas que codifican TLi y TI2 muestran una estructura genética que puede dividirse en tres dominios, con base a las secuencias de aminoácidos de las proteínas maduras. El último residuo aproximadamente 215 aminoácidos de cada proteína madura contienen seis cisteínas y lleva una fuerza parecida de un dominio del fibrinogeno. La región está además denotada como el dominio similar al fibrinogeno o dominio F. Una región central de la proteína madura que contiene aproximadamente 205 residuos que tienen una alta probabilidad de asumir una estructura de resorte enrollado y se denota como el dominio de resorte enrollado o dominio C. Los residuos aminoterminal aproximadamente 5b de ia proteína madura contenía dos cisteinas y tiene una baja probabilidad de tener una estructura de resorte enrollado. Esta región se designa como el dominio N-terminal o N-dominio. Los ligandos modificados descritos aquí están designados usando una terminología en donde N= dominio N-terminal, C = dominio de resorte enrollado, F=dominio similar al fibrinógeno y los números 1 y 2 se refieren a TLl y TL2 respectivamente. Además, ÍN indica ei dominio N-terminai a partir de TLi, 2F indica el dominio similar al fibrinogeno de TL2 y los así expuestos.

A tin de probar si el dominio similar al fibrinógeno (f-dominio) de los ligandos TIE-2 contiene la actividad activante TIE-2, los plasmidios de expresión se construyen con dominios de resorte enrollado y N-terminal, conduciendo solamente a la porción de la secuencia DNA que codifica el dominio F (para TLl, comenzando en la Figura 4 a aproximadamente el nucleotido 1159, residuo aminoácido ARG284; para TL2 correspondiente a aproximadamente el nucleótido 1200 en ia Figura 6, residuo aminoácido 282) . Este constructo mutante se transfectó entonces temporalmente en células COS. Los sobrenadantes que contienen la proteína recombinante se cosecharon. El mutante de dominio F/TL1 se probó por su capacidad para enlazar al receptor TIE-2. Los resultados mostraron que, como un monómero, el mutante de dominioF/TLl no es capaz de enlazar al TIE-2 a un nivel detectabie.

Pero cuando el monómero de dominio F/TL1 es marcado como myc y subsecuentemente agrupado con un anticuerpo dirigido contra el myc marcado, exhibe enlaces detectables a TIE-2. Sin embargo, el anticuerpo agrupado del mutante de dominio F/TL1 no es capaz de inducir fosforilación en una línea de expresión celular TIE 2.

Además, se determina que el dominio F de los ligandos TIE-2 está involucrado en el enlace del receptor pero que una truncación que consiste de justo el dominio F solo no es suficiente para enlazar al receptor. Esto eleva la posibilidad que el dominio de resorte enrollado es responsable por retener juntos varios dominios similares al fibrinógeno, los cuales podrán ser esenciales para enlazar al receptor. En un intento por confirmar esta hipótesis, el dominio F se fusiono con la sección Fc del anticuerpo IgGI humano. Debido a que las secciones Fc se dimerizan sobre la expresión por las células de mamíferos, estas proteínas recombinantes imitan la configuración teorética de los dominios F en donde los ligandos nativos se dimerizan. Este construye el enlace de F-dominio-Fc pero fallan al activar al receptor. Aparentemente, la multimerización causada por otras regiones de los ligandos es necesaria para permitir a los ligandos enlazar al receptor TIE-2. Además, algunos de los otros factores externos del dominio F podrán contribuir a la fosforilación del receptor.

Los mutantes entonces construidos son aquellos que están perdidos en ei dominio similar al fibrinogeno, y por io tanto contienen solamente los dominio N-terminal y de resorte enrollado. No son capaces de enlazar al receptor. Para asegurar un papel del dominio N-terminal en el enlace del receptor y la activación, los ligandos se truncaron justo en sus dominios C y F y se marcaron con un marcador FLAGA al N-término, creando constructores de términos FLAG-1C1F y FLAG-2C2F. A pesar de que estas moléculas robustamente reñidas en las células COS7 transfectadas temporalmente expresan el receptor TIE-2, fallan por responder a un ensayo de fosforilación. Además, el dominio N contiene un factor esencial para el receptor de activación a través de como se describe posteriormente, la capacidad de la molécula quimérica 2N2C1F para activar al receptor muestra que aún el N-dominio de un ligando activo puede cubrir que papel.

Las diferencias en la conducta entre la truncación del F-dominio marcado myc y la truncación del dominio F y Fc marcado descrito previamente sugiere que los ligandos TIE pueden solamente enlazarse en la proteína dimérica o superior de las formas multiméricas.

Verdaderamente, el SDS-PAGE no reductivo muestra que los ligandos TIE existen naturalmente en las formas diméricas, triméricas y multiméricas. Que las truncaciones FLAG-1C1F y FLAG-2C2F pueden enlazar al receptor TIE-2 si la dimerización es por un marcador sintético (tal como Fc) , mientras las truncaciones no pueden sugerir que la reacción C sea al menos parcialmente responsable para la agregación del dominio F. 23.3 Constructos Intercambiantes (quimeras) Los solicitantes han notado que los niveles de producción de TLl en las células COS / fueron aproximadamente de diez pliegues menores que la producción de TL2. Por lo tanto, las quimeras de TLl y TL2 fueron construidas en una hipótesis para explicar esta diferencia y también para caracterizar además la actividad agonista de TLl como las comparadas con la actividad antagonista de TL2.

Cuatro quimeras se construyeron en las cuales ya sea el dominio N-terminal o el dominio fibrinógeno se intercambiaron entre TLl y TL2 y se designaron usando la terminología descrita previamente, de manera que, por ejemplo, se refiere a 1N1C2F de una quimera que tiene el dominio N-terminal y el resorte enrollado de TLl, junto con el dominio similar al fibrinogeno a partir del TL2. Las cuatro quimeras se construyeron como siguen: Quimera 1 - 1N1C2F Quimera 2 - 2N2C1F Quimera 3 - 1N2C2F Quimera 4 - 2N1C1F Las secuencias nucleotidas y aminoácidos de las quimeras 1 a 4 se muestran en las figuras 24-27 respectivamente . Cada quimera se inserta en un vector de expresión pJFEl4 separado.

Las quimeras son entonces transfectadas en células C0S7, a lo largo del vector pJFE14 en vacío, TLl natural, y TL2 natural como controles, y se colectan los sobrenadantes de cultivos.

A fin de determinar como el intercambio afecta al nivel de expresión de los ligandos, una dilución de 1:5 y una dilución de 1:50 de los sobrenadantes COS7 se mancharon en un punto en la nitrocelulosa. Tres ligandos que contienen el dominio N TLl (es decir, TLl nativo, 1N2C2F y 1N1C2F) se probaron con un anticuerpo de conejo especifico al N-término de TLl. Tres ligandos que contienen el dominio N TL2 (es decir TL2 nativo TL2, 2N1C1F Y 2N2C1F) se probaron con un anticuerpo de conejo específico para el término N de TL-2. Los resultados demuestran que las células COS7 que expresaron cualquier molécula que contiene el dominio N de TL2 a aproximadamente diez veces el nivel de cualquier molécula que contiene el dominio TLl, a pesar de la composición del resto de la proteína. La conclusión fue de que el dominio N podrá principalmente controlar el nivel de expresión del ligando.

La siguiente cuestión mencionada fue la capacidad de las quimeras o la incapacidad para activar al receptor TIE-2. Las células Eahy926 se cambiaron con las cuatro quimeras, así también con TLl como un control positivo para la fosforilación y TL2 o un sobrenadante de células C0S7 en vacío JJFE14 transfectadas como controles negativos para la fosforilación. Las células se disgregaron y el receptor TIE-2 se inmunoprecipitó completamente de las células disgregadas y se corrieron en un SDS-PAGE. Las muestras se mancharon con Western y se probaron con un anticuerpo antifosfotirosina para detectar cualquiera de los receptores que han sido fosforilados. Sorprendentemente, solamente los constructos que contienen el dominio similar al fibrinogeno TLl (2N1C1F Y 2N2C1F) pueden fosforilar al receptor TIE-2. Además. A pesar de que la región N-terminal de TLl es esencial para la activación, se pueden reemplazarse por la región N-terminal del TL2, es decir, la información que determina si el ligando es un agonista o un antagonista está actualmente contenida en el dominio similar al fibrinógeno. Además, se determina que el dominio F además de enlazar al receptor TIE-2 es responsable por la actividad de fosforilación de TLl. Además, cuando el TL2 es una molécula de otro modo inactiva, se altera por el reemplazo de su dominio F con el dominio F TL-1. El TL2 alterado actúa como un agonista.

EL constructo 2N1C1F es algunas veces más potente, sin embargo, la señal causada por ia quimera 2N1C1F parece lentamente mas fuerte que aquella de la quimera 2N1C1F, conduciendo a la especulación de que el dominio C del TLl a pesar de no ser crucial para la fosforilación podrá incrementar la potencia del TLl. Sin embargo, puesto que las muestras usadas para los ensayos de fosforilación no están normalizadas en términos de concentración del ligando, es posible que una señal fuerte de fosforilación solamente indique ia presencia de más ligando. El ensayo de fosforilación se repite por lo tanto con cantidades variantes del ligando para determinar si las quimeras activas exhiben potencias diferentes. La concentración del ligando en los sobrenadantes C0S7 de las trasnfecciones del ligando se determinan a través de la tecnología del biosensor BIAcore de conformidad con ios métodos previamente descritos (Stitt, T.N. et ai. (1995) Ceil 80: 661-670). El BIAcore midió la actividad enlazante de un sobrenadante del receptor TIE-2 en unidades arbitrarias llamadas unidades de resonancia (RU) . La buena correlación definitivamente entre el RU y la concentración del ligando han sigo en general observados con 400 RU de la actividad correspondiente a aproximadamente 1 µg de la proteína por mL de sobrenadante. Las muestras se diluyeron a concentraciones de 100 RU, 20 RU, y 5 RU cada uno de los ensayos de fosforilación se repitieron. Los resultados demuestran que el 2N2C1F de la quimera es claramente más potente que cualquiera de los TLl naturales o 1N1C2F de las quimeras a las mismas concentraciones. Otro aspecto interesante de estos constructos de intercambio esta en sus niveles de expresión. Cada una de las quimeras se probaron en sus niveles de producción en células COS, su capacidad para enlazar a TIE-2 y su capacidad para fosforilar al TIE-2. Los resultados de estos experimentos muestran que las quimeras 1 y 3 fueron producidas a niveles comparables a TLl, mientras las quimeras 2 y 4 se produjeron a niveles comparables a TL2. Además un nivel elevado de la producción de la proteína se correlacionó con el dominio N-terminal de TL2. Adicionalmente, cuando se probaron en células endoteliales EAhy926, las quimeras 2 y 4 fueron activas, mientras la 1 y 3 no. Esta actividad (de fosforilación del receptor) se correlacionó con el dominio similar al fibrinogeno TLl. Las quimeras 2 y 4 por lo tanto, cada una tiene las propiedades deseables de niveles de producción elevados así también como la actividad antagonista . 23.4 Constructos proteolíticos resistentes. Basados en la observación de que una gran fracción de las preparaciones de TLl se desdoblaron proteolíticamente a menudo cerca del N-término, se propuso que un residuo de arginina localizado en la posición 49 de la proteína madura (ver la figura 7) sea un candidato del sitio de desdoblamiento que podrá involucrarse en la regulación de las actividades de las proteínas in vivo, y que reemplaza la arginina con una serina (R49—>S) pudiendo incrementar la estabilidad de la proteína sin necesariamente afectar su actividad. Tal mutante de TLl se construyo y se encontró por estar aproximadamente como el TLl natural pero no presenta resistencia al desdoblamiento proteolítico. 23.5 Combinaciones mutantes. El más potente de los constructos quiméricos, 2N1C1F se alteró adicionalmente de manera que la cisteina que codifica por los nucleótidos 784-787 como se muestra en la figura 27 se convirtió a serina. Esta molécula (denotada 2N1C1F (C246S) ) se expresó también, potencialmente activado al receptor, fue resistente al desdoblamiento proteolítico y fue principalmente dimérico, preferiblemente de orden superior multimérico. Además, el dominio 2N parece conferir la resistencia de la proteasa en la molécula.

Finalmente, esta molécula se alteró adicionalmente para eliminar ei sitio sensitivo de la proteasa potencialmente codificado por los nucleótidos 199-201 como se muestra en la figura 27, para dar una molécula (denotada 2N1C1F (R51->S, C246->S) ) la cual se espera ser activadora, bien expresadas diméricas y resistentes a la proteasa.

La tabla 1 resume los constructos del ligando modificado TIE-2 que fueron elaborados y caracterizados cada uno de ellos en términos de su capacidad para enlazar al receptor TIE-2, su habilidad para activar al receptor TIE-2, el tipo de la estructura formada (monómero, dímero, etc), y sus niveles de producción relativos. Los TLl no modificados (plano) y TL" (cortados) están mostrados dentro de los tres dominios como cuadros. Además los cuadros cortados indican los dominios de TL2. La cisteina localizada en la posición 245 de la proteína TLl madura está indica por un "C". Una "X" a través de "C" indica que el residuo de cisteina se substituye por otro aminoácido como, en, por ejemplo, el mutante CYS-TL1". De manera similar, un "X" a través de "R" en el último constructo indica la substitución por un residuo Arg en la posición 49 de la proteína madura TLl. El "C" se presenta en un constructo TL2 modificado mostrando al mutante TL2 CYS+. Los constructos tienen términos FC o extremos marcados que también están indicados.

Basados en ias muestras aquí, un experto en la técnica puede observar rápidamente que además de los constructos se pueden elaborar a fin de crear ligandos modificados y quiméricos TIE-2 adicionales los cuales tienen propiedades alteradas. Por ejemplo, uno puede crear un constructo que comprende el dominio N-terminal de TL2 y el dominio F del TLl fusionado con la sección Fc del anticuerpo IgGl humano. Este constructo podrá ser esperado por enlazar y activar al receptor TIE-2. De manera similar, pueden crearse contructos usando las muestras de aquí, y son por lo tanto considerados por estar dentro del ámbito de esta invención. 23.6 Materiales y métodos Construcción de quimeras Los contructos intercambiables se insertaron en un vector pJFE14 en el cual ei sitio Xbal se cambió a un sitio Ascl. Este vector fue entonces digerido con Ascl y Notl obteniendo una columna estructural Ascl-Notl. Los fragmentos DNA para las quimeras se generaron por PCR usando oligonucleotidos apropiados. Los insertos FLAG-1C1F y FLAG-2C2F se subclonaron en una columna estructural del vector pMT21 que han sido digeridos con EcoRI y Notl. Las truncaciones "CF" se obtuvieron a través de PCR, y el marcado FLAG y una secuencia de señalamiento de tripsina precedente construida por oligonucleótidos sintéticos re-endurecidos.

Transfecciones Todos ios constructos se transfectaron temporalmente en células C0S7 usando ya sea DEAE dextran o LipofectAMINA de conformidad con los protocolos estándares. Los cultivos celulares se cosecharon 3 días después de la transfección y estimularon descendentemente a 1000 rpm por 1 minuto, los sobrenadantes se transfirieron a tubos frescos y se almacenaron a -20°C.

Teñido de células FLAG-lClF transfectadas y FLAG-2C2F transfectadas . Los platos de los 6 pozos de células COS7 se transfectaron temporalmente con el receptor TIE-2. El sobrenadante COS7 de varias transfecciones de ligandos se incubó en las células por 30 minutos, seguido por dos lavados con fosfato de salina amortiguado (PBS) sin magnesio o calcio. Las células se fijaron en -20°C de metano por 3 minutos, lavados una vez con PBS, y se incuban con un anticuerpo anti-FLAG M2 (IBI; 1:3000 dilución) en PBS/10% de suero de cría de bovino (BSC) por 30 minutos. Las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con un anticuerpo conjugado (AP) de fosfatasa alcalina anti-ratón macho. (Promega: 1 : 000) en PBS/10% BCS. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con el substrato de fosfato, BCIP/NBT, con levamisolo 1 M.

Ensayos de fosforilación La dilución de ios sobrenadantes C057 para el estudio de la respuesta de las dosis se hizo en los sobrenadantes de células COS7 transfectadas con el vector pJFE14 en vacío. Las células EA que expresan naturalmente al receptor ITE-2 se limitaron por >2 horas en un medio libre de suero, seguido por el cambio con el sobrenadante COS7 apropiado por 10 minutos a 37 °C en una atmósfera de b% de C02. Las células entonces de enjuagaron en PBS, enfriadas en hielo y se disgregaron con 1% de amortiguador de lisis NP40 que contiene los inhibidores de la proteasa (10 µg/ml leupeptina, 10 µg/ml aprotinina, lMm PMFS) seguidas por la inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para el cuerpo receptor TIE-2. Las muestras se sometieron entonces a análisis de inmunoblastos, usando anticuerpos anti-pTyr.

Puntos Manchados Las muestras se aplicaron a una membrana de nitrocelulosa, la cual se bloqueó y se probó con los anticuerpos apropiados. 23.7 Producción del ligando quimérico TIE-2 a partir de células de insecto infectas con CHO y baculovirus. Producción de virus El gen para el ligando quimérico (denotado 2N1C1F (C246S) ) se diseñó en un plasmidio de expresión del baculovirus y se recombinó con el DNA viral para generar el baculovirus recombinante, amplificado y cosechado usando los métodos descritos previamente (O'Reilly, D.S., L.K. Miller, y V.A. Luckow, Vectores de expresión del baculovirus. Laboratorio manual 1992, New York:; W.H. Freeman). Las células de insectos SF21 (Spodopptera frugiperda) obtenidas de invitrogen se adaptaron y expandieron a 27 °C en un medio libre de suero Gibco SF900 II. Las células no infectadas crecieron a una densidad de 1 x 106 células/Mi. La densidad celular se determinó por el conteo de células viables usando un hemacitómetro. Las pilas de virus para el ligando se agregaron al bioreactor a una multiplicidad baja de 0.01 0.1 PFU/cel para comenzar la infección. El procedimiento de infección se dejó continuar por 3 a 4 dias permitiendo la replicación máxima dei virus sin incurrir en la disgregación substancial de las células. La suspensión celular fueron alícuotas asépticamente en botellas centrifugadas estériles y las células se eliminaron por centrifugación (1600 RPM, 30 minutos) . El sobrenadante libre de células se colectó en botellas estériles y se almacenó a 4°C en la ausencia de luz hasta después del uso.

Los virus del titulo se determinaron por el ensayo de plaquetas como se describe por O'Relly, Miller y Luckow. El método se lleva a cabo en platos de 60 mm de cultivos de tejidos los cuales son sembrados en células 1.5 x 106. Las diluciones en serie de las pilas de virus se agregaron a las células adjuntas y la mezcla se incubó con sacudidas para permitir al virus absorver las células individuales. Una sobrecapa de agar se agregó y las placas se incubaron por 5 días a 27°C. Las células viables se mancharon con placas circulares revelando el x?jo neuLidi los cuales se c?nLai?n para dax el virus del titulo expresado en la formación de placas formado unidades por mililitros (PFU/ml) .

Infección de células para la producción de proteínas. Las células SF21 no infectadas crecieron en placas de cultivos de tejidos, y el virus que contiene el gen ligando quimérico se agregaron a una multiplicidad de pfu/cel 1-10. El virus se dejó para absorber por 90 minutos a 27°C con sacudidas cuidadosas, después del cual las células fueron reformadas con cantidades frescas de un medio libre de suero Sf-900 II. Después de 3 días de crecimiento a 27°C, los fluidos del cultivo de tejido se cosecharon y el ligando se detectó por inmunomanchado .

Expresión CHO de los quimeras ligandos TIE-2 Las quimeras del ligando TIE-2 se clonaron en cualquiera de los varios vectores de expresión celular de mamíferos, incluyendo (pero no limitando a) pJFE, pcDNA3, pMT21, pED u otros. Los plasmidios fueron transfectado en células CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, L.A. 1980. Aislamiento de mutantes de células de hámster chino deficientes en la actividad reductasa dihidrofolata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 77:4126-4220; Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A.M., y Chasin, L.A. 1983. La eliminación de los locus dihidrofolatos diploides de células de mamífero cultivadas. Cell 33:405-412) por la precipitación de fosfato de calcio o liposomas catiónicos. En el caso de los vectores carentes de un marcador selectivo, el plasmidio pSV2.dhrf se contransfectó a una relación molar de 20% del plasmidio que contiene el ligando quimera TIE. Las células DHFR+ se seleccionaron por el crecimiento en un medio de selección (un medio carente de nucleosidos y nucelosidos que contienen 10% de suero de cría fetal dializado) y clones protegidos para la producción quimérica de los ligandos TIE por el inmunomanchado con un cuerpo receptor TIE2. La expresión de los clones de la proteína deseada se sometió a varias vueltas de amplificación del gen usando grados de concentraciones de metotrexato en un medio de selección. Los clones altamente expresados se identificaron después de la amplificación del gen por técnicas similares de inmunomanchado.

Las líneas celulares que expresan los ligandos quiméricos TIE se cultivaron en monocapas, matraces de suspensión, botellas de rodillos, y bioreactores en un medio de selección o en una selección carente de medio, y pueden crecer en formulaciones de medios libres de sueros.

DEPÓSITOS Los siguientes han sido depositados con la Colección de Cultura tipo Americana, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 de conformidad con el tratado de Budapest. Un clon plasmidio que codifica un ligando TIE-2 se depositó con el ATCC el 7 de Octubre de 1994 y se designó como "pJFE14 que codifica al ligando TIE-2" bajo el Acceso ATCC No. 75910. El baculovirus recombinante Autographa calitornica que codifica al cuerpo receptor TIE-2 se depositó con el ATCC el 7 de octubre de 1994 y se designó como "cuerpo receptor vTIE-2" bajo el acceso ATCC No. VR2484. Un vector de fase lambda que contiene el DNA del ligando tie-2 humano se depositó con el ATCC. el 76 de Oct?brp de 1994, y ge designó como " el ligando 1 htie-2 que codifica al lgtlO" bajo el ATCC acceso No. 75928. Un clon de plasmidio que codifica un segundo ligando TIE-2 se depositó con el ATCC el 9 de diciembre de 1994, y se designó como "pBluescppt KS que codifica al ligando 2 TIE-2 humano" bajo el ATCC Acceso No. 759G3. Las cepas E.coli DH10B que contienen el plas idio pBeLoBacll con un inserto de gen humano TL-4 que codifica al ligando 4 TIE de humano, se depositaron con el ATCC el 2 de julio de 1996, y se designaron como "hTL-4" bajo del ATCC acceso No. 98095. La presente invención no está limitada en el ámbito por las modalidades específicas descritas aquí. Verdaderamente, varias modificaciones además a aquellas descritas aquí, han sido aparentes por aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y de las figuras acompañantes. Tales modificaciones son esperadas por cumplir dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIA 1} INFORMACIÓN GENERAL < tJ SOLICITANTE: BEGENEBON PHABMACBOTICALS , INC. (£i| TITULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS LIGANDOS NIDIFICADOS. (111) NUMERO DE SECUENCIA : 28 # IT| DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA __ _ . (B) CALLE: 777 Oíd S**f HUÍ RO«? (O) CIUDAD: Tarrytßwp (0) ESTADO: NY (B) PAB: VBh (F| CP f 10S91 (V) FORMAS LECTORAS DE LA COMPUTADORA (?) UPO DE MEDIO: O±ßkß tß (B) COMPUTADORA.: S&Com?a¿ible (O) SISTEMA OPERATIVO: DOS (0) SOFTWARE: FastSEQ Vtrsión 2? (vl) FECHA DE APLICACIÓN ACTUAL (A) NUMERO DE APLICACIÓN: AUN NO CONOCIDO (B) FE HA DE PRESENTACIÓN: PRESENTADA CON ESO (C) CLASIFICACIÓN: (vli) PECHA DE APLICACIÓN DE PRIORIDAD t?) NUMERO DE APLICACIÓN: Ü8SH Oß/740, 223 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-OCT-1996 (C) CLASIFICACIÓN: (Til) FECHA DE APLICACIÓN DE PRIORIDAD (h) NUMERO DE APLICACIÓN: OßSK 60/022/999 . B } FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 AGOSTO 1996 < vll ) INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE (K) NOMBRE: Cobeit, Rßbert J (B) NUMERO DE REGISTRO: 36 , 108 (C) NUMERO DE REFERENCIAFOCUMENTO: REG 3» ( lx ) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO « 914-345-7 00 (B ) TEI-EFAX» 914-345-7721 <2 ) INFORMACIÓN POR SEQ ID Nß:l: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA (A) LONGITUD: 2149 pares base ( B ) TIPO: áddo núddco (C) TIPO DE HEBRA: una sola ( o ) TOPOLOGÍA: lineal ( ¿¿j UPO DE MOLÉCULA s DNA (LlC) FACRORES: (A ) NOMBRE CLAVE: Secuaida de Códigos ( B) LOCALEZACION: 310...1SO. <D) OTRA INFORMACIÓN: (?) NOMBRE/CLAVE: ligando 1 HE-2 Humano (B) LOCALIZACION: 1__2149 (O) OTRA INFORMACIÓN: a partir dd don ?gtlO que codifica al Bgando 1 htíe-2 (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1: CAGCTGACTC AOßCAßOCTC CATGCTGAAC GGTG?CAGAC AGAGß???CA AT??ATCTCA 60 OCTACTATGC AAX???TATC TCAAGTTTTA ?OOA?a???A AC?TCATTCC ?OTOAAATA? 120 A???TTTT?? A?TTTT?G?? C?AAGCTAAC A??TCCCTAO T1TTCAT6A TTCTTCTTCA 180 AACGCTTTCT TTOAßßßCGA AAGAGTCA?? C???C??GC? OTTTTAOCTG ???T???G?? 240 CTAGTTTTAG ACGTCAGAAG ???ßß?ßC?? CTTTTGOGAO AGGC?OGG?? OGAGTOTOCT 300 GGCAGTACA ATG AC ßTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG 351 Het Thr Val Ph* Leu Ser Phß Ala Phß Leu Ala Ai* Zl* L*u 5 10 ACT CAC ATA GGG TOC AGC AAT CAG CGC CGA AOT CCA ßAA AAC AßT OGG 399 Thr Hi Xle Gly Cyß Ser Aßn Oln Arg Arg Ser Pro Glu Asa Ser ßly -15 20 28 30 AGA ACÁ TAT AAC OGG ATT CA CAT GGG CAÁ TOT GCC TAC ACT TTC ATT 447 ?rg Arg Tyr Aan Arg Zle Gla Hiß Gly Gln Cyß Ala Tyr Thr Phe Zle 35 40 45 CTT CCA GAA CAC ßAT GGC AAC TCT COT OAG AGT ACÓ ACÁ GAC CAß TAC 495 Leu Pro Glu Ble Aßp ßly Aßn Cyß Arg Olu Ser Thr Thr Aßp ßln Tyr 50 SS 60 AAC AC AAC OCT CTC CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTß GAA CCO OAT TTC 543 Aßn Thr Aßn Ala Leu Oln Arg ?ßp ?la Pro Hiß Val ßlu Pro ?ßp Phe 65 70 7S TCT TCC CAO AAA CTT CAÁ CAT CTG CAÁ CAT GTG ATG GAA AAT TAI ACT S91 Ser Ser Gin .?_yß Leu ßln Hiß Leu Glu Hi* Val Het Glu Asn Tyr Thr 80 85 90 CAC TGG CTG CAÁ AAA CTT GAG AAT TAC ATT OTß GAA AAC ATß AAO TOO 639 Gln Trp Leu Gln Lyß Leu Glu Aßn Tyr Zle Val Clu ?ßn Met Lyß Ser 95 100 105 110 GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC 687 Glu Met Ala Gln Zle Cln Gln Aßn Ala. Val Gln Aßn Hiß Thr Ala Thr 115 120 125 ATC CTG GAG ATA OCA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT OCA GAO CAG ACC 735 Met leu ßlu ?le Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu ßln Thr 130 135 140 AGA AAG CTO ACÁ GAT GTT CAC ACC CAC GTA CTA AAT CAÁ ACT TCT CGA 783 Arg Lyß Leu Thr Aßp Val Glu Thr Gln Val Leu Aßn Oln Thr Ser Arg 145 150 15S CTT GAG ATA CAG CTG CTO GAG AAT TC? TTA TCC ACC TAC AAO CTA GAO 831 Leu Glu Zle ßln Leu Leu Glu Aßn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu Glu 160 165 170 AAC CAÁ CTT CTT CAÁ CAG ACÁ AAT GAA ?TC TTG AAO ATC CAT GAA AAA 879 Lyß Gln Leu Leu ßln Cln Thr ?ßn Clu Zle Leu Lyß Zle Hlß Glu Lyß 175 180 185 190 AAC AGT TTA TTA O?? CAT AAA ATC TTA CAÁ ATO ßAA ßß? AAA CAC AAO 927 Aßn ser Leu Leu Clu Hls Lyß lie Leu Glu Het Glu Gly Lyß Hiß Lyß 195 200 205 GAA GAß TTß CAC ACC TTA A?ß ßAA GAß A?? GAO AAC CTT CAÁ CGC TTß 975 ßlu ßlu Leu ?ep Thr Leu Lyß ßlu ßlu Lyß ßlu ?en Leu Oln ßly Leu 210 215 220 ßTT ACT CGT CAÁ ACÁ TAT AT? ?TC CAO GAO CTG ß?? AAG CAÁ TTA ??C 1023 Val Thr ?rg ßln Thr Tyr Zle Zle ßln ßlu Leu ßlu Lyß ßln Leu ?ßn 225 230 235 ?ß OCT ACC ?CC ??C AAC AGT-CTC CTT CAG ??C CAß CAÁ CTG GAG CTG 1071 ?rg ?la Thr Thr ?ßn ?en Ser Val Leu ßln Lye ßln ßln Leu Clu Leu 240 245 250 ATC GAC AC? GTC CAC AAC CTT OTC AAT CTT TOC ?CT A?? ß?? GCT GT 1119 Met ?ßp Thr Val Hiß ?ßn Leu Val Aßn Leu Cyß Thr Lyß ßlu ßly Val 255 260 26S 270 TTA CÍA ??C CGA GßA A?? ?ß? GAG CAÁ GAß A?? CC? TTT ?ß? Q?C TOT 1167 Leu Leu Lya ßly ßly Lyß ?rg ßlu ßlu ßlu Lya Pro Phe ?rg ?ßp Cyß 275 280 285 CCA CAT CTA TAT CAÁ ßCT ßOT TTT A?T ??? AßT ßßA ATC TAC ?CT ATT 1215 Ala ?ßp Val Tyr Gln ?la ßly Phe ?en Lyß Ser Cly Xle Tyr Thr Xle 290 295 300 TAT ATT AAT AAT ?lß OCA CAÁ CCC ??? ??ß GTO TTT TOC A?T ?TG ßAT 1263 Tyr Zle ?ßn ?ßn Met Pro ßlu Pro Lyß Ly* Val Phe Cy* ?en Het ?ßp 305 310 315 GTC AAT OOO GGA ßGT TOO ACT GTA AT? CAÁ CAT CGT GAA GAT Gß? AßT 1311 Val ?*n cly Gly Gly Trp Thr Val Zle ßln Hiß ?rg ßlu ?sp ßly ser 320 325 330 CTA O?T TTC C?? AGA ßGC Tßß AAC ß?? TAT AAA ATC GCT TTT ßß? A?T 1359 Leu ?ßp Phe Cln ?rg Gly Trp Lyß Glu Tyr Lyß Met ßly Phe ßly ?an 335 340 345 350 CCC TCC GGT GAA T?T TCG CTG GCG AAT G?ß TTT ATT TTT GCC ATT ACC 1407 Pro Ser Cly 'Glu Tyr Trp Leu Cly ?en Glu Phe Zle Phe ?la ?le Thr 3S5 360 365 ACT CAC AGG CAG TAC ATC CTA Aß? ATT GAß TTA ATO GAC Tßß GAA Oßß 1455 Ser ßln Arg Gln Tyr Met Leu Arg Zle Glu Leu Met Aßp Trp ßlu ßly 370 375 380 AAC CCA GCC TAT TCA CAG TAT CAC AO? TTC CAC AT? CGA AAT ß?? AAC 1503 Aßn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr ?sp Arg Phe Hiß Zle Oly Aßn Glu Lyß 385 390 395 CAÁ AAC T?T ACG TTG T?T TTA A?? GGT CAC ACT ßßC ACÁ GCA ßß? ??? 1551 ßln ?ßn Tyr Aro Leu Tyr Leu Lyß Gly Kiß Thr Gly Thr ?la Gly Lyß 400 405 410 CAC AGC AGC CTG ATC TTA CAC GCT CCT GAT TTC AGC ACT ??? O?T GCT 1599 Gln Ser Ser Leu Zle Leu Hiß Gly ?la ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp ?la 415 420 425 430 G?T AAT OAC AAC TOT ATG TOC AAA TOT CCC CTC ATG TTA ACÁ COA GGA 1647 ?ßp ?ßn Aßp Aßn Cyß Met Cyß Lys Cyß Ala Leu Met Leu Thr cly Gly 435 440 445 TOO TGG TTT GAT OCT TGT GGC CCC TCC A?T CTA AAT ßß? ATG TTC TAT 1695 Trp Trp Phe ?ßp ?la Cyß Gly Pro Ser ?ßn Leu ?ßn Oly Met Phe Tyr 450 455 460 ACT GCß GßA CAÁ AAC CAT GGA AAA CTG A?T Gßß ?T? A?ß Tßß CAC TAC 1743 Thr Ala ßly Gln ?ßn Hlß Cly Lyß Leu Aßn ßly Zle Lyß Trp Hiß Tyr 465 470 475 TTC AAA Gßß CCC AGT T?C TCC TT? CGT TCC ACÁ ?CT ?Tß ?TG ?TT COA 1791 Phß Lyß aiy Pro Ser Tyr ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Zle ?rg 460 485 490 CCT TT? GAT TTT TOA AAO CCCA ?TGTC?ß??G Cß?TT?Tß?? ?ßC??C???ß ???TC 1848 ro Leu ?sp Phe 495 COG?G??ßCT ßCC?ßßTG?ß ???CTGTTTG A???CTTCAG AAGCAAACAA TATTGTCTCC 1908 CTTCCAGC?? T??GTGGTAC TTATCTG??G TC?CCAAGßT TCTTGAOCßT G??TCTOß?C 1968 CCGTTTGAOT TCAC??ß?ßT CTCTACTTGG GOTGACAGTG CTCACOTOGC TCGACTAT?G 2028 A???CTCC?C TG?CTGTCGG GCTTT????? Gßß??ß???C TGCTß?ßCTT ßCTGTCCTTC 2088 ???CTACTAC Tßß?CCTT?T TTTßßA?CT? TGGTAOCC?ß ATGATAAATA TOOTT??TTT 2148 C 2149 (2) INFORMACIÓNPOR SEQ ID NO: 2: { lj CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA (A) LONGITUD: 498 amino áddos (B) UPO: amino áddo (C) TIPO DE HEBRA una sola (D ) TOPOLOGÍA: lineal ( li ) "ppo DE MOLÉCULA: proteina ( v ) TIPO DE FRAGMENTO: interno ( ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE CLAVE: Hgando 1 HE- 2 Humano (B) LOCALIZACION: 1...498 fD) OTRA INFORMACI N: a partir dd don ? lO que codifica al Blando 1 htt 2 (Xi) DSCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2: Met Thr Val Phß Leu ser Phe ?l* Phe Leu ?la ?la ?le Leu Thr Hiß 1 5 10 15 ?le ßly Cyß. Ser ?ßn Cln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?an Ser ßly ?rg ?rg 20 25 30 Tyr Asn ?rg ?le Gln His Gly Gln Cyß ?la Tyr Thr Phe Zle Leu Pro 35 40 45 Glu Hia ?ßp Cly ?ßn Cyß Arg Glu ser Thr Thr Aap Gln Tyr ?ßn Thr 50 55 60 Aßn Ala Leu Gln Arg Aßp Ala Pro Hiß Val Olu Pro ?ßp Phe Ser Ser 65 70 75 80 oln Lyß Leu Gln Hiß Leu Glu Hiß Val Met Glu ?ßn Tyr Thr Cln Trp 85 90 95 Leu Gln Lyß Leu Glu ?ßn Tyr He Val Glu Aßn Met Lyß Ser ßlu Met 100 105 110 ?l* Gln ?le Gln Gln ?ßn ?la Val Gln ?ßn Hiß Thr ?la Thr Met Leu 115 , 120 125 Glu ?le Gly Thr Ser Leu Leu Ser Cln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lye 130 135 140 Leu Thr ?sp val Glu Thr Gln Val Leu ?ßn Gln Thr Ser Arg Leu Glu 145 150 155 160 Zle Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lyß Gln 165 170 175 Leu Leu Gln ßln Thr Aßn Glu lie Leu Lyß ?le Hiß Olu Lyß Asn Ser 180 185 190 Leu Leu Glu Hiß Lys lie Leu Glu Met Glu Gly Lyß His Lyß Glu ßlu 195 200 205 Leu Aßp Thr Leu Lys Glu Glu Lyß ßlu ?ßn Leu Gln Oly Leu Val Thr 210 215 220 ?rg Gln Thr Tyr ?le Zle Gln Glu Leu Glu Lyß Gln Leu ?ßn ?rg ?la 225 230 235 240 Thr Thr ?sn ?ßn Ser Val Leu Cln Lys Gln ßln Leu ßlu Leu Met Aßp 245 250 2SS Thr v»l Hls Aßn Leu Val Aßn Leu Cyß Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Asp Zle Asn 320 Aßp Ser ßln ?rg ?an 400 Ser Aen Trp ?la Lys 480 Leu ?ßp Phe (2) INFORMACIÓNPOR SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICASDELASECUENCIA: (A) LONGITUD: 2146 pares base (B) UPO: áddo n?ddco (C) TIPO DE HEBRA: una sola (0 ) TOPOLOGÍA: lineal ( ü) UPO DE MOLÉCULA: DNA ( ix ) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE CLAVE: Secuencia de C digos (B) LACAUZACION: 310...1800 ( O ) OTRA INFORMACIÓN: (A) NOMBRE/CLAVE: ligando 1 HE-2 Humano ( B ) LOCALIZACION: 1—2146 ( D ) OTRA INFORMACIÓN: a partir dd don T98G (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CAGCTOACTC AßßC?GßCTC CATC CTO AAC CGTCACACAG AG?Gß??AC? ATA??TCTCA 60 OCT?CT?TGC ??TAAATATC TC??ßTTTTA ?Cß??ßA??? ACATC?TTOC AGTG???T?? 120 AAAATTTTAA A?TTTTACAA C???ßCT??C A??TOGCTAG TTTTCTATß? TTCTTCTTC? 180 ??CGCTTTCT TTG?GGGGGA AAG?GTCA?? C???C??GC? CTTTT?CCTC A??T???ß?? 240 CTAGTTTT?C ?GGTC?G??C AA?GGAGC?? CTTTTGCß?G ?GßC?Cßß?? Gß?GTGTßCT 300 OßCAßT?C? ATß ACÁ CTT TTC CTT TCC TTT CCT TTC CTC ßCT CCC ATT CTß 351 Mßt Thr Val Phe Leu Ser Phe ?la Phe Leu ?la ?la Xle Leu 1 5 10 ACT CAC ATA ßßß TGC AGC A?T CAC CCC COA AGT CCA ß?? AAC AßT CGC 399 Thr Hiß ?le Gly cyß ser Aßn ßln Arg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn ser ßly 15 20 25 30 ?ß? AGA T?T ??C COO ?TT CAÁ CAT ßßß CAÁ TOT GCC T?C ACT TTC ATT 447 ?rg ?rg Tyr ?ßn ?rg Zle Gln His ßly ßln Cys ?la Tyr Thr Phe Zlß 35 40 45 CTT CCA CAÁ CAC O?T ßßC AAC TCT CQT GAO ?OT ?OG ACÁ OAC CAG T?C 495 Leu Pro ßlu Hle ?sp ßly ?sn Cys ?rg ßlu Ser Thr Thr ?ßp ßln Tyr SO 55 60 ??C ACÁ AAC OCT CTO C?ß ?ß? C?T GCT CCA C?C ßTG ß?? CCC ß?T TTC 543 ?sn Thr ?sn ?la Leu ßln ?rg ?sp Ala Pro His Val ßlu Pro ?ßp Phe 65 70 75 TCT TCC CAC A?? CTT C?? C?T CTC CAÁ CAT OTG ?TG C?? ??T T?T ACT S91 Ser Ser ßln Lyß Leu ßln Hlß Leu ßlu Ble Val Met ßlu ?ßn Tyr Tnr 80 85 90 CAG TOO CTß C?? ??? CTT ß?ß ??T T?C ?TT OTO GAA ??C ATO ??G TCG 639 Gln Trp Leu ßln Lyß Leu ßlu ?sn Tyr Xle Val ßlu ?ßn Met Lyß Ser 95 100 105 110 OAC ATC GCC CAO ?T? CAC C?C ??T GCA ßTT C?ß A?C C?C ?CC CCT ?CC 667 Glu Ket Ala Cln Xle Gln Gln ?sn ?la Val ßln ?sn His Thr ?la Thr 115 120 125 ?TG CTG GAC ?T? GGA ACC ACC CTC CTC TCT CAO ?CT GC? GAG C?ß ?CC 735 Met Leu Glu Zle Gly Thr Ser Leu Leu ser ßln Thr ?la ßlu Oln Thr 130 135 140 AGA ??G CTC ?CA C?T GTT G?C ACC CAG CTA CTA ??T C?? ?CT TCT CGA 783 ?rg Lyß Leu Thr ?ßp Val Olu Thr Cln Val Leu ?ßn Cln Thr ser ?rg 145 150 155 CTT OAO ?T? C?ß CTß CTG C?C ??T TCA TTA TCC ACC T?C ??G CTA ß?ß 831 Leu Glu Zle Oln Leu Leu Glu Aßn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu ßlu 160 165 170 AAC CAÁ CTT CTT CAÁ CAG ACÁ A?T C?? ATC TTG AAC ATC C T ß?? ??? 679 Lyß Gln Leu Leu Gln Gln Thr Aßn Glu Zle Leu Lyß ?le His ßlu Lyß 175 180 185 190 A?C ACT TT? TT? ß?? C?T ??? ATC TT? GAA ATG CAÁ GOA AAA C?C ??G 927 ?sn Ser Leu Leu ßlu Hlß Lyß ?le Leu Glu Het Glu Cly Lyß Hiß Lyß 195 200 205 CAÁ GAC TTG G?C ?CC TT? ??G CAA-CAG AAA GAG AAC CTT CAÁ GGC TTG 975 Clu Glu Leu ?ßp Thr Leu Lyß Glu Clu Lyß Glu ?ßn Leu ßln ßly Leu 210 215 220 ßTT ACT CGT C?? ACÁ TAT ?T? ?TC CAC OAC CTG ß?? AAG C?? TT? ?AC 1023 Val Thr ?rg ßln Thr Tyr Zle ?le Cln Glu Leu Glu Lyß Gln Leu ?ßn 225 230 235 ACÁ CCT ACC ACC A?C ?AC AGT CTC CTT CAG AAC CAG CAÁ CTG O?ß CTG 1071 ?rg ?l* Thr Thr ?ßn Aßn Ser Val Leu Gin Lyß Gln ßln Leu ßlu Leu 240 245 250 ATO OAC ACÁ GTC CAC ?AC CTT CTC A?T CTT TGC ?CT ??? GAA GTT TTA 1119 Met Aßp Thr Val Hiß Aßn Leu Val Asn Leu Cyß Thr Lyß Glu Val Leu 25S 260 265 270 CTA AAC GC? GC? AAA ACÁ CAG CAÁ CAG A?? CCA TTT AO? ß?C TOT CCA 1167 Leu Lyß Gly Gly Lyß Arg Glu Glu Clu Lyß Pro Phe Arg Aßp Cyß Ala 275 280 285 GAT GTA TAT CAÁ GCT GGT TTT A?T AAA AGT GGA ?TC T?C ?CT ATT T?T 1215 Aßp Val Tyr ßln Ala Gly Phe Aßn Lyß Ser ßly Zle Tyr Thr Zle Tyr 290 295 300 ATT AAT A?T ?TC CC? ß?? COC ??? ??O ßTß TTT TCC ??T ATß ßAT GTC 1263 Zle ?en ?ßn Met Pro ßlu Pro Lys Lys Val Phe Cyß ?en Met ?sp Val 305 310 315 ??T 066 ßß? CGT TGC ?CT ßT? ?T? C?? CAT COT C?? O?T ßß? AOT CTA 1311 ?sn ßly Gly ßly Trp Thr Val X * G n Bie ?rg Olu ?ep Gly Ser Leu 320 325 330 GAT TTC C?? ?ß? GßC Tßß ??O ß?? T?T ??? ?TG OßT TTT ßß? A?T CCC 59 Aßp Phe ßln ?rg ßly Trp Lyß ßlu Tyr Lyß Met ßly Phe ßly ?en Pro 335 340 34S 350 TCC GßT ß?? T?T Tßß CTß GGG ??T GAO TTT ATT TTT GCC ATT ?CC AßT 407 Ser ßly ßlu Tyr Trp Leu ßly ?ßn ßlu Phß Xle Phe ?la Xle Thr Ar 355 360 365 CAG AGß C?ß T?C ATß CTA ?ß? ?TT ß?ß TT? ATß GAC Tßß ß?? ßßß ??C 1455 Cln ?rg ßln Tyr Met Leu Arg Xle ßlu Leu Met ?ßp Trp ßlu ßly ?ßn 370 375 380 COA CCC T?T TC? C?C T?T O?C A6? TTC CAC ATA ßßA AAT ß?? AAG CAÁ 1503 ?rg ?la Tyr Ser Gln Tyr ?sp ?rg Phe Hia l e Oly Asn ßlu Lyß ßln 385 390 395 A?C TAT AGG TTG T?T TT? ??? OßT CAC ACT ?ßß ACÁ 6CA ßß? ??? CAO 1551 ?ßn Tyr ?rg Leu Tyr Leu Lyß ßly Hlß Thr ßly Thr Ala ßly Lyß ßln 400 405 410 AGC ?CC CTß ?TC TT? C?C CGT GCT ßAT TTC ?CC ?CT ??? ß?T GCT ßAT 1599 Ser Ser Leu lie Leu Hiß ßly ?la ?sp Phe Ser Thr Lya Asp ?la ?ßp 41S 420 425 430 ??T O?C AAC TGT ?TG TCC ??? TGT CCC CTC ?TC TT? ACÁ ßC? ßß? tßß 1647 ?ßn Aßp Aßn Cyß Met Cyß Lye Cyß ?la Leu Mee ?_eu Thr ßly ßly Trp 435 440 445 TGG TTT G?T GCT TGT GßC CCC TCC A?T CTA ??T ßß? ?TG TTC TAT ACT 1695 Trp Phe ?ßp ?la Cyß Gly Pro Ser ?en Leu Aßn Gly Met Phe Tyr Thr 450 455 460 GCG GCA C?? A?C C?T CGA A?? CTO ??T GGG ?T? ??G TGG CAC T?C TTC 1743 ?la ßly ßln ?ßn Ble ?rg Lyß Leu ?ßn Gly ?le Lyß Trp Hiß Tyr Phe 465 470 475 ??? GGG CCC AGT TAC TCC TTA COT TCC ACÁ ACT ATO ATG ATT CGA CCT 1791 Lyß Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg S t Thr Thr Met Met Xle Arg Pro 480 485 490 TT? C?T TTT TOA ??CCGC? ?TOTCACAAG CG?TT?TC?? ?GCAACAA?O ???TCCßß? 1849 CAACCTßCC? ßCTC?ß???C TGTTTß???? CTTCAOAAGC AAACAATATT OTCTCCCTTC 1909 C?CCAAT??ß TßßT?ßTT?T GTC??CTCAC CA?CCTTCTT GACCGTß??T CTOß?ßCCGT 1969 TTCAGTTCAC ??O?GTCTCT ?CTTGGGGTG ?CAGTGCTCA CGTGGCTCG? CTATAGAAAA 2029 CTCCACTGAC TOTCGGGCTT T?????ßCG? AßAAACTGCT GAGCTTßCTG TßCTTC???C 2089 TACTACTßß? CCTT?TTTTß G??CT?TGGT AGCC?ß?Tß? T???T?TßßT T??TTTC 2146 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4: ( 1 ) C _R TERIS1TCAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 497 asnino áddos (B) UPO: andno áddo (C) UPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: pr-idn. (v) UPO DE FRAGMENTO: interno ( ix) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVÉ: ligando 1 TLE-2 Humano ( B) LOCALEZACION: 1...2146 ( o ) OTRA INFORMACIÓN: a partir dd don 19. G (Xi ) DESCRIPCI N DE LA SECUENCIA SEC ID NO: 4: Met Thr Val Phe Leu ser Phe ?la Phe Leu ?la ?la Xle Leu Thr Hiß 1 5 10 15 He Gly Cyß Ser ?en Gln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn Ser ßly ?rg ?rg 25 30 Tyr ?ßn ?rg Xle Gln Hiß Oly Cln Cyß ?la Tyr Thr Phe Xle Leu Pro 3S 40 48 Glu Bis ?sp Gly ?ßn Cyß ?rg Glu Ser Thr Thr ?sp Gln Tyr ?sn Thr 50 SS 60 ?ßn ?la Leu Gln Arg ?ßp ?la Pro Hiß Val ßlu Pro ?ßp Phe Ser Ser 65 70 75 80 ßln Lyß Leu ßln Hlß Leu ßlu Hiß Val Met ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Trp 85 90 95 Leu ßln Lys Leu Glu ?an Tyr Xle Val Glu ?ßn Met Lyß ser ßlu Met 100 IOS 110 ?la ßln Xle ßln ßln ?sn ?la al Cln ?ßn Ble Thr ?la Thr Mat Leu 115 120 125 Glu Xle Gly Thr Ser Leu Leu Ser ßln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß 130 135 140 Leu Thr ?sp Val Olu Thr ßln Val Leu ?en ßln Thr Ser ?rg Leu ßlu 145 150 1SS 160 ?le Gln Leu Leu Olu ?ßn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu Glu Lyß ßln 165 170 175 Leu Leu ßln ßln Thr ?ßn ßlu ?le Leu Lyß Xle Hiß Clu Lyß ?ßn Ser 180 185 190 Leu Leu Olu Hiß Lys Xle Leu ßlu Met Glu Gly Lyß His Lys Glu Glu 195 • 200 205 Leu ?ep Thr Leu Lyß Glu Glu Lyß Clu ?ßn Leu Gln ßly Leu Val Thr 210 215 220 Arg Gln Thr Tyr ?le lie Gln Clu Leu Glu Lyß Oln Leu ?ßn ?rg ?la 225 230 235 240 Thr Thr ?ßn ?sn Ser Val Leu G n Lyß ßln ßln Leu Glu Leu Met ?ßp 245 250 255 Thr Val Hiß Aßn Leu Val Aßn Leu Cyß Thr Ly_ Glu Val Leu Leu Lys 260 265 270 Gly Gly Lyß ?rg Glu Clu Clu Lyß Pro Phe ?rg Aep Cyß ?la Aßp Val 275 280 285 Tyr Cln Ala Gly Phß Aßn Lyß Ser Cly He Tyr Thr Xle Tyr Zle ?en 290 295 300 ?ßn Met Pro Olu Pro Lyß Lye Val Phe Cyß ?ßn Met ?ßp Val ?ßn ßly 305 310 315 320 Gly Gly Trp Thr Val Zle cln Hiß Arg Glu ?ßp Gly Ser Leu ?ep Phe 325 330 335 Gln Arg Gly Trp Lyß Glu Tyr Lyß Met Gly Phe Gly ?ßn Pro Ser Gly 340 345 350 clu Tyr Trp Leu Gly ?ßn ßlu Phe He Phe ?la He Thr Ser ßln ?rg 355 360 365 Oln Tyr Met Leu Arg Xle Glu Leu Met Aep Trp Glu ßly Aßn Arg ?la 370 375 380 Tyr Ser Cln Tyr Aßp ?rg Phe Hiß He Oly Aßn Olu Lys Gln Aßn Tyr 385 390 395 400 Arg Leu Tyr Leu Lyß Gly Hlß Thr Gly Thr ?la Gly Lyß Gln Ser Ser 405 410 415 Leu He Leu Hiß ßly Ala Aßp Phe Ser Thr Lya ?ßp Ala Asp Asn ?sp 420 425 430 ?ßn Cyß Met Cyß Lyß Cyß ?la Leu Het Leu Thr Oly ßly Trp Trp Phe 435 440 445 ?ßp ?l* Cyß cly Pro Ser Aßn Leu Aßn Oly Met Phe Tyr Thr ?la Gly 450 455 460 Gln Aßn Ble ?rg Lyß Leu ?ßn ßly He Lys Trp Bis Tyr Phß Lyß Oly 465 470 475 480 ro Ser Tyr Ser Leu ?rg Ser Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro Leu ?ßp 485 490 496 Phe (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 2282 pares base ( B ) UPO: áddo n?ddco (C) UPO DE HEBRA una sola (0) TOPOLOGÍA: lineal (11) UPO DE MOLÉCULA: DNA ( l? ) CARACTERÍSTICAS: ( j NOMBRE CLAVE: S.c___da de códigos (B) LOCALIZACION: 357.-1844 (D) OTRA INFORMACIÓN: A) NOMBRE/CLAVE: ligando 2 HE-2 Humano (B) LOCALIZACION: 1...22S2 (D) OTRA INFORMACIÓN: a pardr dd don KS pBluesaipt que codifica al ligando 2 HE-2 humano (Xi) DESCRIPCI N DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: C??TTCCTGG GTTßßTßTTT ATCTCCTCCC AßCCTTG?ßß ß?Gßß??C?? CACTGTAOGA 60 TCTGGGß?ß? ß?ßß??C??? ßß?C8Tß?? AßCTOCTCZC T????GCTG? C?CAOCCCTC 120 CC??ßTß?GC ?ßß?CTßTTC TTCCCACTGC AATCTß?C?O TTTACTGC?T CCCTCG?OAG 180 AACAC?ßC?G T?????CC?G OTTTGCT?CT OGAAAA?ß?ß OA??ß?ß??O ACTTTCATTC 240 ACGGACCC?ß CCATGGCAGC CTACCAGCCC TGOCTTTCAG ?CGßC?ßCAß CTCßGG?CTC 300 TGGACGTGTß TTTOCCCTCA ?ßTTTßCT?? QCTOCTOCTT TATTACTGAA ß???ß? ATO 359 Met 1 TCC CAC ATT CTT TTC TTT ACT CTC ACC TGT GAT CTT GTC TTG CCC GCA 407 Trp Cln Xle Val Phe Phe Thr Leu Ser Cyß ?ßp Leu Val Leu ?la ?la 5 10 15 CCC T?T AAC AAC TTT OCO ??G ?OC ATO G?C ?CC ?T? Gß? AAG AAG CAÁ 455 ?la Tyr Aßn ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Met ?ßp Ser Xle ßly Lye Lyß ßln 20 25 30 -TAT CAG GTC CAß C?T ßßß TCC TGC AGC T?C ACT TTC CTC CTG CCA C?G 503 Tyr Gln val Gln Hiß ßly Ser Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro Clu 35 40 45 ?TC G?C A?C TGC CGC TCT TCC TCC ?CC CCC TAC GTO TCC ??T OCT GTG 551 Mßt ?ßp Aßn Cyß Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Bmx Aßn ?la Val SO 55 60 es CAG AGG G?C GCß CCC CTC C?? T?C O?T OAC TCG CTß CAß ?ßß CTß C?? 599 Cln Arg Aßp ?la Pro Leu Glu Tyr Aßp Aßp Ser Val Gln Arg Leu Cln 70 75 80 GTC CTC CAO AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TOO CTA ATO AAO CTT 647 Val Leo Glu ?an Xle Mßt Glu Aßn Aßn Thr Oln Trp Leu Met Lyß Leu 85 40 9B CAC ??T T?T ?TC CAO ß?C A?C ?TG ??ß ??? ß?? ?Tß GTA G?C ATA C?ß 695 Clu ?ßn Tyr He ßln Aßp ?ßn Met Lyß Lyß ßlu Met Val ?lu He ßln 100 105 110 C?C ??T OCA OTA C?ß A?C CAO ACO GCT OTO ATß AT? ß?? ?T? OOO ACÁ 743 ßln ?ßn ?la Val ßln ?ßn ßln Thr ?la Val Met Xle ßlu Xle ßly Thr 115 ; 120 125 AAC CTß TTß ?AC C?? ACÁ OCT ß?ß C?? ACG CGC AAG TT? ?CT O?T GTC 791 ?sn Leu Lew ?ßn ßln Thr Ala Glu ßln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?sp Val 130 135 140 145 GAA OCC C?? CTA TTA AAT CAG AGC ?CO ?GA CTT C?? CTT CAG CTC TTß 839 ßlu ?la Gln Val Leu ?en ßln Thr Thr ?rg Leu ßlu Leu ßln Leu Leu 150 155 160 ß?? CAC TCC CTC TOO ACÁ A?C ??? TTO ß?? ??? CAß ?TT TTß CAC CAC 8B7 Glu Klß Ser Leu Ser Thr ?ßn Lys Leu ßlu Lyß ßln Xle Leu ?ßp din 165 170 175 ACC AGT GAA ?T? AAC ??? TTG CAÁ CAT AAC ??C ?ßT TTC CT? ß?? ??G 9 5 Tbr Ser Glu Xle ?en Lyß Leu Gln Aßp Lyß ?en Ser Phe leu Glu Lyß 180 185 190 ??G OTO CT? OCT ?TO ß?? GAC A?O C?C ?TC ?TC C?? CT? CAß TC? ?T? 983 Lya val Leu ?la Het ßlu Aßp Lyß Hiß Xle Xle Oln Leu ßln Ser Xle 195 200 205 ??? GAA GAC ??? C?T CAC CÍA CAC CTC TT? CTA TCC AAG C?? ??T TCC 1031 Lys Glu Clu Lyß ?ßp Gln Leu ßln Val Leu Val Ser Lyß ßln ?ßn Ser 210 215 220 225 ?TC ?TT G?? ß?? CT? G?? AAA AAA AT? GTß ACT OCC ?CT ßTß ??T ??T 1079 Xle ?le ßlu ßlu Leu ßl? íya Lyß Xle Val Thr ?la Thr Val ?sn ?sn 230 235 240 TC? ßTT CTT C?? AAO C?ß CAÁ CAT C?T CTC ?TG ß?ß ?C? GTT ??T ?AC 1127 ser Val Leu ßln Lyß Gln Gln Hlß Aßp Lau Met Glu Thr Val ?ßn ?ßn 245 250 255 TT? CTC ACT ATO ATO TCC ACÁ TCA AAC TCA GCT AAG CAC CCC ACT CTT 1175 Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Aßn Ser Ala Lyß ?ßp Pro Thr Val 260 265 270 GCT AAA CAÁ GAA CAÁ ATC ACC TTC ?ß? GAC TGT GCT ??? GTA TTC AAA 1223 Al* Lyß Glu Glu Gln Xle Ser Phe Arg ?ßp Cyß ?la Gl? Val Phe Lyß 27S 280 285 TCA GGA C?C ?CC ?CA AAT GCC ATC TAC ?CG TTA ACÁ"TTC CCT AAT TCT 1271 Ser Gly Hiß Thr Thr Aßn Gly He Tyr Thr Leu Thr Phe Pro ?ßn Ser 290 295 300 305 ACÁ GAA OAG ATC AAG OCC TAC TGT G?C ?TG GAA OCT OGA Gß? GßC Cßß 1319 Thr Glu Glu Zle Lyß Ala Tyr Cy* Aßp Mßt Clu ?la Gly Gly Gly Gly 310 315 320 TCG ACÁ ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GCC AGC GTT GAT TTT CAO.AGC 1367 Trp Thr He He Gln Arg Arg Clu ?ßp Cly Ser Val Aßp Phß Oln Arg 325 330 335 ACT TGG AAA GAA TAT AAA OTG COA TTT OCT AAC CCT TC? CCA ß?? T?T 1415 Thr Trp Lyß Glu Tyr Lys Val Gly Ph» Gly Aßn Pro Ser Gly Glu Tyr 340 345 350 TGG CTG GGA AAT GAC TTT CTT TCG CAÁ CTG ACT A?T CAG CAÁ CGC TAT 1463 Trp Leu Cly ?ßn Glu Phe Val Ser Cln Leu Thr Aßn Gln Oln Aro Tyr 355 360 365 GTG CTT AAA ?TA CAC CTT AAA OAC TOO G?? GGO ??T GAß OCT TAC TCA 1511 Val u Lyß He Hiß Leu Lyß ?ßp Trp Clu Gly ?ßn ßlu ?la Tyr Ser 370 37S 380 385 TTO T?T ß?? CAT TTC T?T CTC TC? ACT ß?? ß?? CTC ??T T?T Aß? ?TT 1SS9 Leu Tyr ßlu Ble Phe Tyr Leu Ser Ser ßlu ßlu Leu ?sn Tyr Arg Xle 390 395 400 CAC CTT A?? ßß? CTT ACÁ ßßß ACÁ OCC ßßC ??? ?T? ?ßC AßC ATC AßC 1607 Hlß Leu Lyß ßly Leu Tnr ßly Thr ?la ßly Lyß Xle Ser Ser Xle Ser 405 410 415 CAÁ CC? GGA ??T GAT TTT ?ßC ?C? AAO O?T ßßA O?C ?AC O?C ??? TOT 1655 cln Pro Gly ?ßn ?ep Phe Ser Thr Lyß ?ßp ßly ?sp ?an ?sp Lys Cys 420 425 430 ATT TGC ??? TßT-TC? CAÁ ?TG CT? ACÁ OCA ßßC Tßß Tßß TTT O?T GC? 1703 Xle cyß Lyß Cyß ser Gln Met. Leu Thr ßly ßly Trp Trp Phe ?ep ?la 435 440 445 TGT GOT CCT TCC AAC TTG ??C GGA ATG TAC T?T CC? CAß ?ßß C?G ??C 1751 Cyß Gly Pro Ser ?sn Leu ?an Gly Met Tyr Tyr Pro ßln ?rg ßln ?sn 450 455 460 465 ACÁ A?T AAC TTC ?AC GGC ATT A?? TOO T?C T?C Tßß ??? ßßC TC? ßßC 1799 Thr ?sn Lys Phe ?en ßly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß ßly Ser Oly 470 475 480 T?T TCG CTC AAC GCC ?C? ACC ?TG ATG ?TC CGA CC? OCA GAT TTC T??C 1649 Tyr Ser Leu Lyß ?la Thr Thr Met Met Xle Arg Pro ?la ?sp Phe 485 490 495 ?TCCCACTCC ACCTGAGGAA CTßTCTCß?? CTATTTTC?? ?ß?CTT??GC CCAOTCCACT 1909 G???CTCACG GCTGCGC?CT CTßTCCTCTT cc?cc?C?ß? GOOCOTOTGC TCGßTßCTGA 1969 CGGGACCC?C ?TGCTCC?ß? TTAGACCCTC T???CTTTAT C?CTT???CT TGCATCACTT 2029 ??OCC?CC?? AGCAAGACCC TAA?CATCC? TAATTGTGAT T?ß?C?ß??C ACCTATCCAA 2089 ACATOAACCC OAGGCTGAß? ATCAG?CTG? C?GTTT?C?O ACGCTGCTCT CACA?CC??G 2149 ??TGTTATGT GC??ßTTT?T CAGT???TAA CTOß????C? CAACACTTAT GTTATAC?AT 2209 AC?C?TC?TC TTGG??CTGC ?TTCTTCTC? GCACTGTTT? T?CACTßTGT A??TACCCAT 2269 ?TGTCCTG?? TTC 2282 (2 ) INFORMAION PARA LA SEC ID NO: 6: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 496 «mino áddos (B) UPO: a ino áddo (C) UPO DE HEBRA: una sola (O) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: protdna (V) UPO DE FRAGMENTO: interno ( ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE CLAVE: protdna ( B) LOCALiZAClON: 1...496 ( 0 ) OTRA INFORMACIÓN: a partie dd don pBhiescrlpt KS qu . codifica al ligando 2 ITE-2 humano (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: Met Trp Cln Xle Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Aßp Leu val Leu Ala 1 , S 10 ls ?la Ala Tyr Aßn ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Het ?ßp Ser He Gly Lyß Lyß 20 25 30 Oln Tyr ßln Val Cln Biß Gly Ser Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met ?ßp ?ßn Cyß ?rg ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser ?ßn Ala 50 55 60 Val Oln Arg Aßp Ala Pro Leu ßlu Tyr Aßp Aßp Ser Val Gin Arg Leu 5 70 75 80 Gln Val Leu Clu Aßn He Met Glu Aßn Asn Thr ßln Trp Leu Met Lyß 85 90 95 Leu ßlu ?sn Tyr Xle ßln ?ßp ?sn Het Lyß Vym ßlu Met Val ßlu Xle 100 105 110 Oln ßln ?ßn ?la Val ßln ?en ßln Thr ?la Val Met Xle ßlu Xle ßly 115 120 125 Thr ?sn Leu Leu ?ßn ßln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?ßp 130 135 140 Val ßlu ?la ßln Val Leu ?en ßln Thr Thr ?rg Leu ßlu Leu ßln Leu 145 150 155 160 Leu ßlu Hiß Ser Leu Ser Thr ?ßn Lys Leu ßlu Lyß ßln Xle Leu ?ßp 165 170 175 ßln Thr Ser ßlu Xle ?ßn Lyß Leu ßln ?ßp Lyß ?ßn Ser Phe Leu ßlu 180 185 190 Lyß Lyß Val Leu ?la Met Olu ?sp Lyß Ble Xle ?le ßln Leu ßln Ser 195 200 205 He Lyß Glu ßlu Lyß ?ßp ßln Leu Gln Val Leu Val Ser Lyß Gln ?ßn 210 21S 220 Ser Xle Xle ßlu ßlu Leu ßlu Lyß Lyß Xle Val Thr ?la Thr Val ?sn 225 230 235 240 ?ßn ser Val Leu ßln Lyß ßln ßln Hiß ?ßp Leu Met ßlu Thr Val ?ßn 245 250 255 ?ßn Leu Leu Thr Met Hßt Ser Thr S?t Aßn Ser ?la Lyß ?ßp Pre Thr 260 265 270 Val ?la Lyß ßlu ßlu ßln Xle Ser Phe ?rg ?ßp Cyß ?la Clu Val Phe 275 280 285 Lyß Ser Gly Hiß Thr Thr Aßn oly xle Tyr Thr Leu Thr Phe Pro ?ßn 290 295 300 Smz Thr Glu Glu Zle Lyß ?la Ty¿ Cyß ?ßp Het Glu ?la Oly Oly ßly 305 310 315 320 ßly Trp Thr He Xle ßln ?rg ?rg ßlu ?ep ßly Ser Val Aßp Phe ßln 325 330 335 Arg Thr Trp Lyß ßlu Tyr Lyß Val ßly Phe ßly ?ßn Pro Ser Oly ßl? 340 345 350 Tyr Trp Leu ßly ?ßn Glu Phe Val Ser Cln Leu Tnr ?sn ßln ßln ?rg 355 360 365 Tyr Val Leu- Lyß Zle Hiß Leu Lyß ?ßp Trp ßlu Gly ?ßn ßlu ?la Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr ßlu Hiß Phe Tyr Leu Sur Ser ßlu Glu Leu ?ßn Tyr ?rg 3B5 390 395 400 Zle Hiß Leu Lyß ßly Leu Thr ßly Thr ?la Gly Lyß Xle Ser Ser Xle 405 410 415 ser Cln Pro Cly ?ßn ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp Gly ?ßp ?ßn ?ßp Lyß 420 425 430 Cy* He Cyß Lyß Cyß 8er Cln Met Leu Thr ßly Gly Trp Trp Phe ?ßp 435 440 445 ?l* Cy* Gly Pro Ser ?ßn leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro ßln ?rg ßln 450 4SS 460 ?ßn Thr ?ßn Lyß Phe ?ßn Cly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß Gly Ser 465 470 475 480 ßly Tyr ser Leu Lyß ?l* Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro ?la ?ßp Phe 485 490 495 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 7: (ij CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 478 amino áddos (B) UPO: ambi áddo (C) UPO DE HEBRA: una sola ( 0 ) TOPOLOGÍA: lineal ( li) TIPO DE MOLÉCULA protdna (i ) CARACTERÍSTICAS: ( A ) NOMBRE CLAVE: Protdna madura TLl (B) LOCALKACION: 1...478 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC D_> NO: 7: Aßn Gln Arg ?rg Ser Pro clu Aßn Ser ßly ?rg ?rg Tyr ?ßn ?rg He 1 5 10 15 C n Hiß ßly ßln Cyß ?la Tyr Thr Phe Xle Leu Pro ßlu Klß ?sp ?ly 25 30 ?ßn Cyß ?rg Clu Ser Thr Thr ?ßp Gln Tyr ?sn Thr ?en ?la Leu ßln 40 45 ?ra ?ßp Ala Pro Hiß Val Glu Pro ?sp Phe Ser Ser ßln Lys Leu ßln 50 55 60 Hiß Leu Clu Ble Val Met Glu ?ßn Tyr Thr Oln Trp Leu ßln Lyß Leu 65 70 75 80 Glu ?ßn Tyr Xle Val Glu ?ßn Met Lyß Ser ßlu Met ?la Gln Xle ßln 85 90 95 ßln ?an ?la Val ßln ?sn Hiß Thr ?la Thr Met Leu ßlu Xle ßly Thr 100 105 110 Ser Leu Leu Ser Gn Thr ?la Glu Gln Thr Arg Lyß Leu Thr Aßp Val 115 120 125 Glu Thr Gln Val Leu ?an ßln Thr Ser ?rg Leu ßlu Xle ßln Leu Leu 130 135 140 ßlu ?ßn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu Glu Lyß ßln Leu Leu oln ßln 145 150 155 160 Thr Aßn Glu Xle Leu Lyß Xle Hiß ßlu Lyß ?ßn Ser Leu Leu Glu Bis 165 170 175 Lys Xle Leu ßlu Mßt ßlu ßly Lyß Bl Lys ßlu ßlu Leu ?sp Thr Leu 180 185 190 Lys ßlu ßlu Lyß ßlu ?ßn Leu ßln ßly Leu Val Thr ?rg ßln Thr Tyr 195 200 205 Xle Xle ßln Glu Leu ßlu Lyß ßln Leu ?sn ?rg ?la Thr Thr ?sn ?sn 210 215 220 Ser Val Leu Gln Lys Oln Oln Leu olu Leu Met Asp Thr Val Bis Asn 225 230 235 240 Leu Val Asn Leu Cyß Thr Lyß ßlu ßly Val Leu Leu Lyß ßly ßly Lyß 245 250 255 ?rg ßlu Clu Glu Lyß Pro Phe ?rg ?ßp Cyß ?la ?ßp Val Tyr ßln ?la 260 265 270 ßly Phe ?an Lyß ser Gly He Tyr Thr He Tyr Xle ?ßn ?an Met Pro 275 280 285 Glu Pro Lyß Lyß Val Phe Cyß ?ßn Met ?ßp val ?ßn Gly Gly Gly Trp 290 295 300 Thr Val Zle Cln Hiß ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Leu ?ßp Phe ßln ?rg ßly 305 310 315 320 Trp Lyß ßlu Tyr Lyß Met Gly Phe Gly ?ßn Pro Ser ßly ßlu Tyr Trp 325 330 333 Leu Cly ?ßn Glu Phe Xlc Pne ?la Xle Thr Ser ßln ?rg Gln Tyr Met 340 345 350 Leu ?rg He ßlu Leu Met ?ßp Trp Glu Oly ?ßn ?rg ?la Tyr Ser Oln 355 360 365 Tyr ?ßp ?rg Phe Hiß Xle sly ?ßn ßlu Lyß ßln ?ßn Tyr ?rg Leu Tyr 370 375 380 Leu Ly* ßly Hlß Thr Gly Thr ?la Cly Lyß Gln Ser Ser Leu He Leu 385 390 395 400 Hi» ßly ?la ?ßp Phe Ser Thr Lya Akp Ala ?ap ?ßn ?ßp ?ßn Cyß Met 405 410 415 Cyß Lyß Cyß ?la Leu Met Leu Thr Cly Gly Trp Trp Phe ?ßp ?le Cyß 420 42S 430 Gly Pro 6er ?ßn Leu Aßn Gly Het Phe Tyr Thr Ala Oly Oln Aßn Hlß 435 440 445 Gly Lya Leu Aßn Cly He Lyß Trp Hie Tyr Phe Lyß Gly Pro ser Tyr 450 455 460 Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met He ?rg Pro Leu Aßp Phe 465 470 475 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LARGO: 480 asnino áddos (8) ITPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA, una sola (0) TOPOLOGÍA: lineal { ¿£) TIPO DE MOLÉCULA protdna ( i ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVE: Protdna madura TL2 (B) LOCA IZACION: 1...480 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: ?la ?la Tyr ?ßn ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Met ?ßp Ser He Gly Lyß Ly* 1 S 10 15 Gln Tyr ßln Val Gln Ble ßly Ser Cyß Sex Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 25 30 Glu Met ?ßp ?ßn Cys ?rg Ser Ser Sex Ser Pro Tyr Val Ser ?sn ?la 40 45 Val ßln ?rg ?sp ?la Pro Leu ßlu Tyr ?ep Asp Ser Val ßln Arg Leu 50 55 60 ßln Val Leu ßlu ?ßn Zle Met ßlu ?sn ?ßn Thr ßln Trp Leu Mßt Lyß 65 70 7S 80 Leu Olu ?ßn Tyr Xle oln ?ßp ?ßn Met Lyß Lys Olu Met Val ßlu Xle 85 90 95 Gln Oln ?ßn ?la Val ßln ?sn Gln Thr ?la Val Met Xle Glu Xle Gly 100 105 110 Thr ?ßn Leu Leu ?ßn ßln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?ßp 115 120 125 Val ßlu ?la ßln Val Lßu ?ßn ßln Thr Thr ?rg Leu ßlu Leu ßln Leu 130 135 140 Leu ßlu Ble Ser Leu Ser Thr ?ßn Lyß Leu ßlu Lyß ßln Xle Leu ?ßp 145 150 155 160 ßln Thr Ser ßlu Xle ?en Lyß Leu oln ?ßp Lyß ?ßn ser Phe Leu ßlu 165 170 175 Lyß Lyß Val Leu ?la Mat Olu ?ßp Lyß Ble ?le Xle ßln Leu ßln Ser 180 185 190 Xle Lyß Glu ßlu Lyß ?sp ßln Leu ßln Val Leu Val Ser Lyß ßln ?ßn 195 200 205 ser He He ßlu ßlu Leu Glu Lyß Lyß Xle Val Thr ?la Thr Val ?ßn 210 215 220 Aßn Ser Val Leu Cln Lyß Gln Cln Hiß Aßp Leu Met Glu Thr Val Asn 225 230 235 240 ?ßn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser ?an Ser ?la Lyß ?ßp Pro Thr 245 250 255 al ?la Lyß ßlu ßlu ßln Xle Ser Phe ?rg ?ßp Cyß ?la ßlu Val Phe 260 265 270 Lyß Ser Oly Hiß Thr Thr ?ßn ßly Xle Tyr Thr Leu Thr Phe Pro ?ßn 275 280 285 ser Thr Glu Clu Xle Lyß ?la Tyr Cyß Asp Met Glu Ala Gly Gly ßly 290 296 300 Gly Trp Thr He Xle ßln ?rg Arg ßlu Aßp ßly Ser Val ?ßp Phe ßln 3OS 310 315 320 Arg Thr Trp Lyß ßlu Tyr Lyß Val Gly Phe Cly ?en Pro Ser Oly Glu 325 330 335 Tyr Trp Lrßu Gly ?ßn Clu Phe Val Ser Oln Leu Thr ?sn Gln Gln ?rg 340 345 350 Tyr Val Leu Lyß He Hiß Leu Lyß ?ßp Trp Glu ßly ?ßn Olu ?la Tyr 355 360 365 Ser Leu Tyr Clu Biß Phe Tyr Leu Sex Ser Olu ßlu Leu ?en Tyr ?rg 370 375 380 He Hiß Leu Lyß ßly Leu Thr ßly Thr Ala ßly Lya Xle Ser Ser Xle 385 390 395 400 ser Gln Pro Cly ?ßn Asp Phe Ser Thr Lyß Aßp Cly ?ßp ?ßn ?ep Lyß 405 410 415 cyß Zlß Cys Lyß Cyß ser Cln Met Leu Thr ßly ßly Trp Trp Phe ?ßp 420 425 430 ?la Cyß Gly Pro Ser ?sn Leu Aßn Cly Met Tyr Tyr Pro ßln ?rg ßln 435 . 440 445 ?ßn Thr ?ßn Lyß Phe ?sn ßly Zle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lys ßly Ser 450 455 460 Oly Tyr Ser Leu Lys ?la Thr Thr Met Met Zle ?rg Pro ?la ?ap Phe 465 470 475 480 (2) INFORMACIÓNPARALA SECIDNO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DELASECUENCIA: (?) LONGITUD: 1849 pares base (B ) UPO: áddo núddco (C) TIPO DE HEBRA: úna sela (O) TOPOLOGÍA: lineal ( 11) UPO DE MOLÉCULA: DNA ( i ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: Secuenda dd código (B) LOCALIZACION: 47...1573 <P) OTRATNFORMAsON: (A) NOMBRE CLAVE: Hgando-3 TTE (B) LOCALIZACION: 1...1849 J ( D ) OTRA INFORMACIÓN: El dominio similar al fibrioogeu? inida en la posidón 929. (Xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: CTGTCCT06T ?CCTG?C??C ?CCACCTC?C G?CC?CTTOG TCTCAO ATO CTC TCC 55 Met Leu cys 1 C?C CC? GCT ?TG CT? CT? C?T CCC CTC CTC CTG CTß ßCC ACC ?TG GCT 103 Gln Pro ?lß Met Leu Leu ?ßp Gly Leu Leu Leu Leu ?la Thr Met ?la e ío ís GC? GCC CAC C?C ?ß? CCC CCA OAA OCC OßT ßßC C?C CGC C?C ?TT C?C 151 ?la ?la Gln Hiß ?rg Gly Pro Clu ?la Cly ßly Hiß ?rg ßln Zle Hiß 20 25 30 35 CAG CTC CGG COT ßßC CAC TGC AGC T?C ACC TTT CTG GTß CCG OAG CCT 199 ßln Val Arg Arg ßly ßln Cyß Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Clu Pro 40 45 SO ßAT ATC TCC C?C CTO CCß CCG ?C? CCC GCC CCT GAC GCT TTß ßßß COC 247 Aßp He Cyß Gln Leu ?la Pro Thr ?la ?la Pro Glu Ala Leu Gly Gly 55 60 65 TCC AAT AßC CTC CAG AGC GAC TTG CCT GCC TCC AGC CTß C?C CT? ACÁ 29S 6er Aßn Ser Leu Gln Arg Aßp Leu Pro Ala ser Arg Leu Hlß Leu Thr 70 75 80 OAC TGG COA ßCC CAO AOG OCC CAG CGG GCC CAO CGT GTß ?ßC CAG CTO 343 Aßp Trp ?rg ?la ßln Arg Ala Gln ?rg ?la ßln ?rg Val Ser ßln Leu 85 90 95 GAG ??G ?T? CT? ß?ß AAT A?C ACT CAO TOO CTG CTO AAG CTG G?ß C?ß 391 Clu Lyß He Leu Glu ?ßn ?ßn Thr Gln Trp Leu Leu Lyß Lßu Glu Gln 100 105 110 H5 TCC ?TC AAC GTC AAC TTO ACO TCA C?C CTG OTO CAß OCC C?ß CAß O?C 439 Ser He Lyß Val Aßn Leu ?rg Ser Hiß Leu Val ßln Ala ßln ßln ?ep 120 125 «0 ACÁ ATC CAß A?C CAß AC? ACT ?CC ?TC CTß CC? CTG ßßT OCC ?AC CTC 487 Thr Xle ßln ?ßn ßln Thr Thr Thr Met Leu ?la Leu ßly ?le ?ßn Leu 13S 140 145 ?TG AAC C?ß ACC ??? ßCT C?ß ACC C?C ??G CTO ACT GCT CTG ß?ß ßC? S3S Met ?sn ßln Thr Lyß ?la Gln Thr His Lys Leu Thr ?la Val Olu ?la 150 156 160 CAG OTC CT? A?C C?ß AC? TTO CAC ?TG ??G ?CC C?? ?TG CTß ß?ß ??C 58 ßln Val Leu ?an ßln Thr Leu Hlß Met Lys Thr ßln Met Leu ßlu ?ßn 165 170 175 TC? CTG TCC ACC ??C AAG CTG ß?ß CGG C?ß ATß CTß ATß CAß ?ßC CGA 631 Ser leu Ser Thr ?sn Lyß Leu Glu ?rg Gln Met Leu Met ßln Ser Arg 180 185 190 195 ß?ß CTO CAG CGß CTß CAG ßßT CGC A?C Aßß CCC CTG C?ß ?CC ?ßß CTO 679 ßlu Leu ßln ?rg Leu ßln Gly ?rg Aßn ?rg ?la Leu Clu Thr ?rg Leu 200 205 210 CAO OCA CTß ß?? CCA C?? C?T C?G OCC CAG CTT A?C ?ßC CTC CA? ß?ß 727 Gln ?la Leu Olu ?la ßln Hiß Cln ?la ßln Leu ?ßn Ser Leu ßln ßlu 215 220 225 ??ß ?GC C?? C?? CTC C?C AGT CTC CTO GOC CAT CAß ACC ßßß ?CC CTß 775 Lyß ?rg ßlu ßln Leu Hiß Ser Leu Leu ßly Ble ? n Thr ßly Thr Leu 230 235 240 OCT ?AC CTß ??G C?C ??T CTß C?C CCT CTC ?GC ?ßC ??T TCC AGC TCC 823 ?la ?ßn Leu Lyß Hiß ?ßn Leu Hiß ?la Leu ser Ser ?sn Ser ser Ser 245 250 255 CTß C?ß C?G C?C C?ß C?G C?? CTG ?CC GAO TTT OTA CAO COC CTO OTA 871 Leu ßln ßln ßln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val ßln ?rg Leu Val 260 265 270 275 COC ?TT CT? CCC C?G G?C CAO CAT CCG ßTT TCC TT? ??G ?C? CCT ??ß 919 ?rg He Val Ala Gln ?ßp Gln Hiß Pro Val Ser Leu Lyß Thr Pro Lyß 280 286 290 CC? CTC TTC C?G G?C TGT GC? GAC ATC ??G CGC TCC COG ßTT ??T ?CC 967 Pro Val Phe Gln Aßp cya ?la Glu He Lyß ?rg Ser Gly Val ?ßn Thr 295 300 305 AßC GGT GTC TAT ACC ATC T?T GAG ACC AAC ATG AC? ??ß CCT CTC ??G 1015 Ser Cly val Tyr Thr He Tyr ßlu Thr ?ßn Met Thr Lyß Pro Leu Lyß 3X0 315 320 GTG TTC TOT C?C ATC CAC ACT OAT GGA GGT GßC TCG ACC CTC ATC CAG 1063 Val Phe Cyß Aßp Met Glu Thr Aßp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Xle Gln 32S 330 335 C?C CGG C?G CAT GCA AOC OTA A?T TTC C?G AGG ACC TGG GAA ß?? TAC 1111 Hiß Arg Clu Aßp cly ser Val Aßn Phe Cln Arg Thr Trp Glu Clu Tyr 340 345 350 355 A?? GAG GßT TTT GßT A?T GTG GCC AGA OAß C?C TOO CTß ßGC ??T OAG 1159 Lyß Clu Gly Phe Gly Aßn Val Ala Arg Glu Hiß Trp Leu Gly Aßn Glu 360 365 370 CCT CTG CAC COC CTC ACC AGC ACÁ ACG CCC TAC TTC CTA CGC GTG CAÁ 1207 Ala Val Hiß ?rg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu ?rg Val Glu 375 380 385 CTß CAT CAC TGG CAÁ GGC CGC CAß ACC TCC ATC C?ß T?T GAO AAC TTC 1255 Lßu Hiß Aßp Trp Glu Cly Arg Cln Thr ser He Gln Tyr Glu Aan Phe 390 395 400 CAO CTß ßßC ?GC ß?ß AGG C?ß Cßß T?C ?GC CTC TCT CTß ??T ß?C AßC 1303 ßln Leu ßly Ser ßlu ?rg ßln ?rg Tyr Ser Leu Ser Val ?sn ?sp Ser 405 410 41S ?ßC ?ßT TC? CC? Cßß CGC ??ß ??C ?ßC CTß OCT CCT CAß ßßC ACC A?ß 1351 Ser Ser Ser ?la ßly ?rg Lys ?sn Ser Leu ?la Pro Oln ßly Thr Lyß 420 425 430 435 TTC ?GC ACC ??? C?C ?TC G?C ??T C?T ?AC TCC ?TG TOT A?? TGT GCT 1399 Phe Ser Thr Lyß ?ßp Met ?ep ?sn ?sp ?sn Cyß Met Cyß Lys Cyß ?la 440 445 450 C?ß ?TG CTG TCT ßß? ßßß TGG Tßß TTT ßAT CCC TOT OCC CTC TCC AAC 1447 Gln Met Leu Ser Oly Oly Trp Trp Phe ?ßp ?la Cyß ßly Leu Ser Aßn 455 460 465 CTC ??T GCC ?TC T?C T?T TC? ßTT C?T C?G C?C TTß C?C ??ß ?TC ??T 1495 Leu ?ßn ßly Xle Tyr Tyr Ser Val Hiß ßln Hlß Leu Bis Lyß Xle Aßn 470 475 480 OOC ?TC CßC TGC CAC T?C TTC COA GßC CCC AßC TAC TCA CTC CAC ßßC 1543 ßly Xle ?rg Trp His Tyr Phe ?rg ßly Pro Ser Tyr Ser Leu Ble ßly 465 490 495 AC? CCC ATß ?Tß CTG ?CG CC? ?TC GßT GCC Tß? CACACAG CCCTCCAOAG ?CT 1596 Thr ?rg Met Met Leu ?rg Pro Met Gly ?la 500 505 CATOCCCTAO O?Oß?TTCTC ??CCC?ßßTG ?CTCTGTGC? CßCTßßßCCC TßCCC?ß??? 1656 TCAOTßCCC? OOGCTC?TCT -Tß?C?TTCTG ß??C?TCOß? ?CC?OCTTAC CTTOCCCCTG 1716 ?ATTAC??ß? ?TTC?CCTGC tfTCCCTGTTG CCCTCT??TT GTCAAATTCC TG60TGCTTG 1776 ??CCC?CCTC CCTCTGTTGG A?CCAT?CTC TTTCCCCCTC CTGCTGC?TG CCCßGO??TC 1836 CCTGCCATO? ACT 1849 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 509 amino áddos (B) UPO: ammo áddo (C) UPO DE HEBRA: una sola (0) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: protdna (v) UPO DE FRAGMENTO: interno ( ix ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVE: Hgando- TIE ( B ) LOCAL1ZACION: 1.. 509 (D) OTRA INFORMACIÓN: xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: Het Leu Cyß Gln Pro ?la Met Leu Leu ?ßp ßly Leu Leu Leu Leu ?la 1 5 10 15 Thr Met ?la ?la ?la ßln Hiß Arg Oly Pro Glu Ala Cly Gly Hiß ?rg 20 25 30 Gln He Hiß ßln Val ?rg ?rg Gly cln Cyß Ser Tyr Thr Phe Val Val 35 4C 45 Pro Glu Pro ?ßp Xle Cyß ßln Leu ?la Pro Thr Ala Ala Pro Glu ?la 50 55 60 Leu Cly Cly Ser Asn Ser Leu Gln Arg ?ßp Leu Pro Ala Ser ?rg Leu 65 70 75 80 Hlß Leu Thr ?ßp Trp ?rg ?la Gln Arg Ala Gln ?rg ?la Gln ?rg Val 85 90 95 Ser Gln Leu Glu Lyß He Leu Gl? Aßn ?ßn Thr Gln Trp LAU Leu Lyß 100 105 110 Leu Olu ßln Ser Zle Lyß Val ?ßn Leu ?rg Ser Hie Leu Vel ßln Ala 115 120 125 ßln ßln ?ßp Thr Zle ßln ?ßn ßln Thr Thr Thr Met Leu ?la Leu ßly 130 135 140 ?la ?ßn Leu Met ?ßn Oln Thr Lyß ?l* Gln Thr Hiß Lyß Leu Thr ?la 145 150 155 160 Val Glu ?la Gln Val Leu ?ßn ßln Thr Leu Ble Net Lyß Thr ßln Met 165 170 175 Leu Olu ?ßn Ser Leu Ser Thr ?ßn Lyß Leu ßlu ?rg ßln Met Lßu Met 180 185 190 ßln Ser ?rg ßlu Leu ßln ?rg Leu Gln ßly ?rg ?ßn ?rg ?la Leu ßlu 195 200 205 Thr Arg Leu Oln Ala Leu ßlu Ala ßln Hlß ßln ?la ßln Leu ?ßn Ser 210 215 220 Leu Cln Clu Lyß ?rg Glu ßln Leu Bis Ser Leu Leu ßly Bis ßln Thr 225 230 235 240 ßly Thr Leu ?la ?sn Leu Lyß Hiß ?sn Leu Ble ?la Leu Ser Ser ?sn 245 250 265 ser Ser Ser Leu ßln Gln Oln Gln Gln Gln Leu Thr Olu Phe Val ßln 260 265 270 ?rg Leu Val ?rg ?le Val ?la ßln ?sp ßln Bis Pro val Ser Leu Lyß 275 280 285 Thr Pro Lyß Pro Val Phe ßln ?ßp Cyß ?la ßlu Xla Lyß ?rg Ser ßly 290 295 300 val ?ßn Thr Ser ßly Val Tyr Thr He Tyr ßlu Thr ?ßn Met Thr Lyß 305 310 315 320 Pro Leu Lyß Val Phe Cyß Aßp Het Clu Thr Aßp ßly ßly ßly Trp Thr 325 330 335 Leu Xle ßln Ble ?rg ?lu ?ßp Gly ser Val ?en Pbe Gln ?rg Thr Trp 340 345 350 ßlu ßlu Tyr Lyß ßlu Gly Phe ßly ?ßn Val ?la ?rg ßlu Hlß Trp Leu 355 360 365 Oly ?ßn ßlu ?la Val Ble ?rg Leu Thr ser ?rg Thr ?la Tyr Leu Leu 370 375 380 Arg val Glu Leu Kiß ?ßp Trp Glu ßly ?rg Gln Thr Ser Xle ßln Tyr 385 390 395 400 Olu ?ßn Phe Gln Leu Gly Ser Clu ?rg Gln ?rg Tyr Ser Leu Ser Val 405 410 415 ?ßn ?ßp Ser ser Ser Ser ?la Gly ?rg Lyß Aßn Ser Leu ?la Pro Gln 420 425 430 Gly Thr Lye Phe Ser Thr Lyß ?ßp Met Asp Aßn ?sp Asn Cyß Met Cyß 435 440 445 Lya Cyß Ala Gln Met Leu Ser Cly Gly Trp Trp Phe ?ep ?la cyß Oly 450 455 460 Leu Ser ?ßn Leu ?ßn Gly He Tyr Tyr ser Val Hiß Gln Hiß Leu His 465 470 475 480 Lyß He ?ßn ßly He ?rg Trp Hiß Tyr Phe ?rg ßly Pro Ser Tyr Ser 465 490 495 Leu Hiß Gly Thr Arg Mßt Met Leu ?rg Pro Met Gly ?la 500 505 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11: { i j CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCL _: (?) LONGITUD: 503 omino áddos ( B ¡ UPO: amino áddo ( C) UPO DE HEBRA una sola (O ) TOPOLOGÍA: lineal ( 11 ) UPO DE MOLÉCULA- protdna ( i ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: mTL3 (B ) LOCALIZACION: 1...503 ( O ) OTRA INFORMACIÓN: ligando 3 HE de ratón (Xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA SEC IDNO: 11: Kßt Leu Leu ?ßp Gly Leu Leu Leu Leu ?la Thr Met ?la ?la ?la Gln 1 5 10 15 Hlß ?rg Gly Pro Olu ?la ßly ßly Ble ?rg ßln Xle Hiß Oln Vel ?rg 25 30 ?rg Cly ßln Cyß Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro ßlu Pro ?ßp Xle Cyß 40 45 ßln leu ?la Pro Thr ?la ?la Pro ßlu ?la Leu ßly ßly Ser ?en Ser 50 56 60 Leu ßln ?rg ?ßp Leu Pro ?la Ser ?rg Leu Hlß Leu Thr ?ßp Trp ?r 65 70 75 80 ?l* ßln ?rg ?la ßln ?rg ?la ?ln ?rg Val Ser ßln Leu ßlu Lyß Xle 85 90 95 Leu Glu ?sn ?sn Thr Oln Trp Leu Lßu Lyß Leu ßlu ßln ser Xle Lyß 100 105 U0 .

Val ?ßn Leu ?rg Ser His Leu Val ßln ?la Oln Gln ?sp Tbr xle ßln 115 120 125 ?sn ßln Thr Thr Thr Met Leu ?la Leu ßly Ala ?ßn Leu Met ?en ßln 130 135 140 Thr Lyß ?la oln Thr Hiß Lyß Leu Thr ?la Val ßlu ?la ßln Val Leu 145 150 155 160 ?ßn ßln Thr Leu Hiß Met Lys Thr Gln Mst Leu olu ?ßn ser x<eu Ser 16S 170 175 Thr ?ßn Lyß Leu ßlu ?rg ßln Met Leu Met ßln Ser ?rg ßlu Leu ßln 180 185 190 ?rg Leu ßln ßly ?rg ?ßn ?rg ?la Leu ßlu Thr ?rg Leu ßln ?la Leu 19S 200 205 Clu ?la ßln Hia ßln ?la ßln Leu ?ßn sar Leu ßln ßlu Lyß ?rg ßlu 210 215 220 ßln Leu Hlß Ser Lßu Leu ßly His Gln Thr Gly Thr Leu ?la ?ßn Leu 225 230 235 240 Lyß Bis Asi. Leu Ble ?la Leu Ser Ser ?ßn ser Ser Ser Leu ßln ßln 245 250 255 ßln Gln ßln ßln Leu Thr ßlu Phe Val ßln ?rg Leu Val ?rg Xle Val 260 265 270 ?l* ßln ?ßp ßln Hiß Pro Val Ser Leu Lyß Tbr Pro Lyß Pro Val Phe 275 280 285 cln Asp Cyß ?la Glu Xle Lyß ?rg Ser Gly Val ?ßn Thr Ser ßly Val 290 295 300 Tyr Thr Xle Tyr Olu Thr ?ßn Met Thr Lyß Pro Leu Lyß Val Phe Cyß 305 310 315 320 ?ßp Met Clu Thr ?ßp ßly ßly ßly Trp Thr Leu Xle ßln Hlß ?rg ßlu 325 330 335 ?ßp Gly Ser Val ?ßn Phe Gln ?rg Thr Trp ßlu Glu Tyr Lyß Glu Gly 340 345 350 Phe ßly ?ßn Val ?la ?rg ßlu Hiß Trp Leu Gly ?sn Glu Ala Val Bis 355 360 365 ?rg Lau Thr Ser ?rg Thr Ala Tyr Leu Leu ?rg Vel Glu Leu Hlß ?ßp 370 375 380 Trp Glu Gly ?rg Gln Thr Ser Xle Gln Tyr ßlu ?en Phe Gln Leu Gly 365 390 395 400 Ser Glu ?rg Gln ?rg Tyr Ser Leu Ser Val ?ßn Aßp Ser Ser Ser Ser 405 410 415 Ala Gly ?rg Lyß ?ßn Ser Leu ?la Pro ßln ßly Thr Lyß Phß Ser Tbr 420 425 30 Lyß ?ßp Met ?ßp ?ßn ?ßp Aßn Cyß Met cyß Lyß Cyß ?la ßln Met Leu 435 440 445 Ser Gly Gly Trp Trp Phe Aßp Ala Cyß Gly Leu Ser Aan Leu Aan ßly 450 455 460 He Tyr Tyr Ser Val Hlß Cln Ble Leu Hlß Lyß Xle Aßn ßly He Aro 465 470 475 480 Trp Hiß Tyr Phe Arg Oly Pro Ser Tyr ser Xle Hiß Oly Thr ?rg Met 485 490 495 Met Leu ?rg ro Met Gly Ala 500 ( 2) -TNFORMACTON PARA T.A SF p. NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 490 amino áddos (B) TTPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: una sola (O) TOPOLOGÍA lineal ( 11) UPO DE MOLÉCULA: protdna ( ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE CLAVE: hTLl (B) LOCALEACION: 1...490 (D) OTRAINFORMACIÓN: ligando 1 TTE-2 humano ( i) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SECID NO: 12: ?la Phe Leu ?la ?la Xle Leu Thr Hiß Xle Oly Cys Ser ?sn ßln ?rg 1 5 10 15 ?rg Ser Pro clu ?ßn Sex Gly ?rg ?rg Tyr ?sn ?rg Xle Oln Hlß ßly 25 90 ßln Cyß ?la Tyr Thr Pbe Xle Leu Pro ßlu His ?sp Oly ?ßn Cys ?rg 40 45 ßlu Ser Thr Thr ?ßp ßln Tyr ?ßn Thr ?ßn ?la Leu ßln ?rg ?ßp ?la SO 55 60 Pro Hlß Val Glu Pro Aßp Phe Ser Ser ßln Lyß Leu ßln Hiß Leu ßlu 65 70 75 80 Kiß Val Het ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Tp Leu ßln Lyß Leu ßlu Asn Tyr 85 90 95 Xle Val Clu ?sn Mßt Lyß Ser ßlu Het ?la Gln Xle ßln ßln ?sn ?la 100 105 110 Val ßln ?ßn Kiß Thr ?la Thr Met Leu ßlu Xle ßly Tbr 8er Leu Leu 115 120 125 Sex Oln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?ßp Val ßlu Thr ßln 130 135 140 Val Leu ?ßn ßln Thr Ser ?rg Lßu ßlu He ßln Leu Leu ßlu ?ßn Ser 145 150 155 160 Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu Olu Lya Cln Leu Leu Gln ßln Thr ?ßn ßlu 165 170 175 He Leu Lyß Xle Hiß ßlu Lyß ?ßn Ser Leu Leu ßlu Hiß Lyß He Leu 180 IBS 190 Olu Met Olu Gly Lyß Hiß Lyß Clu Glu Leu ?ßp Thr Leu Lyß Glu Glu 195 200 205 Lyß Glu ?ßn Leu Gln ßly Leu Vßl Thr ?rg ßln Thr Tyr Xle Xle ßln 210 215 220 Glu Leu Glu Lyß Gln Leu ?ßn Arg Ala Thr Thr ?ßn ?ßn Ser Val Leu 225 230 235 240 ßln Lyß ßln ßln Leu ßlu Leu Het Aßp Thr Val Hiß Aßn Leu Val ?ßn 245 250 255 Leu Cyß Thr Lyß olu Val Leu Leu Lyß Gly Gly Lyß ?rg Glu ßlu ßlu 260 265 270 Lyß Pro Phe ?rg ?ßp Cyß ?la ?ßp Val Tyr ßln ?la ßly Phe ?en Lyß 275 280 285 Sar ßly Xle Tyr Thr Xle Tyr He ?ßn ?ßn Met Pro ßlu Pro Lyß Lyß 290 295 300 Val Phe Cyß ?ßn Met Aßp Val Aßn Cly Cly ßly Trp Thr val He ßln 305 310 315 320 Hiß Arg ßlu ?ßp ßly Ser Leu ?ßp Phe ßln Arg ßly Trp Lyß ßlu Tyr 325 330 335 Lyß Met Cly Phe Oly ?ßn Pro Ser Gly Olu Tyr Trp Leu ßly ?ßn ßlu 340 345 350 Pbe He Phe ?la Xle Thr ser ßln ?rg ßln Tyr Met Leu ?rg Xle ßlu 355 360 365 Leu Met ?ßp Trp ßlu Oly ?ßn ?rg ?la Tyr Ser Gln Tyr ?ep ?rg phe 370 375 380 Hlß ?le ßly ?ßn ßlu Lyß Oln ?ßn Tyr ?rg Leu Tyr Leu Lys ßly Bis 385 390 396 400 Thr ?ly Thr Ala Oly Lyß ßln Sex Ser Leu Xle Leu Hiß ßly ?la ?ßp 405 410 415 Phe Ser Thr Lys ?ßp ?la ?sp ?sn Asp Asa Cys Met Cyß Lyß Cyß ?la 420 425 430 Leu Met Leu Thr ßly ßly Trp Trp Phe ?sp ?la Cys ßly Pro Ser ?ßn 435 440 446 Leu ?ßn ßly Met Phß Tyr Thr ?la Oly ßln ?sn Bis Gly Lyß Leu ?ßn 450 4SS 460 ßly Xle Lyß Trp Ble Tyr Phe Lyß Gly Pro Ser Tyr Ser Xle ?rg Ser 465 470 476 480 Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro Leu ?sp Phe 485 490 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13: ( I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 491 amino áddos (B) UPO: apdno áddo (C) TIPO DE HEBRA: una sola (0) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: protdna ( ix ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: chTLl (B) LOCA1JZACION: 1...491 (D ) OTRA INFORMACIÓN: ligando 1 TEE-2 de pon (Xi) DESCRIPCI N DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13: ?la Phe Leu. ?la ?la Xle Leu ?la Ble Xle Oly Cyß Thr Thr ßln ?rg 1 5 10 15 ?rg Sex Pro ßlu ?ßn Sex ßly ?rg ?rg Phe ?ßn ?rg Xle Oln Bis ßly 25 30 ßln cyß Thr Tyr Thr Fhe Xle Leu Pro ßlu ßln ?ßp ßly ?ßn Cyß ?ra 40 45 Glu Ser Thr Thr ?ßp Gln Tyr ?ßn Thr Aßn ?la leu Gln Arg ?ßp Ala 50 55 60 Pro Hiß Val Glu Gln ?ßp Phe Ser Phe ßln Lyß Leu ßln Hiß Leu ßlu 65 70 75 80 Hiß Val Mßt ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Trp Lau ßln ym Leu Glu Ser Tyr 85 90 5 xle Val ßlu ?ßn Met Lys Ser ßlu Met ?la ßln Leu ßln ßln ?an ?la 100 105 no Val ßln Aßn Hiß Thr Ala Thr Net Leu Glu Xle Gly Thr Ser Leu Leu 115 120 25 Ser Oln Thr Ala Olu ßln Thr Arg Lyß Leu Thr Aßp Val ßlu Tbr ßln 130 135 140 v*l Lßu ?ßn Oln Tbr Ser ?rg Leu Glu Xle Oln Leu Leu Glu ?ßn Ser 145 150 155 160 Lßu Ser Thr Tyr Lyß Leu Glu Lyß Cln Leu Leu Oln Cln Thr Aßn Glu 166 170 176 Xle Leu Lyß Xle Hiß Glu Lye Aan Ser Leu Leu Glu Hiß Lyß Zle Leu 180 185 190 Clu Mßt Glu Olu Arg Hiß Lyß Glu Glu Met ?ßp Thr Leu Lyß Glu Glu 195 200 205 Lyß Oiu ?ßn Lßu ßln ßly Leu Val Thr Arg ßln ser Tyr He He ßln 210 215 220 ßlu Leu Clu Lyß ßln Leu ?ßn Lyß ?la Thr Thr ?an ?ßn ser Val Leu 225 230 235 240 ßln Lya ßln ßln Leu ßlu Leu Met ?ap Thr Val Hiß Thr Leu He Thr 246 250 255 Leu cyß ser Lyß Clu ßly Val Leu Leu Lyß ?ßn ?la Lyß ?rg Clu o u 260 265 270 ßl? Lyß Pro Phe ?rg ?ßp Cyß ?la ?ßp val Tyr ßln ?la ßly Pbe ?sn 275 , 280 285 Lys Ser ßly Xle Tyr Thr He Tyr Xle ?sn ?sn Val ser ?sp Pro Lyß 290 295 300 Lys Val Pbs Cy* ?ßn Mat. ?sp Val ?sn ßly ßly ßly Trp Thr Val ?le 305 310 315 320 ßln His ?rg ßlu ?sp ßly Ser Leu ?ep Phe ßln Lyß ßly Trp Lyß ßlu 325 330 335 Tyr Lyß Met Oly Phe ßly Ser Pro ser ßly ßlu Tyr Trp Leu ßly ?ßn 340 345 350 ßlu Phe He Phe ?la Xle Thr Sar ßln ?rg ßln Tyr Ser Leu Arg He 355 360 365 Clu Leu Met ?ep Trp ßlu ßly ?ßn ?rg ?la Tyr Ser ßln Tyr ?sp ?rg 370 375 380 Phe Hiß He Oly ?ßn ßlu Lyß ßln ?sn Tyr ?rg Leu Tyr Leu Lyß ßly 385 390 395 400 Hlß ser Gly Thr ?la Oly Lya ßln Ser Ser Leu Xle Leu Hiß ßly ?la 405 410 416 Glu Ph* Ser Thr Lyß ?sp ?la ?ßp ?sn ?ßp ?sn Cys Met Cyß Lyß Cyß 420 425 430 ?la Leu Met Leu Tbr ßly ßly Trp Trp Phe ?sp ?la Cyß ßly Pro Ser 435 440 445 ?ßn Leu ?ßn ?ly Het Phe Tyr Thr ?la ßly ßln ?ßn Hi* Oly Lyß Leu 450 455 460 ?ßn Oly Xle Lyß Trp Hlß Tyr Phe Lyß ßly Pro ?rg Tyr Ser He ?rg 465 470 475 480 ser Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro Leu ?sp Pbe 485 490 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICASDE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 497 amino áddos (B). UPO: amino áddo (C) TIPO DE HEBRA: ana tola (0) TOPOLOGÍA: lineal (il) UPO DE MOLÉCULA: protdna (i ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRECLAVE: mTLl (B) LOCALJZACION: 1...497 <D) OTRAINFORMACIÓN: ufando 1 TEG-2 deratón 1 (Xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SECID NO: 14: Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Phe Ala ?la He Leu Thr Biß 1 5 10 15 He ßly Cyß Ser ?ßn Gln Arg ?rg Aßn Pro Glu Aßn Ser ßly ?rg ?rg 25 30 Tyr Aßn Arg He ßln Hiß Gly Gln Cyß Ala Tyr Thr Phe He Leu Pro 40 45 Glu Hlß Aßp Cly Aßn Cyß Arg Glu Ser Thr Thr Aßp ßln Tyr ?ßn Thr 50 55 60 Aßn Al* Leu Gln Arg Aßp Ala Pro Hiß Val Glu Pro ?ap Phe Ser Ser 65 70 75 80 Gln Lyß Leu Gln Hiß Leu ßlu Hiß Val Met ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Trp 85 90 95 Lau Cln Lyß Leu Glu ?ßn Tyr He Val Glu Aan Met Lys ser Glu Met 100 IOS 110 Al* Gln He Gln Gln ?ßn ?la Val Cln ?ßn Biß Thr ?la Thr Met Leu 115 120 125 Glu 11» ßly Thr Ser Leu Leu Ser ßln Thr ?la ßlu ?ln Thr ?rg Lyß 130 135 140 Leu Thr ?ßp Val ßlu Thr ßln Val Leu Aan ßln Thr Ser ?rg Leu slu 145 150 155 160 Xle ßln Leu Leu ßlu ?ßn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu ßlu Lys ßln 165 170 175 Leu Leu ßln Thr ?ßn ßlu Xle Leu Lyß Xlß Hiß ßlu Lyß ?en Ser Lau 180 185 190 Leu Clu Hiß Lyß Xle Leu Glu Mat Clu Gly Lyß His Lys ßlu ßlu Mßt 195 200 205 ?ßp Thr Leu Lyß Olu ßlu Lye ßlu ?ßn Leu ßln ßly Leu Val 8ex ?rg 210 215 220 Gln Ser Phe Xle Xle ßln ßlu Leu ßlu Lyß ßln Leu Ser ?rg ?la Thr 225 230 235 240 ?ßn ?ßn ?ßn Ser He Leu Oln Lyß ßln ßln Leu ßlu Leu Met ?ap Thr 245 250 255 .

Val Hiß ?ßn Lßu Xle Ser Leu Cyß Thr Lyß ßlu ßly Vel Leu Leu Lyß 260 265 270 ßly ßly Lyß ?rg ßlu ßlu ßlu Lyß Pro Phe ?rg ?ap Cyß ?la Asp Val 275 280 285 Tyr ßln ?la ßly Phe ?sn Lyß Ser ßly Xlß Tyr Thr Xle Tyr Phe ?sn 290 295 300 ?sn val Pro ßlu Pro Lyß Lys Val Phe Cyß ?sn Met ?sp Val ?sn Oly 305 310 31S 320 Cly ßly Trp Thr Val Xle ßln Biß ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Leu ?ßp Phe 325 330 335 ßln Lyß ßly Trp Lye ßlu Tyr Lyß Met Oly Phe Oly Sex Pro 8er ßly 340 345 350 ßlu Tyr Trp Leu ßly ?sn ßlu Phe Xle Phe ?la Xle Thr Ser ßln ?rg 355 360 365 ßln Tyr Met Leu ?rg Xle ßlu Leu Net ?ßp Trp ßlu ßly ?en ?rg ?la 370 375 380 Tyr Ser Oln Tyr ?sp ?rg Pbe Mis Xle Gly ?ßn Clu Lyß ßln ?en Tyr 385 390 395 400 ?rg Leu Tyr Leu Lyß Gly Hiß Tbr Giy Thr ?la Gly Lyß Oln Sar Ser 405 410 415 Leu Xle Leu Biß Gly ?la ?sp Phß Ser Thr Lyß ?ßp ?la ?sp ?ßn ?ßp . 420 425 430 ?ßn cyß Mßt Cyß Lyß Cyß ?la Leu Met Leu Thr oly ßly Trp Trp Phe 435 440 445 ?sp ?la Cyß ßly Pro ser ?ßn Leu ?ßn ßly Mßt Phe Tyr Thr ?la Gly 450 455 460 Gln ?ßn Hiß Giy Lyß Leu Aßn ?ly He Lyß Trp Hiß Tyr Phe Lyß ßly 465 470 475 480 Pro Arg Tyr Ser Xle Arg Ser Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro Leu ?ßp 485 490 495 Phe (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15: < 1 ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ( ? ) LONGITUD: 496 amino ádds ( B ) UPO: amino áddo (C) TIPO DE HEBRA ana sola < O ) TOPOLOGÍA: lineal ( il) UPO DE MOLÉCULA protdna ( ix ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: mTL2 (B) LOCALIZACION: 1...496 ( 0 > OTRA INFORMACIÓN: ligando 2 ITE-2 de ratón (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15: Ket Trp Gln Xle He Phe Leu Thr Pbe Cly Trp Asp Ala Val Lau Thr 1 , 5 10 15 Ser Ala Tyr Ser ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Val ?ßp Ser Thr Oly ?rg ?rg 20 25 30 ?rg Tyr ?rg Zle Gln ?sn ßly Pro cys ?la Tyr Thr Phe Leu Leu Pro ' 40 45 ßlu Thr Aßp ser ßly ?rg .Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Met Thr ?ßn ?la 50 SS 60 Val Gln ?rg ?sp ?la Pro Pro ?sp Tyr ßlu ?ap Ser Val ßln Ser Leu 65 70 75 «o ßln Leu Leu Clu ?ßn Val Met Glu ?ßn Tyr Thr ßln Trp Leu Met Lyß 65 90 96 Leu Glu ?ßn Tyr Zle Gln ?ßp ?ßn Met Lyß Lyß ßlu Met ?la ßl? Zla 100 IOS 110 Gln Oln ?ßn Val Val Gln ?an Hlß Thr ?la Vßl Met ?le Glu Zlß ßly 115 120 125 Thr Ser Leu Leu Ser ßln Thr ?la Glu Gln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?ap 130 135 140 Val Olu Thr ßln Vel Lßu ?ßn cln Thr Thr ?rg Leu Olu Leu ßln Leu 145 1S0 156 16Q Leu ßln Hlß Ser Zle Ser Tbr Tyr Lyß Leu ßlu Lyß ßln Zle Leu ?ßp 165 170 175 ßln Thr Ser- Glu Zle ?sn Lyß Zle Hiß ?ßn Lys ?ßn Ser Pbe Leu ßlu 180 185 190 ßln Lyß Val Leu ?ßp Met ßlu Cly Lyß His Sex ßlu ßlu Met ßln Thr 195 200 205 Met Lyß ßlu ßln Lyß ?ßp ßlu Leu ßln Val Leu Val Ser Lys Cln Ser 210 215 220 ser val lie ?sp Glu Leu Glu Lys Lys Leu Val Thr ?la Thr Val ?ßn 225 230 235 240 ?sn Ser Lßu Lßu ßln Lys ßln ßln Hls ?ßp Leu Met ?ßp Thr Val ?sn 245 250 255 Ser Leu Leu Thr Met Met Ser Ser Pro ?ßn Ser Lyß Ser Ser Leu ?la 260 265 270 Xle ?rg ?rg Olu Olu Oln Thr Thr Phe ?rg ?sp Cys ?la ?ßp Val Phe 275 280 285 Lyß ?la ßly Leu Thr Lyß Ser Oly Xle Tyr Thr Leu Thr Phe Pro ?sn 290 295 300 Ser Pro Glu Glu Xle Lye ?la Tyr Cyß ?ßn Het ?ßp Val Gly ßly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Val Xle ßln Hiß ?rg ßlu ?ßp ßly Ser leu ?ßp Phe cln 325 330 335 Lyß oly Trp Lyß Glu Tyr Lyß Mßt Gly Phe ßly ?sn Pro Leu Gly ßlu 340 34S 350 Tyr Trp Leu Gly ?sn ßlu Phe He Ser ßln He Thr ßly ßln Hie ?rg 355 360 365 Tyr Val Leu Lyß Xle ßln Leu Lyß Aßp Trp ßlu Gly Aßn Glu ?la Hiß 370 375 380 Ser Leu Tyr ?ßp Hiß Phe Tyr Xle ?la Gly Glu Glu Ser ?ßn Tyr Aro 385 390 395 400 XI* Hiß Leu Thr ßly Leu Thr Cly Thr Ala Ala Lyß He Ser Ser He 405 410 415 Ser ßln Pro ßly Ser ?ßp Phe Ser Thr Lyß Aßp Ser ?ßp ?ßn ?ßp Lyß 420 42S 430 Cyß He cyß Lyß Cyß Ser Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe ?ßp 435 440 445 ?la Cyß Gly Pro Ser ?ßn Leu ?ßn Gly Oln Phe Tyr Pro Cln Lyß Cln 450 455 460 ?ßn Thr ?ßn Lyß Phe ?ßn Gly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß Gly Ser 465 470 475 4ß0 Cly Tyr ser He Lyß Ala Thr Thr Mßt Met He Arg Pro Ala ?ßp Phe 485 490 95 (2 ) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 16: (1) CARACIERIStiCAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 496 amino áddos (B) UPO: amtnoáddo (C) UPO DE HEBRA: una sola (D ) TOPOLOGÍA: Uneal , j ) TEPODE MOLÉCULA: protdna ( i ) CARACTERÍSTICAS: I (A) NOMBRE/CLAVE: hTL2 (B) LOCAIJZACION: 1...496 (O) OTRAINFORMACIÓN: ligando2 HE-2humano (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16: Met Trp ßln Xle Val Phe Phe Thr Leu Ser Cyß ?sp Ala Val Leu Thr 1 s 10 15 ?la ?la Tyr ?ßn ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Met ?sp Ser Xle ßly Lys Lyß 25 30 ?rg Tyr ?rg Xlß ßln Hiß Oly Sex Cyß ?la Tyr Thr Pha Lßu Leu Pro 40 45 ßlu Met Aßp ?ßn Gly ?rg Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Val Tbr ?an ?la 50 55 60 Val ßln ?rg ?sp ?la Pro Pro Glu Tyr ßlu Aep ser Val ßln Ser Leu 65 70 75 80 ßln Lßu Leu ßlu ?sn Val Met ßlu ?ßn Tyr Thr Ola Trp Leu Met Lyß 85 90 95 Leu ßlu ?ßn Tyr Xle ßln ?sp ?sn Met Lyß Lys ßlu Met ?la Glu ?le 100 105 110 ßln Gln ?ßn ?la Val Oln ?ßn Bis Thr ?la Val Het ? e Olu Xle Oly 115 120 125 Thr Ser Leu Leu Ser ßln Thr ?la ßlu ßln Thr Arg Lys I»eu Thr Asp 130 135 140 Val Olu Thr Gis Val Leu ?ßn ßln Thr Thr ?rg Leu Olu Lßu ßln Leu 145 150 155 160 Lßu ßln Bis Ser Xle Ser Thr Tyr Lys Leu Clu Lyß GLn Xle Leu ?ßp 165 170 17» Gln Thr Ser ßlu Xle ?ßn Lyß He Hiß ?sp Lys ?sn Ser Phe Leu ßlu 180 185 190 Lyß Lys Val Leu ?sp Mßt ßlu ?sp Lys Bis Xla Xle Glu Met ßln Thr 195 200 205 He Lyß ßlu Glu Lyß Aßp Glu Lau Cln Val Leu Val Ser Lyß ßln ?ßn 210 215 220 Ser Xle Xle ßlu Glu Leu ßlu Lyß Lyß Xle Val Thr ?la Thr Val ?ßn 225 230 235 240 ?ßn Ser Val Leu ßln Lyß ßln Cln Hlß ?ßp Leu Met ?ep Thr Val ?ßn 245 250 2SS ?ßn Leu Leu Thr Met Met Sex Thr Ser ?ßn Sex ?l* Lyß ?ßp Ser Thr 260 265 270 Val ?la ?rg ßlu ßlu Gln Xle Ser Phe ?rg ?ap Cyß ?la ?sp Val Phe 275 280 285 Lyß ?la Gly Hlß Thr Lys ?ßn Gly Xls Tyr Thr Lßu Thr Phß Pro ?ßn 290 295 300 Ser Pro ßlu Glu Xle Lyß ?la Tyr Cyß ?ßn Met ?ßp ?la Oly ßly ßly 30S 310 315 320 Gly Trp Thr He Xle Gln ?r? Arg Clu ?sp Gly Ser Leu ?sp Phe Gln 325 330 335 Lyß ßly Trp Lyß Glu Tyr Lyß Val Gly Phe Gly Ser Pro Ser ßly ßlu 340 345 350 Tyr Trp Leu ßly ?ßn Glu Phe Xle Ser ßln Xle Thr ?sn ßln ßln ?rg 355 360 366 Tyr Val Lßu Lya Xle Hiß Leu Lyß Aßp Trp ßlu ßly Aen ßlu ?la Tyr 370 37S 380 Ser Leu Tyr *"p Hlß Pbe Tyr He ser Oly Olu ?lu Leu ?ßn Tyr ?rg 385 390 395 400 He Ble Leu Lye ßly Leu Thr ßly Thr ?la ?la Lyß Xle Ser Ser Xle 405 410 15 Ser ßln Pro ßly ?ßn ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp ßly ?ep ?ßn ?ßp Lyß 420 425 430 Cya Xle Cyß Lyß Cyß Ser Leu Ket Leu Thr ßly Gly Trp Trp Phe ?ßp 435 440 445 ?la Cyß Gly Pro Ser ?ßn Leu ?ßn Cly Met Phe Tyr Pro Oln ?rg ßln 450 455 460 Aßn Thr ?ßn Lyß Phe ?ßn Gly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß ßly Sex 465 470 475 460 ßly Tyr Ser Xle Lyß ?la Thr Thr Mot Met Xle ?rg Pro ?la ?ßp Phe 485 490 495 (2) INFORMACIÓNPARALASECID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DELA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1512 naresbase (B) UPO: áddon?ddco (C) TIPO DEHEBRA: una sola , (0) TOPOLOGÍA: lineal (11) TIPODE MOLÉCULA: DNA (ix) CARACTERÍSTICAS: f ) NOMBRECLAVE: Secnenda decódigo (8) LOCALEZACION: 1...1509 (D) OTRAINFORMACIÓN: {Aj NOMBRE/CLAVE: Bgando-4 TIE (B) LOCALHACION: 1...1S12 (D) OIRÁINFORMACI N: (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17: ATO CTC TCC CAG CT? OCC ATG CTG CAG GGC AßC CTC CTC CTT GTG OTT 48 Met Leu Ser ßln Leu ?la Met Leu Oln Oly Ser Leu Leu Leu Val Val 1 5 10 15 OCC ACC ATC TCT CTß CCT C?? C?G ?C? AGC CAß ß?ß GCG GAT ?CG GßC 96 ?la Thr Met- Ser Val ?la Cln ßln Thr ?rg ßln ßlu ?la ?ßp ?rg ßly 20 25 30 TCC GAG AC? CTT CTA ßTC C?G C?C OßC CAC TCT ?ßC T?C ACC TTC TTC 144 Cyß ßlu Thr Leu Val Val ßln Hiß ßly Hiß Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu 35 40 45 CTC CCC AAG TCT CAG CCC TGC CCT CCC GGG CCT GAO CTC TCC AGC G?C 192 leu Pro Lye Ser ßlu Pro Cyß Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser ?rg ?ap SO 55 60 TCC AAC ACC CTC CAC ?ß? G?? TC? CTG GCC A?C CC? CTC C?C CTG GGG 240 ser ?ßn Thr Leu Gln ?rg ßlu Ser Leu ?la Aßn Pro leu Hiß Leu ßly 65 70 75 80 AAC TTG CCC ACC CAG CAG GTG AAA CAG CTO GAO CAß OCA CTG C?G ?AC 288 Lye Leu Pro Thr ßln Gln val Lyß Gln Leu Olu ßln ?la Lau ßln ?ßn 85 90 95 A?C ACC C?C TGG CTG AAG AAG CTA G?ß AGG GCC ATC AAG ACG ATC TTG 336 Aßn Thr Oln Trp Leu Lyß Lyß Leu ßlu Arg ?la Xle Lyß Thr Ha Leu 100 105 110 AGC TCC AAC CTO GAß CAG GTC CAO CAG CAÁ ?TG CCC CAG ??T C?G ACG 384 Arg Ser Lyß Leu Glu Gln Val ßln ßln Gln Met Ala ßln ?ßn ßln Thr 115 120 125 GCC CCC ATC CTA G?G CTG GGC ACC ACC CTC CTG A?C CAß ACC ACT CCC 432 Ala Pro Met Leu Olu Leu ßly Thr Ser Leu Leu Aßn Gln Tbr Tbr ?la 130 136 140 C?C ATC CGC AAC CTG ACC G?C ATC G?G CCT C?G CTC CTG AAC C?O ACÁ 4B0 Gln He Arg Lyß Leu Thr Aep Het Clu Ala Gln Leu Leu ?ßn ßln Thr 145 150 155 160 TC? AGA ATG GAT OCC CAß ATG CC? C?ß ACC TTT CTG TCC ACC AAC AAC S28 Ser Aro Met Aep Ala ßln Met Pro ßlu Thr Pbe Leu Ser Thr ?sn Lys 165 170 175 CTG O?G AAC C?G CTG CTO CT? C?G AGG C?O ??ß CTC C?ß C?ß CTT C?O 576 Leu Glu ?sn Oln Leu Leu Leu ßln ?rg Oln Lyß Lßu ßln ßln Lßu ?ln 180 185 190 GOC C?? A?C AßC GCG CTC ß?ß ??ß CGß TTß C?ß GCC CTG O?ß ACC ??ß 624 ßly ßln ?ßn Ser ?la Leu ßlu Lyß ?rg Leu ßln ?la leu Glu Thr Lyß 195 20D 205 C?ß C?G G?ß ß?ß CTC OCC ?ßC ?TC CTC ?ßC ??ß ??ß ecß ??ß CTß CTß 672 ßln ßln ßlu ßlu Leu ?la Ser He Leu Ser Lye Lye ?la Lys Leu Leu 210 215 220 ?AC ACO CTß ?ßC CCC C?G ?ßC CCC GCC CTC ?CC A?C ?TC ß?ß CCC GßC 720 ?en Thr Leu Ser ?rg Oln Ser ?la ?la Leu Thr ?ßn Xle Olu ?rg ßly 225 230 235 240 CTO CGC ßßT CTC ?ßß C?C ??C TCC AßC CTC CTß C?O O?C C?ß C?ß C?C 768 leu ?rg Cly Val ?rg Bis ?ßn Ser Ser Leu Leu ßln Asp Gln Oln His 245 250 255 AGC CTG CGC C?G CTG CTG GTß TTG TTG CCG C?C CTG GTß C?? G?? ?GC 816 Ser Leu ?rg Gln Leu Leu Val Leu Leu ?rg Bia leu Val ßln ßlu ?rg 260 265 270 GCT ??C GCC TOG GCC CCG GCC TTC ?T? ?TO OCA ßßT ??ß C?ß OTO TTC 864 ?la ?ßn ?la Ser ?la Pro ?la Phe Xle Met ?la ßly ßlu ßln Val Phe 275 280 285 C?C C?C TOT.GC? G?ß ATC CAO CGC TCT 606 OCC AGT OCC AßT ßßT GTC 912 Oln Aßp Cyß Ala Clu He Gln Arg Ser Gly Ala Ser ?la Ser ßly Val 290 295 300 T?C ACC ?TC C?C CTG TCC ??T GC? ACC A?ß CCC Aßß ??ß OTO TTC TßT 960 Tyr Thr He Gln Val Ser ?ßn ?la Thr Lyß Pro ?rg Lyß Val Phe Cyß 305 310 315 320 G?C CTG CAG AGC AGT ßß? CCC ACG TGG ACC CTC ATC C?ß COC CCT ß?ß 1008 ?ßp Leu Cln Ser ser Gly Gly ?rg Trp Thr Leu He ßln Arg Arg Glu 325 330 335 ??T GGC ACC GTß ??T TTT C?O Cßß A?C TGG AAO GAT T?C ??? CAO GßC 1056 ?ßn ßly Thr Val Aßn Phe Gln ?rg ?ßn Trp Lyß ?ßp Tyr Lyß Gin ßly 340 345 350 TTC GGA GAC CC? GCT ßßß ß?ß C?C TOO CTG OßC ??T G?? GTG GTG C?C 1104 Phe Gly ?ßp Pro ?la ßly Glu Hlß Trp Leu Giy ?ßn Glu Val Val Hiß 355 « 360 365 C?G CTC ?CC AOA ?GC CC? GCC T?C TCT CTG CGT GTG O?G CTß C?? C?C 1152 Gln Leu Thr ?rg ?rg ?la ?la Tyr Ser Leu ?rg Val Glu Leu ßln ?ßp 370 375 360 TGC CAÁ GGC C?C G?G CCC T?T GCC CAG TAC G?? CAT TTC C?C CTß ßßC 1200 Trp Clu ßly His Glu ?la Tyr ?la Gln Tyr Glu Hiß Phe Hlß Lau ßly 385 390 395 400 AOT O?G AAC C?ß CT? T?C ?ßß CTT TCT GTG GTC Gßß T?C ?ßC GGC TC? 1248 Ser Glu ?ßn Gln Leu Tyr ?rg Leu Ser val val ßly Tyr Ser Oly Ser 405 410 41S GCA GOC CGC C?G AGC AßC CTC CTC CTG CAG A?C ACC AßC TTT AGC ACC 1296 ?la ßly Arg ßln Ser Ser Leu val Leu ßln Asa Thr Sex Phe ser Thr 420 425 430 CTT C?C C? C?C ?AC CAC CJ?C TOT CTC TCC A?ß TOT ßCC C?ß CTC ?Tß 1344 Leu ?ep Ser ?sp ?sn ?sp Hiß Cyß -Leu Cyß Lyß Cyß ?la ßln Val Mat 435 440 445 TCT ßß? ßßß TCG TOO TTT G?C ßCC TGT CGC CTG TC? ??C CTC ??C GCC 1392 Ser ßly ßly Trp Trp Phe ?ßp ?la Cyß ßly Leu Sex ?sn Leu ?sa ßly 450 455 460 ßTC T?C T?C C?C CCT CCC C?C ??C ??ß T?C ??G ?Tß ß?C ßßC ?TC CGC 1 40 Val Tyr Tyr Kiß ?la Pro ?ßp ?ßa Lys Tyr Lys -Met ?ßp ßly He ?rg 465 470 475 ABO TCG C?C T?C TTC ??G ßßC CCC ?GC T?C TC? CTß COT OCC TCT COC ?Tß 1488 Trp Ble Tyr Phe Lyß ßly Pro ser Tyr Ser Leu ?rg ?la Ser ?rg Met 485 490 495 ?TG ?T? Cßß CCT TTC G?C ?TC TAA 1512 Met Xlß ?rg Pro Leu ?ßp Xle 500 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 18: { ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCL4: (?) LONGITUD: 503 amino áddos (B) TIPO: amino áddo (C) UPO DE HEBRA una sola (0) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: protdna ( v ) UPO DE FRAGMENTO: interno ( ix) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVE: Bgando-4 TTE (B) LOCALIZACION: 1...503 (O) OIRÁ INFORMACI N: I (Xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18: Met Leu Ser ßln Leu ?la Met Leu Gln Gly Ser leu Leu Leu Val Val 1 5 10 15 ?la Thr Met Ser val ?la Gln Gln Thr Arg Oln ßlu Ale ?ßp ?rg ßly 20 25 3o Cyß Clu Thr Leu Val Val Gln Hiß Gly Hlß Cyß Sex Tyr Tbr Phe Leu 35 40 45 Leu Pro Lyß Ser Gl? Pro Cyß Pro Pro Cly Pro Glu Val Ser ?rg Aßp 50 55 60 Ser ?an Thr Leu Gln ?rg Glu Ser Leu ?la ?ßn Pro Lßu Hiß Lßu ßiy 65 70 75 80 Ly* Leu Pro Thr Cln Gln Val- Ly* Gln Leu Clu ßln ?la Leu ßln ?an 85 90 95 ?an Thr ßln Trp Leu Lyß Lyß Leu Glu ?rg Ala Xle Lyß Thr He Leu 100 105 110 ?rg Ser Lyß Leu Glu Oln Val Gln Cln Gln Mat ?la Gln ?ßn Qin Thr 115 120 125 ?la Pro Met leu ßlu Leu Gly Thr Ser Leu Leu ?an ßln Thr Thr ?la 130 13S 0 Gln He Arg Lyß Leu Thr ?ßp Het Clu Ala Oln Leu Leu Aßn ßln Thr 145 150 155 10 Ser ?rg Met Asp Ala Gln Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Aßn Lyß 165 170 175 Leu Glu ?ßn ßln Leu Leu Leu Gln ?rg Gln Lyß Leu ßln Gln Leu Gln 180 IBS 190 ly Oln ?sn ser ?la Leu ßlu Lyß ?rg Leu ßln Ala Lßu ßlu Thr Lye Lßu ßly 240 Hiß ?rg Phe val. Cyß 320 ßlu ßly Bis ?ßp ßly 400 Ser Thr Met ßly ?rg 480 Met (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCLA. (?) LONGITUD: 1497 pares base ( B ) UPO: áddo núddco (C) ITPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: lineal ( 11) TIPO DE MOLÉCULA DNA ( tx ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVE: Secuenda de Códigos (B) LOCALIZACION: 1...1494 (0) OTRA INFORMACIÓN: {A) NOMBRE CLAVE: (quimera 1) 1N1C2F (B ) LOCAIIZACION: 1...1497 ( 0 ) OTRA INFORMACIÓN: (?) NOMBRE CLAVE: otro (B) LOCALIZACION: 1...60 ( 0 ) OTRA INFORMACI N: La tecuán.- Iider putativa e» codificada por los nudeotidos (xi) DESCRIPCIÓNDE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19: ?TG ACÁ GTT TTC CTT TCC TTT ßCT TTC CTC ßCT CCC ATT CTß ?CT CAC 48 Met Thr Val Phe Leu Ser Pbe ?la Phe Leu ?la ?la Xle Leu Thr Biß 5 10 IB ?T? GGG TGC ?ßC ??T C?ß CGC CCA AßT CC? ß?? ??C ?CT ßßß ?ß? ?ß? 96 He ßly Cyß Ser ?sn Gln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn Ser ßly ?rg ?rg 20 25 30 TAT A?C CGß ?TT C?? C?T Cßß C?? TOT GCC T?C ?CT TTC ?TT CTT CC? 144 Tvr ?sn ?rg Xle Oln Hls ßly ßln Cyß ?la Tyr Thr Phe He leu Pro 35 40 45 C?? CAC O?T ßßC AAC TGT COT GAG AGT ACß ACÁ G?C C?ß T?C ??C ACÁ 192 Clu His ?ßp Gly ?ßn Cyß ?rg Glu Ser Thr Thr ?ßp Oln Tyr ?ßn Thr 50 55 60 A?C OCT CTC C?ß ??? CAT GCT CC? C?C CTß ß?? CCß CAT TTC TCT TCC 240 ?sn ?la Leu ßln ?rg ?sp ?la Pro Hiß Val Olu Pro ?ßp he Ser Ser 65 70 75 60 CAO ??? CTT C?? C?T CTG ß?? C?T CTß ?TG ß?? ??T T?T ?CT CAß TCG 288 Gln Ly* Leu ßln Ble Leu ßlu Biß Val Ket ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Trp 85 90 95 CTC C?? ??? CTT G?C ??T T?C ?TT GTG G?? ?AC ?Tß ??ß TCG O?G ?TG 336 Leu ßln Lyß Leu Glu ?ßn Tyr Xle Val ßlu ?an Ket Lys Ser Glu Met 100 105 110 CCC C?G ?T? C?ß C?ß ??T GCA GTT C?G AAC CAC ACG GCT ?CC ?TG CTG 384 ?la Gln Xle ßln ßln ?an ?la Val ßln ?sn Hls Thr ?la Thr Mßt Leu 115 120 125 CAC ATA GGA ACC ?ßC CTC CTC TCT C?ß ACT GC? G?G C?G ?CC ?ß? ??G 432 Glu Xle Oly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr ?la Glu ßln Thr ?rg Lyß 130 135 140 CTC ACÁ ß?T GTT GAG ?CC C?G GTA CTA A?T C?? ?CT TCT CCA CTT G?G 480 Leu Thr ?ßp Val ßlu Thr Gln Val Leu ?ßn Gln Thr Ser ?rg Leu Glu 145 150 155 160 ?TA CAG CTG CTG GAO A?T TCA TT? TCC ACC TAC ??G CT? G?ß AAO CAÁ 528 He Gln Leu Leu ßlu ?ßn Ser Leu ser Tbr Tyr Lyß Leu ßlu Lyß ßln 165 170 175 CTT CTT C?? C?ß ACÁ ??T ß?? ATC TTG AAO ATC C?T C?? ??? AAC AßT 576 Leu Leu ßln ßln Thr ?ßn ßlu Xle Leu Lyß He Biß ßlu Lyß ?sn Ser 160 185 190 TT? TTA ß?? CAT AAA ATC TTA CAÁ ATG CAÁ OCA AAA CAC ??G G?? G?G 624 Leu Leu Glu Hiß Lyß He Leu Glu Ket Glu Gly Lyß Hiß Lyß Glu ßlu 195 200 205 TTG G?C ?CC TT? ??ß G?? G?G AAA GAG A?C CTT C?? ßßC TTß ßTT ?CT 672 Leu ?ßp Thr leu Lyß Glu olu Lyß olu ?ßn Leu Oln Gly Leu val Thr 210 215 220 CCT C?? ACÁ T?T ?TA ATC CAC CAG CTß GAA AAG CAÁ TTA AAC AOA GCT 720 Arg Cln Thr Tyr Xle He ßln Glu Leu Glu Lyß Gln Leu Aßn Arg Ala 225 230 235 240 ACC ACC AAC A?C ACT GTC CTT CAG AAG CAß C?? CTC ß?ß CTG ?Tß GAC 768 Thr Thr ?sn ?ßn Ser Val Lßu Gln Lyß ßln Oln Leu ßlu Leu Met ?ßp 245 250 2S5 ACÁ CTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA OßT GTT TTA CT? 816 Thr Val Hiß ?sn Leu Val ?ßn Leu Cyß Thr Lys ßlu ßly Val Leu Leu 260 265 270 ??ß ßß? ßß? ??? ?ß? ß?ß ß?? ß?C ??? CC? TTT ?ß? C?C TOT ßCT ß?? 864 Lys ßly ßly Lyß ?rg ßlu ßlu ßlu Lyß Pro Phß ?rg ?ßp Cyß ?la ßlu 275 280 285 OTA TTC ??? TC? OCA C?C ?CC ?C? ??T GGC ?TC T?C ?CO TT? AC? TTC 912 Val Phß Lyß Sex ßly Hlß Thr Thr ?ßn ßly Xle Tyr Thr leu Thr Phe 290 295 300 CCT ??T TCT ?C? GAA C?C ATC ??C OCC TAC TßT ß?C ?TC ß?? CCT ßß? 960 pro Aßn Ser Thr Olu ßlu Xle Lyß Ala Tyr Cys ?ßp Met ßlu ?la ßly 305 310 315 320 Gß? OGC CGG TGG ?C? ?TT ?TT C?G CGA COT ß?ß GAT GGC ?GC GTT GAT 1008 Gly Gly ßly Trp Thr Xle Xle ßln ?rg ?rg ßlu ?ep ßly Ser Val ?sp 325 330 335 TTT C?G ACÓ ACT Tßß ??? ß?? T?T A?? CTß ßß? TTT ßßT ?AC CCT TC? 10S6 Pbe Oln Arg Thr Trp Lys ßlu Tyr Lyß Val ßly Phe ßly Aßn Pro Ser 340 345 350 Gß? ß?? T?T Tßß CTC Gß? ??T G?C TTT ßTT TCC C?? CTß ?CT ??T CAG 1104 Gly ßlu Tyr Trp Leu Cly ?ßn Glu Phe Val Ser ßln Leu Thr ?ßn ßln 355 360 365 C?? CGC T?T GTC CTT AAA ?T? C?C CTT ??? ß?C Tßß ßAA 066 ??T GAO 1152 Gln ?rg Tyr Val Lßu Lys Xlß Hiß Leu Lyß ?ßp Trp ßlu ßly ?ßn ßlu 370 375 380 OCT T?C TCA TTG T?T G?? C?T TTC T?T CTC TC? AGT G?? O?? CTC ??T 1200 ?la Tyr Sex Leu Tyr Clu His Phe Tyr Leu Ser Ser ßlu Clu Leu Asn 385 390 39S 400 T?T ?GC ATT' CAC CTT ??? Gß? CTT ACÁ ßßß ACÁ CCC GGC A?? ?T? ?OC 1246 Tyr ?rg Xlß Hiß Leu Lyß Giy Leu Thr Gly Thr ?la Oly Lyß He Ser 405 410 415 ACC ATC ACC CAÁ CCA ßß? ??T GAT TTT AGC ACÁ ??ß GAT OCA QAC AAC 1296 Ser He Ser Gln Pro Gly ?ßn ?ßp Phe ser Thr Lys ?sp Gly Aßp ?*n 420 425 430 C?C AAA TCT ATT TCC ??? TGT TC? CAÁ ATC CTA AC? CCA GßC TGG TCC 1344 Aßp Lys Cyß Xle Cyß Lyß Cyß Ser ßln Ket Leu Thr Gly Gly Trp Trp 435 440 445 TTT C?T CCA TfT GGT CCT TCC AAC TTG AAC Gß? ?TG T?C T?T CCA C?G 1392 Phe ?ßp ?la Cyß Gly Pro ser Aßn leu ?ßn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln 450 455 460 ?ßO C?O AAC ACÁ ??T ?AC TTC A?C OCC ATT A?? Tßß T?C T?C TCG ??? 1440 ?rg Gln ?ßn Thr ?ßn Lyß Phe ?ßn Gly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß 465 470 475 480 GGC TC? GGC T?T TCG CTC AAG GCC ACÁ ACC ATG ATO ATC CGA CC? OCA 1488 Gly Ser Gly Tyr ser Leu Lyß Ala Thr Thr Met Met He ?rg Pro ?la 485 490 9S ?ßp Phe (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 20: (1) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 498 ambo áddos (B) TIPO: arrdno áddo ¡ (C) UPODE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: Hneal (11) UPO DE MOLÉCULA: proteina (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRECLAVE: (quimera 1) 1N1C2F (B) LOCALEACION: 1-.498 (O} OTRAINFORMACIÓN: (Xl) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20: Het Thr Val Phe Leu Ser Phe ?la Pbe Lßu ?la ?la Xle Leu Thr Biß 1 5 10 15 Xle Gly Cyß Ser ?ßn Oln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn Ser ßly ?rg Arg 25 30 Tyr ?ßn ?rg Xle ßln Hlß ßly ßln Cyß ?la Tyr Thr Phe Xle Leu Pro 40 45 ßlu Ble ?ßp ßly ?sn Cys Arg Olu Ser Thr Thr Asp oln Tyr Aßn Thr 50 55 60 ?ßn ?la Leu Oln ?rg ?ap ?la Pro Ble Val ßlu ro ?ßp Phe Ser Ser 65 70 75 80 ßln Lyß Leu ßln Biß Leu ßl? Biß Val Met ßlu ?ßn Tyr Thr ßln Trp 85 90 95 Lßu ßln Lye Leu ßlu ?an Tyr Xle val ßlu ?an Met Lyß ser ßlu Met 100 105 110 ?la Oln Xle ßln ßln ?ßn ?la Val ßln ?sn Hiß Thr ?la Thr Met Leu 115 120 125 ßlu ?le ßly Thr Ser Leu Leu 8ex ßln Tbr ?la ßlu Gln Thr ?rg Lyß 130 135 140 Leu Thr ?ßp Val ßlu Thr ßln Val Leu ?ßn ßln Thr Ser ?rg Leu ßlu 145 150 155 160 He Cln Leu Leu Glu ?sn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu Glu Lyß Gln 165 170 175 Leu Leu Gln ßln Thr ?sn ßlu Xle Leu Lyß He Hiß ßlu Lys ?ßn Ser 180 185 190 Leu Leu ßlu Biß Lyß 11» Leu ßlu Met ßlu ßly Lyß Biß Lyß ßlu ßlu 195 200 205 Leu ?ßp Tbr Leu Lye olu ßlu Lye ßlu ?ßn leu ßln ßly Leu Val Thr 210 215 . 220 ?rg ßln Thr Tyr He Xle ßln ßlu Leu ßlu Lyß ßln Leu ?ßn ?rg ?la 225 230 235 240 Thr Tbr ?ßn ?ßn Ser Val Lßu Gln Lyß Cln Gln Leu ßlu Leu Het ?ßp 245 250 255 Thr Val Hlß ?ßn Leu Val ?ßn Leu Cyß Thr Lyß ßlu ßly Val Leu Leu 260 265 270 Lyß Cly Cly Lys ?rg Clu Glu Glu Lys Pro Phe ?rg ?ßp Cyß ?la Glu 275 280 285 Val Phe Lyß Ser Gly Hiß Thr Thr ?ßn ßly He Tyr Thr Leu Thr Phe 290 295 300 Pro ?ßn Ser Thr ßlu Glu He Lyß ?la Tyr Cyß ?ßp Met Glu ?la Gly 305 310 315 320 Gly ßly ßly Trp Thr Xle Xle ßln Arg ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Val ?ep 325 330 335 Phe ßln ?rg Thr Trp Lyß ßlu Tyr Lyß Val ßly Phe ßly ?ßn Pro Ser 340 345 3S0 Gly Clu Tyr Trp Leu Gly ?ßn clu Phe Val ser Gln Leu Thr ?ßn ßln 355 360 365 ßln ?rg Tyr Vel Leu Lye He Hiß Leu Lyß ?ep Trp ßlu ßly ?ßn ßlu 370 375 380 Ala Tyr ser Leu Tyr Clu Kiß Phe Tyr Leu Ser ser Glu Glu Leu ?ßn 385 390 395 400 Tyr ?rg Xle Hiß Leu Lyß Cly Leu Thr Oly Thr ?la Gly Lyß Xle ser 405 410 41S Ser Xle Ser Oln Pro ßly Aßn ?ßp Phe ser Thr Lyß Asp Oly ?ßp ?sn 420 425 430 Aßp Lyß Oye Xlß Cyß Lye Oye Ser ßln Met Leu Thr ßly ßly Trp Tsp 435 440 446 Pbe ?ßp ?la Cys ßly Pro Ser ?sn Leu ?sn ßly Mßt Tyr Tyr Pro ßln 450 455 460 ?rg Oln ?sn Thr ?sn Lys Phe ?ßn ßly Xle Lyß Trp Tyr Tyr Trp Lyß 465 470 475 480 ßly ßßr ?ly Tyr Ser Leu Lyß ?la Thr Tbr- Mßt Mßt ?lß ?rg Pro ?la 485 490 495 (2) INFORMACIÓNPARALASEC ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 1491 pares base (B) UPO: áddo n?ddco ( C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA lineal ( ii ) UPO DE MOLÉCULA: DNA (ix ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de c digos (8) LOCALJZACION: 1...1488 (0) OTRA TNFORMACTON: (?) NOMBRE/CLAVE: (quimera 2) 2N2C1F (B) LOCALJZACION: 1...1491 ¡ (O) OTRA INFORMACIÓN: (Aj NOMBRE/CLAVE: otro (B) LOCALJZACION: Í..AS ( D ) OTRA INFORMACIÓN: La seanenda Hder putativa esta codificada por los nudeotldos 1-48 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21: ?TC TGG C?ß ?TT ßTT TTC TTT ?CT CTO ?GC TßT G?T CTT 6TC TTß 6CC 46 Met Trp ßln Xle Val Pha Phe Thr Leu Ser Cyß ?ßp Leu Val Leu ?la 1 5 10 15 GC? OCC T?T ??C AAC TTT CGG A?ß ?ßC ?Tß GAC AGC ?TA Gß? ??G ??G 96 ?la ?la Tyr ?#n ?an Phe ?rg Lyß Ser Met ?ßp Ser Xle Cly Lyß Lyß 20 25 30 CAÁ TAT C?ß GTC C?G C?T COC TCC TGC ?GC T?C ACT TTC CTC CTG CC? 144 ßln Tyr Gln Val ßln Hlß ßly Ser Cyß ex Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 GAC ATG GAC A?C TOC COC TCT TCC TCC AOC CCC T?C GTO TCC A?T OCT 192 Olu Ket ?ßp ?ßn Cyß ?rg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Aßn ?la 50 55 60 CTC C?C ?GG GAC GCG CCC CTC CAÁ TAC G?T G?C TCG GTT CAG A6T CTG 240 Val Gln ?rg ?sp ?la Pro Leu Clu Tyr ?ßp ?ßp Ser Val Gln ?rg Leu 65 70 75 80 CAÁ GTG CTG G?ß AAC ?TC ?Tß GAA AAC A?C ACT C?G TGG CT? ATO AAC 288 Gln Val Leu ßlu ?ßn Xle Met Glu Aßn Aßn Thr Cln Trp Leu Het Lye 85 90 95 CTT CAG ??T TAT ATC C?G G?C AAC ATG AAO AAA OA? ATO OTA G?C AT? 336 leu ßlu ?sn Tyr Xlß ßln ?ßp ?sn Mßt Lyß Lyß Olu Mßt Val ßlu Xlß 100 IOS 110 CAO C?ß ??T ßC? 6T? C?ß' ??C C?ß ?CT CCT OTO ?Tß ?T? ß?? ATA ß?ß 384 . ßln ßln ?sn ?la Val Oln ?ßn ßln Thr ?la Val Mßt Xlß ßlu Xlß ?ly 115 120 125 ACÁ AAC CTG TTß ??C C?? ?CA CCT C?ß C?? ACß COO AAG TT? ?CT OAT 432 Thr ?ßn Leu Leu ?ßn ßln Thr ?la ßlu Gln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?ßp 130 135 140 CTO ß?? CCC C?? ßTA TT? ??T C?C ?CC ?Cß ?ß? CTT ß?? CTT CAß CTC 480 Val ßlu ?la ßln Val Leu Aßn ßln Thr Thr ?rg Lßu ßlu leu ßln (eu 145 150 155 160 TTO ß?? C?C TCC CTC TCC ACÁ ??C ??? TTG ß?? AAA C?O ?TT TTO G?C 528 Lßu Clu Hiß Ser Leu Ser Thr ?sn Lys Leu Olu Lyß Ola Xle Leu ?ßp 165 170 175 CAO ?CC ?ßT ß?? ?T? AAC ??? TTß CAÁ G?T ??G A?C ?ßT TTC CT? ß?? 576 ßln Tbr ser ßlu Xle ?ßn Lyß Leu ßln ?sp Lys ?ßn Ser Phe Leu ßlu 180 185 190 ??G ??G ßTß CT? CCT ?Tß ß?? G?C ??ß C?C ?TC ?TC C?? CT? C?O TC? 624 .

Lyß Lyß Val Lßu ?la Mßt Clu ?ßp Lyß Hiß Xlß Xle ßln Lau ßln Ser 195 200 205 AT? ??? ß?? GAG ??? O?T C?ß CT? C?ß ßTß TT? ßT? TCC ??ß C?? ??T 672 Xle Lyß ßlu ßlu Lyß ?ßp ßln Leu ?ln Val Leu Val Ser Lyß ßln ?ßn 210 215 220 TCC ?TC ?TT C?? ß?? CT? ß?? ??? ??? ?T? GTG ACT GCC ACß 6T6 ??T 720 Ser Xle Xle ßlu ßlu Leu Glu Lyß Lyß Xle Val Thr ?la Thr Val ?ßn 225 230 235 240 ??T TC? GTT CTT CAÁ AAC C?C C?? C?T GAT CTC ?Tß ß?ß ?C? ßTT ??T 768 Aßn Ser Val Leu Gln Lyß Gln oln Hiß Aßp Leu Mßt Olu Thr Val ?sn 245 250 255 AAC TTA CTß ACT ATG ATG TCC ACÁ TCA A?C TC? OCT AAG OAC CCC ACT 816 Aßn Leu Leu Thr Met Het Ser Thr Ser ?ßn Ser ?la Lyß ?ßp Pro Thr 260 265 270 GTT CCT AAA CAÁ GAA C?? ?TC ?ßC TTC ?ß? GAC TCT OCA ßAT ßT? T?T 864 -Val ?la Lyß ßlu ßlu ßln He Ser Phe ?rg Aßp Cyß ?la ?ßp Val Tyr 275 280 285 CAÁ CCT GCT TTT ??T ??? ?CT Gß? ?TC T?C ACT ?TT T?T ?TT ??T A?T 912 Cln Al* Gly Phe ?ßn Lyß Ser ßly Xle Tyr Thr Xle Tyr Xle Aßn ?ßn 290 295 300 ?TG CC? GAA CCC AAA ??G GTG TTT TGC ??T ?TG O?T TTC ??T OCO OCA 960 Het Pro Clu Pro Lyß Lya Val Phe Cy* Aßn Met ?ap Val ?ßn Cly ßly 305 310 315 320 OßT TOG ACT OTA ATA C?? C?T CGT C?A G?T ßß? ?ßT CT? OAT TTC C?? 1008 Gly Trp Thr Val He ßln Hiß Arg Glu Aßp Gly Ser Leu ?ßp Phß ßln 325 330 335 ACÁ GCC TOG A?ß ß?? T?T AAA ATO ßßT TTT OGA A?T CCC TCC GGT G?? 1056 ?rg Gly Trp Lyß Glu Tyr Lyß Met Gly Phe Gly ?ßn Pro Ser ßly Glu 340 345 3S0 T?T TGG CTG OGG ??T GAG TTT ATT TTT CCC ATT ACC AGT C?ß ?ßß C?ß 1104 Tyr Trp Leu Gly Aßn ßlu Phe He Pne ?la Xle Tbr Ser ßln ?rg ßin 355 360 365 T?C ?Tß CT? ?ß? ?TT ß?ß TT? ATO O?C Tßß ß?? ?ßß A?C CC? CCC TAT 1152 Tyr Met Leu ?rg Xle Glu Leu Met ?ep Trp ßlu ßly ?ßn ?rg ?la Tyr 370 375 380 TCA CAß T?T C?C ?ß? TTC C?C ?T? Cß? ??T ß?? ??ß C?? ?AC T?T ?GC 1200 Ser ßln Tyr ?ßp ?rg Pbe Bis He ßly Aßn ßlu Lyß ßln Asn Tyr Arg 385 390 395 400 TTG T?T TT? ??? ßßT C?C ?CT GCG ?C? OCA ßß? ??? C?ß ?ßC AßC CTß 1248 Leu Tyr Leu Lye ßly Biß Tbr ßly Thr ?la ßly Lyß ßln Ser Sex Leu 405 410 416 ?TC TT? C?C ßßT GCT ß?T TTC ?ßC ACT A?? ß?T CCT ß?T ??T ß?C ?AC 1296 Xle Leu Biß Gly ?la ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp ?la ?ßp ?ßn ?ßp ?ßn 420 425 430 TGT ?TO TGC ??? TCT OCC CTC ATG TT? AC? ßß? ßß? TOß TOO TTT ß?T 1344 Cyß Met Cye Lyß Cyß ?la leu Met Leu Thr ßly ßly Trp Trp Phe ?ßp 435 440 445 GCT TGT OTC CCC TCC ??T CT? ??T CCA ?Tß TTC T?T ?CT ßCG ßß? C?? 1392 ?la Cyß ßly Pro ser ?ßn Leu ?ßn Oly Met Phß Tyr Thr ?la ßly ßln 450 4S5 460 AAC C?T ßß? ??? CTß ??T ßßß ?T? ??G TOG C?C T?C TTC ??? CGC CCC 1440 ?sn Biß ßly Lyß Leu ?ßn Cly Xle Lyß Trp Biß Tyr Phe Lyß ßly Pro 465 470 475 480 ?ßT T?C TCC TT? CCT TCC ACÁ ACT ?TC ?TG ?TT OG? CCT TT? ß?T TTT T 1489 Ser Tyr ser Lßu ?rg Ser Thr Thr Met Met He ?rg Pro Leu ?ßp Phe 485 490 495 CA 1491 ( 2J INFORMACIÓN PARA LA SEC JD NO: 22: ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 496 amin» áddos (B) UPO: amino ácido (C) UPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) UPO DE MOLÉCULA: proteina ( ) ppo DE FRAGMENTO: interno ( 1* ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: /quimera 2) 2N2C1F (B) LOCAJ IZACION: 1...496 <D > OTRA INFORMACIÓN: (Xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: : SEC ID NO: 22?¡ Ket Trp Cln ?lß Val Phe Phe Thr Leu Ser Cye Aep Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala ?la Tyr ?ßn ?ßn Phe ?rg Lyß Ser Met ?ßp Ser Xle Gly Lyß Lyß 20 25 30 ßln Tyr Gln Val ßln Hiß ßly ser Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met ?ßp ?ßn Cyß ?rg ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Aßn Al* 50 55 60 Val Gln ?rg ?ßp ?la Pro Leu Clu Tyr Aßp Aßp Ser Val Cln Arg Leu 65 70 75 80 Cln Val Leu ßlu Aßn He Met ßlu Aßn Aßn Thr Oln Trp Leu Met Lyß 85 90 95 Leu Clu ?en Tyr Xle Gln Aßp Aßn Met Lyß Lyß Glu Met Val Glu He 100 IOS 110 ?ln ßln ?sn ?la Val ßln ?an ßln Thr ?la Val Met Xlß ßlu Xle ßly 115 120 12S Thr ?an Leu Leu ?sn Oln Tbr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß Lau Thr ?ßp 130 135 140 Val ßlu ?la ßln Val Leu ?ßn ßln Tbr Thr ?rg Lßu ßlu Leu Oln Leu 145 160 155 160 Leu ßlu Hiß Ser Lßu Ser Tbr ?sn Lyß Leu ?lu Lyß Cln Xlß Lßu ?ßp 165 170 175 ßln Thr Sex ßlu He ?ßn Lyß Leu ßln Aep Lye Aßn Ser Pbe Lßu ßlu 180 185 190 Lyß Lyß Val Lßu ?la Met Olu ?sp Lya Hiß Xle Xlß ßla Leu ßln Ser 195 200 206 Xle Lyß ßlu ßlu Lyß ?ßp ßln Leu ßln Val Lßu Val Ser Lys ßln ?ßn 210 215 220 ser Xle Xlß ßlu ßlu Leu ßlu Lyß Lys Xle Val Thr ?la Thr val ?sn 225 230 236 240 ?ßn Ser Val Leu Gln Lys Cln Gln Bis ?ßp Lßu Het Glu Thr Val ?ßn 245 250 286 ?ßn Lßu Lßu Thr Met Met Ser Thr ser ?ßn Ser ?la Lys ?sp Pro Thr 260 365 270 Val ?la Lys ßlu ßlu ßln xlß Ser Phß ?rg ?ßp Cys ?la ?sp Val Tyr 275 260 • 285 Cln ?la ßly Phe ?en Lyß Sex ßly xlß Tyr Thr He Tyr Xlß ?ßn Asn 290 295 300 Met Pro Glu Pro Lyß Lyß Val Phß Cyß ?ßn Mßt ?ßp Val ?sn Oly ßly 305 310 315 320 ßly Trp Thr Val Xlß ßln Hie ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Lßu ?ßp Pbe Oln 325 330 335 ?rg oly Trp Lys ßlu Tyr Lys Met ßly Phe Gly ?ßn Pro Ser ßly ßlu 340 345 350 Tyr Trp Leu Oly ?sn ßlu Phe ?le Phß ?la Xle Thr Ser ßln Arg ßln 355 360 365 Tyr Met Leu ?rg ?le ßlu Leu Met ?sp Trp ßlu ?ly ?sn ?rg ?la Tyr 370 375 380 Sar ßln Tyr ?sp ?rg Phß Biß Xle ßly ?ßn ßlu Lyß ßln ?sn Tyr ?rg 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Lyß Gly Hiß Thr ßly Thr ?la ßly Lyß ßln ser Ser Leu 405 410 415 Xle Leu Biß Gly ?la ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp ?la ?ßp ?ßn ?sp Aßn 420 425 430 Cyß Met Cyß Lys Cyß ?la Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe ?ßp 435 440 445 ?l* Cyß Oly Pro Ser ?ßn Leu ?ßn Gly Met Phe Tyr Thr ?l* Gly ßln 450 455 460 Aßn Hiß Gly Lya Lau Aßn Oly He Lys Trp Hls Tyr Phß Lye Oly Pro 465 470 475 480 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Xle Arg Pro leu ?ep Phe 485 490 495 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC ID NO: 23: ( i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 1500 pares base (B) UPO: áddo n?ddco (C) UPO DE HEBRA: solo una (0) TOPOLOGÍA: lineal ( il) UPO DE MOLÉCULA: DNA ( IX ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de código (B) LOCALEACION: 1...1497 (0 ) OIRÁ INFORMACI N: (A) NOMBRE/CLAVE: (quimer 3; 1N2C2F (B) LOCAHZAdON: 1...15O0 O) OTRA INFORMACIÓN: (?) NOMBRE/CLAVE: otro (B) LOCALJZACION: 1...60 (0) OTRA INFORMACIÓN: La lecaenda líder putativa esta codificada por los nudeotidos 1-60 (xi) DESCRIPCIÓNDELA SECUENCIA SEC ID NO: 23: ?Tß AC? GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC ßCT GCC ?TT CTO ?CT C?C 48 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe ?la Phe leu ?la ?la Xle Leu Thr Hie 5 10 15 ?T? 660 TOC ?GC ??T C?O CCC Cß? ACT CC? O?? AAC ?ßT GGO ?ß? ?ß? 96 He Gly Cyß Ser ?ßn Gln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn Ser ßly ?rg ?rg 20 25 30 T?T AAC CGG ATT C?A CAT Gßß CAÁ TGT OCC TAC ?CT TTC ?TT CTT CC? 144 Tyr ?en ?rg Xle ßln Ble ßly ßln Cyß ?la Tyr Thr Phß Xlß Leu Pro 35 40 45 CAÁ CAC ßAT GCC ??C TGT C6T ??ß AßT ACß AC? ß?C C?ß T?C ??C ?CA 192 ßlu Ble ?ßp ßly ?ßn Cyß ?rg Glu Ser Tbr Tbr ?sp Gln Tyr ?sn Thr 50 55 60 AAC OCT CTß CAC ?ß? ß?T CCT CC? C?C CTß ßAA CCß ßAT ß?C TCC ßTG 240 ?sn ?la Leu Gln ?rg ?ßp ?la Pro Biß Val Glu Pro ?ßp ?ap. Ser Val 65 70 75 80 C?G ?GG CTG CAÁ GTC CTG G?G ?AC ATC ?TG C?A AAC ?AC ACT CG TOG 288 Oln ?rg Leu Oln Val Lßu ßlu Aßn Xle Het ßlu ?ßn ?sn Thr ßln Trp 85 90 95 CT? ?TC ??G CTT ß?G ??T T?T ?TC C?G G?C AAC ?TC ??ß A?? ß?? ?TG 336 Leu Het Lys 'Leu ßlu ?ßn Tyr Xle Gln ?ßp ?ßn Met Lyß Lye ßlu Met 100 105 110 GTA GAO AT? C?C C?G ??T GC? OTA C?ß ?AC C?ß ?CG OCT OTO ?TO ?T? 384 Val Clu He Gln Gln Aßn ?la Val Cln ?sn ßln Thr ?la Val Mßt Xle 115 120 125 G?? ATA CGG ACÁ AAC CTG TTG A?C C?? ACÁ GCT GAG C?? ?Cß Cßß ??ß 432 ßlu He Gly Thr Aßn Leu Leu Aßn Gln Thr Ala Glu ßln Thr ?rg Lyß 130 135 140 TT? ACT OAT ßTß ß?? GCC C?? CT? TT? ??T C?G ?CC ACC ?ß? CTT C?? 480 Leu Thr Aep Val ßlu ?la Gln Val Leu ?ßn Gln Thr Thr ?rg Leu ßlu 145 150 155 160 CTT C?G CTC TTO OA? C?C TCC CTC TCC ACÁ A?C ??? TTß ß?? ??? C?ß 528 Leu Cln Leu Leu Clu Ble Ser Leu Ser Thr ?ßn Lyß Leu ßlu Lyß ßln 165 170 175 ?TT TTG G?C C?ß ACC AßT G?A ATA AAC AAA TTß CA? ß?T ??ß ?AC ?ßT 576 He Leu ?ßp ßln Thr Ser Glu He Aßn Lyß Leu Gln ?ßp Lyß ?ßn Ser 180 185 190 TTC CT? C?A AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA G?C A?ß C?C ?TC ?TC C?? 624 Phe Leu Clu Lyß Lyß val Leu Ala Met Olu Aßp Lyß Hiß He He Oln 195 200 205 CTA C?C TCA AT? AAA GAA GAG AAA GAT C?G CT? C?G OTO TT? GT? TCC 672 Leu Gln Ser Xle Lyß Olu Glu Lyß ?ßp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser 210 215 220 A?C CA? A?T TCC ?TC ?TT G?A GAA CT? GAA AAA A?? ?T? GTC ACT OCC 720 Lyß Gln ?en Ser Xlß Xle ßlu ßlu Leu ßlu Lye Lyß Xlß Val Thr ?la 225 230 235 240 ?Cß OTG ??T ??T TC? OTT CTT C?? ??ß CAß C?? C?T ß?T CTC ATO ??ß 768 Thr Val ?ßn ?ßn Ser val Lßu ßln Lyß ßln ?ln Hiß ?ßp Leu Mßt ßlu 245 2S0 255 ACÁ GTT ??T ?AC TT? CTß ?CT ?TC ?Tß TOC ?C? TC? ??C TC? ßCT ??ß 816 Thr Val ?ßn ?ßn Leu Leu Thr Mßt Mßt Ser Thr Ser ?ßn Ser ?le Lya 260 265 270 C?C CCC ACT CTT CCT ??? ??? ß?? C?? ?TC ?ßC TTC ?ß? G?C TOT OCT 864 ?ßp Pro Tbr Val ?la Lyß Glu Glu Cln Xle Ser Phe ?rg ?ßp Cys ?la * 275 280 28S CAÁ OTA TTC ??? TC? ßß? C?C ACC ACÁ A?T GOC ?TC T?C ?CO TT? ?CA 912 ßlu Val Phe Lys Ser Gly Hiß Thr Tbr ?ßn ßly Xle Tyr Thr Leu Thr 290 295 300 TTC CCT ??T TCT AC? G?? O?ß ?TC A?ß GCC TAC TGT ß?C ?Tß G?? GCT 960 Phe Pro ?ßn Ser Thr ßlu ßlu xle Lyß ?la Tyr Cyß ?ep Met ßlu ?la 305 310 31S 320 GßA ßß? ßßC GßG TGC ?C? ?TT ?TT C?G CG? COT ß?ß ß?T ßßC ?ßC ßTT 1008 Oly ßly ßly ßly Trp Thr Xle Xle ?ln ?rg ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Val 325 330 335 ß?T TTT C?ß ?ßß ?CT Tßß ??? ß?? T?T ??? ßTß ßß? TTT GßT ??C CCT 1056 ?ep Pbe ßln ?rg Thr Trp Lyß ßlu Tyr Lys Val ßly Phß ßly ?ßn Pro 340 345 350 TC? Gß? ß?? T?T Tßß CTß ßß? ??T ß?ß TTT ßTT TCß C?? CTß ?CT ??T 1104 Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly ?sn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr ?ßn 355 360 365 CAO C?? CCC T?T CTß CTT ??? ?T? C?C CTT ??? GAC Tßß 6AA Oßß ??T 1152 Gln Cln ?rg Tyr Val Leu Lyß Xle Hlß Leu Lyß ?ßp Trp Glu ßly ?ßn 370 375 380 G?C OCT T?C TCA TTG TAT ßAA CAT TTC TAT CTC TCA ?ßT ß?? ß?? CTC 1200 Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu Hiß Phe Tyr Leu ser Ser Glu Gl? Leu 385 390 395 400 A?T TAT AGG ?TT C?C CTT ??? GCA CTT ACÁ GGß AC? GCC OGC ??? ?T? 1248 Aßn Tyr ?rg Xle Hiß Leu Lyß Gly Leu Thr Gly Thr ?la Gly Lyß Xle 405 410 415 AGC AGC ATC ?ßC C?? CC? ßß? ??T G?T TTT ACC ACÁ ??G C?T ßß? ß?C 1296 Ser Ser Xle Ser ßln Pro ßly ?ßn ?ßp Phe Ser Thr Lyß ?ßp ßly ?ßp 420 425 430 ?AC G?C ??? TCT ATT TCC AAA TOT TCA CA? ?TG CT? ACÁ GG? OOC TCC 1344 ?ßn ?ßp Lyß Cyß He Cyß Ly* Cyß Ser Cln Met Leu Thr Gly ßly Trp 435 440 445 TCG TTT G?T GC? TGT GßT CCT TCC A?C TTG AAC GGA ATC T?C T?T CC? 1392 Trp Phe ?ep ?l* Cyß ßly Pro Ser ?ßn Leu ?ßn oly Met Tyr Tyr Pro 450 455 460 CAC ?OG C?G A?C ACÁ ?AT ??G TTC AAC GGC ATT ??? TCG T?C T?C TGG 1440 Gln ?rg Gln ?ßn Thr ?ßn Lyß Phß Aßn Gly He Lyß Trp Tyr Tyr Trp 465 470 475 480 A?? GGC TC? GGC TAT TCG CTC AAC CCC AC? ?CC ?Tß ?Tß ?TC CCA CC? 1488 Lyß Gly Ser Cly Tyr Ser Leu Lyo ?la Thr Thr Met Met ?le ?rg Pro 485 490 495 ?la ?ßp Phe ,2. INFORMACI N PARA LA SEC ID NO: 24: ( I ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 499 amino áddos (8) UPO: asnino áddo (C) UPODEHEBRA: solo una (0) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (V) TIPO DEFRAGMENTO: interno (iX) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRECLAVE: (quimera3) 1N2C2F (Xi) DESCRIPCIÓNDELA SECUENCIA: SEC ID NO: 24: Mßt Tbr Val Phe Leu Ser Phe ?la Phe Leu ?la ?la He Leu Thr Hiß 1 5 10 16 Xle Cly Cyß ser ?sn ßln ?rg ?rg Ser Pro ßlu ?ßn Ser ßly ?rg ?rg 25 30 Tyr Aßn ?rg He ßln Biß ßly ßln Cyß ?la Tyr Tbr Phe Xle Leu Pro 4p 45 Clu Ble ?ßp Gly ?ßn Cyß ?rg ßlu Ser Thr Thr ?sp ßln Tyr ?sn Thr 50 55 60 ?ßn ?la Leu Gln ?rg ?ßp ?la Pro Biß Val Glu Pro ?ap ?ap Ser Val 65 70 75 80 ßln ?rg Leu ßln Val Leu ßlu ?an Xle Met ßlu ?ßn ?ßn Thr ?ln Trp 85 90 95 Leu Het Lys Leu Glu ?ßn Tyr ?le Cln ?ßp ?ßn Hßt Lys Lys Clu Mßt 100 105 110 Val ßlu Xlb Gln Gln ?sn ?la Val ßln ?ßn ßln Thr ?la Val Met Xle 115 120 125 ßlu Xle ßly Tnr ?ßn Leu Leu ?ßn ßln Thr ?la Clu ßln Thr ?rg Lyß 130 135 140 Leu Thr ?ßp Val Olu ?la Gln Val Leu ?ßn Gln Thr Thr ?rg Leu Gl? 145 150 155 160 Leu Gln Leu Leu Glu Hiß Ser Leu Ser Thr ?ßn Lyß Leu Glu Lyß Gln 165 170 175 He Leu ?ßp Gln Thr Ser Glu Xle ?en Lye Leu Gln ?ep Lyß ?ßn Ser 180 185 190 Phe Leu Glu Lyß Lyß Val Leu ?la Het Glu ?ßp Lye Hiß He ?le Gln 195 200 205 Leu Gln Ser Xle Lyß ßlu Glu Lya ?sp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser 210 215 220 Lyß Gln ?en Ser Xle Xle Glu ßlu Leu ßlu Lyß Lyß He Val Thr ?la 225 230 235 240 Thr Val ?sn ?ßn Ser Val Leu Gln Lys Cln Gln Hiß ?ßp Leu Met GLu 245 250 255 Thr Val ?en ?ßn Leu Leu Thr Met Ket Ser Thr Ser ?ßn Ser ?la Lyß 260 265 270 ?ßp Pro Thr Val ?la Lyß Glu Clu Gln He Ser Phe Arg Aßp Cyß ?la 275 280 285 Olu Val Phe Lyß Ser Gly Hiß Thr Thr Aßn Oly He Tyr Thr Leu Thr 290 295 300 Phe Pro Aßn Ser Thr Clu Glu He Lyß Ala Tyr Cyß Aßp Met Glu Ala 305 310 315 320 Gly Gly Cly Gly Trp Thr He He Gln Arg Arg Glu Asp Cly Ser Val 32S 330 335 Aap Phe GLn ?rg Thr Trp Lyß Glu Tyr Lyß Val Gly Phe Gly ?ßn Pro 340 345 350 Ser Gly ßlu Tyr Trp Leu ßly ?ßn Glu Phe Val Ser ßln Leu Thr ?en 355 360 365 ßln ßln ?rg Tyr Val Leu Lyß Xle Kiß Leu Lyß ?ßp Trp Olu ßly ?ßn 370 375 380 Clu ?la Tyr ser Lau Tyr Clu Hl* Phe Tyr Leu Ser Ser Glu ßlu Leu 3B5 390; 395 400 ?ßn Tyr ?rg He Hiß Leu Lyß ßly Leu Thr ßly Thr ?la ßly Lyß He 405 410 415 Ser Ser He ser ßln Pro ßly ?ßo ?sp Phe Ser Thr Lyß ?ßp oly ?ßp 420 425 430 ?ßn ?ßp Lyß Cyß Xle Cyß Lyß Cyß Ser ßln Met Leu Thr ßly ßly Trp 435 440 445. Trp Phe Aßp Ala Cyß ßly Pro Ser ?ßn Lßu ?ßn ßly Met Tyr Tyr Pro 450 455 460 ßln ?rg ßln ?ßn Thr ?ßn Lyß Phß ?ßn ßly Xlß Lyß Trp Tyr Tyr Trp 5 470 475 4B0 Lva Gly Ser Cly Tyr Ser Leu Lyß ?la Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro 485 490 495 (2) INFORMACIÓNPARALASEC ID NO: 25: ¿j CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 1488 pares base (B) TIPO: áddo n?d co (C) TIPO DE HEBRA: _«lv una ( D ) TOPOLOGÍA: lineal ( 11) UPO DE MOLÉCULA: DNA ( i ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de código (B) LOCAI ZACION: 1...1485 (0 ) OTRA INFORMACIÓN: A NOMBRE CLAVE: (quimera 4) 2N1C1F (B ) LOCALIZACION: 1...148S (0 ) OTRA INFORMACIÓN: (A) NOMBRE/CLAVE: Otro (B ) LOCALJZACION: 1...48 (0 ) OTRA INFORMACIÓN: La tecuen?a Uder putativa ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IB NO: 25: ATß TGG CAG ATT CTT TTC TTT ACT CTG ?CC TGT G?T CTT GTC TTO OCC 48 Met Trp Cin He Val Phe Phß Thr leu Ser Cyß Aßp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 OCA GCC T?T ?AC AAC TTT CGG AAC ?OC ATO ß?C ?GC ?T? ßß? ??ß ??G 96 ?la ?la Tyr ?ßn ?sn Phe ?rg Lye Ser Met ?ßp Ser He Gly Lyß Lyß 20 25 30 CAÁ TAT CAC GTC C?C C?T GGG TCC TGC ACC TAC ACT TTC CTC CTG CC? 144 Gln Tyr ßln Val ?ln Hiß Gly Ser Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 GAG ATG G?C AAC TGC CGC TCT TCC TCC AßC CCC TAC ßTß TCC ??T GCT 192 Glu Met ?ßp Aßn Cyß Arg Ser ser ser .ser Pro Tyr val Ser Aßn Al* 50 55 60 CTG CAG AGG OAC GCG CCG CTC GAA T?C ß?T TTC TCT TCC CAO AAA CTT 240 Val Cln Arg Aßp ?l* Pro Leu Clu Tyr ?ßp Phe Ser Ser ßln Lyß Leu 65 ~>0 75 80 CA? C?T CTO ß?? C?T ßTß ?Tß ß?? ??T TAT ACT CAß TOO CTß C?? ??? 2B8 Gln Hiß Leu ßlu Biß Val Mßt ßlu ?an Tyr Thr ßln TTp Leu ßln Lyß 85 90 95 CTT ß?ß ??T T?C ?TT ßTß ß?? ??C ?Tß ??ß TCß ß?ß ?Tß COC C?ß ?TA 336 Leu ßlu ?ßn Tyr lie Val ßlu ?ßn Mßt Lyß Ser ßlu Mßt ?la ßln Xlß 100 IOS 110 C?O C?O ?AT OCA ßTT C?ß A?C C?C ACO OCT ACC ?Tß CTß G?ß ?TA ßß? 384 ßln ßln ?ßn ?la Val ßln ?ßn Biß Thr ?la Thr Mßt Lßu ßlu Xlß ßly 115 120 125 ACC AOC CTC CTC TCT C?O ?CT CCA 6AG CAO ACC ?ß? ??ß CTß ?C? ß?T 432 Thr ser Leu Leu eex ßln Thr ?la ßlu Gln Thr ?rg Lya Leu Thr Xßp 130 135 140 CTT ß?ß ?CC C?ß GT? CT? ??T C?? ?CT TCT Cß? CTT GAO ?T? C?O CTß 480 Val ßlu Thr Gln Val Leu ?ßn Gln Thr Ser ?rg Lßu ßlu Xle ßln Leu 145 150 155 160 CTO G?C ?AT TC? TT? TCC ?CC T?C ??G CT? ß?ß ??O C?? CTT CTT C?? 528 Leu ßlu ?an Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu ßlu Lyß ßln Lßu Lßu ßln 165 170 175 C?G ?C? ??T C?? ?TC TTO ??ß ?TC C?T ß?? ??? ??C ?ßT TT? TT? ß?? 576 ßln Thr ?ßn Glu Xle Leu Lyß Xlß Ble ßlu Lyß ?ßn Ser Lßu Leu ßlu 180 185 190 C?T ??? ?TC TT? ß?? ATO ß?? ßß? ??? C?C ??ß ß?? ß?ß TTß OAC ?CC 624 Bis Lya Xle Leu ßlu Met ßlu ßly Lyß Ble Lyß ßlu ßlu Leu ?ßp Thr 19S 200 205 TT? ??ß ß?? ß?ß A?? G?ß ?AC CTT C?? ßßC TTß ßTT ACT CGT C?? ?C? 672 Leu Lyß ßlu ßlu Lyß ßlu ?ßn Leu ßln ?ly Leu Val Thr ?rg ßln Thr 210 215 220 T?T ?T? ?TC C?ß ß?ß CTC G?? ??ß C?? TT? ?AC ?ß? CCT ?CC ?CC ??C 720 Tyr Xla Xle Gln Glu Leu Glu Lyß Gln Leu ?ßn ?rg ?la Thr Thr ?ßn 225 230 235 240 ?AC AßT CTC CTT CAC ??G C?G C?A CTC G?ß CTG ATC G?C ACÁ GTC CAC 768 ?sn Ser Val Leu Gln Lyß Gln Cln Leu Glu Leu Met ?ßp Thr Val Ble 245 250 255 AAC CTT GTC A?T CTT TCC ?CT AAA CAÁ C6T ßTT TTA CTA AAC CGA Gß? 816 ?ßn Leu Val ?ßn Leu Cyß Thr Lyß Glu Gly val Leu Leu Lyß Gly Gly 260 265 270 AAA ACÁ CAG G?? G?G ??? CC? TTT ?OA GAC TGT OCA CAT CTA T?T C?? 864 Lyß Arg Clu ßlu ßlu Lyß Pro Phe Arg ?ßp cyß ?la Aßp val Tyr ßln 275 280 285 CCT GGT TTT ??T ??? ACT GGA ATC TAC ACT ATT T?T ?TT ??T AAT ATO 912 Ala ßly Phe Aßn Lyß ser ßly He Tyr Thr He Tyr He Aßn Aßn Met 290 29S 300 CC? ß?? CCC ??? AAC GTG TTT TCC A?T ?Tß CAT GTC ??T GGG GCA GßT 960 Pro Glu Pro Lyß Lyß Val Phe Cyß Aßn Met Aßp Val Aßn ßly ßly ßly 305 310 315 320 TGC ACT GTA ATA CA? CAT CGT GAA GAT GGA AOT CTA GAT TTC CAÁ ASA 1008 Trp Thr Val Xle Gln Hiß Arg Clu Asp Gly Ser Leu Aßp Phe ßln Arg 325 330 335 GCC TGG ??G G?? T?T AAA ATG CGT TTT OCA ??T CCC TCC OßT G?? T?T 1056 ßly Trp Lyß Clu Tyr Lyß Met Cly Phe Gly ?ßn Pro Ser Gly Clu Tyr 340 34S 350 TGC CTO ßßß ??T ß?ß TTT ?TT TTT OCC ?TT ?CC AGT C?ß ?ßß CAß T?C 1104 Trp Leu Oly ?an Olu Phe Xlß Phß ?la He Thr Ser ßln ?rg ßln Tyr 355 360 365 ?Tß CT? ?ß? ?TT ß?ß TT? ?Tß CAC Tßß ß?? ßßß AAC Cß? GCC T?T TC? 1152 Met Leu ?rg He Clu Leu Met ?ßp Trp ßlu ?ly ?sn ?rg ?la Tyr Ser 370 375 380 C?G T?T G?C ?ß? TTC C?C ?T? ßß? ??T ß?? ??ß C?? ?AC T?T ?ßß TTß 1200 Cln Tyr ?ßp ?rg Phe Bis Xle Gly ?sn ßlu Lys ßln ?ßn Tyr ?rg Leu 385 390 395 400 T?T TT? ??? OßT C?C ?CT Cßß ACÁ GCA ßß? ??? C?ß ?ßC ?ßC CTß ?TC 1248 Tyr Leu Lyß ?ly Biß Thr ßly Thr ?la Oly Lyß Oln Ser Ser Leu Xle 405 410 415 TT? C?C OCT OCT O?T TTC ?OC ACT AAA O?T CCT G?T ??T OAC A?C TßT 1296 Leu Hlß Gly ?la ?ßp Phe Sex Thr Lyß Asp Ala ?sp ?ßn ?ßp ?sn Cyß 420 425 430 ?TG TOC -??? TßT GCC CTC ?TG TTA ?C? Cß? ßß? TOC Tßß TTT ß?T OCT 1344 Met Cyß Lyß Cyß ?la Leu Met Leu Thr Oly Oly Trp Trp Pbe ?ßp ?la 435 440 44S TCT GGC CCC TCC ??T CT? ??T GCA ?TG TTC T?T ACT GCG Gß? C?? AAC 1392 Cys Gly -Pro Ser Asn Lßu ?sn ßly Mßt Phe Tyr Thr ?la ßly ßln ?sn 450 455 460 C?T ßß? ??? CTß ??T ßßß ?T? ??G TOO C?C T?C TTC ??? 66G CCC ?CT 1440 Hiß ßly Lyß Leu han ßly Xle Lyß Trp Hiß Tyr Phß Lyß ßly Pro Ser 465 470 475 480 T?C TCC TT? COT TCC ?C? ?CT ATO ?TC ATT COA CCT TT? G?T TTT Tß? 1488 Tyr Ser Leu ?rg Ser Thr Thr Met Met Xle ?rg Pro Leu ?ßp phß 48S 490 495 (2) INFORMACIÓNDE LA SEC ID NO: 26: (i) (?) LONGITUD: 495 amino áddos (B) TEPO: amino áddo (C) 11PO DE HEBRA: solo una (0 ) TOPOLOGÍA: lineal ( ü) UPO DE MOLÉCULA: proteina ( v ) UPO DE FRAGMENTO: Interno ( lx ) CARACTERÍSTICAS: (?) NOMBRE CLAVE: (quimera 4) 2N1C1F ( B) LOCALIZACION: 1...495 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) I >ESC1tlPCIt )N DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26: Met Trp Cln Xle Val Phe Phe Thr Leu Ser Cyß Aßp Leu val Leu ?la 1 S 10 15 Ala ?la Tyr ?ßn Aßn Phe Arg Lyß Ser Ket Aßp Ser He Gly Lyß Lyß 20 25 30 Gln Tyr Oln Val Cln Hiß Cly Ser Cyß Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Aßn Cyß Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser ?ßn Ala 50 55 60 Val Cln Arg ?ßp Ala Pro Leu Clu Tyr Aßp Phe Ser Ser Cln Lyß Leu 65 70 75 80 Cln Hiß Leu Clu Hiß Val Met Clu Aen Tyr Thr Gln -Trp Leu ein Lyß 85 90 95 Lßu ßlu ?ßn Tyr Xlß Val ßlu ?an Met Lyß ?ex ?lu Mßt ?la Oln Xlß 100 ios 110 Oln Oln ?sn ?la Val oln ?ßn Bis Thr ?la Thr Mßt Lßu Olu Xlß ßly 115 120 125 Thr Ser Lßu Leu Ser ßln Thr ?la ßlu ßln Thr ?rg Lyß Leu Thr ?sp 130 135 140 Val Glu Thr Oln Val Lßu ?sn ßln Thr Ser ?rg Leu ßlu Xle ßln Leu 145 160 185 160 Leu ßlu ?sn Ser Leu Ser Thr Tyr Lyß Leu ßlu Lyß ßla Leu Leu, oln 165 170 175 ßln Thr ?sn ßlu Xle leu Lys Xle Biß ßlu Lyß ?sn Ser Lßu Leu ßlu 180 185 190 His Lye Xle Leu ßlu Met ßlu ßly Lyß Hiß Lyß Glu ßlu Leu ?ßp Thr 195 . 200 205 Lßu Lyß ßlu ßlu ym ßlu ?sn Lßu ßln ßly Leu Vel Thr Arg ßln Thr 210 215 220 Tyr Xle Xle ßln ßlu Leu ?lu Lyß ßln Leu ?ßn ?rg Ala Thr Thr ?ßn 225 230 235 240 ?ßn Ser Val Leu Gln Ly* cln Gla Leu slu Leu Met ?ßp Thr val Biß 245 260 255 ?ßn Leu Val ?an Leu Cyß Thr Lyß ßlu ßly Vel Leu Lßu Lyß ßly ßly 260 265 270 Lyß ?rg ßlu Olu Glu Lys Pro Phe ?rg ?ßp Cyß ?la Aßp Val Tyr Cln 275 280 285 ?la ßly Phe ?ßn Lyß Ser ßly He Tyr Thr Xle Tyr Xle Aßn ?ßn Mßt 290 295 300 Pro Glu Pro Lyß Lys Val Phe Cys ?sn Het ?ßp Val ?ßn ßly ßly ßly 305 310 315 320 Trp Thr val Xle ßln Biß ?rg ßlu ?ßp ßly Ser Leu ?sp Phe ßln ?rg 325 330 335 ßly Trp Lyß Glu Tyr Ly» Met Oly Phe ßly ?ßn Pro Ser ßly ßlu Tyr 340 345 350 Trp Leu Gly ?ßn Glu Phe Xle Phe ?le He Thr Ser Cln ?rg Oln Tyr 355 360 365 Met Leu ?rg Xle Glu Leu Met ?ßp Trp Glu Gly ?sn ?rg ?la Tyr Ser 370 375 380 Gln Tyr ?sp ?rg Phe Hiß Xle Gly ?ßn Glu Lyß ßln ?ßn Tyr -?rg Leu 385 390 395 400 Tyr Leu Lyß Oly Hiß Thr Oly Thr ?la ßly Ly* Oln Ser Ser Lßu Zle 405 410 415 Leu Hiß Gly ?la ?ßp Phe Sar Thr Lyß Aßp ?la ?ap ?ßn ?ßp ?ßn Cyß 420 425 430 Mat Cyß Lyß Cyß ?la Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe ?ßp Ala 435 440 445 Cyß Gly Pro Ser Aßn Leu Aßn Gly Ket Phe Tyr Thr ?la ßly ßln ?ßn 450 455 460 Hiß Oly Lyß Leu Aßn Gly Xle Lyß Trp Hiß Tyr Phe Lyß ßly Pro Ser 465 470 475 480 Tyr Ser Leu Arg ser Thr Thr Met Ket He Arg Pro Leu ?ßp Phe 485 490 495 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27: ( ij CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA A) LONGITUD: 47 pares base (B) TIPO: áddo núddco (C) UPO DE HEBRA: solo una (0) TOPOLOGÍA: lineal (ii) UPO DE MOLÉCULA: DNA (ix) CARACTERÍSTICAS: . - (A) NOMBRE/CLAVE: hTL4atg (B) LOCALIZACION: 1...47 (D) OTRAINFORMACIÓN: primer PCR (A) NOMBRE CLAVE: Otro (8) LOCALJZACION: 1..J0 (0 ) ? IRA INFORMACI N: Secuencia final agregada a un primor PCR para facilitar la donadon de los fragmentos PCR amplificados (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27: < GCATGCTATC TCCACCCACC ?TGCTCTCCC ?GCTAGCCAT ßCTCCAß 47 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28: ( 1 ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 pares base ( B ) TIPO: ú itl _ núdd?o (C) TIPO DE HEBRA: solo una (0) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRECLAVE: hTL4not (B) LOCAI ZACION: 1.. SS (D) OTRA INFORMACIÓN: Primer PCR (?, NOMBRE CLAVE: Otro (B¡ LOCAIJZACION: 1...28 (D ) OTRA INFORMACIÓN: Secuenda final agregada a nn primer PCR para facultar la donadón de los fragmentos PCR amplificados (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28: GTCTCG?CGC GGCCCCTCT? CATC?GACTT AG?TGTCC?? AGGCCGTATC ?TC?T 55 Att. Doc. No. • REG 333-PCT Sol. ínter. No.: AUN NO CONOCIDO Fecha de Presentación Internacional: PRESENTADA AQUÍ Titulo: NUEVOS LIGANDOS MODIFICADOS c> HOJA COMPLEMENTARIA AL CUADRO B DE LA FORMA PCT/RO/134 Identificación de los Depósitos adicionales - En adición a ios depósitos indicados en ia torma adjunta PCT/RO/134, 0 ios solicitantes identi±ican ios siguientes depósitos elaborados con el Americal Type Culture Coliection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A. Y solicitan que también estén disponibles solamente por la publicación de una muestra a un experto nominado por el solicitante como se indica en una forma adjunta: Fecha del depósito Número de Acceso Octubre 7, 1994 VR2484 Octubre 26, 1994 75928 Diciembre 9, 1994 75963 Julio 2, 1996 90895 Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por ia solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es ei que resuita claro a partir de la presente descripción. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (50)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica a un ligando quimérico TIE-2 que comprende ai menos una porción de un primer ligando TIE-2 y una porción de un segundo ligando TIE-2 el cual es diferente del primero, caracterizada porque el primer y segundo ligando TIE-2 se selecciona a partir del ligando 1 TIE-2, Ligando 2 TIE-2, ligando 3 TIE-2 y ligando 4 TIE-2.

2. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque codifica a un ligando quimérico TIE-2 que comprende ai menos una porción del ligando 1 TIE-2 y una porción del ligando 2 TIE-2.

3. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, que codifica un iigando quimérico TIE-2 que enlaza y activa al receptor TIE-2 que comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2, caracterizada porque la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 2 TIE-2.

4. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la porción de ia secuencia nucieótida que codifica al dominio de resorte enrollado del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio de resorte enrollado del ligando 2 TIE-2.

5. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con ia reivindicación 3 o 4, caracterizada porque se modifica para codificar un aminoácido diferente en lugar del residuo de cisteina que codifica para los nucleótidos 784-787 como se expone en la Figura 27.

6. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque se modifica de manera que un residuo de serina se codifica en vez del residuo de cisteina.

7. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación b o b, caracterizado porque además es modificado para codificar una diferente aminoácido en lugar dei residuo de arginina codificado por los nucleótidos 199-201 como se expone en la Figura 97

8. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con ia reivindicación /, caracterizada porque se modifica de manera que un residuo serina es codificado en lugar del residuo de ia arginina.

9. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un ligando TIE-2 modificado que enlaza y activa al receptor TIE-2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2 el 10 cual es modificado para codificar un diferente aminoácido en vez dei residuo de cisteina a una posición de aminoácido _._5.

10. Una molécula de ácido nucleico de lb conformidad con ia reivindicación 9, caracterizado porque se modifica ae manera que un residuo serina es codificado en lugar oe_. residuo de cisteina.

11. Una molécula de ácido nucleico de 20 conformidad con ia reivindicación 3, caracterizada porque tiene ia secuencia expuesta en la figura 2 1 .

12. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque b tiene ia secuencia expuesta en ia Figura 2b.

13. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica a un ligando TIE-2 modificado que enlaza pero no activa ai receptor TIE-2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 ITE-2 o al ligando 2 TIE-2, en donde la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio N-terminal del ligando 1 ITE-2 o del ligando 2 TIE-2 es eliminada.

14. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque ia porción de la secuencia nucieótida que codifica ai dominio de resorte enrollado del ligando 1 TIE-2 o del ligando 2 TIE-Z es eliminada y la porción que codifica al dominio similar al fibrinogeno es fusionado en estructura a una secuencia nucleótida que codifica a una región constante gamma-1 de inmunoglobulina humana (IgGl Fc) .

15. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica a un ligando TIE-2 modificado que enlaza pero no activa ai receptor TIE-2, comprende una secuencia nucleótida que codifica al ligando 1 TIE-2, caracterizada porque la porción de la secuencia nucleótida que codifica al dominio similar al fibrinógeno del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio similar al fibrinógeno del ligando 2 TIE-2.

16.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con ia reivindicación lb, caracterizada porque ia porción de la secuencia nucieotida que codifica al dominio de resorte enrollado del ligando 1 TIE-2 es reemplazada por una secuencia nucleótida que codifica al dominio de resorte enrollado del ligando 1 TIE-2.

17. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación Ib, caracterizada porque tiene ia secuencia expuesta en ia figura 24.

18. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque tiene ia secuencia expuesta en la figura 26.

19. Un ligando TIE-2 modificado quimérico caracterizado porque codifica para una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

20. Un ligando TIE quimérico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tiene las secuencias expuestas en la Figura 24, 25, 26 o 27.

21. Un ligando TIE quimérico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tiene la secuencia expuesta en la figura 27, pero modificada para tener un diferente aminoácido en lugar dei residuo cisteina que codifica por los nucleótidos 784-787.

22. Un vector caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 18.

23. Un vector de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico está enlazado operativamente a una secuencia de control de expresión capaz de dirigir su expresión en una célula huésped.

24. Un vector de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque es un plasmidio.

25. Un sistema de huésped-vector para la producción de un ligando quimérico o modificado de conformidad con una cualquiera de ias reivindicaciones 19, 20 o 21, caracterizado porque comprende un vector de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 22, 23 o 24.

26. Un sistema huésped-vector de conformidad con la reivindicación 2b, caracterizado porque ia célula huésped es una céiuia bacterial, levadura, insecto o mamífero.

27. Un método de producir un ligando como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 0 21, caracterizado porque comprende células en crecimiento de un sistema huésped-vector de conformidad con ia reivindicación 2b o 26, bajo las condiciones que permiten ia producción del ligando y recuperar ei ligando asi producido.

28. Un anticuerpo caracterizado porque enlaza al ligando de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, 0 21.

29. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

30. Un cuerpo receptor caracterizado porque enlaza especificamente al ligando de conformidad con la reivindicación 19, 20 o 21.

31. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica a un cuerpo receptor de conformidad con ia reivindicación 30.

32. Un vector caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 31.

33. Un vector de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque es un plasmidio.

34. Un conjugado, caracterizado porque comprende un ligando de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 0 21 y conjugados de eso, un agente citotóxico.

35. Un conjugado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agente citotóxico es un radioisótopo o toxina.

36. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un ligando modificado o quimérico de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 o 21 y un portador farmacéuticamente aceptable.

37. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28 o 29 y un portador farmacéuticamente aceptable.

38. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un cuerpo receptor de conformidad con la reivindicación 30, y un portador farmacéuticamente aceptable.

39. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un conjugado de conformidad con la reivindicación 34 o 35 y un portador farmacéuticamente aceptable.

40. Un ligando de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 o 21, un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28 o 29, u cuerpo receptor de conformidad con la reivindicación 30 o un conjugado de conformidad con la reivindicación 34 o 35, para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal, o en un método de diagnosis.. i o, ÍA

41. Un ligando producido por le método de la reivindicación 27.

42. Una molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, 9, 13 o lb substanciaimente como se describió aqui.

43. Un ligando TIE-2 modificado o quimérico de la reivindicación 19, substancialmente como se describió aqui anteriormente.

44. Un vector de conformidad con la reivindicación 22 o 32, substancialmente como se describió aqui anteriormente. 4b. Un sistema huésped-vector de ia reivindicación 25, substanciaimente como se describió aqui anteriormente. 46. Un método de conformidad con la reivindicación 27 como se describió aqui anteriormente, 47. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, substanciaimente como se describió aqui anteriormente. 48. Un cuerpo receptor de la reivindicación 30, substancialmente como se describió aqui anteriormente. 49. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38 o 39, substancialmente como se describió aqui anteriormente. 50. Un ligando, anticuerpo, cuerpo receptor o conjugado de conformidad con la reivindicación 40, substancialmente como se describió aqui.