CZ31099A3 - Modifikovaný TIE-2-receptorový ligand - Google Patents

Modifikovaný TIE-2-receptorový ligand Download PDF

Info

Publication number
CZ31099A3
CZ31099A3 CZ1999310A CZ31099A CZ31099A3 CZ 31099 A3 CZ31099 A3 CZ 31099A3 CZ 1999310 A CZ1999310 A CZ 1999310A CZ 31099 A CZ31099 A CZ 31099A CZ 31099 A3 CZ31099 A3 CZ 31099A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tie
ligand
receptor
modified
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ1999310A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295371B6 (cs
Inventor
Samuel Davis
George D. Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ31099A3 publication Critical patent/CZ31099A3/cs
Publication of CZ295371B6 publication Critical patent/CZ295371B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/30—Bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Modifikovaný TIE-2-receptorový Iigand
Pro tuto přihlášku vynálezu se žádá přiznání priority z americké přihlášky vynálezu číslo 08/740,223, podané 25. října 1966 a z americké přihlášky vynálezu číslo 60/022,999, podané 2. srpna 1966. V popise jsou odkazy na různé publikace.
Oblast techniky
Vynález se obecně týká oboru genetického inženýrství a především genu pro receptorové tyrosinkinázy a jejich příbuzné ligandy, jejich inzerce do rekombinantních DNA vektorů a produkce zakódovaných proteinů v recipientových kmenech mikroorganizmů a v recipientových eukaryotických buňkách. Zvláště se vynález týká nového modifikovaného TIE-2 ligandu, který váže TIE-2 receptor, jakož také způsobu výroby a použití modifikovaného ligandu. Vynález se dále týká sekvence nukleové kyseliny kódující modifikovaný Iigand a způsobu generace kódování modifikovaného ligandu a genového produktu nukleovou kyselinou
Dosavadní stav techniky
Modifikovaný TIE-2-receptorový Iigand, jakož také nukleová kyselina, která ho kóduje, mohou být užitečné při diagnóze a ošetř^ování určitých nemocí zahrnujících endotelové buňky a asociované TIE receptory, jako jsou neoplastická onemocnění, zahrnující nádorovou angiogenezi, hojení ran, thromboembolická onemocnění, atherosklerosu a zánětlivá onemocění. Kromě toho se modifikovaného ligandu může používat k podpoře proliferace a/nebo diferenciace hematopoftických kmenových buněk. Obecně se receptor aktivující modifikované TIE-2 ligandy, zde popisované, může používat k podpoře růstu, přežití, migrace a/nebo diferenciace a/nebo stabilizace nebo destabilizace buněk expresujících TIE receptor. Biologicky aktivní modifikovaný TIE-2 Iigand se může používat pro in vivo udržování TIE receptoru expresujícího buňky v kultuře. Buňky a tkáně, expresující TIE receptor, zahrnuji například kardiatické a vaskulární endotheliální buňky, čočkové epithelium a srdeční epikardium a časně hematopoietické buňky. Alternativně se takové lidské ligandy mohou používat pro podprou buněk, které jsou určeny k expresi TIE receptoru. Kromě toho modifikovaný TIE-2 ligand a jeho příbuzný receptor se může používat ve zkušebních systémech k identifikaci dalších agonistů nebo antagonistů receptoru .
Buněčné chování, zodpovědné za vývoj, udržování a opravu různých buněk a tkání se řídí ve velké míře intracelulárními signály vedenými cestou růstových faktorů a podobných ligandů a jejich receptorů. Receptory jsou umístěny na buněčném povrchu a váží peptidy nebo polypeptidy, známé jako růstové faktory a jako jiné hormonu podobné ligandy. Výsledky interakce jsou rychlé biologické změny v odezvových buňkách jakož také rychlé a dlouhodobou readjustaci celulární genové exprese. Některé receptory, spojené s různými povrchy buněk, mohou vázat specifické růstové faktory.
Fosforylace tyrosinových zbytků v proteinech tyrosinkinázami je jedním klíčovým způsobem, kterým se signály vedou napříč plasmové membrány. Některé současně známé proteinové tyrosinkinázové geny kódují transmembránové receptory polypeptidových růstových faktorů a hormonů, jako jsou epidermální růstový faktor (EGF), inzulín, inzulínu podobný růstový faktor-1 (IGF-I), růstové faktory odvozené od destiček (PDGF-A a B) a fibroblastové růstové faktory (FGF) (Heldin a kol., Cell Regulation, 1: str. 555 až 566, 1990; Ullrich a kol., Cell 61, str. 243 až 254, 1990). V každém případě tyto růstové faktory vykonávají své působení vázáním na extracelulární podíl svých příbuzných receptorů, což vede k aktivaci vnitřní tyrosinkinázy obsažené v cytoplasmovém podílu receptoru. Receptory růstového faktoru endotelovéch buněk mají zvláštní význam v důsled-
ku možného zlepšení růstových faktorů v některých důležitých fyziologických a patologických procesech, jako jsou vaskulogeneze, angiogeneze, atheroskleroza a zánětlivá onemocnění (Folkman a kol., Science, 235, str. 442 až 447, 1987). Receptory některých hematopoietických růstových faktorů jsou tyrosinkinázy; zahrnují c-fms, což je kolonový stimulační faktorový 1 reptor (Sherr a kol., Cell, 41, str. 665 až 676, 1985) a c-kit, primitivní hematopoieticky růstový faktorový receptor, který popsal Hung a kol. (Cell, 63, str. 225 až 233, 1990).
Receptorové tyrosinkinázy se dělí na evoluční podrodiny na bázi charakteristické struktury jejich ektodomén (Ullrich a kol.,Cell 61, str. 243 až 254, 1990). Takové subrodiny zahrnují EOF receptorů podobnou kinázu (subtřída I) a inzulínovou receptorů podobnou kinázu (subtřída II), přičemž každá tato subtřída obsahuje opakující se homologické cysteinem bohaté sekvence ve svých extracululárních doménách. Jediný cysteinem bohatý region se také zjistil v extracelulární doméně podobné kináze eph (Hirai a kol., Science 238, str. 1717 až 1720, 1987; Lindberg a kol., Mol. Cell. Biol. 10, str. 6316 až 6324, 1990; Lhotak a kol., Mol Cell. Biol. 11, str. 2496 až 2502, 1991). PDGF receptory stejně jako c-fms a c-kit receptorové tyrosinové kinázy se mohou seskupovat v podtřídě III; zatímco FGF receptory tvoři podstřídu IV. Typické pro členy obou těchto podtříd jsou extracelulární vlásenkové jednotky stabilizované meziřetězcovými disulfidickými vazbami. Tyto tak zvané imunoglobuliny (Ig)-podobné vlásenkové záhyby jsou zjištěny v proteinech imunoglobulinového superrodiny, která obsahuje četné různé jiné buněčné povrchové receptory mající bud na buňku vázané nebo rozpustné ligandy (Williams a kol., Ann. Rev. Immunol., 6, str. 381 až 405, 1988).
Receptorové tyrosinkinázy se liší svou specificitou a afinitou. Obecně jsou receptorové tyrosinkinázy glykoproteiny, které sestávají (1) z extracelulární domény schopné vázat • · specifický růstový faktor nebo specifické růstové faktory; (2) z transmembránové domény, kterou je obvykle a-dvoušroubovicový podíl proteinu; (3) z juxtamembránové domény, kde se receptor může regulovat například proteinovou fosforylací; (4) z tyrosinkinázové domény, která je enzymatickou složkou receptorů; a (5) z karboxyterminálního zakončení, které je zahrnuto v mnoha receptorech v rozpoznávacím místu a ve vazbě substrátů pro tyrosinkinázu.
Procesy, jako jsou alternativní exonový sestřih a alternativní volba genového promotoru nebo polyadenylačního místa se označují jako schopné produkovat některé zřetelné polypeptidy ze stejného genu. Tyto polypetidy mohou avšak nemusí obsahovat různé shora uvedené domény. Následkem toho některé extracelulární domény mohou být expresovány jako oddělené sekretované proteiny a některé formy receptorů mohou postrádat tyrosinkinázovou doménu a obsahují toliko extracelulární doménu včleněnou do plasmové membrány prostřednictvím transmembránové domény plus krátké karboxylové koncové zakončení.
Gen kódující endotelovou buněčnou transmembránovou tyrosinkinázu, označenou původně jako RT-PCR jakožto neznámý tyrosinkinázový homologový cDNA fragment z lidských leukemických buněk, popsal Partanen a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, str. 8913 až 8917, 1990). Tento gen a jeho zakódovaný protein se označují jako TIE což je zkratka pro tyrosinkinázu s Ig a EGF homologovými doménami (Partanen a kol., Mol. Cell. Biol. 12, str. 1698 až 1707, 1992).
Je známo, že smyčková mRNA je obsažena ve všech lidských zárodečných a ve všech myších embryových tkáních. Na základě inspekcí je mediátor tie lokalizován do kardiatických a vaskulárních endotelových buněk. Specificky je tie mRNA lokalizována do endotelu krevních cév a do endokardia 9,5 až 18,5 dní starých myších zárodků. Podporovaná tie exprese je doložená v průběhu neovaskularizace spojené s vývojem vaječníkových folikulů a granulace tkáně v ranách pokožky (Korhonon a kol., Blood 80, str. 2548 až 2555, 1992). Proto se usuzuje, že TIE má úkol při angiogeneszi, která je důležitá pro vývoj ošetřování pevných nádorů a některých jiných na angiogenezi závislých onemocnění, jako jsou diabetická retinopythie, lupénka, atheroskleroza a arthritis.
Uvádí se, že dva strukturálně příbuzné krysí TIE receptorové proteiny kódují odlišné geny s příbuznými profily exprese. Jeden gen, označovaný tie-1 je krysí homolog lidského tie (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 1631 až 1637, 1993). Druhý gen tie-2 může být krysí homolog myšího tek genu, o kterém se podobně jako o tie uvádí, že se expresuje u myší výhradně v endotelovéch buňkách a v jejich předpokládaných progenitorech (Dumont a kol., Oncogene 8, str. 1293 až 1301, 1993). Lidský homolog tie-2, který je zde zcela začleněn, popsal Ziegler (americký patentový spis číslo US 5 447860, 5.
září 1995) (přičemž se označuje jako ork).
Zjistilo se, že oba geny jsou ve velké míře expresovány v endotelovéch buňkách embryí a v postnatálních tkáních. Významné hladiny tie-2 transkriptů jsou obsaženy také v jiných populacích embryonických buněk, včetně epithelia čočky, srdečního epikardia a regionů mesenchymu (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 1631 až 1637, 1993).
Z převážné exprese TIE receptorů ve vaskulárním endotelu vyplývá, že TIE má význam ve vývoji a v udržování vaskulárního systému. To může zahrnovat úlohu při determinaci endotelové buňky, při proliferaci, diferenciaci a migraci buněk a při všablonování do vaskulárních prvků. Analýza myších embryí s deficitem TIE-2 objasňuje význam angiogeneze, zvláště pro vytváření vaskulárního sítoví v endotelovéch buňkách (T.N. Sáto a kol., Nátuře 376, str. 70 až 74, 1995). Ve zralém vaskulárním systému může mít TIE funkci v přežívání endotelových buněk, v udržování a odezvě na patogenní vlivy.
Receptory TIE jsou tedy expresovány v primitiních hematopoetických kmenových buňkách, B buňkách a v subsetu megakaryotických buněk, mají roli ligandů, které váží tyto receptory v časné hematopoiesis, v diferenciaci a/nebo v proliferaci B buněk a v megakaryocytické diferenciační dráze (Iwama a kol., Biochem. Biophys. Research Communications 195, str. 301 až 309, 1993; Hashiyama a kol., Blood 87, str. 93 až 101, 1996; Batard a kol., Blood 87, str. 2212 až 2220, 1996).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandu, přičemž první a druhý TIE-2 ligand je volen ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE-2 ligand 3 a TIE-2 ligand 4.
Podstatou vynálezu je také kompozice obsahující modifikovaný TIE-2 ligand v podstatě prostý jiných proteinů. Mofikovaný TIE-2 ligand se týká ligandu rodiny TIE ligandů, které representativně obsahují popsané ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, které jsou pozměněny adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo způsobem značení například podílem Fc lidského IgG-1, přičemž jim však zůstává schopnost vázat TIE-2 receptor. Modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje také chimerní TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je od prvního odlišný. Například bez záměru na jakémkoliv omezení prvním TIE-2 ligandem je TLI a druhým TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití dalších členů TIE-2 ligandové rodiny. Například jiné kombinace pro vytvoření chimerního • · » · ·· 8 · · « > · · « • * « · • · » I » <
• · I
TIE-2 ligandu jsou možné včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení,, kombinací, kde první ligand je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4, a druhý ligand, odlišný od prvního ligandu je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Podstatou vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand. Podle jednoho provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand z rodiny ligandů TIE, jejímiž representativními ligandy jsou TLI, TL2, TL3 a TL4, jak shora uvedeno, které jsou obměněny adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo způsobem značení například podílem Fc lidského IgG-1, přičemž jim však zůstává schopnost vázat TIE-2 receptor. Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand, který je chimerním ligandem, obsahujícím alespoň část prvního TIE-2 ligandu a alespoň část druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandu. Například avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, prvním TIE-2 ligandem je TLI a druhým TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití dalších členů TIE-2 ligandové rodiny. Například jiné kombinace jsou možné včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinace, kdy izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 ligand, který je chimerní TIE-2 ligand obsahující část prvního ligandu volenou ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4, a část druhého ligandu, odlišného od prvního ligandu, voleného ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Izolovanou nukleovou kyselinou může být ENA, cDNA nebo RNA. Vynález se také týká vektoru obsahujícího izolovanou molekulu nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand. Vynález se také týká hostitelského vektorového systému pro produkci vhodné hostitelské buňky polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu. Vhodná hostitel• · • · · · 0 • · ·· 0 • · · · · · • · · · · »·· * · ská buňka může být bakteriální, kvasinková, hmyzí nebo savší. Vynález se také týká způsobu produkce polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu, který obsahuje rostoucí, buňky hostitelského vektorového systému za podmínek umožňujících produkci polypeptidu a získání takto produkovaného polypeptidu.
Podle vynálezu popsaná iolovaná buňka nukleové kyseliny, kódující modifikovaný TIE-2 ligand, umožňuje vývoj ligandu jako terapeutického činidla pro ošetřování jedinců trpících poruchami bunék, tkání nebo orgánů, které expresují TIE-2 receptor. Vynález se také týká protilátky, která specificky váže takovou terapeutickou molekulu. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká způsobu použití takové monoklonální nebo polyklonální protilátky k měření množství terapeutické molekuly ve vzorku, odebraném pacientovi, pro účely monitorování průběhu terapie.
Vynález se také týká protilátky, která specificky váže shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují protilátku, která specificky váže shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, ve farmaceuticky vhodném nosiči. Vynález se také týká způsobu blokování růstu krevních cév v případě savců podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího protilátku, která specificky váže receptor aktivující shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči.
Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, ve farmaceuticky vhodném nosiči. Vynález se také týká způsobu podpory neovaskularizace podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího receptor aktivující shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči. Podle jednoho provedení se vynález týká podpory léčení ran. Podle • · • · ·· • · · · • · · · ·· ** jiného provedení se vynálezu využívá pro ošetřování ischemie. Podle ještě dalšího provedení se receptorů aktivujícího shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand využívá samotného nebo v kombinaci s jinými hematopoietickými faktory k podpoře proliferace nebo diferenciace hematopoietických kmenových buněk, B buněk nebo megakaryotických buněk.
Modifikované TIE-2 ligandy se podle vynálezu mohou konjugovat na cytotoxická činidla a na terapeutické kompozice z nich připravené. Vynález se proto dále týká receptorů, které specificky váží modifikované TIE-2 ligandy. Vynález se dále týká farmaceutických prostředků, které obsahují receptory, které specificky váží shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči. Vynález se také týká způsobu blokování růstu krevních cév savců podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího receptor, který spéci ficky váže popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči.
Vynález se také týká TIE-2 receptorového antagonistu a způsobu inhibice TIE-2 biologické aktivity savců, při kterém se podává savcům účinné množství TIE-2 antagonistu. Podle vynálezu může být antagonistem shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, který váže, nikoliv však aktivuje TIE-2 receptor.
Vynález blíže objasňuje další podrobný popis s připojenými obrázky.
Seznam obrázků
Obr. IA a IB: TIE-2 receptor (TIE-2 BR) inhibuje vývoj krevních cév v kuřecí embryové chorioallantoické membráně (CAM).
Jeden kousek resorbovatelné želatinové pěny (gelforma) napuštěný 6 pg RB se vloží bezprostředně pod CAM 1 den starého kuřecího embrya. Po dalších třech dnech inkubace se 4 dny staré • 9 • 9 99 · • 9 · · · · • 999 ·
99 » · 999 9 • 9 9 9 • · 9 9 • 99 ·9·
9 • 9 99 embryo a obklopující CAM izoluje a zkouší. Na obr. IA je embryo ošetřné EHK-l RB (rEHK-1 ecto/hlgGl Fc) a má normálně vyvinuté krevní cévy v obklopujícím CAM. Na obr. IB jsou všechna embrya, ošetřná TIE-2 RB (r TIE-2 ecto/h IgGl Fc), mrtvá, mají zmenšenou velikost a většinou zcela bez obklopujicích krevních cév.
Obr. 2: Vektor pJFE14.
Obr. 3: Restrikční mapa lambdagtlO.
Obr. 4: Nukleová kyselina a dedukovaná nukleová kyselina (jednopísmenový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-1 z klonu lambdagtlO kódující htie-2-ligand-l.
Obr. 5: Nukleová kyselina a dedukovaná nukleová kyselina (jednopísmenový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-1 z klonu T98G.
Obr. 6: Nukleová kyselina a dedukovaná nukleová kyselina (jednopísměnový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-2 z klonu pBluescript KS kódující lidský TIE-2 ligand 2.
Obr. 7: Western blot ukazující aktivaci TIE-2 receptorů TIE-2 ligandem 1 (pás LI) nikoliv však TIE-2 ligandem 2 (pás L2) nebo kontrola (Mock).
Obr. 8: Western blot ukazující prioritní ošetření HAEC buněk s nadbytkem TIE-2 ligandu 2 (pás L2) antagonizuje následující schopnost ředit TIE-2 ligand 1 k aktivaci TIE-2 receptorů (TIE2-R) ve srovnání s prioritním ošetřením HAEC buněk prostředím Mock (Mock).
Obr. 9: Western blot ukazující schopnost TL2 konkurenčně inhibovat TL-1 aktivaci TIE-2 receptorů za použití lidské buněčné hybridní linie EA.hy926.
99 •999 9
9 99 · • « « * 9 9
9 9 9 9
9 9 9 99 9
9
Obr. 10: Histogram ukazující vázání na krysí TIE-2 IgG imobilizovaný povrch TIE-2 ligandu v C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP a T98G koncentrovaných (10 X) kondicionovaným prostředím. Krysí TIE-2 (rTIE2) specifické vázání je doloženo významnou redukcí aktivity vázání v přítomnosti 25 pg/ml rozpustného krysího TIE-2 RB ve srovnání s menší redukcí v přítomnosti rozpustného trkB RB.
Obr. 11: Vázání rekombinantního lidského TIE-2 ligandu 1 (hTLl) a lidského TIE-2 ligandu 2 (hTL2) v COS buněčných supernatantech na lidský TIE 2 receptorový (RB) imobílizovaný povrch. Lidské TIE-2-specifické vázání se stanovuje inkubací vzorků s 25 pg/ml bud rozpustného lidského TIE-2 RB nebo trkB RB; významné snížení aktivity vázání se pozoruje toliko pro vzorky inkubované s lidským TIE-2 RB.
Obr. 12: Western blot ukazující, že TIE-2 receptor (označovaný jako TIE-2 RB nebo jako zde TIE-2-Fc) blokuje aktivaci TIE-2 receptorů TIE-2 ligandem 1 (TLI) v HUVEC buňkách, zatímco nepříbuzný receptor (TRKB-Fc) neblokuje tuto aktivaci.
Obr. 13: Agarozové gely ukazující sériové ředění [nezředěno (1) až 104] TLI a TL2 RT-PCR produktů získaných z E14.5 myších fetálních jater (pásy 1 - totál, pásy 3 - stromálně obohaceno a pásy 4 c-kit+TER119 hematopoietické prekursorové buňky) a E14.5 myší fetální thymus (pásy 2 - totál).
Obr. 14: Agarozové gely ukazující sériové ředění [nezředěno (1) až IO3] TLI a TL2 RT-PCR produktů získaných z kortikálních trámčinových buněk E14.5 myšího fetálního thymu (pásy 1 CDR1 + /A2B5-) a z medulárních trámčinových buněk (pásy CDR1 + /A2B5+).
Obr. 15: Schéma hypotetické úlohy TIE-2/TIE ligandů v angiogenezi. TLI je představované (o), TL2 je představované (*), • ·
TIE-2 je představované (T), VEGF je přestavované ([]) a fikl (VEGF receptor) je představované (Y).
Obr. 16: In sítu hybridizční sklíčka ukazující dočasné expresní vzorce TIE-2, TLI, TL2 a VEGF v průvěhu angiogeneze, spojené s folikulárním vývojem a tvořením corpus luteum ve vaječníku krys ošetřených šerem, březí klisny. Sloupec 1: časný předovulační folikul; sloupec 2: předovulační folikul; sloupec 3: časný corpus luteum;a sloupec 4: atretický folukul; řádek A: široké pole; řádek B: VEGF; řádek C: TL2; řádek D: TLI; a řádek Ε: TIE-2 receptor.
Obr. 17: Srovnání aminokyselinových sekvencí zralého TLI proteinu a zralého TL2 proteinu. TLI sekvence je stejná jako na obr. 4 s tou výjimkou, že zdánlivá vedoucí sekvence se odstranila. Podobné TL2 sekvence je stejná jako sled podle obr. 6 s tou výjimkou, že zdánlivá vedoucí sekvence se odstranila. TIE-2 je představované (T), VEGF je přestavované ([]) a fikl (VEGF receptor) je představované (Y).
Obr. 18: Western blot kovalentni multimerní struktury TLI a TL2 (panel A) a interkonverze TLI a TL2 mutací jednoho cysteinu (panel B).
Obr. 19: Typická křivka TIE-2-IgG vázání k imobilizovanému TLI ve kvantitativním testu vázání v nepřítomnosti buněk.
Obr. 20: Typická křivka ukazující TIE-2 ligand 1 ligandové části obsahující fibrinogenidovou doménu ligandu vázaného na Fc doménu IgG (TLl-fFc) vázání k imobilizované TIE-2 ectodoméně ve kvantitativním testu vázání v nepřítomnosti buněk.
Obr. 21: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísmenový kód) sekvence TIE ligand 3. Kódující sekvence startuje v poloze 47. Fibrinogenová doména startuje v poloze 929.
• φ ·· φ · · · • φ ·· • φ φ φ • φ φ · • Φ ·· φ ♦ · φ · · φ · φ ♦ φφ ··
ΦΦ· » φ φ · » φ φ · φφφ ··'
Obr. 22: Srovnání aminokyselinových sekvencí TIE ligandových členů rodiny. mTL3 je myší TIE ligand-3; hTLl je lidský TIE-2 ligand-1; chTLl je kuřecí TIE-2 ligand-1; mTLl je myší TIE-2 ligand-1; mTL2 je myší TIE-2 ligand-2; hTL2 je lidský TIE-2 ligand-2. Boxované oblasti indikují konzervované regiony homologu mezi Cleny rodiny.
Obr. 23: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísměnový kód) sekvence TIE ligand 4. šipka indikuje nukleotidovou pozici 569.
Obr. 24: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísměnový kód) chimerniho TIE ligandu označeného 1N1C2F (chiméra 1). údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-60.
Obr. 25: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísměnový kód) chimerniho TIE ligandu označeného 2N2C1F (chiméra 2). údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-48.
Obr. 26: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísměnový kód) chimerniho TIE ligandu označeného 1N2C2F (chiméra 3). údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-60.
Obr, 27: Nukleotid a dedukovaná aminokyselina (jednopísměnový kód) chimerniho TIE ligandu označeného 2N1C1F (chiméra 4). údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-48.
Další podrobný popis je zaměřen na vytvořené nové modifikované TIE-2 ligandy, které váží TIE-2 receptor. Vynález se týká kompozice obsahující modifikovaný TIE-2 ligand v podstatě prostý jiných proteinů. Modifikovaným TIE-2 ligandem se míní ligand TIE rodiny ligandů, jejíž reprezentanty obsahují ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, který je obměněn adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo značením například PC podílu lidského IgG, který si však ponechává schopnost vázat TIE-2 receptor. Modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje také chimerní TIE-2 Iigand, obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního podílu TIE-2 ligandu. Příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezení, je prvním TIE-2 ligandem TLI a druhým TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá možnost jiné kombinace pro vytváření TIE-2 ligandu členů rodiny. Například jiné kombinace pro vytváření, chimerního TIE-2 ligandu jsou možné včetně, bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinací, kdy první Iigand je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4 a druhý Iigand, odlišný od prvního ligandu je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Vynález se rovněž týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 Iigand. Podle jednoho provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand rodiny TIE ligandů, jehož reprezentanty zahrnují shora popsané ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, které jsou obměněny adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo značením například PC podílu lidského IgG-1, který si však ponechává schopnost vázat TIE-2 receptor. Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 Iigand, který je chimerním TIE-2 ligandem, obsahujícím alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního podílu. Příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezení, je prvním TIE-2 ligandem TLI a druhým TIE-2 ligandem TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití přídavných členů TIE-2 ligandové rodiny. Například jsou možné další kombinace zahrnující příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezeni, kombinace, ve kterých izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 Iigand, který je chimerním TIE-2 ligandem obsahujícím podíl prvního ligandu voleného ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4 a podíl druhého ligandu, odlišného od prvního ligandu, voleného ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
• · • · • · · • ·
Vynález zahrnuje modifikované TIE-2 ligandy a jejich aminokyselinové sekvance jakož také jejich funkční ekvivalentní varianty, jakož také proteiny nebo peptidy zahrnující substituci, deleci nebo inserci mutantů popsaných sekvencí, které váží TIE-2 receptor a působí jako jejich agonisty nebo antagonisty. Takové varianty zahrnují případy, kdy jsou aminokyselinové zbytky nahrazeny zbytky v sekvenci vedoucí k tiché změně. Například jeden nebo několik aminokyselinových zbytků v sekvenci mohou být nahrazeny alespoň jednou jinou aminokyselinou s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent vedoucí k tiché obměně. Substituenty pro aminokyselinu v rámci sekvence mohou být veleny z jiných členů třídy, do které aminokyselina patří. Například třída nepolárních (hydrofobních) aminokyselin zahrnuje alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Aminokyseliny s pozitivním nábojem (zásadité) zahrnují arginin, lysin a histidin. Aminokyseliny s negativním nábojem (kyselé) zahrnují asparagovou a glutamovou kyselinu.
Vynález zahrnuje také proteiny nebo fragmenty jejich derivátů, které mají stejnou nebo podobnou aktivitu jako shora popsané modifikované TIE-2 ligandy a deriváty, které jsou odlišně modifikovány v průběhu translace nebo po ní, například glykosylací, proteolytickým štěpením, vázáním na protilátkovou molekulu nebo na jiný celulární ligand. Funkčně ekvivalentní molekuly také zahrnují molekuly, které obsahují modifikace, N-koncové modifikace, které jsou výsledkem exprese v určitém rekombinantním hostiteli, jako jsou například N-koncová modifikace, ke kterým dochází v určitých bakteriálních (například E.coli) expresních systémech.
Vynález zarhuje také nukleotidové sekvence, které kódují shora popsané proteiny jako modifikované TIE-2 ligandy, jakož • Φ ·* » φ Φ 1 ··· • Φ φ« »· φ φ · φ • · φ φ • φφφ ·φ« φ · φφ ·· také hostitelské buňky, včetně kvasinek, bakterií, virů a savčích buněk, které jsou geneticky upraveny k produkci proteinů, například transfekcí, transdukcí, infekcí, elektroporací nebo mikroinjekcí nukleové kyseliny, kódující shora popsané modifikované TIE-2 ligandy do vhodného expresního vektoru. Vynález také zahrnuje zavádění nukleové kyseliny kódující modifikované TIE-2 ligandy technikou . genové terapie, popsanou v literatuře (například Finkel a Epstein FASEB J. 9, str. 843 až 851, 1995; Guzman a kol. PNAS (USA) 91, str. 10732 ač 10736, 1994).
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že vynález zahrnuje DNA a PNA sekvence, které hybridizují na modifikovaném TIE-2 ligandu kódující nukleotidové sekvence za podmínek mírné tvrdosti, jak je objasněno v literatuře (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, svazek 1, str. 101 až 104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Proto molekula nukleové kyseliny, uvažovaná podle vynálezu, zahrnuje molekulu mající nukleotidovou sekvenci dedukovanou z aminokyselinové sekvence modifikovaného TIE-2 ligandu, jak shora popsáno, stejně jako molekulu mající sekvenci nukleotidů, které hybridizují na takové nukleotidové sekvenci a také nukleotidovou sekvenci, která je degenerát shora popsané sekvence jakožto výsledek genetického kódu, která však kóduje lígand, který váže TIE-2 receptor a která má aminokyselinovou sekvenci a jiné primární, sekundární a terciární charakteristiky, které jsou dostatečně duplikativní shora popsanému modifikovanému TIE-2 ligandu, takže dodávají molekule stejnou biologickou aktivitu jako má shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand.
Vynález se týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje Nkoncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje H-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2. Vy17 »· ** • 9 9 9 » * ·· • · · · * · · · ·· *· *· *♦ » · · « ► · · ♦ f«· ··« ·» nález se také týká takové molekuly nukleové kyseliny s další modifikací, přičemž podíl nuklsctidové sekvence, který kóduje spirálově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje spirálové stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
Vynález se také týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje Nkoncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje N~koncovou doménu TIE-2 ligandu 2 a který je dále modifikován ke kódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku kódovaného nukleotidy 784-787, jak je objasněno na obr. 27. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za cysteinový zbytek. Podle jiného provedení je molekula nukleové kyseliny modifikována ke kódování odlišné aminokyseliny místo argininového zbytku kódovaného nukleotidy 199-201, jak je objasněno na obr. 27. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za argininový zbytek.
Vynález se také týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, který je modifikován ke kódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku aminokyseliny v pozici 245. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za cysteinový zbytek.
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je vypuštěn. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje spirálově stoče• · • · ·· · * ·· • · · · · ·· · · · · · • · · · · · · · ···· • · · · · · · ··· · ··· · · · nou doménu ΤΙΞ-2 ligandu 1, je vypuštěn a podíl, který kóduje fibrinogenovou doménu je fúzován v rámu do nukleotidové sekvence kódující lidský imunoglobulinový gamma-1 konstantní region (IgG Fc).
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 2, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2, je vypuštěn. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje spirálově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2, je vypuštěn a podíl, který kóduje fibrinogenovou doménu je fúzován v rámu do nukleotidové sekvence kódující lidský imunoglobulinový gamma-1 konstantní region (IgG Fc).
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje fibrinogenovou domémnu TIE-2 ligandu 2. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje spirálově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje spirálově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
Vynález se dále týká modifikovaného TIE-2 ligandu zakodo váného jakýmikoliv molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu
Vynález se také týká chimerního TIE-2 ligandu obsahujícího alespoň část prvního TIE-2 ligandu a alespoň část druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandu, přičemž jsou první a druhé TIE-2 ligandy voleny ze souboru zahr- 19 ···· · · · · ···· ·«·· «··· · · · · • · · · · · · ··· · ··· ··· ······ · · · ·· · · ·· ·· ·· · · nujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE ligand 3 a TIE ligand 4. Výhody chimerní TIE-2 ligand obsahuje alespoň část TIE-2 ligandu 1 a alespoň část TIE-2 ligandu 2.
Vynález se také týká molekuly nukleové kyseliny, která kóduje chimerní TIE ligand, jak je uvedeno na obr. 24, 25, 26 nebo 27. Vynález se také . týká chimerního ligandu podle obr. 24, 25, 26 nebo 27. Vynález se také týká chimerního ligandu podle obr. 27, modifikovaného tak, aby měl odlišnou aminokyselinu místo cysteinového zbytku kódovaného nukleotidy 784-787.
Jakéhokoliv způsobu, známého pracovníkům v oboru pro inserci DNA fragmentů do vektoru, se může používat pro konstrukci expresního vektoru kódujícího modifikovaný TIE-2 ligand za použití vhodných transkripčních/translačních kontrolních signálů a proteinových kódujících sekvencí. Tyto způsoby mohou zahrnovat in vitro rekombinantní DNA a syntetické techniky a in vivo rekombinaci (genetická rekombinace). Exprese sekvence nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand nebo jejich peptidové fragmenty se může regulovat druhou sekvencí nukleové kyseliny, která je operativně vázána na modifikovaný TIE-2 ligand kódováním sekvence tak, že je modifikovaný TIE-2 ligandový protein nebo peptid expresován v hostiteli transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Například exprese modifikovaného TIE-2 ligandu, zde popsaná, se může řídit jakýmkoliv systémem promotor/podporovač, známým v oboru. Promotory, kterých se může používat k řízení exprese ligandu zahrnují bez záměru na jakémkoliv omezení dlouhou koncovou repetici, popsanou v literatuře (Squinto a kol., Cell 65, str. 1 až 20, 1991); SV4O časný promotorovy region (Bernoist a Chambon, Nátuře 290, str. 304 až 310), CMV promotor, M-MuLV 5' koncovou repetici, promotor obsažený ve 3' dlouhé koncové repetici viru Rous sarcoma (Yamamoto a kol., Cell 22, str. 787 až 797, 1980), oparový thimidinkinázový promotor (Wagner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, str. 144 až 145, • · ·· ·· ·· ·· · · • · · · ·· · · ·· · • · · · · · · · ·· · • · · · · · · · · · · · · · · · ····· · · ·
1981) , adenovirový prototor, regulační sekvence metallothioneinového genu (Brinster a kol., Nátuře 296, str. 39 až 42,
1982) , prokaryotické expresní vektory, například β-laktamázový promotor (Villa-Kamaroff a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75, str. 3727 až 3731, 1978) nebo tac promotor (DeVoer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80, str. 21 až 25, 1983), viz také Useful proteins .fťom recombinant bacteria (Scientific American 242, str. 74 až 94, 1980); promotorové prvky z kvasinek nebo z jiných hub, například GAL 4 promotor, ADH (alkoholdehydrogenázový) promotor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promotor, alkalický fosfatázový promotor a následující živočišné transkripční řídící regiony, které specificky exhibují tkáň a použily se v transgenních živočiších; elastázový I genový řídicí region, který je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (Swift a kol., Cell 38, str. 639 až 646, 1984; Ornitz a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, str. 399 až 409, 1986; Mac Donald, Hepatology 7, str. 425 až 515, 1987); inzulínový gen řídící region, který je aktivní v pankreatických β buňkách (Hanahan, Nátuře 315, str. 115 až 122, 1985); imunoglobulinový gen řídící region, který je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosscheld a kol., Cell 38, str. 647 až 658, 1984; Adames a kol., Nátuře 318, str. 533 až 538, 1985; Alexander a kol., Mol. Cell. Biol. 7, str. 1436 až 1444, 1987) myší prsní nádorový virový řídící region, který je aktivní v testikulárních, v prsních a v žírných buňkách (Leder a kol., Cell 45, str. 485 až 495, 1986), albuminový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Pinkert a kol., Genes and Devel. 1, str. 268 až 276, 1987), α-fetoproteinový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Krumlauf a kol., Mol. Cell. Biol. 5, str. 1639 až 1648, 1985; Hammer a kol., Science 235, str. 53 až 58, 1987); a 1-antitrypsinový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Kelsey a kol., Genes and Devel. 1, str. 161 až 171, 1987), β-globinový gen řídící region, který je aktivní v myeloidních buňkách (Morgan a kol., Nátuře 315, str. 338 až 340, 1985; Kollias a kol., Cell 46, str. 89 až 94, • · · · ·· · · ·· • · · · · · * · · · · ··· · · ♦ · · · « · ·· ··· · ··· · ··· ··· ♦ ···· · · · • · ·· · · · · ··
1986); myelinový bázický proteinový gen řídící region, který je aktivní v oligodendrocytes v mozku (Readhead a kol., Cell 48, str. 703 až 712, 1987); myosinový lehký řetězcový-2 gen řídící region,, který je aktivní ve skeletálních svalech (Shání , Nátuře 314 uvo1ňuj í cí gen (Mason a kol., dále zahrnuje str. 283 až 286, 1985) a gonadotropní hormon řídící region, který je aktivní v hypothalamu Nátuře 234, str. 1372 až 1378, 1986). Vynález produkci antimediátorových sloučenin, které jsou schopny specifické hybridizace se sekvencí. RNA kódující modifikovaný TIE-2 ligand k modulaci jeho exprese (Ecker, americký patentový spis číslo 5 166195, 24, listopadu 1992).
Podle vynálezu se expresní vektory schopné replikace v bakteriálním nebo v eukaryotickém hostiteli obsahujícím nukleovou kyselinu kódující modifikovaný TIE-2 ligand, jak shora popsáno, používají pro transfektování hostitele a tím k přímé expresi takové nukleové kyseliny k produkci modifikovaného TIE-2 ligandu, který se může získat v biologicky aktivní formě. Biologicky aktivní forma zde zahrnuje formu schopnou vázat TIE receptor a vyvolávat biologickou odezvu, jako diferenciovanou funkci nebo ovlivňovat fenotyp buňky expresující receptor. Takové biologicky aktivní formy mohou například navozovat fosforylaci tyrosinkinázové domény TIE receptoru. Nebo biologická aktivita může být jevem jako je antagonist k TIE receptoru. V alternativním provedení je aktivní formou modifikovaného TIE-2 ligandu forma, která může rozeznávat TIE receptor a tím působit jako terčové činidlo pro receptor pro použití k diagnostickým i k terapeutickým účelům. Podle tohoto provedení vynálezu aktivní forma nemusí dodávat žádné TIE expresní buňce žádnou změnu fenotypu.
Expresní vektory obsahující genové inserty mohou být identifikovaný prostřednictvím čtyř obecných přístupů: (a) DNA-DNA hybridizace, (b) přítomnost nebo nepřítomnost funkcí markerového genu, (c) exprese včleněných sekvencí a (d) PCR detekce.
• · • ·
Podle prvního přístupu se může zjišťovat přítomnost cizího genu, včleněného do expresního vektoru DNA-DNA hybridizací za použití nukleotidových sond obsahujících sekvence, které jsou homologické se zřetelem na včleněný modifikovaný TIE-2 ligand kódující gen. Podle druhého přístupu se může identifikovat rekombinantní systém vektor/hostítel a selektovat na základě přítomnosti nebo nepřítomnost funkcí markerového genu (například thimidinkinázové aktivity, odolnosti proti antibiotikům, transformačního fenotypu, vytváření oklusní látky v baculoviru) způsobujících inserci cizích genů do vektoru. Například jestliže se včlení nukleová kyselina kódující modifikovaný TIE-2 ligand v markerové genové sekvenci vektoru, mohou se identifikovat rekombinanty nepřítomností markerové genové funkce. Podle třetího přístupu se mohou identifikovat rekombinantní expresní vektory zjištěním cizího genového produktu expresovaného rekombinantem. Taková zjištění mohou být založena například na fyzikálních nebo na funkčních vlastnostech modifikovaného TIE-2 ligandového genového produktu, například vázáním ligandu na TIE receptor nebo na jeho část, která se může značit například zjistitelnou protilátkou nebo její částí nebo vázáním protilátek, produkovaných proti modifikovanému TIE-2 ligandovému proteinu nebo jeho části. Buňky podle vynálezu mohou přechodně, konstitučně nebo trvale expresovat modifikovaný TIE-2 ligand, jak shora uvedeno. Podle čtvrtého přístupu se mohou připravovat DNA nukleotidové primery odpovídající smyčkové specifické DNA sekvenci. Tyto primery se mohou používat pro PCR smyčkový fragment (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, vydavatel Michael A. Innis a kol., Academie Press, 1990).
Rekombinantní ligand se může čistit jakýmkoliv způsobem, který umožňuje následující vytvoření stabilního, biologicky aktivního proteinu. S výhodou se ligand vylučuje do kultivačního prostedí, ze kterého se získal. Nebo se ligand může získat z buněk bud ve formě rozpustných proteinů nebo jako ink23 ·· *♦ · · · · 9··· · · · · · • · · · ···· · • · · ··· · · · · · • · · · · · · luzní látky, ze kterých se může kvantitativně extrahovat 8M guanidiniumhydrochloridem a dialýzou o sobě dobře známými způsoby. Pro další čištění ligandu se může používat afinitní chromatografie, konvenční ionexové chromatografie, hydrofobní interakční chromatografie, reverzní fázové chromatografie nebo gelové filtrace.
Podle přídavného provedení vynálezu, podrobněji popsaného v příkladech, se může modifikovaný TIE-2 ligand kódující gen používat pro inaktivaci nebo knock out endogenního genu homologovou rekombínací a tím k vytváření TIE ligandu postrádajícího buňky, tkáně nebo živočichy. Například bez záměru na jakémkoliv omezení se může konstruovat rekombinantní TIE ligand-4 kódující gen obsahující insercionální mutaci, například neo gen, který by mohl inaktivovat nativní TIE ligand-4 kódující gen. Takový konstrukt za řízení vhodného promotoru, se může zavádět do buňky, jako je embryonická kmenová buňka, způsobem například transfekce, transdukce nebo injekce. Buňky, obsahující konstrukt, se pak mohou selektovat G418 odolností. Buňky prosté intaktní TIE lígand-4 kódujícího genu se pak mohou identifikovat například způsobem Southern blotting. PCR detekce, Northern blotting nebo zkouškou exprese. Buňky prosté intaktní TIE ligand-4 kódujícího genu se pak mohou fúzovat na časné embryové buňky pro generaci transgenických živočichů prostých takového ligandu. Takoví živočichové se mohou používat k definici specificky in vivo procesech, normálně závislých na ligandech.
Vynález se také týká protilátek k modifikaci popsaného TIE-2 ligandu, který je užitečný pro detekci ligandu například pro diagnostické účely. Pro přípravu monoklonálních protilátek, zaměřených na modifikovaný TIE-2 ligand, se může používat jakéhokoliv způsobu pro produkci protilátkových molekul kontinuálními buněčnými liniemi v kultuře. Například do rozsahu vynálezu patří’technika hybridoma, kterou vyvinul původně Kohler • · ·· · · ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · · • · ·· · · · · ···· • ·· * · · · ···· ··· ··· a Milstein (Nátuře 256, str. 495 až 497, 1975), jakož také technika trioma, technika lidského B-buňky hybridoma (Kozbor a kol., Immunology Today 4, str. 72, 1983) a technika EBV-hybridoma pro produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole a kol., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, lne. str. 77 až 96, 1985) .
Monoklonálními protilátkami mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimerní lidsko-myší (nebo jiného typu) monoklonální protilátky. Lidské monoklonální protilátky se mohou vyrábět četnými způsoby, známými ze stavu techniky (například Tang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80, str. 7308 až 7312, 1983; Kozbor a kol., Immunology Today 4, str. 72 až 79, 1982; Olsson a kol. Meth. Enzymol 92, str. 3 až 16, 1982). Mohou se připravovat molekuly chimerní protilátky obsahující myší antigen vázající doménu s lidskými konstantními regiony (Morrison a kol., Proč. Nati. Acad. Sci U.S.A. 81 , str. 6851, 1984; Takeda a kol. Nátuře 314, str. 452, 1985).
Mohou se použít různé způsoby, známé ze stavu techniky pro produkci polyklonálních protilátek na epitopy modifikovaného shora popsaného TIE-2 ligandu. Pro výrobu protilátky se mohou imunizovat různí hostitelé, přičemž se příkladně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, uvádějí králíci, myši a krysy, vstřikováním modifikovaného TIE-2 ligandu nebo jeho fragmentu nebo derivátu. Mohou se používat různá pomocná činidla ke zvýšení imunologické odezvy v závislosti na druhu hostitele a včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, Freundova činidla (kompletního a nekompletního), minerálních gelů, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivních látek, jako jsou lysolecithin, pluronických polyolů, polyaniontů, peptidů, olejových elulzí, hemocyaninů, dinitrofenolu a potenciálně užitečných lidských pomocných činidel, jako je BCG (Bacille Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.
·· ♦♦ · 9 ·« »9 9» • · · · t 9 · » * · « 9 ···· · * · · 9 1 9 · • · · · · ♦ · ·»9 9 ·»· 99* • 9 9 9 9 « 9 · · »9 99 ·· ·· »· ··
Molekulární klon protilátky k selektovanému modifikovanému TIE-2 ligandovému epitopu se může připravovat o sobě známým způsobem. Rekombmantní DNA metodika (například Maniatis a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Your, 1982) se může používat ke konstruování sekvencí nukleové kyseliny, které kódují monoklonální protilátkovou molekulu nebo region vázání její protilátky.
Vynález se týká protilátkových molekul a fragmentů takových protilátkových molekul. Protilátkové fragmenty, které obsahují idiotyp molekuly, se mohou generovat o sobě známými způsoby. Napříkad takové fragmenty zahrnují, avšak bez záměru na jakémkoliv omezeni, F(ab')2 fragment, který se může produkovat pepsinovou digescí protilátkové molekuly; Fab' fragmenty, které se mohou generovat redukcí disulfidických můstků F(ab')2 fragmentu a Fab fragmenty, které se generují zpracováním protilátkové molekuly papainem a redukčním činidlem. Protilátkové molekuly se mohou čistit o sobě známými způsoby, například imunoabsorpční nebo imunoafinitní chromatografií, chromatografickými způsoby, jako je HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) nebo kombinacemi těchto způsobů.
Vynález zahrnuje imunozkoušku pro měření množství modifikovaného TIE-2 ligandu v biologických vzorcích, při které se
a) uvádí do styku biologický vzorek s alespoň jednou protilátkou, která specificky váže modifikovaný TIE-2 Iigand, takže protilátka vytváří komplex s jakýmkoliv TIE-2 ligandem obsaženým ve vzorku a
b) měří se množství komplexu a tím se měří možství modifikovaného TIE-2 ligandu ve vzorku.
Vynález se také týká využití modifikovaného TIE-2 ligandu, který aktivuje TIE-2 receptor, jak shora popsáno, k podpoře přežití a/nebo růstu a/nebo migrace a/nebo diferen• ··· 9 · 9 9 9 9 9 9
99 999 9 999 9 999 999
9 9 9 9 9 9 9 9
99 Η «· ·· ·· ciace TIE-2 buněk expresujících receptor. Ligand se tak může využít jako doplněk nosiče, například endotelových buněk v kultuře.
Kromě toho vytvoření modifikovaného TIE-2 ligandu pro TIE-2 receptor umožňuje využít testovacích systémů užitečných pro identifikaci agonistů nebo antagonistů TIE-2 receptoru. Takové testovací systémy by mohly být užitečné v identifikačních molekulách schopných podpory nebo inhibíce angiogenese. Například podle jednoho provedení se mohou antagonisty TIE-2 receptoru identifikovat jako testovací molekuly, které jsou schopny interference s interakcí TIE-2 receptoru s modifikovaným TIE-2 ligandem, který váže TIE-2 receptor. Takové antagonisty se identifikují svojí schopností 1) blokovat vázání biologicky aktivního modifikovaného TIE-2 ligandu na receptor při měření například za použití technologie BIAcore biosensor (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway. NJ) nebo 2) blokovat schopnost biologicky aktivního modifikovaného TIE-2 ligandu vyvolávat biologickou odezvu. Takové biologické odezvy zahrnují příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezení, fosforylaci TIE receptoru nebo složek TIE signálu transdukční cestou nebo přežití, růst nebo diferenciaci TIE receptor nesoucích buněk.
Podle jednoho provedení buňky, směrované k expresi TIE receptoru, mohou být závislé pro růst na přidání modifikovaného TIE-2 ligandu. Takové buňky poskytují užitečné testovací systémy pro identifikaci přídavných agonistů TIE receptoru nebo antagonistů schopných rušit aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu na takové buňky. Nebo autocrinní buňky, upravené ke schopnosti koexprese jak modifikovaného TIE-2 ligandu tak recetoru, mohou být užitečnými systémy možných agonistů nebo antagonistů.
Vynález proto umožňuje zavedení TIE-2 receptoru do buněk, které by normálně neexpresovaly tento receptor a tak umožňuje těmto buňkám vytvářet výrazné a snadno rozlišitelné odezvy na ligand, který váže tento receptor. Typ vyvolané odezvy závisí na použité buňce a nikoliv na specifickém receptorů, zavedeném do buňky. Mohou se volit vhodné buněčné linie k dosažení odezvy největší užitečnosti pro posouzení i pro objevení molekul, které působí jako receptory tyrosinkinázy. Těmito molekulami může být jakýkoliv typ molekuly včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, peptidových a nepeptidových molekul, které působí v popisovaných systémech receptorově specifickým způsobem .
Jeden z četných použitelných systémů zahrnuje zavedení TIE receptorů (nebo chimerového receptorů obsahujícího extracelulární doménu jiné receptorově tyrosinkinázy, jako například trkC a intracelulární doménu TIE receptorů) do fibroblastové buněčné linie (například NIH3T3 buňky), takže receptor, který normálně nezprostředkovává proliferativní nebo jiné odezvy, může po zavedeni do fibroblastů být nicméně testován různými dobře známými způsoby ke kvantitativnímu stanovení fibroblastových růstových faktorů (například začlenění thymidinu nebo jiných typů zkoušek proliferace, van Zoelen, The Use Of Biological Assay For Detection Of Polypeptide Growth Factors, Progress Factor Research, svazek 2, str. 131 až 152, 1990; Zhan a M. Goldfarb, Mol. Cell. Biol. svazek 6, str. 3541 až 3544, 1986). Tyto testy mají přídavnou výhodou, že se může zkoušet jakýkoliv preparát jak buněčné linie se zavedeným receptorem tak mateřské buněčné linie bez receptorů; posuzují se toliko jevy na buněčné linii s receptorem zprostředkovávané zavedením receptorů. Takové buňky mohou být dále upravovány k expresi modifikovaného TIE-2 ligandu za vytváření autokrinního systému užitečného pro zkoušení molekul, které působí jako antagonisty/agonisty pro toto vzájemné působení. Vynález tak umožňuje pro hostitelské buňky, obsahující nukleovou kyselinu, kódovat modifikovaný TIE-2 ligand a nukleovou kyselinu • · β · ·« • » · • · ·· » · · • · · • · · <Ď zakódující TIE receptor.
Interakce TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand také poskytuje užitečný systém pro identifikaci malých molekulových agonitů nebo antagonistů TIE receptoru. Například fragmenty, mutanty nebo deriváty modifikovaného TIE-2 ligandu umožňují další charakterizaci aktivních podílů molekuly. Identifikace ligandu umožňuje také stanovení rentgenovou krystalovou strukturu komplexu receptor/ligand, čímž je umožněna idetifikace vázacího místa na receptoru. Znalost vázacího místa se jeví užitečná pro racionální konstrukci nových agonistů a antagonistů.
Specifické vázání testované molekuly na TIE receptor se může měřit různými způsoby. Například aktuální vázání testované molekuly na buňky expresující TIE se mohou zjistit nebo měřit detekcí nebo měřením (1) testované molekuly vázané na povrch nedotčené buňky, (ii) testované molekuly příčně vázané na TIE protein v buněčných lyzátech nebo (iii) testované molekuly vázané na TIE in vitro. Specifická interakce mezi testovanou molekulou a TIE se může vyhodnocovat použitím reakčních činidel, která demonstrují jedinečné vlastnosti takové interakce.
Jakožto specifický příklad, bez záměru na jakémkoliv omezení, se způsobu podle vynálezu používá následovně. Uvažuje se případ, při kterém se měří modifiovaný TIE-2 ligand ve vzorku. Obměňující se ředění vzorku (testovaná melekula) paralelně s negativní kontrolou (NC), prostou modifikované TIE-2 aktivity, a s pozitivní kontrolou, obsahující známé množství modifikovaného TIE-2 ligandu, se může vystavovat působení buněk, které expresují TIE v přítomnosti zjistitelného značeného modifikovaného TIE-2 ligandu (v tomto případě rádiojodovaného ligandu). Množství modifikovaného TIE-2 ligandu v testovaném vzorku se může vyhodnocovat stanovením množstvé 125J-značeného modifikovaného TIE-2 ligandu, které se váže na kontroly a • · · e · · · · · • φ φφ φφφφ · φ φφ φ φ » φ φφφφ φφφ·φφ φ φ φ φ · φφ φφ «φ φ · φφ v každém zředění a pak porovnáním hodnot vzorku se standardní křivkou, čím je více modifikovaný TIE-2 ligand ve vzorku, tím méně se váže 125J-ligand na TIE.
Množství vázaného 125J-ligandu se může stanovit měřením množství radioaktivity na buňku nebo příčně vázaného modifikovaného TIE-2 ligandu na buněčný povrch proteinů za použití DSS způsobem, který popsal Maekin a Shooter (Nátuře 6, str. 153 až 163, 1991) a detekcí množství značeného proteinu v buněčných extraktech za použití například SDS polyakrylamidové gelové elektroforéze, která může zjistit značený protein mající velikost odpovídající systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand. Specifický test interakce molekula/TIE se může dále testovat přidáním do zkoušky různých ředění neznačeného kontrolního ligandu, který neváže TIE receptor, a proto nemá podstatný vliv na konkurenci mezi značeným modifikovaným TIE-2 ligandem a testovanou molekulou se zřetelem na TIE vázání. Nebo molekula, o které je známo, že ruší vázání systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand, například avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, antiTIE protilátka nebo TIE-2 receptor, jak shora uvedeno, podle očekávání bude interferovat s konkurencí mezi 125J-modifikovaným TIE-2 ligandem a testovanou molekulou pro vázání TIE receptorů.
Stanovitelný značený modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje například, avšak bez záměru na jakémkoliv omezeni, modifikovaný TIE-2 ligand nvázaný kovalentně nebo nekovalentně na radioaktivní látku, na fluorescenční látku, na látku s enzymovou aktivitou, na látku, která může sloužit jako substrát pro enzym (přednost se dává enzymům a látkám s kolorimetricky zjistitelnou reakcí), nebo na látku, která se může zjistit protilátkovou molekulou, což je s výhodou značená protilátková molekula .
Nebo specifické vázání zkoušené molekuly na TIE se může » » · · · · · · • · · · · · · · » · · · 9 · · · · · · · · · · · • 99 ♦ * * * 999 9 ··· 999
9 9 9 9 · 9 9 ·
99 99 99 99 99 měřit hodnocením sekundárních biologických vlivů vázání systému modifikovaný TIE-2 ligand/TIE receptor včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, růstu buněk a/nebo diferenciace nebo bezprostřední urychlené exprese genu nebo fosforylace TIE. Například schopnost testované molekuly zahrnovat diferenciaci se může testovat v buňkách, které nemají tie a ve srovnatelných buňkách, které expresují tie; diferenciace tie expresu jících buněk nikoliv však ve srovnatelných buňkách prostých tie je indikativní pro specifickou interakci testovaná molekula/TIE. Podobná analýza se může provádět detekcí bezprostředně časného genu (například fos a jin) zavedením tie-minus a tie-plus buněk nebo detekcí fosforylace TIE za použití standardního fosforylačního testu v oboru o sobě známého. Takové analýzy mohou být užitečné pro identifikaci agonistů nebo antagonistů, které se konkurenčně neváží na TIE .
Podobně vynález umožňuje způsob identifikace molekuly, která má biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandů, zahrnující (i) expozici buňky, které expresuje tie, testovací molekuly a (ii) detekci specifického vázání testované molekuly na TIE receptor, přičemž specifické vázání na TIE je v pozitivním vztahu s TIE obdobnou aktivitou. Specifické vázání se může zjistit bud testováním přímé vazby nebo podle sekundárních biologických působení vázání, jak shora uvedeno. Takový způsob je obzvláště užitečný pro identifikaci nových členů rodiny TIE ligandů nebo ve farmaceutickém průmyslou při skrínování velké řady peptidových a nepeptidových molekul (například peptidomimetika) pro biologickou aktivitu spojenou s TIE. Podle výhodného, specifického nikoliv však omezujícího provedení vynálezu se může připravit velká sada kultivačmních důlků, které obsahují řady PC12 buněk (nebo fibroblastů, jak shora uvedeno), které jsou bud tie-minus nebo jsou konstruovány, aby byly tie-plus. Mohou se přidávat četné testované molekuly, aby každá řada nebo její část obsahovala různé testované molekuly. Následně se hodnotí každý důlek se zřetelem na přítomnost nebo • · 99 99 • · · · · • · · · 9 • 9 9 · * 9 · 9 · 9
9· «9 99
9 9 9
9 9
9 9
999 999
9
9 9 nepřítomnost růstu a/nebo diferenciace. Mimořádně velké množství testovaných molekul se mohou tímto způsobem skrínovat se zřetelem na takovou aktivitu.
Přídavně vynález umožňuje detekci nebo měření aktivity podobné TIE ligandové aktivitě nebo identifikaci molekuly mající takovou aktivitu (i) vystavením testované molekuly TIE receptorovému proteinu in vitro za podmínek, které umožňují vázání, (ii) detekci vázání testované molekuly na TIE receptorový protein, přičemž je vazba testované molekuly na TIE receptor ve vztahu k aktivitě podobné aktivitě TIE ligandu. Při takovém způsobu se TIE receptor může nebo nemusí v podstatě čistit, může být fixován na pevný nocič (například na afinitní sloupec nebo jako při testu ELISA) nebo může být včleněn do umělé membrány. Vázání testované molekuly na TIE receptor se může hodnotit jakýmkoliv známým způsobem. Podle výhodného provedení se vázání testované molekuly zjišťuje nebo měří hodnocením schopnosti konkurovat se zjistitelně značenými známými TIE ligandy pro TIE receptorové vázání.
Vynález se také týká zjišťování schopnosti testované molekuly působit jako antagonist podobné ligandové aktivity jako ligandové aktivity TIE, přičemž se zjišťuje schopnost molekuly inhibovat vliv TIE ligandového vázání na TIE receptor buňky, která expresuje receptor. Takový antagonist může ale nemusí interferovat vázání systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand. Vlivy vázání modifikovaného TIE-2 ligandu na TIE receptor jsou přednostně biologické nebo biochemické včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, přežívání nebo proliferace buněk, tranformace buněk, bezprostřední časné genové indukce nebo TIE fosforylace.
Vynález se dále týká jak způsobu identifikace protilátak nebo jiných molekul schopných neutralizace ligandu nebo blokovat vázání na receptor, tak molekul pro tento způsob. Na32 • · · příklad, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, se může způsobu využít podobně jako testu ELISA. Například se TIE reptorová látka (receptorbody) může vázat na pevný nosič, jako je plastová mnohodůlková destička. Jako kontrola se do důlku může zavádět známé množství modifikovaného TIE-2 ligandu, které je Myc značené a jakýkoliv značený modifikovaný TIE-2 ligand, který se váže na receptórovou látku, se pak může identifikovat receptorovou protilátkou směrovanou proti značení Myc-tag. Tento testovací systém se pak může použít ke skrínování vzorků molekul, které jsou schopny i) vazby značený ligand nebo ii) vazby na receptorovou látku a tak blokovat vazbu na receptorovou látku značeným liaandem. Například testovaný vzorek obsahující zkoumanou molekulu spolu se známým množstvím značeného ligandu se může zavádět do důlku a měří se množství značeného ligandu, které se váže na receptorovou látku. Porovnáním množství vázaného značeného ligandu v testovaném vzorku se množstvím v kontrole, se mohou identifikovat vzorky obsahující molekuly schopné blokovat vazbu ligandu na receptor. Takto identifikované molekuly se mohou izolovat o sobě známými způsoby pracovníkům v oboru.
Jakmile se zjistí blokátor vazby ligandu, je pracovník v oboru schopen provést sekundární zkoušku ke stanovení, zdali se blokátor váže na receptor nebo na ligand a zjistit, zdali blokátorová molekula je schopna neutralizovat biologickou aktivitu ligandu. Například za použití testu vázání, při kterém se používá BIAcore biosensorové technologie (nebo zařízení), přičemž se bud TIE receptor nebo modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandová látka kovalentně váže na pevný nosič (například karboxymethyldextran na zlatém povrchu), je pracovník v oboru schopen stanovit, zadli se blokátorová molekula váže specificky na ligand, na ligandovou látku nebo na receptorovou látku. Ke stanovení, zdali blokátorová molekula může neutralizovat biologickou aktivitu ligandu, může pracovník v oboru provádět fosforylační zkoušku (příklad 5) nebo funkční biotest, jako je
test přežívání, za použití primární kultury například endotelových buněk. Nebo blokátorová molekula, která se váže na receptorovou látku, může být antagonistem a pracovník v oboru to může zjistit vhodným testem pro identifikaci přídavných agonistů TIE receptoru.
Vynález se také týká kompozic, přičemž TIE ligand je receptorovou vázací doménou TIE-2 ligandu, jak shora popsáno. Například TIE-2 ligand 1 obsahuje smyčkově stočenou (coiled coil) doménu (začínající na 5’ zakončení a táhnoucí se přibližně k poloze 1160 na obr. 4 a přibližně k poloze 1157 na obr. 5) a fibrinogenovou doménu (která je zakódovaná nukleotidovou sekvencí podle obr. 4 začínající přibližně v poloze 1161 a přibližně k poloze 1158 na obr. 5). Fibrinogenová doména TIE-2 ligandu 2 pravděpodobně začíná na aminokyselinovoé sekvenci jako ligand 1 nebo okolo této sekvence jako ligand 1 (FRDCA), která je zakódovaná nukleotidy začínajícími přibližně v poloze 1197 na obr. 6. Fibrinogenová doména TIE ligandu 3 pravděpodobně začíná na aminokyselinové sekvenci okolo sekvence, která je zakódovaná nukleotidy začínajícími okolo polohy 929 na obr. 21. Multimerizace smyčkově stočené domény při produkci ligandu vadí čištění. Jak se popisuje v příkladu 19, zjistilo se podle vynálezu, že fibrinogenová doména obsahuje TIE-2 receptorovou vázací doménu. Monomerní formy fibrinogenové domény se však nejeví, že by vázaly receptor. Studie, využívající myc-značenou fibrinogenovou doménu, která byla nahromaděna anti-myc protilátkami, váže TIE-2 receptor.(Způsoby produkce nahromaděných ligandů a ligandových látek popsal Davisa a kol., Science 266, str. 816 až 819, 1994). Na zákldě těchto poznatků byly podle vynálezu připraveny ligandové látky, které obsahují fibrinogenovou doménu TIE-2 ligandu kopulovanou na Fc doménu IgG (fFc's). Tyto ligandové látky, které vytvářejí dimery, účinněji váží TIE-2 receptor. Podle vynálezu se uvažuje o produkci modifikovaných TIE ligandových protilátek, kterých se může používat jako štítových činidel
99
9 9
9 99
9 9
99 9
9 pro nádory a/nebo pro asociovanou vaskulaturu, přičemž se indikuje TIE antagonist.
Vynález se dále týká vývoje ligandu, fragmentu nebo jiného derivátu nebo jiné molekuly, která je receptorovým agonistem nebo antagonistem jako terapeutického činidla pro ošetřování jedinců trpících poruchami buněk, tkání nebo orgánů, které expresují TIE receptor. Takových molekul se může používat pro ošetřování lidí nebo zvířat nebo při diagnostice.
Jelikož TIE receptor byl identifikován v asociaci s endotelovými buňkami a jak zde doloženo, blokování TIE-2 ligendu 1 se jeví jako prevence vaskularizace, očekává se podle vynálezu, Že modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu může být užitečný pro navozování vaskularizace při nemocích nebo poruchách, kde se taková vaskularizace indikuje. Takové nemoci a poruchy zahrnují hojení ran, ischemii a diabetes. Ligandy se mohou zkoušet na zvířecích modelech a používat terapeuticky jako jiné účinné látky, jako například vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF), jiný endotelový buněčně specifický faktor než angiogenní (Ferrara a kol., americký patentový spis číslo 5 332671, 26. července 1994). Ferrara, jakož také jiní autoři, popisují in vitro a in vivo způsoby k doložení vlivu angiogeního faktoru při podpoře toku krve do ischemického myokardu, k podpoře hojení ran a pro další terapeutické účely, kde je žádoucí neoangiogenéze (Sudo a kol., evropská přihláška vynálezu číslo 0 550296 A2 , zveřejněná 7. července 1993; Banai a kol., Circulation 89, str. 2183 až 2189, 1994; Unger a kol., Am. J. Physiol. 266, str. H1588 až 1595, 1994; Lazarous a kol., Circulation 91, str. 145 až 153, 1995). Podle vynálezu modifikovaný TIE-2 ligand se může používt samotný nebo spolu s jedním nebo s několika přídavnými farmaceuticky účinými sloučeninami, jako jsou například VEGF nebo bázický fibroblastový růstový faktor (bFGF), stejně jako cytokiny nebo neurotrof iny.
·· ·· • · · · • · ·Φ • · · · • · · · • ·· · · ·· · • · · · · · · · • · · · · · · · · · · · • · · φ φ
Naproti tomu antagonisty TIE receptorů, jako modifikované TIE-2 ligandy, které váží avšak neaktivují zde popsaný receptor, receptorovou látku, jak popsáno v příkladu 2 a 3 a TIE-2 ligand 2, jak popsáno v příkladu 9, jsou užitečné k předcházení nebo k zeslabení vaskularizace a tak k předcházení nebo k zeslabení nádorového růstu. Tato činidla se mohou používat samotá nebo v kombinaci s jinými Činidly, jako jsou například anti-VEGF protilátky, které se jeví jako užitečné při ošetřování stavů, při kterých je terapeutickým záměrem blokovat angiogenezi. Podle vynálezu se očekává, že modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu může být také užitečný s činidly, jako jsou například cytokinové antagonisty, například IL-6 antagonisty, o kterých je známo, že blokují záněty.
Například se podle vynálezu zjistilo, že se TIE ligandy expresují v buňkách v nádorech nebo v těsně přilehlých buňkách. Napříklaed TIE-2 ligand 2 se jeví jako těsně přiléhající k nádorovým endotelovým buňkám. Proto také jiné TIE antagonisty mohou být užitečné při prevenci nebo zeslabování například nádorového růstu. Kromě toho TIE ligandy nebo ligandové látky mohou být užitečné pro uvolňování toxinů k buňce nesoucí receptor. Nebo jiné molekuly, například růstové faktory, cytokiny nebo živiny se mohou uvolňovat k TIE receptor nesoucím buňkám prostřednictvím TIE-2 ligandů nebo ligandových látek. TIE-2 ligandy nebo ligandové látky, jako modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu se také mohou používat jako diagnostické reakční činidlo pro TIE receptor ke zjišťování receptorů in vivo a in vitro. Když souvisí TIE receptor s chorobným stavem, TIE ligandy nebo ligandové látky, například modifikovaný TIE-2 ligand, mohou být užitečné jako diganostická činidla k detekci nemoci nebo například k zabarvení tkáně nebo k představě celého těla. Taková reakční činidla zahrnují radioisotopy, fluorochromy, barviva, enzymy a biotin. Taková dignostická a štítová činidla se mohou připravovat způsobem, který popsal Alitalo a kol., (světový patentový spis číslo WO 95/26364, • · ·· • · · · ·
0 00 · • 0 0 · · · « · · · · • 0 0 • ··· · ·· • 0 <
»00 «·« zveřejněno 5. října 1995; a Burrows F a Thorpe P., PNAS (USA) 90, str. 8996 až 9000, 1993).
Podle jiného provedení TIE ligandy, receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu se používají jako hematopoietické faktory. Různé hematopoietické faktory a jejich receptory jsou zahrnuty v prolifaraci a/nebo v diferenciaci a/ nebo v migraci různých buněčných typů obsažených v krvi. Jelikož jsou TIE receptory expresovány časnými hematopoietickými buňkami, očekává se, že TIE ligandy budou mít podobný úkol v proliferaci nebo v diferenciaci nebo v migraci těchto buněk. Proto se například mohou TIE obsahující prostředky připravovat, testovat a zkoušet v biologických systémech in vitro a in vivo a terapeuticky používat, jak je popsáno v literatuře (například Sousa, americký patentový spis číslo 4 810643; Lee a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, STR. 4360 ažo 4364, 1985; Wong a kol., Science, 228, str. 710 až 814, 1985; Yokota a kol., Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 81, str. 1070, 1984; Bosselman a kol., světový patentový spis číslo WO 91/05795, zveřejněný 2. května 1991 pod názvem Stem Cell Factor; a Kirkness a kol., světový patentový spis číslo WO WO 95/19985, zveřejněný 27. června 1995 pod názvem Haemapoietic Maturation Factor). Proto se receptorového aktivačního modifikovaného TIE-2 ligandu může používat pro diagnostikování a pro ošetřování stavů, při kterých je normální hematopoieze potlačena, včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, anemie. thrombocytopenie, leukopenie a granulocytopenie. Podle výhodného provedení receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand se může používat pro stimulaci diferenciace prokursorů krevních buněk v situacích, kdy jedinec trpí nemocí, jako je získaný syndrom imunitní nedostatečnosti (AIDS), který způsobí snížení normální hladině krevních buněk nebo v klinických stavech, při kterých je žádoucí podpora hematopoietické populace, jako při transplantaci kostní dřeně nebo při ošetřování aplasie nebo myelopotlačení v důsledku ozáření, chemického ošetřování nebo • ·· · · · · · · · · · • · ·· · · · · · · · · • ·· · · · · ·*· · ··· ·*· ······ · · · chemoterapie .
Receptorové aktivační modifikované TIE-2 ligandy podle vynálezu se mohou používat samotné nebo spolu s jinými farmaceuticky aktivními látkami, jako jsou například cytokiny, neurotropiny a interleukiny. Podle výhodného provedení se ligandy mohou používat spolu s jakýmkoliv počtem shora uvedených faktorů, o nichž je známo, že indukují proliferaci kmenové buňky nebo jiného hematopoietického prekursoru, nebo faktorů působících na další buňky v hematopoietické cestě včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, hematopoietického faktoru zrání, thrombopoietinu, faktoru kmenové buňky, erythropoietinu, G-CSF a GM-CSF.
Podle alternativního provedeni TIE receptorové antagonisty jsou užitečné k diagnóze nebo k ošetřování jedinců, přičemž je žádoucí inhibice hematopoietické cesty, například při ošetřování myeloproliferativních nebo jiných proliferativních porch krvetvorných orgánů, jako je thrombocythemie, polycythemie a leukemie. Podle takového provedení může ošetřování zahrnovat použití terapeuticky účinného množství modifikovaného TIE-2 ligandu, TIE protiolátky, TIE receptorové látky, konjugátu modifikovaného TIE-2 ligendu nebo ligandové látky fFC, jak shora uvedeno.
Vynález se také týká farmaceutických prostředků, obsahujících modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku zde popsanou, její peptidové fragmenty nebo deriváty ve farmaceuticky vhodném nosiči. Modifikované TIE-2 ligandové proteiny, peptidové fragmenty nebo deriváty se mohou podávat systdemicky nebo místně. Může se použít jakýkoliv vhodný způsob podání včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, intravenozního, intrathekálního, intraarteriálního, intranasálního, orálního, subkutanního, intraperitoneálního nebo lokálního vstřikování nebo chirurgického implantátu. Jsou také možné pro• 9 • 9 9«
9 9 9 · 99
9 9 9 9
9 9 9
99
99
9 9 9
9 9 9
999 999
9
99 středky s pozdrženým uvolňováním.
Vynález se také týká protilátky, která specificky váže taškovou terapeutickou molekulu. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká způsobu použití takové monoklonální nebo polyklonální protilátky k měření množství terapeutické molekuly ve vzorku odebraném jedinci pro monitorování průběhu terapie.
Vynález se dále týká terapeutického prostředku obsahujícího modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku a cytotoxické činidlo s ním konjugované. Podle jednoho provedení cytotoxickým činidlem může být radioisotop nebo toxin.
Vynález se také týká protilátky, která specificky váže modifikovaný TIE-2 ligand. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální
Vynález se dále týká způsobu čištění modifikovaného TIE-2 ligandu, při kterém se
a) kopuluje alespoň jeden TIE vážící substrát na pevnou matrici,
b) substrát podle odstavce a) se inkubuje s buněčným lyzátem, takže substrát vytvoří komplex s jakýmkoliv TIE-2 ligendem v buněčném lyzátu,
c) pevná matrice se omyje a
d) modifikovaný TIE-2 ligand se eluuje z kopulovaného substrátu .
Substrátem může být jakákoliv látka, která specificky váže modifikovaný TIE-2 ligand. Podle jednoho provedení se substrát voli ze souboru zahrnujícího antimodifikovanou TIE-2 ligandovou protilátku, TIE receptor a TIE receptorovou látku. Vynález se dále týká receptorové látky, která specificky váže TIE-2 ligand stejně jako terapeutického prostředku obsahující- 39 ·« • · « ♦ ·· • · 4 • · 1 » ·· ··· ··· ho receptorovou látku ve farmaceuticky vhodném nosiči a způsobu blokování růstu krevních cév u lidí, kterým se podá účinné množství terapeutického prostředku.
Vynález se dále týká terapeutického prostředku obsahujícího receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku ve farmaceuticky vhodném nosiči, jakož také způsobu podpory neovaskularizace u jedinců, kterým se podává účinné množství terapeutického prostředku.
Kromě toho se vynález týká způsobu identifikace buňky, která expresuje TIE receptor, při kterém se uvádí do styku buňka s detekovatelným značeným modifikovaným TIE-2 ligandem nebo s ligandovou látkou za podmínek umožňujících vázání detekovatelného značeného ligandu na TIE receptor a stanovuje se, zdali se detekovatelný značený ligand váže na TIE receptor, čímž se identifikuje buňka, která expresuje TIE receptor. Vynález se také týká terapeutického prostředku, který obsahuje modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku a cytotoxické činidlo s ním konjugované. Cytotoxickým činidlem může být radioisotop nebo toxin.
Vynález se také týká způsobu detekce exprese modifikovaného TIE-2 ligandu buňkou, při kterém se získá mRNA z buňky, takto získaná mRNA se uvádí do styku se značenou molekulou nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand za hybridizačních podmínek, stanovuje se obsah mRNA hybridizované na značenou molekulu a tak se zjištuje exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v buňce.
Vynález se také týká způsobu detekce exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v sekcích tkáně, při kterém se uvádí do styku sekce tkáně se značenou molekulou nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand za hybridizačních podmínek, stanovuje se obsah mRNA hybridizované na značenou molekulu a ··· *· ·· ·« · · • · · · 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9999
9 9 9 9 9 9 · 9 tak se zjištuje exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v tkáňové sekci.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace buněčných linií ABAE jako reporterských buněk pro vazební TIE-2 receptor
Dospělé buňky BAE jsou zaregistrovány v evropském rejstříku European Cell Culture Repository pod označením ECACC# 92010601 (viz PNAS75:2621 (1978)). Northern (RNA) analysy objevily střední úrovně přepisu tie-2 v buněčné linii ABAE (Adult Bovine Arterial Endothelia) konsistentní s výsledky hybridizace in šitu, které ukázaly téměř výhradní lokalizaci TIE-2-RNA na cévních endothelových buňkách. Proto byly zkoumány lysáty buněk ABAE z hlediska přítomnosti proteinu TIE-2 stejně jako z hlediska rozsahu, v jakém je protein TIE-2 fosforylován tyrosinem za normálních podmínek oproti podmínkám růstu deprivovaného sérem. Lysáty buněk ABAE byly shromážděny a podrobeny imunoprecipitaci, po které následovaly analýzy Western blot imunoprecipitovaných proteinů se specifikací ΤΙΕ2 a s antiséry s fosfotyrosinovou specifikací. Vynechání nebo začlenění peptidů TIE-2 jako specifických blokujících molekul během imunoprecipitace TIE-2 umožnilo nepochybnou identifikaci TIE-2 jako středně detekovatelného proteinu přibližně 150 kD, jehož setrvalý stav hladiny fosfotyrosinu se zmenšuje až na nezjistitelnou míru předběžným sérovým vyhladověním buněk.
Kultivace buněk ABAE a shromážděni lysátů buněk se provádí tímto způsobem: na plastové petrimisce (Falcon) se roz41 prostřou v jedné vrstvě buňky v hustotě 2xlO6 buněk/150 mm ABAE s nízkým počtem průchodů a pěstují se v Eaglově mediu modifikovaném Dulbecco mediem (DMEM) obsahujícím 10 % telecího séra (10 % BOS), 2 mM L-glutaminu (Q) a po 1 % penicillinu a streptomycinu (P-S) v prostředí 5% oxidu uhličitého. Před shromážděním buněčných lysátů se buňky vyhladoví 24 hodin sérem v DMEM/Q/P-S, s odtažením prostředí a pokropením destiček ledově studenou solankou pufrovanou fosfátem (PBS) doplněnou orthovanadátem sodným, fluoridem sodným a benzamidinem sodným. Buňky se lysuji v malém objemu tohoto oplachového pufru, který byl doplněn 1 % detergentu NP40 a inhibitory proteázy PMSF a aprotininem. Nerozpuštěné zlomky se z buněčných lysátů odstraní odstředěním 10 minut při 14 000 xG při teplotě 4 ’C a supernatanty se podrobí imunoprecipitaci antiserem specifickým pro receptor TIE-2, případně za přítomnosti blokujících peptidů přidaných do přibližně 20 pg/ml lysátů. Imunoprecipitované proteiny se rozpustí v PAGE (7,5% gel Laemmli) a elektro přenesou na membránu PVDF a inkubují se s různými antiséry TIE-2 nebo s antiséry specifickými pro fosfotyrosin. Protein TIE-2 se zviditelní inkubací membrány sekundárním antisérem vázaným na HRP následovanou zpracováním reakčním činidlem ECL (Amersham).
Příklad 2
Klonování a exprese receptorové látky TIE-2 ke studii založené na afinitě ligandu TIE-2
Interakce
Byla vytvořena expresní sestava, která by měla poskytovat oddělený protein sestávající z úplně extracelulární části receptoru TIE-2 fúzované ke konstantní oblasti (lgGl Fc) lidského imunoglobulinu gama-1. Tento fuzní protein se nazývá TIE-2 receptorová látka receptorbody) (RB) a normálně se předpokládá, že existuje jako dimer v roztoku založeném na vy- 42 ·· «· e · · * • · · · • · · · ·· ·· ·· ·♦ ·· *e » · · · «.·♦· • · « « β · ♦ · • · « ·*· · ·&· ·»· » · ♦ · » *· «· ·· ·* tváření disulf .idových vazeb mezi jednotlivými konci lgGl Fc. Podíl Fc TIE-2 RB se připraví takto: Fragment DNA kódující část Fc lidského lgGl, která zasahuje od pantové oblasti ke karboxylovému konci proteinu, se zesíli z lidské placentární cDNA pomocí PCR s oligonukleotidy odpovídajícími publikované sekvenci lidského lgGl; výsledný fragment DNA se klonuje do plasmidového vektoru. Příslušné restrikční fragmenty DNA od plasmidu kódujícího receptor TIE-2 v plné délce a od lidského plasmidu lgGl Fc se liguje po obou stranách krátkého fragmentu odvovozeného od PCR, který byl určen k fúzování v základní struktuře sekvencí kódujících TIE-2 a lidský protein lgGl Fc. Výsledný protein TIE-2 oktodoménní-Fc fůze tudíž přesně substituoval lgGl Fc v místě oblasti zasahující do transmembrány TIE-2 a do cytoplasmových domén. Alternativní způsob přípravy RB popsal Goodwin a kol. (Cell 73, str. 447 až 456, 1993).
Klonováním fragmentu DNA TIE-2 RB do vektoru baciloviru pVL1393 se získají miligramová množství TIE-2 RB, načež se infikuje buněčná linie SF-21AE hmyzu Spodoptera frugiperda. Alternativně může být použito buněčné linie SF-9 (ATCC Accession No. CRL-1711) nebo buněčné linie BTI-TN-5bl-4. DNA kódující TIE-2 RB se klonuje jako fragment Eco RI-Notl do transferového baculoviru plasmidu pVL1393. Plasmid DNA, vyčištěný odstředěním gradientu hustoty chloridu česného, se rekombinuje do virové DNA přimíšením 3 pg plasmidu DNA s 0,5 pg BaculoGold DNA (Pharminigen) následovaným zavedením do liposomů pomocí 30 pg Lipofektinu (GIBCO-BRL). Do buněk SF-21AE (2xlO6 buněk na 60 mm misku) v mediu TMN-FH (Modified Grace's Insect Cell Medium (GIBCO-BRL) se přidají směsi DNA-liposomu na pět hodin při teplotě 27 °C, načež následuje inkubace pět dní při teplotě 27 °C v prostředí TMN-FH doplněným 5% zárodečným telecím sérem. Medium tkáňové kultury se shromáždí k destičkovému čištění rekombinantních virů, což se provede shora popsanými způsoby (O'Reily, D.R., L.K. Miller a V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manul 1992, New York:
W.H. Freeman), s výjimkou, že agarová krycí vrstva obsahovala 125 pg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktopyranosidu GIBCO-BRL), Po pětidenní inkubaci při teplotě 27 C nebyly shledány žádné rekombinantní destičky pozitivní chromogenovou reakcí na X-gal substrát a jejich polohy se vyznačí. Rekombinantní destičky se pak zviditelní přísadou druhé krycí vrstvy obsahující 100 pg/ml MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]~ 2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma). Destičky s předpokládaným rekombinantním virem se vyjmou odsátím zátkou a vyčistí se několika průběhy izolace destiček k zaručení homogenity. Zásoby viru se vytvoří sérií několikanásobnou pasáží viru vyčištěného destičkami. Získají se zásoby klonu viru s nízkou pasáží (v TIE-2 receptorové látce).
Buňky SF-21AE se pěstují v mediu prostém séra (SF-900 II Gibco BERL) obsahujícím roztok systému IX antibiotikum/antimykotikum (Gibco BRL) a 25 mg/1 gentamycinu (Gibco-BRL). Přidá se Pluronik F-68 jako povrchově aktivní činidlo do konečné koncentrace 1 g/1. Před infikováním se kultury (4 1) ponechají nejméně tři dny v bioreaktoru (Artisan Cell Station System) Buňky se nechají růst při teplotě 27 °C v plynu obsahujícím 50 % rozpuštěného kyslíku při proudění plynu rychlostí 80 ml/min (ovzdušnění v pokropeném prstenci), žil námořní ventilátor se 100 otáčkami/min.
ve střední logaritmické růstové fázi (přibližně 2xlO6 buněk/ ml), zkoncentrují se odstředěním a infikují se 5 jednotkami tvořícími destičky TIE-2 receptorové látky na buňku. Buňky a inokulum se vnesou do 400 ml čerstvého media a virus se adsorbuje po dobu dvou hodin při teplotě 27 °C v odstředivkové baňce. Kultura se resuspenduje na konečný objem 8 1 čerstvým mediem prostým séra a buňky se inkubují v bioreaktoru za shora popsaných podmínek.
K ovzdušnění slouBuňky se shromáždí
Po 72 hodinách od infikování se kultivační medium od buněk SF-21AE, infikovaných TIE-2 receptorovou látkou, shro44 • ·· · • 9 9 9 9
999 999 máždí odstředěním ( 500x g, 10 minut). Hodnota pH buněčných supernatantů se upraví na 8 hydroxidem sodným. Přidá se EDTA do konečné koncentrace 10 mM a hodnota pH supernatantu se znovu upraví na 8. Supernatanty se zfiltrují (0,45 pm Milipore) a vnesou se na sloupec proteinu A (rychle tekutý protein A sepharosy 4 nebo HiTrap protein A, obojí obchodní produkt společnosti Pharmacia). Sloupec se promyje PBS obsahujícím 0,5M chloridu sodného až do klesnutí adsorbance při 280 nm na základní linii. Sloupec se promyje PBS a eluuje se 0,5M kyselinou octovou. Frakce kolony se okamžitě neutralizují eluováním do zkumavek obsahujících 1M Tris o hodnotě pH 9. Pikové frakce, obsahující TIE-2 receptorovou látku, se zředí a dialyzují se proti PBS.
Příklad 3
Doklad rozhodující úlohy TIE-2 ve vývoji cév
Náhled na funkci TIE-2 byl získán zavedením nadbytku rozpustné TIE-2 receptorové látky (TIE-2 RB) do vývojového systému. Potenciální způsobilost TIE-2 RB vázat a tím také neutralizovat dostupný ligand TIE-2 by mohla vést k pozorovatelnému přerušení normálního vývoje cév a ke charakterizování ligandu. K vyzkoušení, zda by bylo možno použít ligandu TIE-2 RB k přerušeni vývoje cév v čerstvých kuřecích embryích, se nasály malé porce biologicky resorbovatelné pěny s TIE-2 RB a byly vneseny těsně za chorioallantoickou membránu v poloze těsně bočně k časnému embryu.
Časná kuřecí embrya se vyvíjejí nad žloutkem z malého kotoučku buněk, který je povlečen chorioallantoickou membránou (CAM). Endothelové buňky, které přijdou do cévní linie embrya pocházejí jak z vnějších, tak z vnitřních zdrojů embryonických buněk. Z vnějšku odvozené embryonicky endothelové buňky, které tvoří hlavní zdroj endothelových buněk embrya, pocházejí • · • ·· · * · · · · · · · ···· · · · · ···· • ·· · · · · ···· ··· ·· · ······ · · · z přirůstání mesenchymu, který je situován bočně kolem vlastního embrya, těsně pod CAM. Když tyto mesenchymové buňky dospějí, dají vznik společnému progenitoru jak endothelových, tak hematopoietických linií buněk, nazývaných hemangioblast. Hemangioblast pak okamžitě umožní vznik smíšené populaci anioblastů (progenitoru endothelových buněk) a hematoblastům (pluripotenciálnímu hematopoietickému prekursoru). Tvoření základů oběhového systému začíná, když progeny endothelových buněk segregují za vytvoření váčku s jednobuněčnou tlouštkou, který obklopuje původní krevní buňky. Proliferace a migrace těchto buněčných složek případně vytvoří rozsáhlé sítoví krví naplněných mikrocév pod CAM, které nakonec přivedou embryo ke spojení s omezenými, intra-embryonicky odvozenými cévními elementy .
čerstvě oplozená vajíčka kuřat (obchodní produkt společnosti Spafas, lne.,Boston, MA) se inkubují při teplotě 37,5 ’C a 55% relativní vlhkosti. Po přibližně 24 hodinách vývoje se vajíčka otřou 70% ethanolem a zubařským vrtáčkem se v nich vytvoří 1,5 cm otvor v tupém konci každého vajíčka. Skořápková membrána se odstraní k odkrytí volného prostoru přímo nad embryem. Skalpelem se vyříznou čtvercové kousky Gelfoamu (Upjohn) a napustí se ve stejné koncentraci TIE-2 nebo EHK-1 receptorovou látkou. Receptorová látka EHK-1 se získá jako podle příkladu 2 pomocí extrabuněčné domény místo extrabuněčné domény TIE-2 (Maisonpierre a kol. Oncogene 8, str. 3277 až 3288, 1993). Každý kousek Gelfoamu adsorboval přibližně 6 pg proteinu ve 30 μΐ. K otevření malé dírky v CAN se použije hodinářské pinsety v místě několik milimetrů stranou primitivního embrya. Pod CAM se zasune hlavní část Gelfoamu s napuštěným RB pod CAM a skořápka vajíčka se zalepí lepicí páskou. Ostatní vajíčka v podobném stavu se paralelně ošetří RB neodvozenou, neuronálně expresovanou receptorovou tyrosinkinázou, EHK-1 (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 3277 až 3288, 1993). Vývin se nechá pokračovat čtyřio dny a pak se vejce podrobí vizuální prohlídce. Embrya se vyjmou opatrným rozbitím skořápky v miskách zahřáté PBS a opatrně se odřízne embryo s obklopující CAM Ze 12 vajec, z nichž každé bylo oštřeno RB, 6 TIE-2 RB a 5 EHK-1 RB, se vyvinula embrya od stavu pozorovanému na začátku pokusu. Mezi těmito vyvinutými embryi se pozoruje dramatický rozdíl, jak patrno z obr. 1A a IB. Vejce ošetřená EHK-1 RB se vyvinula poměrně normálně. čtyři z pěti ambrví EHK-1 žilo, podle tlukoucího srdce. Kromě toho vnější embrvové cévy, které jsou vizuálně patrné přítomností červených krvinek, jsou hluboké a nacházejí se několik centimetrů pod CAM. Na rozdíl od toho, embrya ošetřená TIE-2 RB jsou silně zakrnělá, mají 2 až 5 mm, oproti průměru 10 mm embryí EHK-1 RB. Všechna embrya ošetřená TIE-2 RB jsou mrtvá a jejich CAM jsou prostá krevních cév. Způsobilost TIE-2 RB blokovat vývoj cév u kuřat ukazuje, že Iigand TIE-2 je nutný pro vývoj vaskulatury.
Příklad 4
Identifikace vazební aktivity specifické pro TIE-2 v kondiciovaném mediu od ras onkogenně transformované myoblastové buněčné linie myši C2C12
Snímání desetinásobně koncentrovaného media (10 x CCM) od různých buněčných linií pro přítomnost specifické vazební aktivity rozpustného TIE-2 (BIAcore; Pharmacvia Biosensor, Poscataway, NJ) ukázala vazební aktivitu v mediu prostém séra od onkogenic-ras-transformovaných buněk C2C12 (C2C12-ras), RAT 2-ras (což je ras transformovaná fibroblastová buněčná linie), lidské glioblastoma T98G a lidské buněčné linie neuroblastoma známé jako SHEP-1.
C2C12-ras lOx CCM pochází od stabilně transfektované linie C2C12 myoblastů, které byly transformovány onkogenicky transfekcí mutantem T-24 H ras standardními metodami na bázi kalciumfosfátu. Plasmid SV40, založený na expresi neomycinové re• · • · • ·
4Ί • · ·· • · · · • · · · • · · · • · · · · · • · · · • · · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · ·· ·· ·· ·· sistance, byl fyzicky vázán s plasmidem ras exprese k umožnění selekce transfektovaných klonů. Výsledné buňky G418 resistantní ras-C2C12 byly rutinně udržovány jako monovrstva na plastových miskách v systému DMEM/glutamin/penicillin-streptomycin doplněném 10 % zárodečného telecího séra (FCS). Séra prosté C2C12-ras lOx CCM se připraví překrytím buněk při 60% slití v mediu prostém séra v průběhu 12 hodin (Zhan a Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6, str. 3541 až 3544, 1986; Zhan a kol., Oncogene 1, str. 369 až 376, 1987). Medium se vyhodí a nahradí čerstvým DMEM/Q/P-S na 24 hodiny. Toto medium se shromáždí a buňky se doplní čerstvým DMEM/Q/P-S, které se rovněž vyhodí po dalších 24 hodinách. Tyto CCM byly doplněny inhibitory proteázy PMSF (lmM) a aprotininem (10 pg/ml) a destinásobně zkoncentrovány na sterilních velikost vylučujících membránách (Amicon). Vazební aktivita TIE-2 by mohla být neutralizována inkubací media nadbytkem TIE-2 RB, nikoli však inkubací s EHK-1 RB, před analýzou BIAcore.
Vazební aktivita lOx CCM se měří pomocí biosensorové technologie (BIAcore: Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), která monitoruje biomolekulární interakce v reálném čase cestou povrchové plasmonové resonance. Vyčištěný TIE-2 RB se kovalentně kopuluje přes primární aminy na vrstvu karboxymethyldextranu CM5 sensorového čipu pro výzkum (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). Povrch sensorového čipu byl aktivován pomocí směsi N-hydroxysukcinimidu (NHS) a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimidu (EDC), následovaným imobilizací TIE-2 RB (25 pg/ml, hodnota pH 4,5) a deaktivací nezreagovaných míst 1,0 M ethanolaminem (hodnota pH 8,5). Negativní kontrolní povrch receptorové látky EHK-1 se připraví podobným způsobem.
Běžným pufrem, použitým v systému, je HBS (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005 % povrchově aktivního činidla P20, hodnota pH 7,4). Vzorky lOx CCM se odstředují 15 minut při teplotě 4 °C a vyčeří se použitím sterilního filtru 0,45 • · ·· · ·· ·· • · · · · · · · · · ♦ ··· ··»· · · · · • · · · · · · · · · ··· ··· ····· · · · pm, vázajícího nízký protein (Millipore; Bedford, MA). Do každého vzorku CCM se přidá dextran (2 mg/ml) a povrchově aktivní činidlo P20 (0,005 %). Podíly 40 μΐ se vstřikují přes imobilizovaný povrch (bud TIE-2 nebo EHK-1) při průtočné rychlosti 5 μΐ/min a vazba receptoru se sleduje po dobu osmi minut. Vazební aktivita (rezonanční jednotky, RU) se měří jako rozdíl mezi základní hodnotou stanovenou 30 sekund před vstřiknutím do vzorku a měření proběhne 30 sekund po vstřiknutí. Regemerace povrchu se provede jedním pulsem 12 μΐ 3M chloridu hořečnatého
Šumová úroveň přístroje je 20 RU; proto nemůže být žádná vazební aktivita se signálem nad 20 RU interpretována jako skutečná interakce s receptorem. Pro media kondiciovaná C2C12ras, jsou vazební aktivity v rozmezí 60 až 90 RU pro imobilizovaný povrch TIE-2 RB. U stejných vzorků zkoumaných na imobilizovaném povrchu EHK-1 RB, jsou naměřené aktivity nižší než 35 RU. Specifická vazba na receptorovou látku se vyhodnocuje inkubací vzorků s nadbytkem bud rozpustného TIE-2 nebo EHK-1 RB před zkoumáním vazební aktivity. Přísada rozpustného TIE-2 RB nemá žádný účinek na vazební aktivitu TIE-2 u kteréhokoli vzorku, zatímco v přítomnosti rozpustného TIE-2 je vazba k povrchu o dvě třetiny nižší než hodnota naměřená v přítomnosti TIE-2. Opakovaná zkouška s použitím více než 50x koncentrovaného C2C12-ras CCM ukázala čtyřnásobné zlepšení vůči pozadí vazebního signálu specifického pro TIE-2.
Příklad 5
C2C12-ras CCM obsahuje aktivitu, která indukuje tyrosinovou fosforylaci receptoru TIE-2
C2C12 -ras lOx CCM se zkoumá z hlediska schopnosti vyvolat tyrosinovou fosforylaci TIE-2 v buňkách ABAE. Šerem vyhladovělé buňky ABAE se krátce inkubují C2C12-ras CCM, lysují se a podrobí se imunoprecipitaci a Western analýze jak shora uvede• · • · ·· ·« ·· ·· • · « · · · • · · · · · · · · · · · • · · · · * ♦ · · · · ··· ··· no. Stimulace šerem vyhladovělých buněk ABAE C2C12-ras lOx CCM se provede následujícím způsobem: Medium ABAE buněk, vyhladovělých jak uvedeno, se odstraní a nahradí se bud definovaným mediem nebo lOx CCM předehřátým na 37 °C. Po deseti minutách se media odstraní a buňky se dvakrát na ledu promyjí nadbytkem chladné PBS doplněné systémem orthovanadát/NaF/benzamidin. Lyse buněk a TIE-2 specifická imunoprecipitace se provedou, jak shora popsáno.
Buňky ABAE, inkubované 10 minut s definovaným mediem, nevykazují žádnou indukci fosforylace TIE-2 tyrosinu, zatímco inkubace C2C12-ras lOx CCM stimuluje nejméně lOOx nárůst ve fosforylaci TIE-2. Tato aktivita je téměř úplně vyčerpána předinkubací C2C12-ras lOx CCM 90 minut při teplotě místnosti s 13 pg TIE-2 RB kopulované na protein kuliček G-sefarosy. Medium inkubované proteinem G separosy samotné nebylo zbaveno této fosforylační aktivity.
Příklad 6
Expresní klonování ligandů TIE-2
V Dulbeccem modifikovaném Eaglově mediu (DMEM) obsahujícím 10 % zárodečného telecího séra (FBS), po 1 % penicillinu a streptomycinu (P/S) a 2 mM glutaminu v prostředí 5% oxidu uhličitého se kultivují buňky COS-7. V Eaglově minimálně potřebném mediu (EMEM) s 10 % FBS, (P/S) a 2 mM glutaminu se kultivuje linie buněk myšího myoblastu C2C12 ras. Snímáním knihovny C2C12-ras cDNA v buňkách COS expresovaných vektorem pJFE14 se získají v plné délce myší klony cDNA ligandů TIE-2. Tento vektor, jak vyplývá z obr. 2, je modifikovanou versí vektoru pSRa (Takebe a kol., Mol.Cell.Biol. 8, str. 466 až 472, 1988). Knihovna se vytvoří pomocí dvou restrikčních míst BSTX1 ve vektoru pJFE14.
• · · • ·· • · · • · · • · · · · ··
Buňky COS-7 se přechodně transfektují bud knihovnou pJFE14 nebo řídicím vektorem podle transfekčního protokolu DEAE-dextran. Přitomse buňky COS-7 24 hodin před transfekcí pokryjí povlakem 1,0 x 106 buněk/100 mm. K transfekcí se buňky kultivují v DMEM prostém séra, obsahujícícm 400 pg/ml DEAE-dextranu, 1 μΜ chlorochinu a 2 mM glutaminu a 1 pg příslušné DNA po dobu 3 až 4 hodin při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Transfekční medium se odsaje a nahradí se PBS s 10 % DMSO na 2 až 3 minuty. Po šoku DMSO se buňky COS-7 umístí do DMEM s 10 % FBS, po 1 % penicillinu a streptomycinu a 2 mM glutaminu na 48 hodin.
Jelikož ligand TIE-2 je utajen, je nutno buňky uschopnit k detekci vazeb receptorové sondy k ligandu. Dva dny po transfekcí se buňky propláchnou PBS a pak se inkubují s PBS obsahujícím 1,8 % formaldehydu na 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Buňky se pak promyjí PBS a inkubují se na 15 minut s PBS obsahujícím 0,1 % Tritonu x-100 a 10 % zárodečného telecího séra k permeabilizaci buněk a k blokování nespecifických vazebních míst.
Snímání se provede přímou lokalizací zbarvení pomocí TIE-2 receptorové látky (RB), která sestává z extrabuněčné oblasti TIE-2 fúzovaného do konstantní oblasti IgGl. Tato receptorová látka se připraví podle příkladu 2. Miska o průměru 100 mm transfektovaných, fixovaných a permeabilizovaných buněk COS se sonduje jejich 30 minutovou inkubací s TIE-2 RB. Buňky se promyjí dvakrát PBS a inkubují se na dalších 30 minut s konjugátem PBS/10 % telecího séra/antihumanní lgG-alkalické fosfatázy. Po trojnásobném promytí PBS, se buňky inkubují v alkalicko-fosfatázovém substrátu po dobu 30 až 60 minut. Miska se pak zkoumá mikroskopem z hlediska přítomnosti obarvených buněk. Kolem každé zabarvené buňky se odškrabe koncem plastové pipety malá ploška buněk obsahující vybarvenou buňku a plasmid DNA se pak uchová a použije se k elektroporaci bak·· • · • Φ Φ· • · · · · · · · φ φφ φ • · · · · ·· φ φ φφ φ • · · · · · φ φφφ · φφφ φφφ • ••ΦΦΦ φ φ φ ·· ·Φ φφ φφ φφ φφ teriálních buněk. Jednotlivé kolonie bakterií z elektroporace se vyjmou a plasmid DNA, připravený z těchto kolonií, se použije k transfektování buněk COS-7, které byly sondovány na expresi ligandu TIE-2, jak vyplývá z vazby na receptorová tělesa TIE-2. To umožňuje identifikaci jednotlivých klonů kódujících ligand TIE-2. Potvrzení exprese ligandu TIE-2 se získá fosforvlací receptoru TIE-2 popsanou v příkladu 5. Plasmidovy klon.
kóduj ící čen jako sion No. ligand TIE-2, byl uložen v ATCC 7.října 1994 a ozna- pJFE14 kódující ligand TIE-2 pod číslem ATCC Acces- 75910.
Příklad 7
Izolace a sekvencování klonu cDNA v plné délce, kódujícího
lidský ligand TIE-2
Z Clontech Laboratories lne. (Palo Alto,CA) se získá rodina cDNA lidských zárodkových plic v lambda gt-10 (obr. 3). Destičky se povléknou v hustotě 1,25 xlO5 povlakem 20x20 cm a odeberou se replika filtry standardními postupy (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, str. 8 až 46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York).
Izolace lidských ligandových klonů tie-2 se provede takto: Fragment 2,2 kb Xhol z uloženého ligandového klonu tie-2 (ATCC No. 75910- viz příklad 6) se označí náhodným znakem pro specifickou aktivitu přibližně 5xlOa cpm/ng. Hybridizace se provede při teplotě 65 °C v hybridizačním roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososového sperma. Filtry se promyjí při teplotě 65 °C ve 2xSSC, 0,1% SDS a exponují se přes noc na film Kodak XAR-5 při teplotě -70 °C. Pozitivní fág se vyčistí na destičce. K izolaci DNA způsobem sloupce Qiagen se použijí fágové lysáty čistého fágu s vysokým titrem fágu standardními způsoby (Qiagen, lne., Chatworth, CA, 1995, kata- 52 ·· ·« ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · ···· ···· ···· ···· • ·· ··· · ··· · ··· · · · ······ · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· log str. 36). Fág DNA se digeruje EcoRI k uvolnění fragmentu klonované cDNA k následnému subklonování Lambda fágový vektor obsahující lidský ligand tie-2 DNA byl uložen ATCC 26. října 1994 pod označením lambda gtlO, kódující htie-2 ligand 1 (ATCC Accesssion No 75928). Fág DNA může být podroben přímo analyse sekvencí DNA metodou dideoxy řetězcového ukončení (Aanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, str. 5463 až 5467, 1977).
Subklonování lidského ligandu tie-2 DNA do savčího expresního vektoru se může provést takto: Klon lambda gtlO, kódující htie-2 ligand 1, obsahuje místo EcoRI umístěné 490 sudých párů ve směru od začátku kódovací sekvence pro lidský ligand TIE-2. Kódovací oblast může být vyříznuta pomocí jedinečných restrikčních míst ve směru nahoru a dolů od iniciátoru a koncových kodonů. Například místo Spěl, umístěné 70 bp 5' vůči kodonu iniciátoru a Bpu 1102i (známé též jako B1P1) misto umístěné 265 bp 3' ke konečnému kodonu, může být použito k vyříznutí úplné kódovací oblasti. To pak může být subklonováno do klonovacího vektoru pJFE14 pomocí Xbal (kompatibilní s převisem Spěl) a míst Pstl (Pstl a Bpull02i jsou oba s hrubým koncem).
Kódovací oblast od klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1 se sekvencují pomocí sekvenceru ABI 373Q DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, lne., Poster City, CA). Nukleotidová a odvozená sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1, je znázorněna na obr. 4.
Kromě toho se získaly klony lidského tie-2 ligandu cDNA v plné délce snímáním lidské knihovny cDNA glioblastoma T98G ve vektoru pJFE14. Klony, kódující lidský ligand TIE-2, byly identifikovány hybridizací DNA pomocí fragmentu 2,2kbXhol od uloženého klonu ligandu tie-2(ATCC No. 75910) jako sonda (příklad 6). Kódovací oblast se sekvencuje použtím sekvenceru ABI 373A DNA a Tag Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied
9« 99 99 ·· ···· · 9 · 9 9 9 9 9
9 9 9 · · · · 9 9 9 9 • 99 999 9 999 9 999 999 • · 9 9 9 9 · 9 9
99 99 99 99 99
Biosystems, inc. Foster City, CA). Tato sekvence byla téměř stejná jako klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1. Jak vyplývá z obr. 4, obsahuje klon lambda gtlO, kódující htie-2 ligand 1 přídavný glycinový zbytek, který je zakódován nukleotidy 1114 až 1116. Kódovací sekvence klonu T98G neobsahuje tento glycinový zbytek ale je jinak identická s kódovací sekvencí klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1. Obr. 5 ukazuje nukleotid a odvozené sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu T98G.
Příklad 8
Izolace a sekvencování druhého klonu A v plné délce cDNA kódující lidský ligand TIE-2
Knihovna cDNA lidských zárodkových plic v lambda gt-10 (obr, 3), se získá od Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Destičky byly pokryty v hustotě 1,25 xlO6/destičky 20x20 odebrány filtry replik A Laboratory Manual, 2. Harbor Laboratory, Cold sondou 3 1 TIE-2, jak patrno cm a standardními způsoby byly (Sambrook a kol. Molecular Cloning: vydání, str. 8 až 46, Cold Spring
Spring Harbor New York). Duplikátní filtry se snímají s nízkým řazením (2xSSC, 55 °C) se sondami provedenými na sekvenci lidského ligandu 1 TIE-2. Jeden z duplikátních filtrů byl opatřen sondou 5', kódující aminokyseliny 25 až 265 lidského ligandu 1 TIE-2, jak patrno z obr. 4. Druhý duplikátní filtr byl opatřen kódující aminokyseliny 286 až 498 lidského ligandu z obr. 4. Obě sondy byly hybridizovány při teplotě 55 C v hybridizačním roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososového sperma. Filtry se promyjí 2xSSC při teplotě 55 °C a přes noc se exponují na rentgenový film. Kromě toho byly také hybridizovány duplikátní filtry při normálním řazení (2xSSC při teplotě 65 °C) do plné délky kódující sondy myšího ligandu 1 TIE-2 (F3-15,Xhol insert). Vybrány byly tři positivní klony, které splňovaly následující kriteria: i) hybridizace
4· 4« 44 «· «« »««9 «4·· 4 4 4 «
4* 4 4 4 4 4949
4« 994 · 949 4 »«· 444
494494 9 * · «4 44 49 99 «9*4 nebyla patrná u sondy (myší) v plné délce při normálním řazení a ii) hybridizace byla patrná při nízkém řazení u obou sond 3' a 5'. Digesce EcoRl fágu DNA získaná z těchto klonů indikuje dva nezávislé klony s vloženými rozměry přibližně 2,2kb a přibližně l,8kb. Vložka 2,2kb EcoRl byla subklonována do míst EcoRl obou pBluescript KS (Stratagene) a do savčího expresního vektoru vhodného k použití u buněk COS. U savčího expresního vektoru byly identifikovány dvě v pBluescript KS byla uložena ATCC 9, ním pBluescript KS kódující ligand 2 bod, kódující sekvence TIE-2 ligandu orientace. Vložka 2,2kb prosince 1994 s označelidského TIE-2. Výchozí 2 je přibližně
355 základních párů ve směru místa pBluescript EcoRl.
Buňky COS-7 byly transientně transfektovány bud expresním vektorem nebo řídicím vektorem transfekčního protokolu DEAEdextran. Buňky COS-7 byly povlečeny s hustotou 1,0x10® buněk na 100 mm destičku 24 hodin před transfekcí. Ke transfekci byly buňky kultivovány v DMEM prostém séra obsahujícím 400 pg/ml DEAE-dextranu, 1 μΜ chlorochinu a 2 mM glutaminu al pg příslušné DNA 3 hodiny při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Transfekční medium se nasaje a nahradí se fosfátem pufrovanou solankou 10% DMSO po dobu 2 až 3 minuty. Po tomto šoku DMSO se buňky COS-7 umístí do DMEM s 10% FBS, po 1% penicillinu a streptomycinu a 2 mM glutaminu na 48 hodin.
Jelikož ligand TIE-2 je sekretován, bylo nutno permeabilizovat buňky k detekci vazby sondy receptorové látky na ligand. Transfektované buňky COS-7 byly povlečeny s hustotou 1,0 xlO6 buněk na 100 mm destičku. Buňky se opláchnou PBS a inkubují se s PBS obsahujícím 1,8 % formaldehydu po dobu 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Buňky se promyjí PBS a inkubují se na 15 minut PBS obsahujícím 0,1 % Triton X-100 a 10 % telecího séra k permeabilizaci buněk a k blokování nespecifických vazebních míst. Snímání se provede přímou lokalizací vybarvení za pomoci TIE-2 receptorové látky, která sestává z extrabuněčné • · · · · ·· · » · · · • ·· · · · · ··· · ··· ···
domény TIE-2 fúzované ke konstantní oblasti lgGl. Tato receptorová látka se připraví jak uvedeno v příkladu 2. Transfektované buňky COS se podrobí inkubaci na 30 minut s TIE-2 receptorovou látkou. Buňky se promjí dvakrát PBS, fixují se methanolem a inkubují se na dalších 30 minut s konjugátem PBS/10 % telecího sera/antihumánní laG-alkalická fosfatáza. Po třech promytích PBS se buňky inkubují v substrátu alkalické fosfatázy po dobu 30 až 60 minut. Miska se zkoumá mikroskopem z hlediska přítomnosti obarvených buněk. Ukázalo se, že buňky expresující jednu orientací klonu, avšak nikoli jinou orientaci, se vážou na TIE-2 receptorovou látku.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že popsané způsoby mohou být použity dále k identifikaci jiných příbuzných látek rodiny ligandů TIE-2.
Kódující oblast od klonu pBluescript KS kódující lidský ligand 2 TIE-2 se sekvencuje sekvencerem ABI 373A DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems lne., Foster City, CA). Nukleotidová a odvozená sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu pBluescript KS kódující lidský ligand 2 TIE-2 je na obr. 6.
Příklad 9
Ligand 2 TIE-2 je antagonist receptorů
Kondiciovaná media z buněk COS expresující bud TIE-2 ligand 2 (T12) nebo TIE-2 ligand 1 (TLI) se porovnávají z hlediska schopnosti aktivovat receptory TIE-2 vyskytující se přírodně v lidských liniích endotlelových buněk.
K transfektování buněk C0S-7 bylo použito lipofektaminového reakčního činidla (GIBCO-BRL,lne.) bud samotným expresním vektorem pJFE14, vektorem pJFE14 obsahujícím TIE-2 ligand 1, • · • · • · nebo expresním vektorem pMT21 (Kaufman R.J., Proč. Nati. Acad. Sci.USA 82, str. 689 až 693 1985) obsahujícím lidský TIE-2 ligand 2 cDNA. Media COS, obsahující sekretované ligandy, se shromáždí po třech dnech a zkoncentrují se na 20-násobek diafiltrací (DIAFLO ultrafiltrační membrány, Amicon, lne.). Množství aktivních TIE-2 ligandů la TIE-2 ligandu 2, obsažené v těchto mediích se zjistí a vyjádří se jako množství (v rezonančních jednotkách R.U.) specifické vazební aktivity receptoru TIE-2 měřené vazebním testem BIAcore.
Analysy Northern (RNA) ukázaly významné úrovně transkriptů TIE-2 v HAEC (Human Aortic Endothelial Cell) lidských primárních endothelových buněk (Clonetics,lne.). Proto bylo těchto buněk použito k vyzkoušení, zda receptor TIE-2 je fosforylován tyrosinem, když je vystaven mediu COS obsahujícímu TIE-2 ligandy. Buňky HAEC se udržovaly v úplném růstovém mediu endothelových buněk (Clonetics,lne.), které obsahovaly 5 % zárodečného telecího séra, rozpustný extrakt hovězího mozku, 10 ng/ml lidské EGF, 1 mg/ml hydrokortisonu, 50 mg/ml gentamicinu a 50 ng/ml amfotericinu-B. K posouzení, zda může TLI a TL2 aktivovat receptor TIE-2 v buňkách HAEC, se postupovalo takto: Napůl slité buňky HAEC se nechají dvě hodiny vyhladovět šerem v Dulbecově MEM s vysokou glukosou s přidaným L-glutaminem a systémem penicillin-streptomycin při teplotě 37 °C, načež následuje náhrada vyhladovacího media kondicionovaným mediem COS obsahujícím ligand na 7 minut při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5 % oxidu uhličitého. Buňky se nato lysují a TIE-2 receptorový protein se získá imunoprecipitaci lysátu s TIE-2 peptidovým antisérem a následným Western blotting s antifosfotyrosinovým antisérem, přesně jak je popsáno v příkladu 1. Výsledky jsou na obr. 7. Fosfotyrosinové úrovně TIE-2 receptoru (TIE-2R) se zavedou zpracováním HEAC buněk TIE-2 ligandem 1 (dráha 1) avšak nikoli TIE-2 ligandem (dráha 2) kondicionovaného media COS. MOCK je kondicionované medium z COS transfektovaného prázdným vektorem JFE14.
• · > · • · · · 9 9 9 9 9 • ••9 9 · 9 · · 4 φ · ·· 9 9 9 · 999 9 ··· 9·· ••9999 · · *
Poznatek., že jak TLI tak TL2 se specificky vážou na receptor TIE-2, byl doložen použitím BIA-jádra ke zkoumání specifických vazebních aktivit receptorů TIE-2 ve transfektovaném mediu COS a imunovybarvením TLI a TL2 expresujících COS buněk TIE-2 receptrorovými látkami. Jelikož TL-2 neaktivoval receptor TIE-2, dospělo se podle vynálezu k úvaze, zda TL2 by mohly být schopné sloužit jako antagonisty aktivity TLI. Byly provedeny zkoušky fosforylace HAEC, ve kterých byly buňky napřed inkubovány s nadbytkem TL2, následovaným přísadou zředěného TLI. Bylo usouzeno, že přední okupování receptorů TIE2, způsobené vysokými hladinami TL2, mohou bránit následné stimulaci receptorů po expozici na TLI existující při mezních koncentracích.
Poloslité buňky HAEC byly vyhladověny sérem jak shora popsáno a pak inkubovány tři minuty při teplotě 37 °C s 1 až 2 ml kondiciovaného media 20x COS/JFE14-TL2. Kontrolní destičky byly zpracovány pouze mediem 20x COS/JFE14 (MOCK). Destičky se vyjmuly z inkubátoru a přidala se různá zředění media COS/JFE14-TL1, načež následovala další inkubace destiček na pět až sedm minut při teplotě 37 °C. Buňky pak byly opláchnuty, lysovány a tyrosinová fosforylace TIE-2 v lysátech se zkoumala receptorovou imunoprecipitací a způsobem Western blotting, jak shora popsáno. Zředění TLI byla provedena pomocí media 20x COS/JFE14-TL1 zředěného na 2x, 0,5x, O,lx nebo 0,02x přísadou samotného media 20x COS/JFE14. Zkouška počátečního 20x TLÍ a 20x TL2 COS pomocí BIAcore biosensorové technologie naznačila, že měly stupeň podobný stupeň specifické vazební aktivity TIE2, tedy 445 R.U. a 511 R.U. pro TLI TL2. Výsledky antifosfotyrosinového Wester blotu, znázorněné na obr. 8, ukazují, že v porovnání s předchozím zpracováním buněk HAEC mediem MOCK (linie 1), před zpracováním buněk HAEC nadbytkem TIE-2 ligandu 2 (linie 2) antagonizuje následnou schopnost zředěného TIE-2 ligandu 1 aktivovat TIE-2 receptor (TIE-2-R).
• · • 0
0
Schopnost TL2 konkurenčně bránit TLI aktivaci TIE-2-R se doložila použitím lidské hybridní buněčné linie EA.hy926 (příklad 21, kde je podrobně popsána tato buněčná linie a její uchovávání). Byly provedeny pokusy, při kterých byla nezkoncentrovaná buněčná media COS obsahující TLI směšována s různým zředěním jako MOCKem nebo TL2 kondicionovaného media a nanášena na monovrstvy sérem vyhladovělých buněk EA.hy926 na pět minut při teplotě 37 °C. Media se pak odstranila, buňky se shromáždily lyží a specifická tyrosinová fosforylace pro TIE-2 byla zkoumána způsoby Western blot, jak shora popsáno. Obr. 9 ukazuje pokus, který zahrnuje tři skupiny zpracování, jak patrno zleva doprava. Jak patrno ve čtyřech řádcích vlevo, zpracování buněk EA.hv926 samotným COS TLI mocně aktivovalo endogenní TIE-2-R v těchto buňkách, zatímco medium lx TL2 COS bylo inaktivní. Avšak směs TLI jak s MOCK tak s TL2 ukázala, že TL2 může blokovat aktivitu TLI způsobem závislým na dávce. V prostředních třech párech linií byl poměr TL2 (nebo MOCK) snížen, zatímco množství TLI ve směsi bylo příslušně zvýšeno z 0,1 x na 0,3x. U každé z těchto poměrů směsí linie TL1:TL2 ukazuje sníženou míru fosforylace ve srovnání s odpovídajícími liniemi TL1:MOCK. Když však bylo množství TLI zachováno stejné a množství TL2 (nebo MOCK) se snížilo, (znázorněno ve třech párech linií vpravo) bylo dosaženo bodu, ve kterém TL2 ve vzorku bylo příliš zředěno, než aby účinně bránilo aktivitě TLI. Relativní množství každého ligandu, obsaženého v tomto kondiciovaném mediu COS, mohlo být stanoveno z jejich vazebních jednotek, jak změřeno testem BIAcore a způsoby Western blot, media COS s protilátkami specifickými pro ligand. V důsledku toho lze dospět k závěru, že k účinnému blokování aktivity TLI in vitro je potřebný jen málonásobný molární přebytek TL2. To je významné, jelikož se pozorovalo v jednotlivých příkladech in vivo (příklad 17 a obr. 16), že TL2 mRNA dosahuje značné hojnosti se zřetelem na mRNA TLI. TL2 tak může mít významnou fyziologickou úlohu k účinnému blokování, signalizací TIE-2-R v těchto místech.
·· · · • · · ·
V souhrnu tato data potvrzují, že TLI, TL2 je neschopen stimulovat endogenně expresovaný TIE-2-R na endothelových buňkách. Nadto může málonásobný molární přebytek TL2 blokovat stimulaci receptoru TIE-2, což značí, že TL2 je přirozeně se vyskytujícím antagonistem v TIE-2 receptoru.
Příklad 10
Identifikace specifické vazební aktivity TIE-2 v kondicionovaném mediu buňky COS
Vazební aktivita lOxCCM z buněčných linií C2C12-ras, Rat2ras, SHEP a T98G, nebo supernatantů buněk COS po transfekci bud s lidským TIE-2 ligandem 1 (hTLl) nebo lidským TIE-2 ligandem 2 (hTL2) se měří pomocí biosenzorové technologie (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), která monitoruje biomolekulární interakce v reálném čase cestou povrchové plasmové resonance (SPR). Vyčištěné krysí nebo lidské TIE-2 RB byly kovalentně kopulovány přes primární aminy ke karboxymethyldextranové vrstvě sensorového čipu CM5 výzkumného druhu (Pharmacia Biosensors; Piscataway, NJ). Povrch sensorrového čipu byl aktivován pomocí směsi N-hydroxysukcinimidu (NHS) a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC), následnou imobilizací TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) a deaktivací nezreagovaných míst 1,OM ethanolaminem (pH 8,5). K sensorovému čipu bylo kopulováno obecně 9000 až 10000 RU každého receptorového tělesa.
Běžným pufrem, použitým v systému, byl HBS (10 mM Hepes, 150 mM chloridu sodného, 0,005 % povrchově aktivního činidla P20, hodnota pH 7,4). Vzorky se odstředovaly po dobu 15 minut při teplotě 4 ’C a vyčeřily se použitím sterilního 0,45 gm filtru s nízkou vazbou proteinů (Millipore, Bedford, MA). Ke každému vzorku byl přidán Dextran (2 mg/ml) a povrchově aktivní činidlo P20 (0,005 %). Přes imobilizovaný povrch byly in• · • · • · • · • · · · * · · • · · · · · · • 9 · · 9 · « • 9 · · · · jektovány podíly 40 μΐ (krysího nebo lidského TIE-2) nízkou rychlostí 5 μΐ/min a receptorová vazba byla sledována po dobu osmi minut. Vazební aktivita (v resonančních jednotkách RU) byla měřena jako rozdíl mezi základní hodnotou stanovenou 30 sekund před injekcí vzorku a měřením 30 sekund po injekci. Regenerace povrchu byla provedena jedním pulsem 15-μ1 3M chloridu hořečnatého.
Vzorky CCM (C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP, T98G) byly testovány na krysím imobilizovaném povrchu TIE-2 RB. zatímco rekombinantní HTL1 a HTL2 byly testovány na lidském imobilizovaném povrchu lidského TIE-2 RB. V každém případě byla specifická vazba na receptorové těleso TIE-2 vyhodnocena inkubací vzorků s 25 pg/ml bud rozpustným TIE-2 (krysím nebo lidským) RB nebo trkB RB před zkoumáním vazební aktivity. Jak patrno na obr. 10 a 11, přísada rozpustného trkB RB způsobuje mírný pokles vazební aktivity TIE-2, zatímco přísada rozpustného TIE-2 RB snižuje významně vazební aktivitu ve srovnání s aktivitou měřenou v nepřítomnosti TIE-2 RB.
Příklad 11
TIE-2 RB specificky blokuje aktivaci receptorů TIE-2 ligandem 1 TIE-2
Zkoumá se, zda rozpustný TIE-2 RB může sloužit jako konkurenční inhibitor k blokování aktivace TIE-2 receptorů TIE-2 ligandem 1 (TLI). K tomu byla media COS obsahující TLI předběžně inkubována bud TIE-2 nebo TrkB-RB a pak porovnána z hlediska schopnosti aktivovat TIE-2 receptory přirozeně obsažené v lidské linii endothelových buněk.
Kondiciovaná media COS byla vytvořena z buněk COS-7 transfektovaných bud se samotným expresním vektorem pJFE14 (MOCK), nebo vektorem pLFE14, obsahujícím lidský TIE-2 Iigand 1 cDNA • · · (TLI) a shromážděna, jak popsáno shora v příkladu 9, s tou výjimkou, že media byla sterilně zfiltrována, avšak nezkoncentrována. Množství ZLÍ bylo určeno a vyjádřeno jako množství (v resonančních jednotkách R.U.) vazební aktivity specifické pro receptor TIE-2 měřené vazebním testem BIAcore.
Analysy Northern (RNA) ukázaly významné úrovně transkriptů TIE-2 ve HUVEC (Human Umbilical Vein Endosthelial Cell) lidských primárních endothelových buňkách (Clonetics, lne.). Proto byly tyto buňky použity ke zjištění, zda může být TIE-2 receptor tyrosinem fosforylován, je-li vystaven v přítomnosti TIE-2 nebo TrkB-RB mediu COS obsahujícímu TLI. Buňky HUVEC byly udržovány při teplotě 37 °C, 5% oxidu uhličitém v úplném růs-tovém mediu endothelových buněk (Clonetics lne.), které obsahovalo 5 % zárodečného telecího séra, rozpustný extrakt hovězího mozku s 10 pg heparinu, 10 ng/ml lidské EGF, 1 mg/ml hydrokortisonu, 50 mg/ml gentamicinu a 50 ng/ml amfotericinuB. Posouzení, zda může TLI aktivovat receptor TL2 v buňkách HUVEC, se provádí tímto způsobem: Slité destičky buněk HIVEC se nechají dvě až čtyři hodiny vyhladovět šerem v Dulbeco MEM s nízkou glukózou při teplotě 37 ’C, načež následuje desetiminutová inkubace ve vyhladovacím mediu, které obsahuje 0,1 mM ortovanadátu sodného, mocného inhibitoru fosfotyrosinových fosfatáz. Mezi tím se předběžně inkubuje 30 minut při teplotě místnosti kondicionované medium COS bucf TIE-2 nebo TrkB-RB přidaným do 50 pg/ml uvedeného media. Vyhladovací medium se z misek HUVEC odstraní a inkubuje se s mediem COS obsahujícím RB sedm minut při teplotě 37 eC. Buňky HUVEC se lyžují a protein TIE-2 receptorů se získá imunoprecipitací peptidovým antisérem TIE-2, načež následuje Western blotting antifosfotyrosinovým antisérem, přesně jak je popsáno v příkladu 1. Výsledky jsou na obr. 12. Fosfotyrosinové hladiny TIE-2 receptorů se zavedou zpracováním buněk HUVEC TIE-2 ligandem 1 (TLI), podobným s pozorovaným u kontrolního media (MOCK), a tato indukce je specificky blokována předběžnou inkubací TIE-2 RB (ΤΣΕ-2-Fc), • · ·· ·· ·· ·· 9 · 9
9 99 9 • ·9 999 9 9999 999
9 9 9 9 9 · · ·· 99 99 99 99 nikoli však inkubací TIE-2 RB (TrkB-Fc). Tato data znamenají, že rozpustný TIE-2 RB může sloužit jako selektivní inhibitor k blokové aktivaci TIE-2 receptoru TIE-2 ligandem 1.
Příklad 12
Konstrukce ligandových těles TIE-2
Vytvoří se expresní konstrukt, který může poskytovat sekreční protein sestávající z úplné kódovací sekvence lidského TIE-2 ligandu 1 (TLI) nebo TIE-2 ligandu 2 (TL2) fúzovaného na lidskou konstantní oblast imunoglobulinu gama-1 (lgGl Fc). Tyto fúzované proteiny se nazývají ligandobodies TIE-2 (TLl-Fc nebo TL2-Fc). Fc část TLl-Fc a TL2-Fc se připraví následujícím způsobem: Fragment DNA, kódující Fc část lidského lgGl, který zasahuje od stěžejní oblasti ke karboxylovému konci proteinu, se zesílí z lidské placentální cDNA pomocí PCR s oligonukleotidy odpovídajícími publikované sekvenci lidského lgGl; výsledný fragment DNA se klonuje do plasmidového vektoru. Příslušné restrikční fragmenty DNA od plasmidu kódujícího receptor TLI a TL2 v plné délce a od lidského plasmidu lgGl Fc se liguje po obou stranách krátkého fragmentu, odvovozeného od PCR, který byl určen k fúzování do TLI a TL2 s lidskými sekvencemi kódujícími lgGl Fc.
Klonováním fragmentu DNA TL2-Fc do vektoru baciloviru pVL1393 se získají miligramová množství TL2 Fc, načež se infikuje buněčná linie SF-21AE hmyzu Spodoptera frugiperda. Alternativně může být použito buněčné linie SF-9 (ATCC Accession No. CRL-1711) nebo buněčné linie BTI-TN-5bl-4. DNA, kódující TL2-Fc, se klonuje jako fragment Eco Rl-Notl do transferového baculoviru plasmidu pVL1393. Plasmid DNA se rekombinuje do virové DNA přimíšením 3 pg plasmidu DNA s 0,5 pg DNA Baculo-Gold (Pharminigen) následovaným zavedením do liposomů pomocí 30 pg Lipofektinu (GIBCO-BRL). Přidávají se DNA-liposomové směsi do buněk SF-21AE (2xlO6 buněk na 60 mm misku) v mediu TMN-FH (Modified Grace's Insect Cell Medium) (GIBCO-BRL) na pět hodin při teplotě 27 °C, načež následuje inkubace pět dní při teplotě 27 °C v prostředí TMN-FH doplněném 5 % zárodečného telecího séra. Medium tkáňové kultury se shromáždí k destičkovému čištění rekombinantních virů, což se provede shora popsanými způsoby (D.R. O'Reily, L.K, Miller a V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual 1992, Nevr York: W.H. Freeman) s výjimkou, že agarová vrchní vrstva obsahovala 125 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-(3-D-galaktopyranosidu GIBCO-BRL). Po pětidenní inkubaci při teplotě 27 °C byly počítány nerekombinantní destičky pozitivní chromogenickou reakcí na X-gal substrát a jejich polohy se vyznačí. Rekombinantní destičky se pak zviditelni přísadou druhé vrchní vrstvy obsahující 100 pg/ml MTT (3—[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma). Domnělé destičky rekombinantního viru se vyjmou odsátím zátkou a vyčistí se několika průběhy izolace destiček k zaručení homogenity. Zásoby viru se vytvoří sérií několikanásobným průchodem viru vyčištěného destičkami. Získají se zásoby jednoho klonu viru s nízkým průchodem (vTL2-Fc klon #7).
Buňky SF-21AE se pěstují v mediu prostém séra (SF-900 II Gibco BRL) obsahujícím roztok IX antibiotika a antimykotika (Gibco BRL) a 25 mg/1 gentamycinu (Gibco-BRL). Přidá se Pluronik F-68 jako povrchově aktivní činidlo do konečné koncentrace 1 g/1. Před infikováním se kultury (4 1) ponechají mejméně tři dny v bioreaktoru (Artisan Cell Station System). Buňky se nechají růst při teplotě 27 °C v plynu obsahujícím, 50 % rozpuštěného kyslíku při proudění plynu rychlostí 80 ml/min (ovzdušněni na rozprašovacím prstenci). K ovzdušnění sloužil námořní ventilátor s počtem otáček 100/min. Buňky se shromáždí ve střední logaritmické růstové fázi (2xlO5 buněk/ml), zkoncentrují se odstředěním a infikují se 5 jednotkami tvořícími destičky receptorových těles vTL2-Fc na buňku. Buňky a inokulum • · · • · · • · ·· ·· se vnesou do 400 ml čerstvého media a virus se adsorbuje dvě hodiny při teplotě 27 °C v odstředivkové baňce. Kultura se resuspenduje na konečný objem 8 1 čerstvým mediem prostým séra a buňky se inkubují v bioreaktoru za shora popsaných podmínek.
Po 72 hodinách od infikování se kultivační medium od buněk SF-21AE, infikovaných vTL2-Fc, shromáždí odstředěním (500x g, 10 minut). Hodnota pH buněčných supernatantů se upraví na 8 hydroxidem sodným. Přidá se EDTA do konečné koncentrace 10 mM a hodnota pH supernatantu se znovu upraví na 8. Supernatanty se zfiltrují (0,45 pm Milipore) a vnesou se na sloupec proteinu A (rychle tekutý protein A sepharosy 4 nebo HiTrap protein A, obojí obchodní produkt společnosti Pharmacia). Sloupec se promývá PBS obsahujícím 0,5M chloridu sodného až do klesnutí adsorbance při 280 nm na základní linii. Sloupec se promyje PBS a eluuje se 0,5M kyselinou octovou. Frakce kolony se okamžitě neutralizují eluováním do zkumavek obsahujících 1M Tris, hodnota pH 9. Píkové frakce, obsahující TL2-Fc se zředí a dialyzují se proti PBS.
Příklad 13
Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 v karcinomu ledvinových buněk
Pokusy hybridizace in šitu byly provedeny na lidské tkáni rakovinových nádorových buněk pomocí sond cDNA TIE-1, TIE-2, TLI a TL2. Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 byly všechny přeregulovány v cévním řečišti nádoru. Ukázalo se, že ligandová exprese je umístěna bud na cévních endothelových buňkách (TL2) nebo v jejich těsné blízkosti v mesenchymu (TLI). Bylo patrno, že VEGF je dramaticky přeregulován v této nádorové tkáni (Brown a kol. Am. J. Pathol. 143, str. 1255 až 1262, 1993).
Příklad 14
Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 při hojení ran ·· ·· ·· • · · · · • · · · · • · · · « · • · · · · «·
9· ·· • · · · • · · · • · · · · · ·
Byly provedeny pokusy in šitu na průřezových proužcích tkáně získané z modelu krysích řezných ran pomocí sond cDNA TIE-1, TIE-2, TLI a TL2. Model hojení ran zahrnuje přitisknutí malé korkové vývrtky ke kůži krysy a odejmutí malého válcového vzorku kůže. Když začne hojení na spodině rány, odebere se svislý proužek tkáně a použije se ho k hybridizaci in šitu. V testovaném vzorku se jeví TLI a TL2 mírně přeregulované čtyři po poranění. Na rozdíl k mírně přeregulované expresi TLI a TL2 v této tkáni, je dramaticky přeregulována exprese VEGF, která může předcházet expresi TLI a TL2.
Příklad 15
Exprese ligandů v játrech a v brzlíku myšího zárodku
Provedla se reversní transkripce PCR (RT-PCR) na játrech E14,5 myšího a na brzlíku E17,5 myšího zárodku. Elektroforéza agarového gelu produktů RT-PCR ukázala, že v myších zárodečných játrech je TIE-2 ligand 1 (TLI) RNA obohacen v podpůrné vazivové oblasti, chybí však v hematopoietických prekursorových buňkách c-kit+TER119. V téže tkáni je TIE-2 ligand 2 (TL2) RNA obohacen ve vazivových buňkách, chybí však v hematopoietických prekursorových buňkách (obr. 13). V myším zárodečném brzlíku je TL2 obohacen ve vazivových buňkách (obr. 14).
Příklad 16
Systém TIE receptor/ligand v angiogenesi
Ačkoli se jeví, že ligandový systém TIE-2/TIE hraje významnou úlohu v biologii endothelových buněk, neukázalo se, že hraje významnou aktivní úlohu v počátečních až středních stadiích tvorby cév (například proliferace angioblastových nebo endothelových buněk a jejich migrace, tvorba kanálků a další počáteční děje ve vytváření cév). Na rozdíl od receptorů a • * ·· ·· ·« • · · · t · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· • · · é ··· ·»· • · · ·· ·· ·· faktorů, o kterých je známo, že zprostředkují tyto děje ve vývoji cév, naznačuje časný pozdní obrazec exprese TIE-2 a TLI v průběhu tvoření cév, že tento systém hraje odlišnou úlohu v pozdějších stadiích vývoje cév, včetně strukturální a funkční odlišnosti a stabilizace krevních cév. Obrazec exprese TIE-2 TLI je také konsistentní s pokračující úlohou v uchování strukturální integrity a/nebo fyziologické charakteristiky ustálené vaskulatury.
Zdá se, že ligand 2 (TL2) je konkurenčním inhibitorem TLI. Prostoročasová charakteristika exprese TL2 naznačuje, že tato samotná inhibiční molekula může hrát několikanásobnou úlohu závislou na kontextu, potřebnou k příslušnému vývoji nebo přemodelování (například destabilizaci/dediferenciaci zralých endothelových buněk umožňujících tvoření nových cév ze stávající vaskulatury, inhibici vytváření nevhodných krevních cév a regresi/involuci zralých krevních cév). Na obr. 15 je schematicky znázorněna hypotetická úloha ligandů TIE-2/TIE při angiogenesi. Na tomto obr. je TLI vyznačena tečkou (.), TL2 hvězdou (*), TIE-2 je vyznačena (T), VEGF závorkou ([]) a flk-1 (receptor VEGF) je znázorněna (Y).
Příklad 17
Exprese ligandů v ženském reproduktivním systému: exprese ve vaječníku
Předběžné poznatky z pokusů zkoumajících expresi TIE receptorů a ligandů v ženském reprodukčním systému jsou konsistentní s hypotézou o úloze TLI v neovaskularizaci, která časově následuje po VEGF. Obrazec exprese TL2 také soouhlasi s antagonismem působení TLI a se specifickou úlohou v cévní regresi. K ověření může být zkoumána exprese relevantních mRNA následující po experimentální indukci vývoje folikula a žlutého tělíska, takže jejich časový poměr k různým aspektům systému ·· ·4 ·* ♦· ·· » » 4 # ···· < · · · · »· · · · · » · · · • ·· · · · · ··· « <·· ·«· ·····> · · · >· ·· 99 99 99 99 neovascularizace/vaskulární regrese může být jasněji definován (například ve spojení s barvením endothelových buněk cévních výplní). Angiogenese, spojená s vývojem folikula a s tvořením žlutého tělíska ve vaječnících dospělých krysích samic nebo sledování indukované ovulace v předpubertálních zvířatech se sledovala pomocí hybridizace in šitu. Obr. 16 obsahuje snímky in šitu hybridizačních .řezů ukazující časový obrazec exprese TIE-2 , TLI, TL2 a VEGF během ovariálního cyklu [Sloupec 1: časný předovulační folikul, sloupec 2: předovulační folikul, sloupec 3: časné žluté tělisko a sloupec 4: atretický folikul, řádek A: světlé pole, řádek B: VRGF, řádek C: TL2, řádek D: TLI a řádek E receptor TIE-2]. Tyto studie ukázaly, že VEGE, TLI a TL2 jsou expresovány časově a prostorově koordinovaným způsobem vzhledem k vývoji a regresi vaskulatury ve vaječníku, specificky s ohledem na ustavení cévního systému, který je generován v průběhu konverse vaječníkového folikula na žluté tělísko (CL).
Je možno konstatovat, že exprese VEGF se zvětšuje ve vrstvě folikulárních granulí před vaskularizací během procesu vývoje žlutého tělíska. V průběhu procesu vytváření CL se vyskytují nejvyšší hladiny VEGF uprostřed vyvíjejícího se CL v sousedství vývoje buněk Žlutého tělíska, které nebyly dosud vaskularizovány. Hladiny VEGF zůstávají středně vysoké a jsou difuzně rozděleny ve vyvinutém CL. Na rozdíl od toho, vyskytuje se patrná zlepšená exprese TIE-2 ligandu pouze později v procesu vytváření CL, po ustavení primárního vaskulárního plexu. Později je v celém CL patrná exprese TLI, kdy bylo ustaveno definitivní kapilární sítoví CL.
TL2 vykazuje značně složitější obrazec exprese než VEGF nebo TLI. Při vývoji CL je TL2 expresován při nejvyšších úrovních na čele vyvíjejícího se kapilárního plexu mezi centrální vaskulární oblastí CL, kde je exprese VEGF nejvyšší a nejvíce obvodová část CL, kde exprese TLI převládá a kde proces vývoje • · • · žlutého tělíska je ukončen a vaskulární systém je nejzralejší. Zdá se, že TL2 je také expresován ve vysokých hladinách ve folikulární vrstvě velkých folikulů, které prodělávají atresii. Zatímco je TLI také patrná v atretických follikulech, VEGF není expresována.
Shora popsaný model exprese je nejkonsistnější s úlohou VEGF v iniciaci angiogenese, s TLI působícím v tomto procesu později - například při modelování a/nebo stabilizacím definitivního cévního sítoví. Na rozdíl od toho je TL2 obsažená jak v oblastech aktivní expanze nově se tvořícího cévního sítoví (během tvoření CL) a v oblastech, které selhávají ve vytváření nové vaskulatury a vaskulární regrese převládá (atretické folikuly). To naznačuje dynamičtější a komplexnější úlohu pro TL2, možná zahrnující destabilizaci stávající vaskulatury (nutné pro regresi) nebo vývoji vaskulatury (nutné pro dynamické formování nově se tvořících cév).
Příklad 18
Test vazby receptorového tělesa a test ligandové vazby a kopetice
Byl vyvinut kvantitativní test bezbuněčné vazby ve dvou alternativních podobách k detekci bud vazby TIE-2 receptorové látky nebo ligandové vazby a kompetice. Ve versi testu vazby receptorové látky se ligandy TIE-2 (vyčištěné nebo částečně vyčištěné; bud TLI nebo TL2) nanesou na destičku ELISA. Přidá se receptorová látka v různých koncentracích, které se váže na imobilizovaný ligand způsobem závislým na dávce. Po dvou hodinách se receptorová látka odplaví, množství vázané na destičku se reportuje pomocí specifické anti-lidské Fc protilátky, která je značená alkalickou fosfatázou. Přebytek reportérové protilátky se odplaví, načež se vyvolá reakce AP pomocí barevného substrátu. Test se vyhodnocuje spektrofotometrem. Obr. 19 ukazuje typickou křivku vazby TIE-2-lgG. Testu bylo použito k vyhodnocení integrity TIE-2-lgG po injektováni do krys a myší. Testu může být použito v této podobě jako testu ligandové kompetice, při které čištěné nebo částečně vyčištěné TIE ligandy konkurují s imobilizovaným ligandem pro těleso receptoru. Ve versi ligandové vazby nebo kompetiční versi vazebního testu se destička ELISA povlékne TIE-2 ectodoménou. Fragmenty Fc-značené domény podobné fibrinogenu TIE ligandů (TLI fFc a TL2-fFc) se vážou na ektodoménu a mohou být detekovány pomocí stejné antihumánní Fc protilátky jak shora popsáno. Na obr. 20 je příklad vazby TLl-fFc na ektodoménu TIE-2. Této verse testu může být také použito ke kvantitativnímu vyhodnocení hodnot TLl-fFc v séru nebo v jiných vzorcích. Pokud neznačený ligand (opět bud vyčištěný nebo nevyčištěný) je přidán současně jako TLl-fFc, pak nastane kompetice mezi značeným ligandovým fragmentem a ligandem v plné délce. Ligand v plné délce může vytěsnit Fc-značený fragment a vytvoří se kompetiční křivka.
Příklad 19
Jako reportéra buněčné linie pro aktivitu TIE ligandu může být použito buněčné linie EA.hy926
EA.hy926 je buněčná hybridní linie, která se ustavila fusí HUVEC s buněčnou linií odvozenou z karcinomu lidských plic A549 (Edgell a kol., Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 80, str. 3734 až 3737, 1983). Zjistilo se, že buňky EA.hv926 expresují významné množství proteinu TIE-2 receptorů s nízkými bazálními úrovněmi fosfotyrosinu. Hustota, při které jsou buňky EA.hy926 pasažovány před svým použitím pro receptorové testy, stejně jako jejich stupeň slití v době testu, může ovlivnit receptorovou hojnost a relativní indukovatelnost v odezvě na zpracování ligandem. Přijetím následujících režimů pro růst těchto buněk může být linie buněk EA.hy926 použito jako závislého systému pro test aktivit ligandu TIE-2.
• ·· · · · · · · · · · • · · · ···· · · · · “· ·· · · · · ··· · ··· ··· ····*· · · ·
Buňky EA.hy926 se nasadí v množství l,5x 106 buněk do baněk T-75 (Falconware) a každý druhý den se jim přidají živiny Dulbeco MEM obsahující vysoké množství glukózy, 10 % plodového telecího séra, L-glutamin, penicillin-streptomycin a Ix hypoxanthin/aminopterin/thymidin (HAT, Gibco/BRL). Po třech až čtyřech dnech růstu se buňky ještě jednou přemístí do baňky T-75 v množství 1,5x10®. buněk a kultivují se po dobu dalších tří až čtyř dní. K fosforylačním testům se buňky upraví, jak shora uvedeno, vyhladoví se na sérum náhradou kultivačního media DMEM s vysokou glukózou a inkubují se dvě až tři hodiny při teplotě 37 °C. Toto medium se z baňky odsaje a do baňky se přidají vzorky kondiciovaného media nebo vyčištěného ligandu v celkovém množství 1,5 ml, načež následuje inkubace 5 minut při teplotě 37 ’C. Baňky se z inkubátoru vyjmou a umístí se na vrstvu ledu. Medium se odstraní a nahradí se 1,25 ml lyzového pufru obsahujícího 1 % nonidet P-40, 0,5 % deoxycholátu sodného, 0,1 % SDS ve 20 mM Tris, hodnota pH 7,6, 150 mM chloridu sodného, 50 mM fluoridu sodného, 1 mM orthovanadátu sodného, 5 mM benzamidinu a 1 mM EDTA obsahující inhibitory proteázy PMSF, aprotidin a leupeptin. Po 10 minutách na ledu k rozpuštění membrán, se destičky seškrabou a buněčné lyzáty se vyčeří mikroodstředěním vrcholovou rychlostí 10 minut při teplotě 4 °C. TIE-2 receptor se imunoprecipituje z vyčeřeného supernatantu inkubací v chladu s antiTIE-2 polyklonálním antisérem a s protein G-konjugovanými kuličkami sefarosy. Kuličky se promyjí třikrát studeným lyzovým pufrem a vaří se 5 minut v Laemliho vzorkovém pufru, který byl pak vylit na 7,5% SDSpolyakrylamidové gely,. Rozpuštěné proteiny se elektrotransferují na membránu PVDF (Lambia-P) a pak se podrobí analýze Western blot za použití anti-fosfotyrosinové protilátky a reakčního činidla ECL. Následující porovnání celkových hladin proteinu TIE-2 na těchže blotech se provede stripováním anti-fosfotyrosinové protilátky a reinkubací s polyklonálním antisérem specifickým pro ektodoménu TIE-2.
• 0 0 · · 0 · · 0 ·· · .0 0 00 ···· 0 0·· • · · · · · · ··· · ··· ··· • 0 0 0 0 0 0 0 0
Příklad 20
Izolace a sekvencování klonu cDNA o plné délce kódujícího savčí TIE ligand-3
TIE ligand-3 (TL3) se klonuje z genomické knihovny myšího BAC (Research Genete.tics) hybridizací knihovních duplikátů bud myší sondy TLI nebo myší sondy TL2 odpovídající celé kódovací sekvenci těchto genů. Každá kopie knihovny se hybridizuje pomocí fosfátového pufru přes noc při teplotě 55 °C. Po hvbridizaci se filtry promyjí pomocí 2xSSC, 0,1% SDS při teplotě 60 °C, načež následuje expozice filtrů na rentgenový film. Identifikují se silné hybridizační signály odpovídající myšímu TLI a myšímu TL2. Kromě toho se identifikují signály, které slabě hybridizují jak myší TLI, tak myší TL2. DNA odpovídající těmto klonům se vyčistí, pak digerují s restrikčními enzymy a dva fragmenty, které hybridizovaly na původní sondy se subklonují na bakteriální plasmid a sekvencují se. Sekvence plasmidu obsahuje dva exony s homologií jak myšího TLI, tak myšího TL2. Primerů specifických pro tyto sekvence se použije jako primerů PCR k identifikaci tkání obsahujících transkripce odpovídající TL3. Svazek PCR odpovídající TL3 byl identifikován v knihovně cDNA myší dělohy v lambda gt-11 (Clontech Laboratories, lne. Palo Alto, CA).
Destičky se povléknou 1,25xlO6/20x20 cm a pořídí se replikové filtry standardním způsobem (Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Mamual, 2. vydání, str. 8 až 46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Duplikátní filtry se sejmou při normálním řádkování (2 x SSC, 65 °C) s 200 bp PCR radioaktivní sondou myší sekvence TL3, Hybridizace se provádí při 65 °C v roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososího spermatu. Filtry se promyjí 2x SSC při teplotě 65 °C a exponují se 6 hodin na rentgenový film. Zachytí se dva pozitivní klony, které hybridizují v duplikátu. Digesce _ 7 9 —· · ·· ···· ···· ' · · · ··· · ···· · · · «·· ······ · · ·
EcoRI fágu DNA, získakaného z těchto klonů, indikuje dva nezávislé klony s vloženými rozměry přibližně 1,2 kb a přibližně 2,2 kb. Vložka 2,2 kb EcoRI se subklonuje do místa EcoRI pBluescriptu KS (Stratagene). Sekvenční analýza ukázala, že delšímu klonu chyběl iniciátor methioninu a signál peptidu ale jinak zakódoval sondu homologickou k jak myšímu TLI, tak k myšímu TL2 .
Pak byly syntetizovány dva primery PCR specifické pro TL3 US2: cctctgggctcgccagtttgttagg US1: ccagctggcagatatcagg
Pomocí expresních knihoven, odvozených z myších buněčných linií C2C12ras a MG87, byly provedeny následující reakce PCR. V primární reakci PCR bylo použito ve spojení s oligy specifickými pro vektor k umožnění zesílení v každé orientaci. PCR byl v celkovém objemu 100 ml používající 35 cyklů 94 °C, 1 min; 42 °C nebo 48 °C na 1 min, 72 °C, 1 min. Sekundární reakce pCR zahrnovaly sekundární specifický primer, US1, který je obsažen v primárním produktu PCR, ve spojení se stejným oligo vektorem. Sekundární reakce činily 30 cyklů pomocí stejných teplot a časů jako shora uvedeno. Produkty PCR byly gelově izolovány a podrobeny sekvenční analýze. Na základě sekvencí, získaných z celkem čtvr nezávislých reakcí PCR, používajících dvou různých knihoven cDNA, byl odvozen konec 5' sekvence TL3. Northern analýza ukázala střední až nízké hodnoty myšího transkriptu LT3 v myší placentě. Exprese myšího TL3 sestávala z transkriptu přibližně 3 kb. Kódovací sekvence TL3 v plné délce je na obr. 21.
Myší sekvence TL3 je pak možno použít k získání lidského klonu obsahujícího sekvenci lidské TL3 hybridizací bud lidské genomické knihovny nebo cDNA se sondou odpovídající myšímu TL3, jak bylo shora popsáno, například v příkladu 8.
,9 9 9 9 9 9 9 · 9 99 9
99 · 9 9 · 999 9 999 999
999999 9 9 9
Příklad 21
Izolace genomického klonu v plné délce kódujícího lidský TIE ligand-4
Z myší BAC genomické knihovny (BAC HUMAN (II), Genome Systems lne.) byl klonován .ligand-4 (TL4) hybridizací duplikátové knihovny bud s lidskou radioaktivní sondou TLI k úplné sekvenci TLI kódující fibrinogen (nukleotidy 1153 až 1806 z obr. 4) nebo s myší radioaktivní sondou TL3 odpovídající segmentu 186 nukleotidů z fibrinogenní oblasti myšího TL3 (nukleotidy 1307 až 1492 z obr. 21). Každá sonda se značí pomocí přesných oligonukleotidů a stadardních podmínek PCR s výjimkou náhrady dCTP P32dCTP. Směs PCR se nechá procházet gelovým filtračním sloupcenm k oddělení sondy od volného P32dCTP. Každá kopie knihovny se hybridizuje pomocí fosfátového pufru a radioaktivní sondou přes noc při teplotě 55 °C za použití standardních hybridizačních podmínek. Po hybridizací se filtry promyjí 2x SSC, 0,1 % SDS při teplotě 55 °C následované exposicí na rentgenový film. Pozoruji se silné hybridizační signály odpovídající lidské TLI. Kromě toho se identifikují signály, jež slabě hybridizují jak lidský TLI tak myší TL3. DNA, odpovídající těmto klonům, se Čistí pomocí standardních postupů, provádí se digesce s restrikčními enzymy a jeden fragment, který hybridizoval k původnímm sondám, byl subklonován do bakteriálního plasmidu a sekvencován. Sekvence fragmentů obsahovala jeden exon s homologií jak k lidskému TLI tak k myšímu TL3 a k dalším členům rodiny ligandů TIE. Primerů specifických pro tyto sekvence může být použito jako primerů PCR k identifikaci tkání obsahujících transkript odpovídající TL4.
Kompletní sekvence lidského TL4 může být získána sekvencováním plného klonu BAC, obsaženého v uložených bakteriálních buňkách. Exony mohou být identifikovány homologií ke známým členům rodiny ligandů TIE, jako jsou TLI, TL2 a TL3. úplná ko74 • · ·« · · · · ·· · · • · · · ···· · · · · • · ·· ···· · · · · • ·· · · · · ··· · ··· ··· ······ · · · dovací sekvence TL4 může pak být určena spojením dohromady exonů z genomického klonu TL4, což opět může být použito k vytvoření proteinu TL4. Alternativně mohou být exony použity jako sondy k získání plné délky klonu cDNA, kterého může pak být použito k vytvoření proteinu TL4. Exony mohou být také identifikovány ze sekvence klonů BAC homologií k proteinovým doménám, jako jsou fibrinogenní domény, smyčky smyčkových domén, nebo proteinové signály, jako jsou signály peptidových sekvencí. Chybějící exony z klonu BAC mohou být získány identifikací kontigních klonů BAC, například pomocí konců uloženého klonu BAC jako sondy ke skrínování lidské genomické knihovny, jako je jedna z nich zde použitá pomocí exonové sekvence obsažená v klonu BAC ke snímání knihovny cDNA, nebo provedením bud postupu 5' nebo 3' BACE za použití oligonukleotidových primerů, založených na sekvencích exonu TL4.
Identifikace dalších členů rodiny ligandu TIE
Nových sekvencí ligandu 4 TIE může být použito k racionálnímu pátrání po dalších členech rodiny ligandů TIE pomocí přístupu, který využívá výhod existence konzervovaných segmentů silné homologie známých členů rodiny. Například seřazení sekvencí aminokyselin ligandů TIE ukazuje několik oblastí konzervované sekvence (viz boxové oblasti na obr. 22). Degenerovaných oligonukleotidů, v podstatě založených na těchto boxech, v kombinaci s bud dříve známými segmenty nebo novými homologiemi ligandů TIE může být použito k identifikování nových ligandů TIE.
Výše konzervovaných oblastí mezi TLI, TL2 a TL3 může být použito ke konstrukci degenerovaných oligonukleotidových primerů, ve kterých mohou být generovány první reakce pCR použitím cDNA. Šablony cDNA mohou být generovány reversní transkripcí tkáni RNA použitím oligo d(T) nebo jiných příslušných primerů. Podíly reakční směsi PCR mohou pak být podrobeny ·· ·· ·· ·♦ ·· ·· • · · · · · · · ···· — · ··· · ·· · · ·· · • ·· · · · · ··· · ··· ··· ······ · · · elektroforéze na agarovém gelu. Výsledné zesílené fragmenty DNA mohou být klonovány začleněním do plasmidů, sekvencovány a sekvence DNA porovnány se sekvencemi všech známých ligandů TIE
Zesílené fragmenty, vybrané podle velikosti, z těchto reakcí PCR mohou být klonovány do plasmidů, zavedeny do E. coli elektroporací a trans.formanty mohou být naneseny na selektivní agar. Kolonie bakterií z transformace PCR mohou být analyzovány sekvencováním plasmidových DNA, které jsou vyčištěny standardními plasmidovými postupy.
Klonovaných fragmentů, obsahujících segment nového ligandu TIE, může být použito jako hybridizačních sond k získání klonů cDNA o plné délce z knihovny cDNA. Například může být použito genomické lidské sekvence TL4 k získání lidského klonu cDNA obsahujícího úplnou kódovací sekvenci lidského TL4 hybridizací lidské knihovny cDNA sondou odpovídající lidské TL4, jak bylo shora popsáno.
Příklad 22
Klonování úplné klonovací sekvence hTL4
Kódovací sekvence 5' a 3' z genomického lidského klonu TL-4, kódující lidský ligand-4 TIE (hTL-4 ATCC Acession No. 98095), byla získána restrikcí enzymové digesce Southern blotting a hybridizací klonu hTL-4 ke kódování sekvencí z myší TL-3 následované subklonováním a sekvencováním hybridizačních fragmentů. Kódovací sekvence, odpovídající N-termínálovým a C-terminálovým aminokyselinám hTL4, bylo použito ke konstrukci primerů PCR (znázorněno dále), kterých se pak použilo k zesílení PCR TL4 z lidské vaječníkové cDNA. Pásmo PCR se identifikuje jako odpovídající lidské TL4 sekvencováním DNA pomocí sekvenceru ABI 373A DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA). Pásmo
0« 0 0 0
0 00
0 0
0 0
00 00 00
0 0 0 0 0 0
0 0 · 0 0 · • 0000 000 000
PCR se subklonuje do vektoru pCR-skriptu a několik plasmidových klonů se analyzuje sekvencováním. úplná kódovací sekvence lidského TL4 se provede jak patrno na obr. 23. Podle jiného provedení vynálezu se zamění nukleotid v poloze 569 z A do G, což vede ke změně aminokyselin z Q na R.
Primery PCR použité jak shora popsáno se označují takto: hTL4atg 5'-gcatgctattcgagccacc ATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3' hTL4not 5'gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3'. Malá písmena vyznačují tail sekvence přidané k usnadnění klonování zesílených fragmentů PCR.
Příklad 23
Konstrukce a charakterizace modifikovaných ligandů TIE
K získání názoru na počet jejich pozorovaných vlastností byla podniknuta genetická analysa TIE-2 ligandu 1 a TIE-2 a ligandu 2 (TLI a TL2). Ačkoli TLI a TL2 mají podobnou strukturální homologii, vykazují rozdílné fyzikální a biologické vlastnosti. Nejprominentnější význak, který rozlišuje oba ligandy je skutečnost, že ačkoli oba vážou receptor TIE-2, je TLI agonist a TL2 antagonist. Za neredukujících elektroforetických podmínek vykazují oba proteiny kovalentní, multimerické struktury. TLI je produkován jako směs disulfidy zesítěných multimerů, primárních trimerů a druhů vyšších řádů, bez jakýchkoli dimerních druhů. Avšak TL2 se produkuje téměř výhradně jako dimerní druhy. Také, ačkoli TL2 je produkován dobře ve většině expresních systémů, TLI je expresován zřídka a je obtížné ho vyrobit ve velkých množstvích. Nakonec výrobní a čisticí podmínky se také jeví jako určující TLI k inaktivaci proteolytického štěpení v místě blízkém aminovému konci.
Ke studiu těchto rozdílů bylo zkonstruováno několik modifikovaných ligandů následujícím způsobem:
Φ 99 »99« 9999
9 9 9 9 9 9 999 9 «99 999
9 9 · 9 9 9 9 9
99 99 99 99 9»
23.1 Cysteinová substituce - Výzkum faktorů, které by mohly přispívat k různým fyzikálním a biologickým vlastnostem obou molekul, ukázal přítomnost v TLI cysteinovém zbytku (CYS 265 na obr.4, CYS 245 na obr. 17) předcházející fibrinu podobnou doménu v TLI, nevyskytující se však v TL2 - nebyly tedy odpovídající cysteinové zbytky v TL2. Zbytek Cysteinu 265 v TLI je zakódován TGC a je umístěn u nukleotidů 1102 až 1104 (obr. 4) při přibližném spojení mezi svinutou smyčkou a fibrinu podobnou oblastí. Jelikož cysteinové zbytky jsou obvykle zahrnovány do dísulfidem vázaných formací, jejichž přítomnost může přispívat jak k terciární struktuře, tak k biologickým vlastnostem molekuly, mělo se zato, že snad přítomnost zbytku CYS265 v TLI může být alespoň částečně zodpovědná za různé vlastnosti obou molekul.
K potvrzení této hypotézy byl zkonstruován expresní plasmid, který obsahoval mutaci v TLI ve které CYS (zbytek 265 na obr. 4, zbytek 245 na obr. 17) byl nahražen aminokyselinou (serinem), který nevytváří disulfidové vazby. Vedle tohoto TLl/CYS-mutantu byl zkonstruován druhý expresní plasmid, který mutoval přibližně odpovídající polohu v TL2 (Met247 na obr. 17), takže tento zbytek byl nyní cystein. Oba nemutovaný a mutovaný expresní plasmid TLI a TL2 byly transientně transfektovány do buněk C0S7, buněčné supernatanty obsahující rekombinantní proteiny se shromáždily a vzorky byly podrobeny jak redukční, tak neredukční elektroforese SDS/PAGE a následnému Western blottingu.
Obr. 18 ukazuje Western bloty za neredukčních podmínek jak mutovaného tak nemutovaného proteinu TLI a TL2, což ukazuje, že mutant TLl/CYS- probíhá jako dimer velmi podobně TL2 a TL2/CYS+ je schopen tvořit trimer, stejně jako multimery vyššího řádu podobněji TLI. Když byly dva mutantní proteiny testovány z hlediska schopnosti indukovat fosforylaci v expresních buňkách TIE-2, byl mutant TLl/CYS- schopen aktivovat re• a e * • ·
<· · · ceptor TIE-2, zatímco mutant TL2/CYS+ nikoli.
Jestliže tedy cysteinový zbytek (zbytek 265 na obr. 4, zbytek 245 na obr. 17) TLI byl geneticky změněn na serin, zjistilo se, že kovalentní struktura TLI se stala podobnou struktuře TL2, tedy primárně dimerní. Modifikovaná molekula TLI se stále chovala jako agonist, tudíž trimerní a/nebo multimerní struktura vyššího řádu nebyla určujícím faktorem dávajícím TLI schopnost aktivace. Ačkoli odstraňování cysteinu vytvářelo molekulu s více žádoucími vlastnostmi, nezlepšilo produkční. úroveň TLI.
23.2 Dělení domén - Nukleotidové sekvence kódující TLI a TL2 mají genetickou strukturu, která může být rozdělena do tří domén na základě sekvencí aminokyselin zralých proteinů. Posledních přibližně 215 zbytků aminokyselin každého zralého proteinu obsahuje šest cysteinů a tvoří velkou podobnost doméně fibrinogenu. Tento region byl tedy přejmenován na fibrinogenu podobná doména neboli F-doména. Centrální oblast zralého proteinu, obsahující přibližně 205 zbytků, měla velkou pravděpodobnost k předpokladu zavinuté-smyčkové struktury a byla nazvána doména coiled-coil neboli C-doména. Aminový terminál přibližně 55 zbytků zralých proteinů obsahoval dva cysteiny a s nízkou pravděpodobností měl zavinutě smyčkovou strukturu. Tato oblast byla pojmenována N-terminal neboli N-doména. Zde popsané modifikované ligandy jsou označovány použitým názvoslovím, kde N = N-terminálová doména, C = zavinutě smyčková doména, F = fibrinogenu podobná doména a číslice 1 a 2 se týkají TLI a TL2. Znamená tedy 1N N-terminálovou doménu z TLI, 2F fibrinogenu podobnou doménu TL2 a podobně.
K vyzkoušení, zda fibrinogenu podobná doména (F-doména) ligandů TIE-2 obsahovala aktivitu aktivující TIE-2 , byly zkonstruovány expresní plasmidy, které rozdělily doménu zavinuté smyčky a N-terminálovou doménu nechající pouze část sek79 • ·· · · ·· 9 9 · · * • · · 9 9 99 9 9 9 9 9 « 99 999 9 999 9 999 999
999999 9 9 ·
99 99 9 9 9 9 9 9 vence DNA kódující F-doménu (pro TLI, začínající na obr. 4 přibližně u nukleotidu 1159 zbytku aminokyseliny ARG284; pro TL2 odpovídající přibližně nukleotidu 1200 na obr. 6, zbytku aminokyseliny 282). Tento mutantní konstrukt byl pak transientně transfektován do buněk COS. Supernatant, obsahující rekombinantní protein, byl shromážděn. Mutant TLl/F-domény byl testován z hlediska schopnosti vázat receptor TIE-2 . Výsledky ukázaly, že jako monomer nebyl mutant TLl/F-domény schopen vázat TIE-2 ve zjistitelné míře.
Jestliže však byl monomer TLl/F-domény značen myc a následně seskupen s protilátkou zaměřenou proti myc tag, vykázal zjistitelnou vazbu TIE-2. Avšak protilátkový seskupený mutant TLl/F-domény nebyl schopen indukovat fosforylaci v buněčné linii expresující TIE-2 .
Bylo tedy zjištěno, že F-doména ligandů TIE-2 je zapletena do vazby receptorů, ale že zkomolení sestávající ze samotné F-domény není postačující k vazbě receptorů. To vyvolalo možnost, že doména zavinuté smyčky zodpovídala za to, že několik domén podobných fibrinogenu drželo při sobě, což mohlo být potřebné pro receptorovou vazbu. Ve snaze o potvrzení této domněnky byla F-doména fúzována se sekcí Fc lidské protilátky lgGl. Jelikož Fc sekce dimerizuje na expresi savčími buňkami, mimikovaly tyto rekombinantní proteiny teoretickou konfiguraci F-domén, kde nativní ligandy dimerizují. Tento konstrukt F-domény-Fc vázal, avšak nedokázal aktivovat receptor. Multimerace zřejmě způsobená jinými oblastmi ligandu je nutná k uschopnění ligandu vázat receptor TIE-2. Kromě toho musejí některé jiné faktory mimo F-doménu přispívat k fosforylaci receptoru.
Pak byly zkonstruovány mutanty, kterým chyběla fibrinu podobná doména a obsahovaly proto pouze N-terminálovou doménu a doménu zavinuté smyčky. Nebyly schopné se vázat na receptor.
• · φ · ·· · · · * ·· • · · · · · φ φ φ · · · • · Φ· ♦ · · · · · · · • Φ φ Φ·· · ··· · Φ · Φ ΦΦΦ
ΦΦΦ· ΦΦ · * ·
Κ posouzení úlohy N-terminálové domény ve vázání receptoru a aktivaci, byly ligandy spleteny až na jejich C- a F-domény a značeny s FLAG tag a se N-zakonČení.m, za vytváření konstruktů, nazývaných FLAG-1C1F a FLAG-2C2F. Ačkoli se tyto molekuly silně vybarvovaly v buňkách COS7 transfektované transientně k expresování receptoru TIE-2, selhaly ve výpovědi ve foaforylačním testu. N-doména tudíž neobsahuje potřebný faktor k aktivaci receptoru, ačkoli, jako uzavřená infra, schopnost chimerních molekul 2N2C1F k aktivování receptoru ukazuje, že dokonce N-doména inaktivního ligandu může splňovat tuto úlohu.
Rozdíly v chování mezi myc-značenou F-doménou a Fc-značenou F-doménou, shora uvedené, naznačily, že ligandy TIE mohou být vázány pouze v dimerních nebo ve vyšších multimerních formách. Ve skutečnosti neredukční SDS-FAGE ukázala, že ligandy TIE existují přirozeně v dimerních, v trimerních a v multimerních formách. Skutečnost, že se FLAG-1C1F a FLAG-2C2F mohou vázat na receptor TIE-2 bez dimerizace syntetickým zakončením (jako je Fc), zatímco F nemohou, naznačuje, že C-region je alespoň zčásti zodpovědná za agregaci F-domén.
23.3 Záměnné konstrukty (chiméry)
Zjistilo se, že úroveň produkce TLI v buňkách COS7 byla přibližně desetkrát nižší než produkce TL2. Proto byly zkonstruovány chiméry TLI a TL2 ve snaze vysvětlit tento rozdíl a také k dalšímu charakterizování aktivity agonistů TLI ve srovnání s aktivitou agonistů TL2.
Byly zkonstruovány čtyři chyméry, ve kterých jedna z Nterminálových domén fibrinogenní domény byla vyměněna mezi TLI a TL2 a byly označeny pomocí shora popsaného názvosloví tak, že například 1N1C2F se týká chiméry mající N-zakončení a zavinuté smyčkové domény TLI, společně s fibrinogenu podobnou doménou z T2. čtyři chiméry byly konstruovány takto:
chiméra 1 - 1N1C2F • ·
φ φφφφ φ φ φ · φ φφφφ φφφ ··· • φ φ • φ φ φ ** chiméra 2 - 2N2C1F chiméra 3 - 1N2C2F chiméra 4 - 2N1C1F
Nukleotidy a sekvence aminokyselin chimér 1 až 4 jsou znázorněny na obr. 24 až 27.
Každá chiméra byla začleněna do separátního expresního vektoru PJFE14.
Chiméry byly pak transfektovány do buněk COS7, spolu s prázdným vektorem pJFE14, nativním TLI a nativním TL2 jako kontroly a supernatanty kultur byly shromážděny.
Ke zjištění, jak změna ovlivní míru exprese ligandů, byly na nitrocelulóze dot-blotována zředění 1:5 a 1:50 supernatantů C0S7. Tři ligandy, které obsahovaly TLI N-doménu (tedy nativní TLI, 1N2C2F a 1N1C2F), byly pak sondovány s králičí protilátkou specifickou pro N-zakončení TLI. Tři ligandy, obsahující TL2 N-doménu (tedy nativní TL2, 2N1C1F a 2N2C1F), byly sondovány s králičí protilátkou specifickou pro N-zakončení TL2. Výsledky ukázaly, že buňky C0S7 expresovaly každou molekulu obsahující N-doménu TL2 při přibližně desetinásobku úrovně jakékoli molekuly obsahující N-doménu TLI, nezávisle na úpravě zbytku proteinu. Dospělo se k závěru, že N-doména musí zásadně řídit úroveň exprese ligandu.
Další otázkou byla schopnost nebo neschopnost chimér aktivovat receptor TIE-2. Buňky EAhy926 byly porovnány se čtyřmi chimérami stejně jako TLI jako pozitivní kontrola fosforylace a TL2 nebo supernatant prázdné buňky C0S7, transfektované pJFE14 jako negativní kontrola pro fosforylaci. Buňky se lyžovaly a receptor TIE-2 byl imunoprecipitován z buněčného lyzátu a prodělal SDS-PAGE. Vzorky byly Western blotovány a sondovány s antifosfotyrosinovou protilátkou k detekci jakéhokoli receptoru, který byl fosforylován. S překvapením pouze konstrukt
» · · · · · ·
V · Β· · · · » · · 9 9 9 9 ' k · « · · · « 9 9 9 99 <
obsahující TLI fibrinu-podobnou doménu (2N1C1F a 2N2C1F) mohl fosforylovat receptor TIE-2. Tudíž, ačkoli N-terminálová oblast TLI je potřebná k aktivaci, může být nahražena N-terminálovou oblastí TL2, což znamená že informace určující, zda ligand je agonistem nebo antagonistem je aktuálně obsažena ve fibrinogenu podobné doméně.
Bylo tedy zjištěno, že F-doména, vedle vázání TIE-2 receptoru je zodpovědná za fosforylační aktivitu TLI. Dále, když TL2, což je jinak neaktivní molekula, byla změněna náhradou své F~domény F-doménou TLI, působila změněná TL2 jako agonist.
Konstrukt 2N1C1F byl však poněkud méně mocný. Signál, způsobený chimérou 2N1C1F, se jevil poněkud silnější než chimérou 2N2C1F, což vedlo k úvahám, že C-doména TLI, ačkoli není rozhodující pro fosforylaci, může zlepšit potenci TLI. Avšak, jelikož vzorky použité k testu fosforylace nebyly normalizovány ve smyslu koncentrace ligandu, bylo možné, že silnější fosforylační signál pouze indikoval přítomnost více ligandu. Fosforylační test se proto opakoval s různým množstvím ligandu ke zjištění, zda aktivní chiméry vyvolávaly rozdílné potence. Koncentrace ligandu v supernatantech ligandových transfekcích COS7 byla zjištěna pomocí biosensorové technologie BIAcore způsoby shora popsanými (T.N. Stitt a kol., Cell 80, str. 661 až 670, 1995). Technologie BIAcore měřila vazbovou aktivitu supernatantu k TIE-2 receptoru v dohodnutých jednotkách nazývaných rezonanční jednotky (RU) . Obecně byla pozorován velmi dobrý vztah mezi RU a koncentrací ligandu s aktivitou 400 RU, odpovídající přibližně 1 pg proteinu na ml supernatantu. Vzorky se zředily na koncentrace 100 RU, 20 RU a 5 RU a fosforylační test se opakoval. Výsledky ukázaly, že chiméra 2N2C1F byla zřetelně mocnější než jak nativní TLI tak chiméra 1N1C2F při stejných koncentracích.
Jiným zajímavým význakem těchto výměnných konstruktů je • · * · · • φ · ♦ · » · • ·· · · · · · • · · · · · · · · · · · • · · · · φ · t · ·« ·» jejich úroveň exprese. Každá ze čtyř chimér byla testována z hlediska úrovně produkce buněk COS, schopnosti vázat TIE-2 a schopnosti fosforylace TIE-2. Výsledky těchto pokusů ukázaly, že chiméry 1 a 3 byly produkovány v množství porovnatelném s TLI, zatímco chiméry 2 a 4 byly produkovány v množství porovnatelném s TL2. Vysoká úroveň produkce proteinu byla tudíž korelována s N-koncovou.doménou TL2. Kromě toho při testování na endotelových buňkách EAhy926, byly chiméry 2 a 4 aktivní, zatímco chiméry 1 a 3 aktivní nebyly. Tato aktivita (fosforylace receptoru) je v korelaci s fibrinogenu-podobnou doménou TLI. Chiméry 2 a 4 měly obě žádoucí vlastnosti vysoké produkční úrovně stejně jako agonistovou aktivitu.
23.4 Proteolyticky resistentní konstrukty - Na základě poznatku, že frakce TLI preparátů byla často proteolyticky rozštěpena v blízkosti N-zakončení, se usoudilo, že argininový zbytek v poloze 49 zralého proteinu (obr. 17) byl kandidujícím místem štěpení, které mohlo být účastno na regulaci proteinové aktivity in vivo a náhrada argininu serinem (R49—>S) mohla zvyšovat stabilitu proteinu, aniž nutně ovlivnila jeho aktivitu. Takový mutant TLI byl zkonstruován a zjistilo se, že je přibližně stejně aktivní jako nativní TLI, nevykazoval však odolnost proti proteolytickému štěpení.
23.5 Kombinační mutanty - Nejmocnější z chimerních konstruktů, 2N1C1F, byl dodatečně změněn tak, že cystein zakódovaný nukleotidy 784 až 787, jak patrno na obr. 27, byl převeden na šeřin. Tato molekula (označená 2N1C1F (C246S)) byla dobře expresována, případně aktivována receptorem, byla odolná vůči proteolytickému štěpení a byla primárně dimerní, spíše než multimerní vyššího řádu. Zdálo se, že doména 2N udílí proteázovou odolnost molekule. Nakonec byla tato molekula změněna k eliminování potenciálně na proteázu citlivého místa zakódovaného nukleotidy 199 až 201, jak patrno z obr. 27, k získání molekuly (označené 2N1C1F (R51->S,C246->S)) u které se očekávalo, že
• · ·· ·· * · · · • · · · ··· ··· • · ·· «· bude aktivující, dobře expresovaná, dimerní a vůči proteáze odolná.
Tabulka 1 shrnuje modifikované ligandové konstrukty TIE-2, které byly realizovány, a charakterizuje každý z nich z hlediska schopnosti vázat receptor TIE-2, schopnosti aktivovat receptor TIE-2, typu vytvořené struktury (na příklad monomer, dimer) a relativní produkční úrovně. Nemodifikovaný TLI (plný) a TL2 (čárkovaný) jsou znázorněny se třemi doménami jako boxy. Čárkované boxy tedy indikují domény od TL2. Cystein, umístěný v poloze 245 zralého proteinu TLI, je označen C. 0značení X až C znamená, že cysteinový zbytek byl substituován pro jinou aminokyselinu než například v mutantu TLI CYS“. Podobně X až R v posledním konstruktu znamená substituci pro zbytek Arg v poloze 49 zralého proteinu TLI. C je obsažen v jednom modifikovaném TL2 konstruktu vykazujícím TL2 CYS+ mutant. Konsttrukty mají Fc zakončení nebo je také naznačeno nahromadění.
Na základě shora uvedeného je pracovníkům v oboru zřejmé, že další konstrukty jsou možné k vytvoření přídavných modifikovaných a chimerních TIE-2 ligandů s obměněnými vlastnostmi. Například se může vytvořit konstrukt obsahující N-zakončovací doménu a F-doménu TLI fúzovanou se sekcí Fc lidské protilátky IgGl. Tento konstrukt bude vázat a aktivovat TIE-2 receptor. Podobně se mohou vytvořit jiné konstrukty podle shora uvedených skutečností, přičemž tyto konstrukty spadají do rozsahu vynálezu,
23.6 Materiály a způsoby
Konstrukce chimér četné konstrukty se včleňují do pJFE14 vektoru, ve kterém je Xbal místo zaměněno za Ascl místo. Tento vektor se digeruje s Ascl a Notl za získání Ascl-NOtl řetězce. Fragmenty DNA pro • · · · « · « « · · ♦ « · · • · · · » · · • 6 «9 «9 ·· ·» chiméry se generují PCR za použití vhodných oligonukleotidů.
FLAG-1C1F a FLAG-2C2F inserty se subklonují do pMT21 vektorového řetězce, který se digeruje s ECoRI a NOtl. CF úseky se získají prostřednictvím PCR a FLAG tag a předběžná trypsin signalizující sekvence se konstruuje napojením syntetických oligonukleotidů.
Tranfekce
Všechny konstrukty se transfektuji přechodně do COS7 buněk za použití bud DEAE-dextranu nebo LipofectAMINU o sobě známými způsoby. Buněčné kultury se sklidí tři dny po transfekci a odstředují se při otáčkách 1000/min po dobu jedné minuty a supernatanty se převedou do čistých zkumavek a uloží se při teplotě -20 °C.
Zabarvování FLAG-1C1F transfektovaného a FLAG-2C2F transfektovaných buněk
Šestidůlkové destičky COS7 buněk se transfektuji přechodně TIE-2 receptorem. C0S7 supernatant z různých ligandových transfekcí se inkubuje na buňkách po dobu 30 minut, dvakrát se promyje fosfátem pufrovanou solankou (PBS) bez hořčíku nebo vápníku. Buňky se fixují v methanolu o teplotě -20 'C po dobu tří minut, promyjí se jednou PBS a inkubují se s anti FLAG M2 protilátkou (IBI, zředění 1:3000) v systému PBS/10 % hovězího telecího séra (BCS) po dobu 30 minut. Buňky se promyjí jednou PBS a inkubují se s kozí antimyší IgG alkalickou fosfatázovou (AP) konjugovanou protilátkou (Promega, 1:1000) v systému PBS/ 10 % BCS. Buňky se promyjí dvakrát PBS a inkubují se s fosfátovým substrátem, BCIP/NBT s ImM levamisolem.
• · • fc • fc • · · · · · • · · * · · * • · · · · · · • · · fc « fc · · · · ·
Fosforylační test
Zředí se COS7 supernatanty pro studii odezvy na dávku v supernatantu COS7 buněk transfektovaných prázdným vektorem pJFE14. EA buňky, které normálně expresují TIE-2 receptor, se vyhladoví po dobu více než dvou hodin v prostředí prostém séra a následně se působí vhodným COS7 supernatantem po dobu 10 minut při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Buňky se propláchnou ledově chladným PBS a lyžují se 1% NP40 lyzovým pufrem obsahujícím proteázové inhibitory (10 pg/ml leupeptinu, 10 pg/ml aprotininu, 1 mM PMSF), načež se provede imunoprecipitace s protilátkou specifickou pro TIE-2 receptor. Vzorky se podrobí imunoblot analýza za použití anti pTyr protilátek.
Dot Blots
Vzorky se nanášejí na nitrocelulózovou membránu, která se blokuje a sonduje vhodnými protilátkami.
23.7 Produkce chimerního TIE-2 ligandu z CHO a hmyzích buněk infikovaných Bacilovirem
Produkce viru
Gen pro chimerní ligand (označovaný 2N1C1F (C246S)) se zabuduje do baculovirového expresního plasmidu a rekombinuje se s virovou DNA ke generaci rekombinantního baculoviru, zesíleného a sklízeného způsoby popsanými v literatuře (D.R. O'Reilly, L.K. Miller a V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, New York, W.F. Freeman). SF21 hmyzí buňky (Spodoptera frugiperda) získané z invitrogenu se adaptují a expandují při teplotě 27 °C v seru prostém prostřčedí Gibco SF900 II. Neinfikované buňky se nechají růst do hustoty 1x600 buněk/ml. Hustota buněk se posuzuje počítáním φφ φ φ φφ φ φ φφ φφφφ φφφφ φφφφ
ΛΠ φφφφ φφφφ φφφφ
Ο / — φ φφ ΦΦΦ ΦΦΦΦ. φ φ φ φ φ φ φ φφφφφφ φ φ φ viditelných buněk za použití hymacytometru. Virový zásobní roztok pro ligand se vnese do bioreaktoru při 0,01 až 0,1 PFU/ buňka na začátku infekce. Infekční proces se nechá probíhat po dobu tří až čtyř dnů za umožnění maximální virové replikace bez podstatnější lýze buněk. Buněčná suspenze se asepticky rozdělí do sterilních odstředivkových baněk a buňky se získají odstředěním (otáčky 1600/min, 30 minut) Supernatant, prostý buněk, se shromáždí ve sterilních baňkách a uloží se při teplotě 4 eC ua vyloučení světla až do dalšího použití.
Virový titr se stanoví povlakovou zkouškou, kterou popsali D.R. O'Reilly, L.K. Miller a V.A. Luckow. Způsob se provádí v 60 mm tkáňových kultivačních miskách, které se naočkují 1,5x106 buňkami. Přidává se sériové ředění virového zásobního roztoku na zachycené buňky a směs se inkubuje za protřepávání, aby se virus absorboval na jednotlivých buňkách. Přidá se agarové překrytí a destičky se inkubují po dobu pěti dnů při teplotě 27 ’C. Viditelné buňky se zabarvují neutrální červení za zviditelnění okrouhlých povlaků, které se počítají za získání virového titru vyjádřeného počtem povlaků vytvořejících jednotku na ml (PFU/ml).
Infekce buněk pro produkci proteinu
Neinfikované SF21 buňky se nechají růst na tkáňových kultivačních destičkách a přidá se virus obsahující chimérický ligandový gen v množství 1 až 10 pfu/buňka. Virus se nechává absorbovat po dobu 90 minut při teplotě 27 °C za mírného protřepávání a na buňky se nanese čerstvé množství Sf-900 II séra prostého prostředí. Nechá se růst tři dny při teplotě 27 °C, kapaliny se shromáždí a ligand se stanovuje imunoblotingem.
CHO exprese TIE-2 ligandovými chimérami
TIE-2 ligandové chiméry se klonují do několika savčích bu• · * · 9 9 · · · 9 • 99 9 9 99 9 ·· 9 · 99 9 ··· 999
9 9 9 9 «9 99 99 něčných expresních vektorů včetně (avšak bez záměru na jakémkoliv omezeni) například pJFE, pcDNA3, pMT21, pED. Plasmidy se transfektují do CHO DG44 buněk (G. Urlaub a L.A. Chasin, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in hydrofolate reductase activity, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77, str. 4216 až 4220, 1980; G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers a L.A. Chasin, Deletion of diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells, Cell, 33, str. 405 až 412, 1983) kalciumfosfátovým vysrážením nebo kationtovými liposomy. V případě vektorů postrádajících dhfr selektovatelné markéry se plasmid pSV2.dhfr kotransfektuje v 20% molárním poměru do plasmidu obsahujícího TIE ligandové chiméry. DHFR+ buňky se selektují růstem v selekčním prostředí (medium prosté nukleosidů a nukleotidů obsahující 10 % dialyzovaného zárodečného telecího séra) a klony se skrínují se zřetelem na produkci chimerních TIE ligandů imunoblotingem s TIE-2 receptorovou látkou. Klony, expresu jící žádaný protein, se podrobují opakovanému genovému zesílení za použití odstupňopvaných koncentrací methotrexátu v selekčním prostředí. Identifukují se vysoce expresující klony po genovém zesílení podobnými imonoblotingovými způsoby.
Buněčné linie, expresující chimerní TIE ligandy, se kultivují v monovrstvách, v suspenzních baňkách, v protřšepávaných baňkách a v bioreaktorech v selekčním prostředí nebo v prostředí prostém selekce a mohou se nechávat růst v prostředí prostém séra.
Následující tabulka I se týká mutační analýzy TIE ligandů. Ve sloupci I je vázání TIE-2, ve sloupci II aktivace TIE-2, ve sloupci III multimerní struktura a ve sloupci IV produkční úroveň. N.D. znamená nestanoveno, higher order vyššího řádu, LOW nízký HIGH vysoký, HIGH* nejvyšší produkce RU a ** nejmocnější aktivace.
·· 9*
9 9 * 9
99 9··· 9999 • 9 9 999 9 999« 9·9 999 • 99999 9 · ·
Tabulka I Nsmyčkově fibninostočené genové n-ι I I °l I TL2 \77777777/77ZZZ77
I i........ _I
7777777777777777
V77777777\
77777/A
I I f? I
Y777777 * I
I t Ct I Fc |
V7Z7777777777777 * I fia9- II c I I ag- V/7/7////A7//7/7 /laj I cl l
777777777777/7 Π7 <//77777
777777777 --1
77777777727777
RT1 XI —I
IX cl...........-|
«X» + + j2 HGHER ORDER Í LOW
+ - DtMER HGH
+ + DtMER HGHER LOW
+ ORDER HGH
- N.D. N.D. LOW
- N.D. N.D. HGH
- - MONOMER HGH
- - MONOMER HGH
+ - DtMER HGH
+ - DtMER HGHER HGH
+ + ORDER HGHER LOW
+ ORDER LOW
+ + N.D. LOW
+ - N.D. HGH
+ - N.D. HGH
+ - N.D. HGH
+ - N.D. LOW t
+ + N.D. HGH
+ ♦» N.D. LOW
+ + «· N.D. HGH
+ + DtMER HGH
+ + N.D. LOW
• · • 4 9 · · 9· · · ·* * «9 99 «999 9 999
9· 9 4 4 4 444 9 4·9 994 • 44··· · · ·
Depozity
V souhlase s Budapešťskou dohodou došlo k uložení v organizaci American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852. Plasmidový klon kódující TIE-2 ligand byl uložen s ATCC 7. října 1994 a označen pJFE14 kódující TIE-2 ligand pod ATGC objednacím číslem No. 75910. Rekombinantní Autographa californica baculovirus kódující TIE-2 receptorovou látku byl uložen s ATCC 7. října 1994 a označen vTIE-2 receptorbody pod ATCC objednacím číslem No.VR2484. Lambda fágový vektor obsahující lidský tie-2 ligand DNA byl uložen s ATCC 26. října 1994 a označen IgtlO zakodující htie-2 ligand 1 pod ATCC objednacím číslem No. 75928. Plasmidový klon zakodující druhý TIE-2 ligand byl uložen s ATCC 9. prosince 1994 a označen pBluescript KS endoding human TIE-2 ligant 2 pod ATCC objednacím číslem No. 75963. E. coli kmen DH1OB obsahující plasmid pBeLoBacll s lidským TL-4 genovým insertem kódující lidský TIE ligand-4 byl uložen s ATCC 2. července 1996 a označen hTL-4 pod ATCC objednacím číslem No. 98095.
úkolem shora uvedených příkladů je toliko vynález blíže objasnit nikoliv ho však jakkoliv omezovat. Proto jsou kromě popsaných možné dalši modifikace, jak je pracovníkům v oboru zřejmé. Všechny takové modifikace do rozsahu vynálezu patří.
Průmyslová využitelnost
Modifikovaný TIE-2 ligand a izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující tento modifikoévaný TIE-2 ligand pro výrobu terapeutických prostředků pro blokování růstu krevních cév, pro podporu neovaskularizace, pro podporu nebo pro blokování růstu nebo diferenciace buněk expresujících TIE receptor a pro zeslabování nebo prevenci růstu nádorů u lidí.
·· «· ·· ·· ·· ·· « · « · · · ♦ · · · · · « ··· · ·· · · ·· · • ·« 9 9 9 · ··· · ··· ♦·· ······ · * * ·· ·· 99 99 99 99
Seznam sekvencí (1) Obecné informace
i) Přihlašovatel: Regeneron Pharmaceuticals, lne.
ii) Název vynálezu: Nové modifikované ligandy iii) Počet sekv.encí: 28 iv) Adresy pro korespondenci
A. Adresát: Regeneron Pharmaceuticals, lne.
B. Ulice: 777 Old Saw Milí Road
C. Město: Tarratown
D. Stát: NY
E. Země: Sp. st. a.
F. ZIP: 10591
v) Forma pro počítač
A. Typ média: Disketa
B. Počítač: IBM Compatible
C. Operační systém: DOS
D. Software:FastSEQ Version 2.0 vi) Platné přihlašovací údaje
A. číslo přihlášky: dosud neznámé
B. Datum podání:
C. Klasifikace:
vii) Předchozí přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: USSN 08/740,223
B. Datum podání: 25. října 1996 C: Klasifikace:
vii) Předchozí přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: USSN 60/022/999
B. Datum podání: 2. srpna 1996 viii) Informace o zástupci/zmocněnci
A. Jméno: Cobert, Robert J.
B. Registrační číslo: 36,108
C. Referenční/štítkové číslo: REG 333 ix) Telekomunikační informace
A. Telefon: 914-345-7400
B. Telefax: 914-345-7721
2. Informace o sekv. ID. N0.1:
i) Charakteristiky sekv.ence
A. Délka: 2149 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvervení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA • 9 9
99 99
99 9 9 99
9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9
9..Í 9
9 9 9 ' ; 9 ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 310..1803
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....2149
D. Jiné informace: od klonu zí gtlO kódující hite-2 ligand xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:l:
CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA 60 GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA 120 AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA 180 AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG' AAATAAAGAA 240 CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT 300 GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG 351
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Xle Leu 1 5 10
ACT CAC ATA GGG TGC Xle Gly Cye AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG 399
Thr 15 His Ser Asn 20 Gin Arg Arg Ser 25 Pro Glu Asn Ser Gly 30
AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT 447
Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile
35 40 45
CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC 495
Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr
50 55 60
AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC 543
Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe
65 70 75 .
TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT 591
Ser Ser Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr
80 85 90
CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG 639
Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser
95 100 105 110
GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC 687
Glu Met Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr
115 120 125
ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC 735
Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr
130 135 140
AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA 783
Arg Lye Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr ser Arg
145 150 155
CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG 831
Leu Glu Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu
160 165 170
AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA 879
Lve Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys
175 180 185 190
AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC : TTA . GAA . ATG GAA . GGA . AAA . CAC : AAG 927
Aon Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu . Met Glu Gly • Lys His i Lys
195 200 205 • 9 •9 99 ♦ · ·9 · 9 9
9 9« ·. « « 9 9 9 9 « 9
9 9 9 9 9
9« ·««
99 '9 '9 9 9 «'· 99 ·
999 9 999 999 • 9 ·
9« 99
GAA GAG Glu Glu TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG 975
Leu Asp 210 Thr Leu Lys Glu Glu 215 Lys Glu Asn Leu Gin Gly 220 Leu
GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC 1023
Val Thr Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn
225 230 235
AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG 1071
Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu
240 245 250
ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT 1119
Met Aep Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys GlU Gly Val
2S5 260 265 270
TTA CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT 1167
Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys
275 280 285
GCA GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT 1215
Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile
290 295 300
TAT ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT 1263
Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp
305 310 315
GTC AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT 1311
Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser
320 325 330
CTA GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT 1359
Leu Asp Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn
335 340 345 350
ccc TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC 1407
Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr
355 360 365
AGT CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG 1455
Ser Gin Arg Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly
370 375 380
AAC CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG 1503
Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys
385 390 395
CAA AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA 1551
Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys
400 405 410
CAG AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT 1599
Gin Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala
415 420 425 430
GAT AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA 1647
Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly
435 440 445
TGG TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC : TAT 1695
Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr
450 455 460
ACT GCG GGA CAA AAC CAT GGA AAA CTG AAT 1 GGG ATA . AAG TGG i CAC TAC 1743
Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn í Gly Ile ! Lys ; Trp i His i Tyr
465 470 475
··· 9 • 99 • 9
II 99
9 9
99 • 9 9
9 *
9 • 9 9
9 9 • 99
9
99
TTC AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA 1791
Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg
480 48S 490
CCT TTA GAT TTT TGA AAG CGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATC 1848
Pro Leu Asp Phe
495
CGGAGAAGCT GCCAGGTGAG AAACTGTTTG AAAACTTCAG AAGCAAACAA TATTGTCTCC 1908
CTTCCAGCAA TAAGTGGTAG TTATGTGAAG TCACCAAGGT TCTTGACCGT GAATCTGGAG 1968
CCGTTTGAGT TCACAAGAGT CTCTACTTGG GGTGACAGTG CTCACGTGGC TCGACTATAG 2028
AAAACTCCAC TGACTGTCGG GCTTTAAAAA GGGAAGAAAC TGCTGAGCTT GCTGTGCTTC 2088
AAACTACTAC TGGACCTTAT TTTGGAACTA TGGTAGCCAG ATGATAAATA TGGTTAATTT 2148
C 2149
2. Informace o sekv. ID. NO.2:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 498 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace :1..498
D. Jiné informace: od klonu ž gtlO kódující hite-2 ligand xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu GlU Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
• · · * · ♦ · · · ·· ·
- 95 - « · · · • · · · • · : · • ·
• · • ·
260 265 270
Lye Gly Gly Lye Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cye Ala Asp
275 280 285
Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile
290 295 300
Aen Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp
325 330 335
Phe Gin Arg Gly Trp Lye Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin
355 360 365
Arg Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
370 375 380
Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe Hie Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn
385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lye Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser
405 410 415
Ser Leu Ile Leu Kle Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
420 425 430
Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala
450 455 460
Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Sér Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
485 490 495
Asp Phe
2. Informace o sekv. ID. NO.3:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 2146 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 310..1800 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....2146
D. Jiné informace: od T98G klonu xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:
CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA 60 GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA 120 AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA 180 AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA 240 CTAGTTTTAG agGtcagaag AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT 300 GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG 351
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu 15 10
ACT CAC ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly 15 20 25 30
399 • ·
- 96 - • · • • • • *· • · « • ·· • · 4 • · 4 ·· * · • · 1 · · · • · ·· • · · • · · ··· · •
AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT 447
Arg Arg Tyr Asn Arg 35 Ile Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 Ile
CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC 495
Leu Pro Glu His 50 Asp Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr
AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC 543
Asn Thr Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Phe
TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT 591
Ser Ser 80 Gin Lys Leu Gin His 65 Leu Glu His Val Met 90 Glu Asn Tyr Thr
CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG 639
Gin 95 Trp Leu Gin Lys Leu 100 Glu Asn Tyr Ile Val 105 Glu Asn Met Lys Ser 110
GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC 687
Glu Met Ala Gin Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn His Thr Ala 125 Thr
ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC 735
Met Leu Glu Ile 130 Gly Thr Ser Leu Leu 135 Ser Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr
AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA 783
Arg Lys Leu 145 Thr Asp Val Glu Thr 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Ser Arg
CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG 831
Leu Glu 160 Xle Gin Leu Leu Glu 165 Asn Ser Leu Ser Thr 170 Tyr Lys Leu Glu
AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA 879
Lys 175 Gin Leu Leu Gin Gin 180 Thr Asn Glu Ile Leu 185 Lys Ile His Glu Lys 190
AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG 927
Asn Ser Leu Leu Glu 195 His Lys Ile Leu Glu 200 Met Glu Gly Lys His 205 Lys
GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG 975
Glu Glu Leu Asp 210 Thr Leu Lys Glu Glu 215 Lys Glu Asn Leu Gin 220 Gly Leu
GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC 1023
Val Thr Arg 225 Gin Thr Tyr Ile Ile 230 Gin Glu Leu Glu Lys 235 Gin Leu Asn
AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG 1071
Arg Ala 240 Thr Thr Asn Asn Ser 245 Val Leu Gin Lys Gin 250 Gin Leu Glu Leu
ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GTT TTA 1119
Met 255 Asp Thr Val His Asn 260 Leu Val Aen Leu Cys 265 Thr Lys Glu Val Leu 270
CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA ' AGA . GAC ! TGT GCA 1167
Leu Lys Gly Gly Lys 275 Arg Glu Glu Glu Lys 280 Pro Phe i Arg Asp i Cys 285 Ala
GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT ' AAA . AGT ' GGA ATC TAC ACT ATT TAT 1215
Asp Val Tyr Gin 290 Ala Gly Phe Asn : Lys 295 : Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr 300
·« ·· ·* ·· • · · * · ·· · · · · · ···· ··«* · · · ·
97 • · • · ·· • · • · • · ♦ > « • · • * • ·· ·
ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC 1263
Ile Asn Asn 305 Met Pro Clu Pro Lys 310 Lys Val Phe Cys Asn 315 Met Asp Val
AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA 1311
Αβη Gly 320 Gly Gly Trp Thr Val 325 Ile Gin His Arg Glu 330 Asp Gly Ser Leu
GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC 1359
Asp 335 Phe Gin Arg Gly Trp 340 Lys Glu Tyr Lys Met 345 Gly Phe Gly Asn Pro 350
TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT 1407
Ser Gly Glu Tyr Trp 355 Leu Gly Asn Glu Phe 360 Ile Phe Ala Ile Thr 365 šer
CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC 1455
Gin Arg Gin Tyr 370 Met Leu Arg Ile Glu 375 Leu Met Asp Trp Glu 380 Gly Asn
CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA 1503
Arg Ala Tyr 385 Ser Gin Tyr Asp Arg 390 Phe His Ile Gly Asn 395 Glu Lys Gin
AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG 1551
Asn Tyr 400 Arg Leu Tyr Leu Lys 405 Gly His Thr Gly Thr 410 Ala Gly Lys Gin
AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT 1599
Ser 415 Ser Leu Ile Leu His 420 Gly Ala Asp Phe Ser 425 Thr Lys Asp Ala Asp 430
AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG 1647
Asn Asp Asn Cys Met 435 Cys Lys Cys Ala Leu 440 Met Leu Thr Gly Gly 445 Trp
TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT 1695
Trp Phe Asp Ala 450 Cys Gly Pro Ser Asn 455 Leu Asn Gly Met Phe 460 Tyr Thr
GCG GGA CAA AAC CAT CGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC 1743
Ala Gly Gin 465 Asn His Arg Lys Leu 470 Αβπ Gly Ile Lys Trp 475 His Tyr Phe
AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT 1791
Lys Gly 480 Pro Ser Tyr Ser Leu 485 Arg Ser Thr Thr Met 490 Met Ile Arg Pro
TTA GAT ΤΤΤ TGA AAGCGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATCCGGA 1849
Leu Asp Phe
495
GAAGCTGCCA GGTGAGAAAC TGTTTGAAAA CTTCAGAAGC AAACAATATT GTCTCCCTTC 1909 CACCAATAAG TGGTAGTTAT GTGAAGTCAC CAAGGTTCTT GACCGTGAAT CTGGAGCCGT 1969 TTGAGTTCAC AAGAGTCTCT ACTTGGGGTG ACAGTGCTCA CGTGGCTCGA CTATAGAAAA 2029 CTCCACTGAC TGTCGGGCTT TAAAAAGGGA AGAAACTGCT GAGCTTGCTG TGCTTCAAAC 2089 TACTACTGGA CCTTATTTTG GAACTATGGT AGCCAGATGA TAAATATGGT TAATTTC 2146
2. Informace o sekv. ID. NO. 4:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 497 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ·· • · « * · • · ·· « • · · · ♦ · • · · · · tt ·· ·* • » 9 • · · • *♦· « • ·
Φ· ·« *»
Ο · * <» · · ·»« ··« • · • * ··
v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace : 1..2146
D. Jiné informace: od T98G klonu
xi) Popis sekvence : SEQ ID NO:4:
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Xle Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg ·
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys Híb Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu' Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu Leu Lys
260 265 270
Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val
275 280 285
Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn
290 295 300
Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Αβπ Met Asp Val Asn Gly
305 310 315 320
Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe
325 330 335
Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly
340 345 350
Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg
355 360 365
Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala
370 375 380
Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr
385 390 395 400
Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser
405 410 415
Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp
420 425 430
Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe
435 440 445
Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly
• ·
- 99 - • · • · • · • · • · • · • • · • • · • ·' •
450 455 460
Gin Asn Hic Arg Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly
465 470 475 480
Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met lle Arg Pro Leu Asp
485 490 495
Phe
2. Informace o sekv. ID. NO.5:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 2282 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 357..1844 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 2
B. lokace: 1....2282 . , ,
Ό Jiné informace: od klonu pBluescript KS zakoaujici lidský TIE-2 ligand 2 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
GAATTCCTGG GTTGGTGTTT ATCTCCTCCC AGCCTTGAGG GAGGGAACAA CACTGTAGGA 60
TCTGGGGAGA GAGGAACAAA GGACCGTGAA AGCTGCTCTG TAAAAGCTGA CACAGCCCTC 120
CCAAGTGAGC AGGACTGTTC TTCCCACTGC AATCTGACAG TTTACTGCAT GCCTGGAGAG 180
AACACAGCAG TAAAAACCAG GTTTGCTACT GGAAAAAGAG GAAAGAGAAG ACTTTCATTG 240
ACGGACCCAG CCATGGCAGC GTAGCAGCCC TGCGTTTCAG ACGGCAGCAG CTCGGGACTC 300
TGGACGTGTG TTTGCCCTCA AGTTTGCTAA GCTGCTGGTT TATTACTGAA GAAAGA ATG 359
Met
TGG Trp CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT GAT CTT GTC TTG GCC Ala GCA Ala 407
Gin Ile Val 5 Phe Phe Thr Leu Ser 10 Cys Asp Leu Val Leu 15
GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG CAA 455
Ala Tyr Asn 20 Asn Phe Arg Lys Ser 25 Met Asp Ser Ile Gly 30 Lys Lys Gin
TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA GAG 503
Tyr Gin 35 Val Gin His Gly Ser 40 Cys Ser Tyr Thr Phe 45 Leu Leu Pro Glu
ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC ccč TAC GTG TCC AAT GCT GTG 551
Met 50 Asp Asn Cys Arg Ser 55 Ser Ser Ser Pro Tyr 60 Val Ser Asn Ala Val 65
CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG CAA 599
Gin Arg Asp Ala Pro 70 Leu Glu Tyr Asp Asp 75 Ser Val Gin Arg Leu 80 Gin
GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG CTT 647
Val Leu Glu Asn 85 Ile Met Glu Asn Asn 90 Thr Gin Trp Leu Met 95 Lys Leu
GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA CAG 695
Glu Asn Tyr 100 Ile Gin Asp Asn Met 105 Lys Lys Glu Met Val 110 Glu Ile Gin
- 100 - • • • • · · • · · > · · • ' · · • • · · • ·· · • · • · · • · · · •
CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG ACA 743
Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn Gin 120 Thr Ala Val Met Ile 125 Glu Ile Gly Thr
AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT GTG 791
Asn 130 Leu Leu Asn Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp Val 145
GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC TTG 839
Glu Ala Gin Val Leu 150 Asn Gin Thr Thr Arg 155 Leu Glu Leu Gin Leu 160 Leu
GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC CAG 887
Glu His Ser Leu 165 Ser Thr Asn Lys Leu 170 Glu Lys Gin Ile Leu 175 Asp Gin
ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA AAG 935
Thr Ser Glu 180 Ile Asn Lys Leu Gin 185 Asp Lys Asn Ser Phe 190 Leu Glu Lys
AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA ATA 983
Lys Val 195 Leu Ala Met Glu Asp 200 Lys His Ile Ile Gin 205 Leu Gin Ser Ile
AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC AAG CAA AAT TCC 1031
Lye 210 Glu Glu Lys Asp Gin 215 Leu Gin Val Leu Val 220 Ser Lys Gin Asn Ser 225
ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT AAT 1079
Ile Ile Glu Glu Leu 230 Glu Lys Lys Ile Val 235 Thr Ala Thr Val Asn 240 Asn
TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT AAC 1127
Ser Val Leu Gin 245 Lys Gin Gin Hle Asp 250 Leu Met Glu Thr Val 255 Asn Asn
TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT GTT 1175
Leu Leu Thr 260 Met Met Ser Thr Ser 265 Asn Ser Ala Lye Aep 270 Pro Thr Val
GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT GAA GTA TTC AAA 1223
Ala Lye 275 Glu Glu Gin Ile Ser 280 Phe Arg Asp Cys Ala 285 Glu Val Phe Lys
TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA' TTC CCT AAT TCT 1271
Ser 290 Gly His Thr Thr Asn 295 Gly Ile Tyr Thr Leu 300 Thr Phe Pro Asn Ser 305
ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA GGA GGC GGG 1319
Thr Glu Glu Ile Lys 310 Ala Tyr Cys Asp Met 315 Glu Ala Gly Gly Gly 320 Gly
TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT TTT CAG AGG 1367
Trp Thr Ile Ilé 325 Gin Arg Arg Glu Asp 330 Gly Ser Val Asp Phe 335 Gin Arg
ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT TCA GGA GAA TAT 1415
Thr Trp Lys 340 Glu Tyr Lys Val Gly 345 Phe Gly Asn Pro Ser 350 Gly Glu Tyr
TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG CAA CGC TAT 1463
Trp Leu 355 Gly Asn Glu Phe Val 360 Ser Gin Leu Thr Asn 365 Gin Gin Arg Tyr
GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG GCT TAC ! TCA 1511
Val 370 Leu Lys Ile His Leu 375 Lys Asp Trp Glu Gly 380 Asn Glu Ala Tyr Ser 385
• - 101 - • · • • • • • · • · • · · • · « · • · • ♦ * · • 9 9 ♦ · · • 9 · • · · • 99 9 • · • · • 9 9 9 9 99 9 9
TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT TAT AGG ATT 1559
Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Sér Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile
390 395 400
CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC AGC ATC AGC 1607
His Leu Lya Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser
405 410 415
CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC GAC AAA TGT 1655
Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys
420 425 430
ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG TTT GAT GCA 1703
Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp A'la
435 440 445
TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA CAG AGG CAG AAC 1751
Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin Asn
450 455 460 465
ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA GGC TCA GGC 1799
Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly
470 475 480
TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA GAT TTC TAAAC 1849
Tyr Ser Leu Lya Ala Thr Thr Met· Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
ATCCCAGTCC ACCTGAGGAA CTGTCTCGAA CTATTTTCAA AGACTTAAGC CCAGTGCACT 1909 GAAAGTCACG GCTGCGCACT GTGTCCTCTT CCACCACAGA GGGCGTGTGC TCGGTGCTGA 1969 CGGGACCCAC ATGCTCCAGA TTAGAGCCTG TAAACTTTAT CACTTAAACT TGCATCACTT 2029 AACGGACCAA AGCAAGACCC TAAACATCCA TAATTGTGAT TAGACAGAAC ACCTATGCAA 2089 AGATGAACCC GAGGCTGAGA ATCAGACTGA CAGTTTACAG ACGCTGCTGT CACAACCAAG 2149 AATGTTATGT GCAAGTTTAT CAGTAAATAA CTGGAAAACA GAACACTTAT GTTATACAAT 2209 ACAGATCATC TTGGAACTGC ATTCTTCTGA GCACTGTTTA TACACTGTGT AAATACCCAT 2269 ATGTCCTGAA TTC 2282
2. Informace o sekv. ID. NO . 6 :
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 2
B. lokace: 1..2146 .
D Jiné informace: od klonu pBluescript lidský TIE-2 ligand
KS zakóduj cí xi) Popis sekvence
SEQ ID NO:6:
Met Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
65 70 75 80
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys
• ·
- 102 ·· · o
85 90 95
Leu Glu Aan Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lya Glu Met Val Glu Ile
100 105 110
Gin Gin Aan Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Aan Leu Leu Aan Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 155 160
Leu Glu Hia Ser Leu Ser Thr Asn Lya Leu Glu Lya Gin Ile Leu Asp
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Aan Lya Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lys Lya Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin Leu Gin ser
195 200 205
Xle Lya Glu Glu Lya Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn
210 215 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lya Lya Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu GÍn Lys Gin Gin Hia Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Aan Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260 265 270
Val Ala Lya Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cya Ala Glu Val Phe
275 280 285
Lys Ser Gly Hia Thr Thr Aan Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290 295 300
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cya Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin
325 330 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lya Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg
355 360 365
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370 375 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Hia Leu Lya Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
405 410 415
Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cys Ile Cys Lya CyB Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cya Gly Pro Ser Aan Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin
450 455 460
Aan Thr Aan Lya Phe Asn Gly Ile Lya Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Leu Lya Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
2. Informace o sekv. ID. NO.7:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 478 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: zralý TLI protein
B. lokace: 1..478 D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:
• · • ·
- 103 • fc · fc · · • · · fc ♦ · • · · · fc • fc · ·
Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg 10 Arg Tyr Asn Arg 15 Ile
1 5
Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly
20 25 30
Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin
35 40 45
Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin
50 55 60
His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu
65 70 75 80
Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile Gin
85 90 95
Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr
100 105 110
Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val
115 120 125
Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu
130 135 140
Glu Asn Ser Leu Ser. Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His
165 170 175
Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu
180 185 190
Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr
195 200 205
Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn
210 215 220
Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn
225 230 235 240
Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys
245 250 255
Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala
260 265 270
Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro
275 280 285
Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp
290 295 300
Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg Gly
305 310 315 320
Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp
325 330 333
Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Met
340 345 350
Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin
355 360 365
Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr
370 375 380
Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu
385 390 395 400
His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met
405 410 415
Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys
420 425 430
Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His
435 440 445
Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr
450 455 460
Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
465 470 475
2. Informace o sekv. ID. NO.8:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 480 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
9
9
- 104 · · · • · ♦· · • 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 ·« ·* ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: zralý TL2 protein
B. lokace: 1..480 D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
1 5 10 15
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
20 25 30
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
35 40 45
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
50 55' 60
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
85 90 95
Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
100 105 110
Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
115 120 125
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin . Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
130 135 140
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
145 150 155 160
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
165 170 175
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin Leu Gin Ser
180 185 190
Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn
195 200 205
Ser Ilé Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
210 215 220
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
245 250 255
Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
260 265 270
Lys Šer Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
275 280 285
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin
305 310 315 320
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
325 330 335
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg
340 345 350
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
355 360 365
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
370 375 380
Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
3S5 390 395 400
Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
405 410 415
• · • · 9 9 9 ♦ · « • 9 9 · · · * · *
9 9 9 9 · · · · ·· ·
99 999 9 999· 999 «99
- 105 - 9 9 9 · 9 9
Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
420 425 430
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin
435 440 445
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
450 455 460
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
465 470 475 480
2. Informace o sekv. ID. NO. 9:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1849 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 47..1573 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: TIE ligand 3
B. lokace : 1....1849
D. Jiné informace: fibrinogenová doména začíná v poloze 929 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:
CTGTCCTGGT ACCTGACAAG ACCACCTCAC CACCACTTGG TCTCAG ATG CTC TGC 55
Met Leu Cys
CAG CCA Gin Pro GCT ATG CTA CTA GAT GGC Gly CTC CTC CTG Leu CTG Leu 15 GCC Ala ACC Thr ATG Met GCT Ala 103
Ala Met Leu Leu Asp 10 Leu Leu
5
GCA GCC CAG CAC AGA GGG CCA GAA GCC GGT GGG CAC CGC CAG ATT CAC 151
Ala Ala Gin His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg Gin Ile His
20 25 30 35
CAG GTC CGG CGT GGC CAG TGC AGC TAC ACC TTT GTG GTG CCG GAG CCT 199
Gin Val Arg Arg Gly Gin Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Glu Pro
40 45 50
GAT ATC TGC CAG CTG GCG CCG ACA GCG GCG CCT GAG GCT TTG GGG GGC 247
Asp Ile Cys Gin Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly
55 60 65
TCC AAT AGC CTC CAG AGG GAC TTG CCT GCC TCG AGG CTG CAC CTA ACA 295
Ser Asn Ser Leu Gin Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr
70 75 80
GAC TGG CGA GCC CAG AGG GCC CAG CGG GCC CAG CGT GTG AGC CAG CTG 343
Asp Trp Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Val Ser Gin Leu
85 90 95
GAG AAG ATA CTA GAG AAT AAC ACT CAG TGG CTG CTG AAG CTG GAG CAG 391
Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gin
100 105 110 115
TCC ATC AAG GTG AAC TTG AGG TCA CAC CTG GTG CAG GCC CAG CAG GAC 439
Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gin Ala Gin Gin Asp
120 125 130
φ φ φφ φφ φφ φ φφ φ φ φφ φ φ φφ φ φφφφ φφφφ φφφφ
— 106 — Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ •
ACA ATC CAG AAC CAG ACA ACT ACC ATG CTG GCA CTG GGT GCC AAC CTC 487
Thr lle Gin Asn 135 Gin Thr Thr Thr Met 140 Leu Ala Leu Gly Ala Asn 145 Leu
ATG AAC CAG ACC AAA GCT CAG ACC CAC AAG CTG ACT GCT GTG GAG GCA 535
Met Asn Gin 150 Thr Lys Ala Gin Thr 155 His Lys Leu Thr Ala 160 Val Glu Ala
CAG GTC CTA AAC CAG ACA TTG CAC ATG AAG ACC CAA ATG CTG GAG AAC 583
Gin Val 165 Leu Asn Gin Thr Leu 170 His Met Lys Thr Gin 175 Met Leu Glu Aen
TCA CTG TCC ACC AAC AAG CTG GAG CGG CAG ATG CTG ATG CAG AGC CGA 631
Ser 180 Leu Ser Thr Asn Lys 185 Leu Glu Arg Gin Met 190 Leu Met Gin Ser Arg 195
GAG CTG CAG CGG CTG CAG GGT CGC AAC AGG GCC CTG GAG ACC AGG CTG 679
Glu Leu Gin Arg Leu 200 Gin Gly Arg Asn Arg 205 Ala Leu Glu Thr Arg 210 Leu
CAG GCA CTG GAA GCA CAA CAT CAG GCC CAG CTT AAC AGC CTC CAA GAG 727
Gin Ala Leu Glu 215 Ala Gin His Gin Ala 220 Gin Leu Asn Ser Leu Gin 225 Glu
AAG AGG GAA CAA CTG CAC AGT CTC CTG GGC CAT CAG ACC GGG ACC CTG 775
Lys Arg Glu 230 Gin Leu His Ser Leu 235 Leu Gly His Gin Thr 240 Gly Thr Leu
GCT AAC CTG AAG CAC AAT CTG CAC GCT CTC AGC AGC AAT TCC AGC TCC 823
Ala Asn 245 Leu Lys His Asn Leu 250 His Ala Leu Ser Ser 255 Asn Ser Ser Ser
CTG CAG CAG CAG CAG CAG CAA CTG ACG GAG TTT GTA CAG CGC CTG GTA 871
Leu 260 Gin Gin Gin Gin Gin 265 Gin Leu Thr Glu Phe 270 Val Gin Arg Leu Val 275
CGG ATT GTA GCC CAG GAC CAG CAT CCG GŤr TCC TTA AAG ACA CCT AAG 919
Arg lle Val Ala Gin 280 Asp Gin His Pro Val 285 Ser Leu Lys Thr Pro 290 Lys
CCA GTG TTC CAG GAC TGT GCA GAG ATC AAG CGC TCC GGG GTT AAT ACC 967
Pro Val Phe Gin 295 Asp Cys Ala Glu lle 300 Lys Arg Ser Gly Val Asn 305 Thr
AGC GGT GTC TAT ACC ATC TAT GAG ACC AAC ATG ACA AAG CCT CTC AAG 1015
Ser Gly Val 310 Tyr Thr lle Tyr Glu 315 Thr Asn Met Thr Lys 320 Pro Leu Lys
GTG TTC TGT GAC ATG GAG ACT GAT GGA GGT GGC TGG ACC CTC ATC CAG 1063
Val Phe 325 Cys Asp Met Glu Thr 330 Asp Gly Gly Gly Trp 335 Thr Leu lle Gin
CAC CGG GAG GAT GGA AGC GTA AAT TTC CAG AGG ACC TGG GAA GAA TAC 1111
His 340 Arg Glu Asp Gly Ser 345 Val Asn Phe Gin Arg 350 Thr Trp Glu Glu Tyr 355
AAA GAG GGT TTT GGT AAT GTG GCC AGA GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAG 1159
Lys Glu Gly Phe Gly 360 Asn Val Ala Arg Glu 365 His Trp Leu Gly Asn 370 Glu
GCT GTG CAC CGC CTC ACC AGC AGA ACG GCC TAC TTG CTA CGC GTG GAA 1207
Ala Val Híb Arg 375 Leu Thr Ser Arg Thr 380 Ala Tyr Leu Leu Arg Val 385 Glu
CTG CAT GAC TGG GAA GGC CGC CAG ACC TCC ATC CAG TAT GAG AAC TTC 1255
Leu His Asp 390 Trp Glu Gly Arg Gin 395 Thr Ser lle Gin Tyr 400 Glu Asn Phe
- 107 • · « · · • B • · · — · · · • B • • · • « B B B • · • B • · B B • * • « B B B · B B B · • BB BB B B B B B B B ♦· B
CAG CTG GGC AGC GAG AGG CAG CGG TAC AGC CTC TCT GTG AAT GAC AGC 1303
Gin Leu Gly Ser Glu Arg Gin Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser
405 410 415
AGC AGT TCA GCA GGG CGC AAG AAC AGC CTG GCT CCT CAG GGC ACC AAG 1351
Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gin Gly Thr Lys
420 425 430 435
TTC AGC ACC AAA GAC ATG GAC AAT GAT AAC TGC ATG TGT AAA TGT GCT 1399
Phe Ser Thr Lye Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala
440 445 450
CAG ATG CTG TCT GGA GGG TGG TGG TTT GAT GCC TGT GGC CTC TCC AAC 1447
Gin Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn
455 460 465
CTC AAT GGC ATC TAC TAT TCA GTT CAT CAG CAC TTG CAC AAG ATC AAT 1495
Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser val His Gin His Leu His Lys Ile Asn
470 475 480
GGC ATC CGC TGG CAC TAC TTC CGA GGC CCC AGC TAC TCA CTG CAC GGC 1543
Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Leu His Gly
485 490 495
ACA CGC ATG ATG CTG AGG CCA ATG GGT GCC TGA CACACAG CCCTGCAGAG ACT 1596
Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500 505
GATGCCGTAG GAGGATTCTC AACCCAGGTG ACTCTGTGCA CGCTGGGCCC TGCCCAGAAA 1656 TCAGTGCCCA GGGCTCATCT TGACATTCTG GAACATCGGA ACCAGCTTAC CTTGCCCCTG 1716 AATTACAAGA ATTCACCTGC CTCCCTGTTG CCCTCTAATT GTGAAATTGC TGGGTGCTTG 1776 AAGGCACCTG CCTCTGTTGG AACCATACTC TTTCCCCCTC CTGCTGCATG CCCGGGAATC 1836 CCTGCCATGA ACT 1849
2. Informace o sekv. ID. NO.10:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 509 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: TIE ligand 3
B. lokace: 1..509 D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:10:
Met Leu Cys Gin Pro Ala Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Thr Met Ala Ala Ala Gin His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg
20 25 30
Gin Ile His Gin Val Arg Arg Gly Gin Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val
35 40 45
Pro Glu Pro Asp Ile Cys Gin Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala
50 55 60
Leu Gly Gly Ser Asn Ser Leu Gin Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu
65 70 75 80
His Leu Thr Asp Trp Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Val
85 90 95
Ser Gin Leu Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Leu Lys
• ·
- 108 - • · • · « · • · • · • · « · • · • • • · • • · • · • · · •
100 105 110
Leu Glu Gin Ser Ile LyB Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gin Ala
115 120 125
Gin Gin Asp Thr Ile Gin Asn Gin Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly
130 135 140
Ala Asn Leu Met Asn Gin Thr Lys Ala Gin Thr His Lys Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Leu His Met Lys Thr Gin Met
165 170 175
Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gin Met Leu Met
180 185 190
Gin Ser Arg Glu Leu Gin Arg Leu Gin Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu
195 200 205
Thr Arg Leu Gin Ala Leu Glu Ala Gin His Gin Ala Gin Leu Asn Šer
210 215 220
Leu Gin Glu Lys Arg Glu Gin Leu His Ser Leu Leu Gly His Gin Thr
225 230 235 240
Gly Thr Leu Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn
245 250 255
Ser Ser Ser Leu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Thr Glu Phe Val Gin
260 265 270
Arg Leu Val Arg Ile Val Ala Gin Asp Gin His Pro Val Ser Leu Lys
275 280 285
Thr Pro Lys Pro Val Phe Gin Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly
290 295 300
Val Asn Thr Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys
305 310 315 320
Pro Leu Lys Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr
325 330 335
Leu Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asn Phe Gin Arg Thr Trp
340 345 350
Glu Glu Tyr Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu
355 360 365
Gly Asn Glu Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu
370 375 380
Arg Val Glu Leu His Asp Trp Glu Gly Arg Gin Thr Ser Ile Gin Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Phe Gin Leu Gly Ser Glu Arg Gin Arg Tyr Ser Leu Ser Val
405 410 415
Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gin
420 425 430
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys
435 440 445
Lys Cys Ala Gin Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly
450 455 460
Leu Ser Asn Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Gin His Leu His
465 470 475 480
Lys Ile Asn Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser
485 490 495
Leu His Gly Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500 505
2. Informace o sekv. ID. NO.11:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 503 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix ) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTL3
B. lokace: 1..503
D. Jiné informace:myší TIE liaand-3 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:li:”
109 » 9 9 » 9 9
9 9
Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Met Ala Ala Ala Gin
1 5 10 15
Hle Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg Gin Ile His Gin Val Arg
20 25 30
Arg Gly Gin Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Glu Pro Asp Ile Cys
35 40 45
Gin Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly Ser Asn Ser
50 55 60
Leu Gin Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr Asp Trp Arg
65 70 75 80
Ala Gin Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Val Ser Gin Leu Glu Lys Ile
85 90 95
Leu Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gin Ser Ile Lys
100 105 110
Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gin Ala Gin Gin Asp Thr Ile Gin
115 120 125
Asn Gin Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly Ala Asn Leu Met Asn Gin
130 135 140
Thr Lys Ala Gin Thr His Lys Leu Thr Ala Val Glu Ala Gin Val Leu
145 150 155 160
Asn Gin Thr Leu His Met Lys Thr Gin Met Leu Glu Asn Ser Leu Ser
165 170 175
Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gin Met Leu Met Gin Ser Arg Glu Leu Gin
180 185 • 190
Arg Leu Gin Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu Thr Arg Leu Gin Ala Leu
195 200 205
Glu Ala Gin His Gin Ala Gin Leu Asn Ser Leu Gin Glu Lys Arg Glu
210 215 220
Gin Leu His Ser Leu Leu Gly His Gin Thr Gly Thr Leu Ala Asn Leu
225 230 235 240
Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Leu Gin Gin
245 250 255
Gin Gin Gin Gin Leu Thr Glu Phe Val Gin Arg Leu Val Arg Ile Val
260 265 270
Ala Gin Asp Gin His Pro Val Ser Leu Lys Thr Pro Lys Pro Val Phe
275 280 285
Gin Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly Val Asn Thr Ser Gly Val
290 295 300
Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys Pro Leu LyB Val Phe Cys
305 310 315 320
Aep Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Gin His Arg Glu
325 330 335
Asp Gly Ser Val Asn Phe Gin Arg Thr Trp Glu Glu Tyr Lys Glu Gly
340 345 350
Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Ala Val His
355 360 365
Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu Arg Val Glu Leu His Asp
370 375 380
Trp Glu Gly Arg Gin Thr Ser Ile Gin Tyr Glu Asn Phe Gin Leu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Arg Gin Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser Ser Ser Ser
405 410 415
Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gin Gly Thr Lys Phe Ser Thr
420 425 430
LyB Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Gin Met Leu
435 440 445
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450 455 460
Ile Tyr Tyr Ser Val His Gin His Leu His Lys Ile Asn Gly Ile Arg
465 470 475 480
Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Ile His Gly Thr Arg Met
485 490 495
Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
110
99 99 • 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 ·
999999 9 9 9 • 9 9 • · 9
999 9··
500
2. Informace ο sekv. ID. NO.12:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 480 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTLl B . lokace: 1. . 490
D. Jiné informace: lidský TIE-2 ligand 1 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:12:
Ala Phe 1 Leu Ala Ala 5 Ile Leu Thr His Ile Gly Cys 10 Ser Asn Gin Arg 15
Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly
20 25 30
Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg
35 40 45
Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala
50 55 60
Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin His Leu Glu
65 70 75 80
His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala
100 105 110
Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu
115 120 125
Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin
130 135 140
Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser
145 150 155 160
Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu
165 170 175
Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu
180 185 190
Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu
195 200 205
Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin
210 215 220
Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu
225 230 235 240
Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn
245 250 255
Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu
260 265 270
Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys
275 280 285
Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys
290 295 300
Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin
305 310 315 320
His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu
340 345 350
Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu
355 360 365
Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe
- 111 - • · • · • · • · • · • · • · • · • · • · : i • · ί • • · • · • · • · · • ··
370 375 380
His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His
385 390 395 400
Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu Hle Gly Ala Asp
405 410 415
Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala
420 425 430
Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn
435 • 440 445
Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn
450 455 460
Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Ile Arg Ser
465 470 475 480
Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490
2. Informace o sekv. ID. NO.13:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 491 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTLl
B. lokace : 1..491
D. Jiné informace: kuřecí TIE-2 ligand 1
xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO :13:
Ala 1 Phe Leu Ala Ala Ile 5 Leu Ala His Ile 10 Gly Cys Thr Thr Gin Arg 15
Arg Ser Pro Glu Asn Ser 20 Gly Arg Arg 25 Phe Asn Arg Ile Gin His Gly 30
Gin Cys Thr 35 Tyr Thr Phe Ile Leu 40 Pro Glu Gin Asp Gly Asn Cys Arg 45
Glu Ser Thr 50 Thr Asp Gin Tyr Asn 55 Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala 60
Pro 65 His Val Glu Gin Asp 70 Phe Ser Phe Gin Lys Leu Gin His Leu Glu 75 80
His Val Met Glu Asn Tyr 85 Thr Gin Trp Leu 90 Gin Lvs Leu Glu Ser Tyr 95
Ile Val Glu Asn Met Lys 100 Ser Glu Met 105 Ala Gin Leu Gin Gin Asn Ala 110
Val Gin Asn 115 His Thr Ala Thr Met 120 Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu 125
Ser Gin Thr 130 Ala Glu Gin Thr Arg 135 Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin 140
Val 145 Leu Asn Gin Thr Ser 150 Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser 155 160
Leu Ser Thr Tyr Lys Leu 165 Glu Lys Gin Leu 170 Leu Gin Gin Thr Aen Glu 175
Ile Leu Lys Ile His Glu 180 Lys Asn Ser 185 Leu Leu Glu His Lys Ile Leu 190
Glu Met Glu 195 Glu Arg His Lys Glu 200 Glu Met Asp Thr Leu Lys Glu Glu 205
Lys Glu Asn 210 Leu Gin Gly Leu Val 215 Thr Arg Gin Ser Tyr Ile Ile Gin 220
Glu 225 Leu Glu Lys Gin Leu 230 Asn Lys Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu 235 240
Gin Lys Gin Gin Leu Glu 245 Leu Met Asp Thr 250 Val His Thr Leu Ile Thr 255
Leu Cys Ser Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Asn Ala Lys Arg Glu Glu
• · • · ·· ·· ·· ·· • · · · · ····
- 112 - • · • · ·· ·
260 265 270
Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn
275 280 285
Lye Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Val Ser Asp Pro Lys
290 295 300
Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile
305 310 315 320
Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Lys Gly Trp Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Met Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn
340 345 350
Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Ser Leu Arg Ile
355 360 365
Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg
370 375 380
Phe Hle Xle Gly Asn Glu Lye Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lye Gly
385 390 395 400
Hle Ser Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala
405 410 415
Glu Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lye Cys
420 425 430
Ala Leu Ket Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser
435 440 445
Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lye Leu
450 455 460
Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Arg Tyr Ser Ile Arg
465 470 475 480
Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490
2. Informace o sekv. ID. NO.14: i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 497 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: : jeden
D. Topologie: lineární
ii) Typ ' molekuly: protein
ix) Charakteristika
A. jméno/klič: mTLl
B. lokace :1..497
D. Jiné informace: myší TIE-2 ligand 1
xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14 :
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Phe Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Asn Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
• 9 ·
113 • · 4 9 9 4 • 4 9 4 9 4
4 ·· 44 • 4 4 9 4 4 4 • 4 4 4 4 4
4« 44 44
4 4
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu
180 185 190
Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Met
195 200 205
Aep Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Ser Arg
210 215 220
Gin Ser Phe Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Ser Arg Ala Thr
225 230 235 240
Asn Asn Asn Ser Ile Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr
245 250 255
Val His Asn Leu Ile Ser Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys
260 265 270
Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val
275 280 285
Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Phe Asn
290 295 300
Asn Val Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly
305 310 315 320
Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe
325 330 335
Gin Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly
340 345 350
Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg
355 360 365
Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala
370 375 380
Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr
385 390 395 400
Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser
405 410 415
Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp
420 425 430
Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe
435 440 44S
Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly
450 455 460
Gin Asn His Gly Lys Leu Αβπ Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly
465 470 475 480
Pro Arg Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp
485 490 495
Phe
2. Informace o sekv. ID. NO.15:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix ) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTL2
B. lokace: 1..496
D. Jiné informace: myší TIE-2 ligand 2
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:15 :
Met Trp Gin Ile Ile Phe Leu Thr Phe Gly Trp Asp Ala Val Leu Thr
1 5 10 15
Ser Ala Tyr Ser Asn Phe Arg Lys Ser Val Asp Ser Thr Gly Arg Arg
·· X *· ·· • 9
- 114 - 9 • • ·· » * » ·» • » • · ·· • * » • · « ·> · i 9 9 9 9 • · • 1« ·
20 25 30
Arg Tyr Arg Ile Gin Asn Gly Pro Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Thr Asp Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Met Thr Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Ser Val Gin Ser Leu
65 70 75 80
Gin Leu Leu Glu Asn Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Met Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Ala Glu Ile
100 105 110
Gin Gin Asn Val Val Gin Asn His Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 155 160
Leu Gin His Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Ile His Asn Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Gin Lys Val Leu Asp Met Glu Gly Lys His Ser Glu Glu Met Gin Thr
195 200 205
Met Lys Glu Gin Lys Asp Glu Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Ser
210 215 220
Ser Val Ile Asp Glu Leu Glu Lys Lys Leu Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Leu Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn
245 250 255
Ser Leu Leu Thr Met Met Ser Ser Pro Asn Ser Lys Ser Ser Leu Ala
260 265 270
Ile Arg Arg Glu Glu Gin Thr Thr Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Phe
275 280 285
Lys Ala Gly Leu Thr Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290 295 300
Ser Pro Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asn Met Asp Val Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin
325 330 335
Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Leu Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn GlU Phe ile Ser Gin Ile Thr Gly Gin His Arg
355 360 365
Tyr Val Leu Lys Ile Gin Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala His
370 375 380
Ser Leu Tyr Asp His Phe Tyr Ile Ala Gly Glu Glu Ser Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile His Leu Thr Gly Leu Thr Gly Thr Ala Ala Lys Ile Ser Ser Ile
405 410 415
Ser Gin Pro Gly Ser Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ser Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cys Ile Cys Lye Cys Ser Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Gin Phe Tyr Pro Gin Lys Gin
450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Ile Lye Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
··· • 9 • 99
2. Informace o sekv. ID. NO.16:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein • · • 9 • » • · ···· ···· fc · · *
Í· ·· · · · · fcfcfcfc •fc fc fc · fc fcfcfc fc »·· ·»· ···· · · fc · « ix) Charakteristika
A. iméno/klíč: hTL2
E. lokace: 1..496
D. Jiné informace: lidský TIE-2 ligand 2
xi; i Popis sekvence: SEQ ID N0:16:
Met Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser cyu .—----
1 Ala Ala Tyr 5 Asn Asn Phe Arg Lys 10 15 Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
Arg Tyr Arg 20 Ile Gin His Gly Ser 25 30 Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
Glu 35 Met Asp Asn Gly Arg ser 40 Ser 45 Ser Ser Thr Tyr Val Thr Asn Ala
Val 50 Gin Arg Asp Ala Pro 55. Pro Glu 60 Tyr Glu Asp Ser Val Gin Ser Leu
65 Gin Leu Leu 70 Glu Asn Val Met Glu 75 80 Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Met Lys
Leu Glu Asn 85 Tyr Ile Gin Asp Asn 90 95 Met Lys Lys Glu Met Ala Glu Ile
Gin Gin Asn 100 Ala Val Gin Asn His 105 110 Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
Thr 115 Ser Leu Leu Ser Gin Thr 120 Ala 125 Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
Val 130 Glu Thr Gin Val Leu 135 Asn Gin 140 Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 Leu Gin His 150 Ser Ile Ser Thr Tyr 155 160 Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
Gin Thr Ser 165 Glu Ile Asn Lys Ile 170 175 His Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
Lys Lys Val 180 Leu Asp Met Glu Asp 185 190 Lys His Ile Ile Glu Met Gin Thr
Ile 195 Lys Glu Glu Lys Asp Glu 200 Leu 205 Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn
Ser 210 Ile Ile Glu Glu Leu 215 Glu Lys 220 Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 Asn Ser Val 230 Leu Gin Lys Gin Gin 235 240 His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn
Asn Leu Leu 245 Thr Met Met Ser Thr 250 255 Ser Asn Ser Ala Lys Asp Ser Thr
Val Ala Arg 260 Glu Glu Gin Ile Ser 265 270 Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Phe
Lys 275 Ala Gly His Thr Lys Asn 280 Gly 285 Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
Ser 290 Pro Glu Glu Ile Lys 295 Ala Tyr 300 Cys Asn Met Asp Ala Gly Gly Gly
305 Gly Trp Thr 310 Ile Ile Gin Arg Arg 315 320 Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin
Lys Gly Trp 325 Lys Glu Tyr Lys Val 330 335 Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly Glu
Tyr Trp Leu 340 Gly Asn Glu Phe Ile 345 350 Ser Gin Ile Thr Asn Gin Gin Arg
Tyr 355 Val Leu Lys Ile His Leu 360 Lys 365 Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
Ser 370 Leu Tyr Asp His Phe 375 Tyr Ile 380 Ser Gly Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385 Ile His Leu 390 Lys Gly Leu Thr Gly 395 400 Thr Ala Ala Lys Ile Ser Ser Ile
Ser Gin Pro 405 Gly Asn Asp Phe Ser 410 415 Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
Cys Ile Cys 420 Lys Cys Ser Leu Met 425 430 Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
Ala 435 Cys Gly Pro Ser Asn Leu 440 Asn 445 , Gly Met Phe Tyr Pro Gin Arg Gin
- 116 — Φ · .· Φ φ Φ • »
450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Ile Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
465 490 495
ΦΦ ΦΦ ·Φ ΦΦ «ΦΦΦ • Φ Φ · · ·· · · φ · · φ Φ ΦΦ φ··· · · φ φ • Φ Φ Φ · β · ΦΦΦ Λ φφφ ΦΦΦ
2. Informace ο sekv. ID. NO.17:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1512 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C . Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární
) Ty 'P molekuly: DNA
ix i Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1..1509
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: TIE ligand-4
B. lokace: 1....1512
D. Jiné informace:
y ' Popis sekvence: SEQ ID NO:17:
ATG CTC TCC CAG CTA GCC ATG CTG CAG GGC AGC CTC CTC CTT GTG GTT 48
Met 1 Leu Ser Gin Leu 5 Ala Met Leu Gin Gly 10 Ser Leu Leu Leu Val 15 Val
GCC ACC ATG TCT GTG GCT CAA CAG ACA AGG CAG GAG GCG GAT AGG GGC 96
Ala Thr Met Ser 20 Val Ala Gin Gin Thr 25 Arg Gin Glu Ala Asp 30 Arg Gly
TGC GAG ACA CTT GTA GTC CAG CAC GGC CAC TGT AGC TAC ACC TTC TTG 144
Cys Glu Thr 35 Leu Val Val Gin His 40 Gly His Cys Ser Tyr 45 Thr Phe Leu
CTG ccc AAG TCT GAG CCC TGC CCT CCG GGG CCT GAG GTC TCC AGG GAC 192
Leu Pro 50 Lys Ser Glu Pro Cys 55 ' Pro Pro Gly Pro Glu 60 Val Ser Arg Asp
TCC AAC ACC CTC CAG AGA GAA TCA CTG GCC AAC CCA CTG CAC CTG GGG 240
Ser 65 Asn Thr Leu Gin Arg 70 Glu Ser Leu Ala Asn 75 Pro Leu His Leu Gly 80
AAG TTG CCC ACC CAG CAG GTG AAA CAG CTG GAG CAG GCA CTG CAG AAC 288
Lys Leu Pro Thr Gin 85 Gin Val Lys Gin Leu 90 Glu Gin Ala Leu Gin 95 Asn
AAC ACG CAG TGG CTG AAG AAG CTA GAG AGG GCC ATC AAG ACG ATC TTG 336
Asn Thr Gin Trp 100 Leu Lys Lys Leu Glu 105 Arg Ala Ile Lys Thr 110 Ile Leu
AGG TCG AAG CTG GAG CAG GTC CAG CAG CAA ATG GCC CAG AAT CAG ACG 384
Arg Ser Lys 115 Leu Glu Gin Val Gin 120 Gin Gin Met Ala Gin 125 Asn Gin Thr
GCC CCC ATG CTA GAG CTG GGC ACC AGC CTC CTG AAC CAG ACC ACT GCC 432
Ala Pro 130 Met Leu Glu Leu Gly 135 Thr Ser Leu Leu Asn 140 Gin Thr Thr Ala
CAG ATC CGC AAG CTG ACC GAC ATG GAG GCT CAG CTC CTG AAC CAG ACA 480
Gin Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gin Leu Leu Asn Gin Thr
• · • ·
145 150 GAG Glu ACC Thr 170 117 155 TTT Phe CTG Leu TCC Ser Φ φ Φ ACC Thr * « < • · . • « AAC Asn 175 1 Φ 9 • Φ 160 AAG Lys
TCA AGA ATG GAT Asp GCC Ala 165 CAG Gin ATG Met CCA Pro
Ser Arg Met
CTG GAG AAC CAG CTG CTG CTA CAG AGG CAG AAG CTC CAG CAG CTT CAG
Leu Glu Asn Gin Leu Leu Leu Gin Arg Gin Lys Leu Gin Gin Leu Gin
180 185 190
GGC CAA AAC AGC GCG CTC GAG AAG CGG TTG CAG GCC CTG GAG ACC AAG
Gly Gin Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gin Ala Leu Glu Thr Lys
195 200 205
CAG CAG GAG GAG CTG GCC AGC ATC CTC AGC AAG AAG GCG AAG CTG CTG
Gin Gin Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu
210 215 220
AAC ACG CTG AGC CGC CAG AGC GCC GCC CTC ACC AAC ATC GAG CGC GGC
Asn Thr Leu Ser Arg Gin Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly
225 230 235 240
CTG CGC GGT GTC AGG CAC AAC TCC AGC CTC CTG CAG GAC CAG CAG CAC
Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gin Asp Gin Gin His
245 250 255
AGC CTG CGC CAG CTG CTG GTG TTG TTG CGG CAC CTG GTG CAA GAA AGG
Ser Leu Arg Gin Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gin Glu Arg
260 265 270
GCT AAC GCC TCG GCC CCG GCC TTC ATA ATG GCA GGT GAG CAG GTG TTC
Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gin Val Phe
275 280 285
CAG GAC TGT GCA GAG ATC CAG CGC TCT GGG GCC AGT GCC AGT GGT GTC
Gin Asp Cys Ala Glu Ile Gin Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val
290 295 300
TAC ACC ATC CAG GTG TCC AAT GCA ACG AAG CCC AGG AAG GTG TTC TGT
Tyr Thr Ile Gin Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys
305 310 315 320
GAC CTG CAG AGC AGT GGA GGC AGG TGG ACC CTC ATC CAG CGC CGT GAG
Asp Leu Gin Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gin Arg Arg Glu
325 330 335
AAT GGC ACC GTG AAT TTT CAG CGG AAC TGG AAG GAT TAC AAA CAG GGC
Asn Gly Thr Val Asn Phe Gin Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gin Gly
340 345 350
TTC GGA GAC CCA GCT GGG GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAA GTG GTG CAC
Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
355 360 365
CAG CTC ACC AGA AGG GCA GCC TAC TCT CTG CGT GTG GAG CTG CAA GAC
Gin Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gin Asp
370 375 380
TGG GAA GGC CAC GAG GCC TAT GCC CAG TAC GAA CAT TTC CAC CTG GGC
Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gin Tyr Glu His Phe His Leu Gly
385 390 395 400
AGT GAG AAC CAG CTA TAC AGG CTT TCT GTG GTC GGG TAC AGC GGC TCA
Ser Glu Asn Gin Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
405 410 415
GCA GGG CGC CAG AGC AGC CTG GTC CTG CAG AAC ACC AGC TTT AGC ACC
• φ φ φ • φφφφ • φφφφ φφφ φ φ·φ Φ·· φ φ φ φφ φβ φφ
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296 • ·
Ala Gly Arg Gin Ser Ser Leu Val Leu 425 Gin
420
CTT GAC TCA GAC AAC GAC CAC TGT CTC TGC
Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys
435 440
TCT GGA GGG TGG TGG TTT GAC GCC TGT GGC
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly
450 455
GTC TAC TAC CAC GCT CCC GAC AAC AAG TAC
Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr
465 470
TGG CAC TAC TTC AAG GGC CCC AGC TAC TCA
Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser
485 490
ATG ATA CGG CCT TTG GAC ATC TAA
Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
500
• · • 9 9 · • # ·· · • 1 9 9 9 · • 9 · • · · · · · 9 · 9 9 ·· • 9 · 9 * · · · · ·
118 « · 9 9 • » • · 9 * 9 9 • · « • 9 ·· 9»
Asn Thr Ser Phe 430 Ser Thr
AAG TGT GCC CAG GTG ATG 1344
Lys Cys Ala 445 Gin Val Met
CTG TCA AAC CTC AAC GGC 1392
Leu Ser 460 Asn Leu Asn Gly
AAG ATG GAC GGC ATC CGC 1440
Lys 475 Met Asp Gly Ile Arg 480
CTG CGT GCC TCT CGC ATG 1488
Leu Arg Ala Ser Arg 495 Met
1512
2. Informace o sekv. ID. NO.18:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 503 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: TIE ligand-4
B. lokace: 1..503 D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:18:
Met Leu Ser Gin Leu Ala Met Leu Gin Gly Ser Leu Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Ala Thr Met Ser Val Ala Gin Gin Thr Arg Gin Glu Ala Asp Arg Gly
20 25 30
Cys Glu Thr Leu Val Val Gin His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser Arg Asp
50 55 60
Ser Asn Thr Leu Gin Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly
65 70 75 80
Lys Leu Pro Thr Gin Gin Val· Lys Gin Leu Glu Gin Ala Leu Gin Asn
85 90 95
Asn Thr Gin Trp Leu LyB Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu
100 105 110
Arg Ser Lys Leu Glu Gin Val Gin Gin Gin Met Ala Gin Asn Gin Thr
115 120 125
Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gin Thr Thr Ala
130 135 140
Gin Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gin Leu Leu Asn Gin Thr
145 150 155 160
Ser Arg Met Asp Ala Gin Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Leu Glu Asn Gin Leu Leu Leu Gin Arg Gin Lys Leu Gin Gin Leu Gin
180 185 190
Λ ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Í9 99 9 · 9 9 9 9 9 9
9 ··« · · 99 9 9 9 9 99 9
Gly Gin Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gin Ala Leu Glu Thr Lys
195 200 205
Gin Gin Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu
210 215 220
Asn Thr Leu Ser Arg Gin Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly
225 230 235 240
Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gin Asp Gin Gin His
245 250 255
Ser Leu Arg Gin Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gin Glu Arg
260 265 270
Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gin Val Phe
275 280 285
Gin Asp Cys Ala Glu Ile Gin Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val.
290 295 300 -
Tyr Thr Ile Gin Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys
305 310 315 320
Asp Leu Gin Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gin Arg Arg Glu
325 330 335
Asn Gly Thr Val Asn Phe Gin Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gin Gly
340 345 350
Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
355 360 365
Gin Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gin Asp
370 375 380
Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gin Tyr Glu His Phe His Leu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Asn Gin Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
405 410 415
Ala Gly Arg Gin Ser Ser Leu Val Leu Gin Asn Thr Ser Phe Ser Thr
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gin Val Met
435 440 445
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450 455 460
Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg
465 470 475 480
Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met
485 490 495
Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
500
2. Informace ο sekv. ID. NO.19:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1497 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1..1494 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 1N1C2F (chiméra 1)
B. lokace: 1....1497 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....60
D. Jiné informace: domělá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-60 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:19:
120
9 9 9 ι · ·· • · · · • 9 · ·
ATG ACA GTT TTC CTT Leu 5 TCC Ser TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG Leu ACT Thr 15 CAC His 48
Met 1 Thr Val Phe Phe Ala Phe Leu 10 Ala Ala Ile
ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA 96
Ile Gly Cys Ser 20 Asn Gin Arg Arg Ser 25 Pro Glu Asn Ser Gly 30 Arg Arg
TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT CTT CCA 144
Tyr Asn Arg 35 Ile Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 Ile Leu Pro
GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA 192
Glu Hle 50 Asp Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr Asn Thr
AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC TCT TCC 240
Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Phe Ser Ser 80
CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT CAG TGG 288
Gin Lys Leu Gin His 85 Leu Glu His Val Met 90 Glu Asn Tyr Thr Gin 95 Trp
CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG GAG ATG 336
Leu Gin Lys Leu 100 Glu Asn Tyr Ile Val 105 Glu Asn Met Lys Ser 110 Glu Met
GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG 384
Ala Gin Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn His Thr Ala 125 Thr Met Leu
GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG 432
Glu Ile 130 Gly Thr Ser Leu Leu 135 Ser Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr Arg Lys
CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG 480
Leu 145 Thr Asp Val Glu Thr 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Ser Arg Leu Glu 160
ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA 528
Ile Gin Leu Leu Glu 165 Asn Ser Leu Ser Thr 170 Tyr Lys Leu Glu Lys 175 Gin
CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT 576
Leu Leu Gin Gin 180 Thr Asn Glu Ile Leu 185 Lys Ile His Glu Lye 190 Asn Ser
TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG 624
Leu Leu Glu 195 His Lys Ile Leu Glu 200 Met Glu Gly Lys His 205 Lys Glu Glu
TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT 672
Leu Asp 210 Thr Leu Lys Glu Glu 215 Lys Glu Asn Leu Gin 220 Gly Leu Val Thr
CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT 720
Arg 225 Gin Thr Tyr Ile Ile 230 Gin Glu Leu Glu Lys 235 Gin Leu Asn Arg Ala 240
ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC 768
Thr Thr Asn Asn Ser 245 Val Leu Gin Lys Gin 250 Gin Leu Glu Leu Met 255 Asp
ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC í ACT AAA . GAA . GGT 1 GTT 1 TTA . CTA 816
• · 9 · ,·» * · 9 9 • 99 9 9· 9· 9 9 »9 9
999 9' 9 9 9 «99 9 «ί 99 9.9 9 9 9999 999 999
- 121 - 9 9 9 9 9 · 9
Thr Val His Asn 260 Leu Val Asn Leu Cys 265 Thr Lys Glu Gly Val 270 Leu Leu
AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCT GAA 664
Lys Gly Gly 275 Lys Arg Glu Glu Glu 280 Lys Pro Phe Arg Asp 285 Cys Ala Glu
GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC 912
Val Phe 290 Lys Ser Gly His Thr 295 Thr Asn Gly Ile Tyr 300 Thr Leu Thr Phe
CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA 960
Pro 305 Asn Ser Thr Glu Glu 310 Ile Lys Ala Tyr Cys 315 Asp Met Glu Ala Gly 320
GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT 1008
Gly Gly Gly Trp Thr 325 Ile Ile Gin Arg Arg Glu 330 Asp Gly Ser Val 335 Asp
TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT TCA 1056
Phe Gin Arg Thr 340 Trp Lys Glu Tyr Lys 345 Val Gly Phe Gly Asn 350 Pro Ser
GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG 1104
Gly Glu Tyr 355 Trp Leu Gly Asn Glu 360 Phe Val Ser Gin Leu 365 Thr Asn Gin
CAA CGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG 1152
Gin Arg 370 Tyr Val Leu Lys Ile 375 His Leu Lys Asp Trp 380 Glu Gly Asn Glu
GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT 1200
Ala 385 Tyr Ser Leu Tyr Glu 390 His Phe Tyr Leu Ser 395 Ser Glu Glu Leu Asn 400
TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC 1248
Tyr Arg Ile His Leu 405 Lys Gly Leu Thr Gly Thr 410 Ala Gly Lys Ile 415 Ser
AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC 1296
Ser Ile Ser Gin 420 Pro Gly Asn Asp Phe 425 Ser Thr Lys Asp Gly 430' Asp Asn
GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG 1344
Asp Lys Cys 435 Ile Cys Lys Cys Ser 440 Gin Het Leu Thr Gly 445 Gly Trp Trp
TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA CAG 1392
Phe Asp 450 Ala Cys Gly Pro Ser 455 Asn Leu Asn Gly Met 460 Tyr Tyr Pro Gin
AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA 1440
Arg 465 Gin Asn Thr Asn Lys 470 Phe Asn Gly Ile Lys 475 Trp Tyr Tyr Trp Lys 480
GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA 1488
Gly Ser Gly Tyr Ser 485 Leu Lys Ala Thr Thr Met 490 Met Ile Arg Pro 495 Ala
GAT TTC TAA Asp Phe
1497
2. Informace o sekv. ID. NO.20: i) Charakteristiky sekvence « ·
- 122 • *
A. Délka: 498' aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 1N1C2F (chiméra 1)
B. lokace: 1..498 D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:20:
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 Seř 10 15
Xle Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
14S 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
260 265 270
Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Glu
275 280 285
Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe
290 295 300
Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp
325 330 335
Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin
355 360 365
Gin Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu
370 375 380
Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn
385 390 395 400
Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Xle Ser
• 9
99 » 9 9 9
- 123 • 9·
9 9
405 410 415
Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn
420 425 430
Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin
450 455 460
Arg Gin Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys
465 470 475 480
Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr' Met Met Ile Arg Pro Ala
485 490 495
Asp Phe
2. Informace o sekv. ID. NO.21:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1491 párů. bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence B . lokace : 1. . 1488 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 2N2C2F (chiméra 2)
B. lokace: 1.....14.91
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace :1....48
D. Jiné informace: domělá vedoucí sekvence nukleotidy 1-48 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:22:
je zakódována
ATG TGG CAG Gin ATT Ile GTT TTC TTT Phe ACT Thr CTG Leu AGC Ser 10 TGT Cys GAT Asp CTT Leu GTC Val TTG Leu 15 GCC Ala 48
Met 1 Trp Val 5 Phe
GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG 96
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA 144
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT 192
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG 240
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
65 70 75 80
CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG 288
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys
85 90 95
CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA 336
124 • · » · β · ·· ·· « · » · β • » · · » •·· 9 «·« ··· • * · «· ·· ··
Leu Glu Aen Tyr 100 Ile Gin Asp Asn Met 105 Lys Lys Glu Met Val 110 Glu Ile
CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG
Gin Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn Gin 120 Thr Ala Val Met Ile 125 Glu Ile Gly
ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT
Thr Asn 130 Leu Leu Asn Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp
GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC
Val 14S Glu Ala Gin Val Leu 150 Ašn Gin Thr Thr Arg 155 Leu Glu Leu Gin Leu’ Í60
TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC
Leu Glu His Ser Leu 165 ser Thr Asn Lys Leu 170 Glu Lys Gin Ile Leu 175 Asp
CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA
Gin Thr Ser Glu 180 Ile Asn Lys Leu Gin 185 Asp Lys Asn Ser Phe 190 Leu Glu
AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA
Lys Lys Val 195 Leu Ala Met Glu Asp 200 Lys His Ile Ile Gin 205 Leu Gin Ser
ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC AAG CAA AAT
Ile Lys 210 Glu Glu Lys Asp Gin 215 Leu Gin Val Leu Val 220 Ser Lys Gin Asn
TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT
Ser 225 Ile Ile Glu Glu Leu 230 Glu Lys Lys Ile Val 235 Thr Ala Thr Val Asn 240
AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT
Asn Ser Val Leu Gin 245 Lye Gin Gin His Asp 250 Leu Met Glu Thr Val 255 Asn
AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT
Asn Leu Leu Thr 260 Met Met Ser Thr Ser 265 Asn Ser Ala Lys Asp 270 Pro Thr
GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT
Val Ala Lys 275 Glu Glu Gin Ile Ser 280 Phe Arg Asp Cys Ala 285 Asp Val Tyr
CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT
Gin Ala 290 Gly Phe Asn Lys Ser 295 Gly Ile Tyr Thr Ile 300 Tyr Ile Asn Asn
ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA
Met 305 Pro Glu Pro Lys Lys 310 Val Phe Cys Asn Met 315 Asp Val Asn Gly Gly 320
GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA
Gly Trp Thr Val Ile 325 Gin His Arg Glu Asp 330 Gly Ser Leu Asp Phe 335 Gin
AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA
Arg Gly Trp Lys 340 Glu Tyr Lys Met Gly 345 Phe Gly Asn Pro Ser 350 Gly Glu
TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT ' GCC ATT ' ACC : AGT CAG AGG CAG
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin , Arg Gin
355 360 365
364
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
I
- 125 - • • • • * » · « · • · • » • « a • · « · • . · • · • • · • · • · • • • « • · ♦ • • ♦ · * « · • · • 9 9 9 » · · · 9 9 9
TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC CGA GCC TAT 1152
Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr
370 375 380
TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG 1200
Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg
385 390 395 400
TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG 1248
Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu
405 410 415
ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC 1296
Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn
420 425 430
TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT 1344
Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GCG GGA CAA 1392
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin
450 455 460
AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC 1440
Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro
465 470 475 480
AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT T 1489
Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
GA 1491
zí * Informace o sekv. ID. NO .22
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární
i i ) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu:interní
ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 2N2C2F ( chiméra 2)
B. lokace : 1..496
D. Jiné informace:
xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22 :
Met Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 S 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Ly6 Lys
20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
65 70 75 80
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
100 105 110
126 • ·· « ·.·« « · ♦· · • · ·» «··» «♦·· « »» · · · · ·*· ♦ ··· ·»· • ·« * * * * .
«· ·· ·· »· »♦ ··
Gin Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met 120 Ile 125 Glu Ile Gly
Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 155 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lye Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin Leu Gin Ser
195 200 205
Ile Lys Glu Clu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn
210 215 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lye Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin. Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245 250 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr
275 280 285
Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn
290 295 300
Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin
325 330 335
Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin
355 360 365
Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr
370 375 380
Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu
405 410 415
Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn
420 425 430
Cys Met Cye Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin
450 455 460
Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro
465 470 475 480
Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
2. Informace o sekv. ID. NO.23:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1500 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1..1497 D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 1N2C2F (chiméra 3)
B. lokace: 1....1500
127 • Φ ·· I φ φ φ · ' φ * φ φφ « φ φ φ φφφ φφφφ · φφ φφ ·· « φφφφ φ φφφφ • •Φ φ φφφ φφφ φ φ φ
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace : 1....60
D. Jiné informace: domélá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-60 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:23:
ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG ACT CAC 48
Met 1 Thr Val Phe Leu 5 Ser Phe Ala Phe Leu 10 Ala Ala lle Leu Thr 15 His
ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA 96
lle Gly Cys Ser 20 Asn Gin Arg Arg Ser 25 Pro Glu Asn Ser Gly 30 Arg Arg
TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT CTT CCA 144
Tyr Asn Arg 35 Xle Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 lle Leu Pro
GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA 192
Glu His 50 Asp Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr Asn Thr
AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT GAC TCG GTG 240
Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Asp. Ser Val 80
CAG AGG CTG CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG 288
Gin Arg Leu Gin Val 85 Leu Glu Asn lle Met 90 Glu Asn Asn Thr Gin 95 Trp
CTA ATG AAG CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG 336
Leu Met Lys Leu 100 Glu Asn Tyr lle Gin 105 Asp Asn Met Lys Lys 110 Glu Met
GTA GAG ATA CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA 384
Val Glu lle 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn Gin Thr Ala 125 Val Met lle
GAA ATA GGG ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG 432
Glu lle 130 Gly Thr Asn Leu Leu 135 Asn Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr Arg Lys
TTA ACT GAT GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA 480
Leu 145 Thr Asp Val Glu Ala 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Thr Arg Leu Glu 160
CTT CAG CTC TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG 528
Leu Gin Leu Leu Glu 165 His Ser Leu Ser Thr 170 Asn Lys Leu Glu Lys 175 Gin
ATT TTG GAC CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT 576
lle Leu Asp Gin 180 Thr Ser Glu lle Asn 185 Lys Leu Gin Asp Lys 190 Asn Ser
TTC CTA GAA AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA 624
Phe Leu Glu 195 Lys Lys Val Leu Ala 200 Met Glu Asp Lys His 205 lle lle Gin
CTA CAG TCA ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC 672
Leu Gin 210 Ser lle Lys Glu Glu 215 Lys Asp Gin Leu Gin 220 Val Leu Val Ser
AAG CAA AAT TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC 720
- 128 - • • • • t · • · • · • · • • • · • 9 9 9 9 • · · * • · * · · • · 9 • · • 9 9 99 9 9
Lys Gin 225 Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys 230 235 Ile Val Thr Ala 240
ACG GTG AAT AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG 768
Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His 245 250 Asp Leu Met 255 Glu
ACA GTT AAT AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG 816
Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser 260 265 Asn Ser 270 Ala Lys
GAC CCC ACT GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT 864
Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe 275 280 Arg 285 Asp Cys Ala
GAA GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA 912
Glu Val 290 Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile 295 300 Tyr Thr Leu Thr
TTC CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT 960
Phe Pro 305 Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys 310 315 Asp Met Glu Ala 320
GGA GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT 1008
Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu 325 330 * Asp Gly Ser 335 Val
GAT TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT 1056
Asp Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly 340 345 Phe Gly 350 Asn Pro
TCA GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT 1104
Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser 355 360 Gin 365 Leu Thr Asn
CAG CAA CGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT 1152
Gin Gin 370 Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp 375 380 Trp Glu Gly Asn
GAG GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC 1200
Glu Ala 385 Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser 390 395 Ser Glu Glu Leu 400
AAT TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA 1248
Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr 405 410 Ala Gly Lys 415 Ile
AGC AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC 1296
Ser Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr 420 425 Lys Asp 430 Gly Asp
AAC GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG 1344
Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu 435 440 Thr 445 Gly Gly Trp
TGG TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA 1392
Trp Phe 450 Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly 455 460 Met Tyr Tyr Pro
CAG AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC : TAC 1 TGG 1440
Gin Arg 465 Gin Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys 470 475 Trp i Tyr Tyr Trp 480
AAA GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG 1 ATC CGA CCA 1488
Lya Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met 485 490 . Met . Ile Arg Pro 495
• ·
129
0 0 0 '0 • 0 0» · 0 0 0 · 0 · • 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
000 000 0 0
0 0 0
GCA GAT TTC TAA Ala Asp Phe
1500
2. Informace o sekv. ID. NO.24:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 499 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 1N2C2F (chiméra 3)
xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24 :
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Asp Ser Val
65 70 75 80
Gin Arg Leu Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Met Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met
100 105 110
Val Glu Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met Ile
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu
145 150 155 160
Leu Gin Leu Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Ile Leu Asp Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser
180 185 190
Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin
195 200 205
Leu Gin Ser Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser
210 215 220
Lys Gin Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala
225 230 235 240
Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu
245 250 255
Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys
260 265 270
Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala
275 280 285
Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr
290 295 300
Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val
325 330 335
Asp Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro
340 345 350
Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn
355 360 365
130 • fc * • fcfc • · » • · · » fcfc fc fc fc · • fcfc · · fc* fcfc fcfc ·· fc « • · • fc · • fcfc fcfc ·
Gin Gin Arg Tyr Val Leu Lys 375 Ile His Leu Lys Asp 380 Trp Glu Gly Asn
370
Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu Hle Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu
385 390 395 400
Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile
405 410 415
Ser Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp
420 425 430
Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp
435 440 445
Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro
450 455 460
Gin Arg Gin Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp
465 470 475 480
Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro
485 490 495
Ala Asp Phe
2. Informace o sekv. ID. NO.25:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1488 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA i χ', Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace : 1..1485
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 2N1C1F (chiméra 4)
E. lokace: 1.,..1488
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
E. lokace :1....48
D. Jiné informace: domělá vedoucí sekvence nukleotidy 1-48 xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO:25:
je zakódována
ATG Met 1 TGG Trp CAG Gin ATT GTT TTC Phe TTT Phe ACT Thr CTG Leu AGC Ser 10 TGT Cys GAT Asp CTT Leu GTC Val TTG Leu 15 GCC Ala 48
Ile Val 5
GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG 96
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA 144
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT 192
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT TTC TCT TCC CAG AAA CTT 240
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu
65 70 75 80
- 131 - • 9 • 9 • · • · 9 9 • 9 9 * 99 9 9 9 9 9 4 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 • 9 9« 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9
CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT CAG TGG CTG CAA AAA 288
Gin His Leu Glu His 85 Val Met Glu Asn Tyr 90 Thr Gin Trp Leu Gin 95 Lys
CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG GAG ATG GCC CAG ATA 336
Leu Glu Asn Tyr 100 Ile Val Glu Asn Met 105 Lys Ser Glu Met Ala 110 Gin Ile
CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG GAG ATA GGA 384
Gin Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn His 120 Thr Ala Thr Met Leu 125 Glu Ile Gly
ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG CTG ACA GAT 432
Thr Ser 130 Leu Leu Ser Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp
GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG ATA CAG CTG 480
Val 145 Glu Thr Gin val Leu 150 Asn Gin Thr ser Arg 155 Leu Glu Ile Gin Leu 160
CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA CTT CTT CAA 528
Leu Glu Asn Ser Leu 165 Ser Thr Tyr Lys Leu 170 Glu Lys Gin Leu Leu 175 Gin
CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT TTA TTA GAA 576
Gin Thr Asn Glu 180 Ile Leu Lys Ile His 185 Glu Lys Asn Ser Leu 190 Leu Glu
CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG TTG GAC ACC 624
His Lys Ile 195 Leu Glu Met Glu Gly 200 Lys His Lys Glu Glu 205 Leu Asp Thr
TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT CGT CAA ACA 672
Leu Lye 210 Glu Glu Lys Glu Asn 215 Leu Gin Gly Leu Val 220 Thr Arg Gin Thr
TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT ACC ACC AAC 720
Tyr 225 Ile Ile Gin Glu Leu 230 Glu Lys Gin Leu Asn 235 Arg Ala Thr Thr Asn 240
AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC ACA GTC CAC 768
Asn Ser Val Leu Gin 245 Lys Gin Gin Leu Glu 250 Leu Met Asp Thr Val 255 His
AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTA CTA AAG GGA GGA 816
Asn Leu Val Asn 260 Leu Cys Thr Lys Glu 265 Gly Val Leu Leu Lys 270 Gly Gly
AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT CAA 864
Lys Arg Glu 275 Glu Glu Lys Pro Phe 280 Arg Asp Cys Ala Asp 285 Val Tyr Gin
GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT ATG 912
Ala Gly 290 Phe Asn Lys Ser Gly 295 Ile Tyr Thr Ile Tyr 300 Ile Asn Asn Met
CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA GGT 960
Pro 305 Glu Pro Lys Lys Val 310 Phe Cys Asn Met Asp 315 Val Asn Gly Gly Gly 320
TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA AGA 1008
Trp Thr Val Ile Gin 325 His Arg Glu Asp Gly 330 Ser Leu Asp Phe Gin 335 Arg
GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA . TAT 1056
Gly Trp Lys Glu 340 Tyr Lys Met Gly Phe 345 Gly Asn Pro Ser Gly 350 Glu Tyr
132 ·« ·
TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT CAG AGG CAG TAC
Trp Leu Gly 355 Asn Glu Phe Ile Phe 360 Ala Ile Thr Ser Gin 365 Arg Gin Tyr
ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC CGA GCC TAT TCA
Met Leu 370 Arg Ile Glu Leu Met 375 Asp Trp Glu Gly Asn 380 Arg Ala Tyr Ser
CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG TTG
Gin 385 Tyr Asp Arg Phe His 390 Ile Gly Asn Glu Lys 395 Gin Asn Tyr Arg Leu 400
TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG ATC
Tyr Leu Lys Gly His 405 Thr Gly Thr Ala Gly 410 Lys Gin Ser Ser Leu 415 ne
TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC TGT
Leu His Gly Ala 420 Asp Phe Ser Thr Lys 425 Asp Ala Asp Asn Asp 430 Asn Cys
ATG TGC -AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT GCT
Met Cys Lys 435 Cys Ala Leu Met Leu 440 Thr Gly Gly Trp Trp 445 Phe Asp Ala
TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GCG GGA CAA AAC
Cys Gly 450 Pro Ser Asn Leu Asn 455 Gly Met Phe Tyr Thr 460 Ala Gly Gin Asn
CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC AGT
His 465 Gly Lys Leu Asn Gly 470 Ile Lys Trp His Tyr 475 Phe Lys Gly Pro Ser 480
TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT TGA
Tyr Ser Leu Arg Ser 485 Thr Thr Met Met Ile 490 Arg Pro Leu Asp Phe 495
·· ·· • · ♦ · • · · · • »*» »·· * · ·· ··
1104
1152
1200
1248
1296 '1344
1392
1440
1488
2. Informace o sekv. ID. NO.26:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 495 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein v) Typ fragmentu:interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 2N1C1F (chiméra 4)
B. lokace: 3.....49 5 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:26:
Het Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu
65 70 75 80
Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys
··· 44·
- 133 - • 4 • • • • 44 ·· • · · • ·· ♦ · · • · · • · • 4 • > 4 4 • • • 4 4 4 4 4 4 4 • < 4 4 4 4 • • 4 · • 4
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile
100 105 110
Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu
145 150 155 160
Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu. Gin
165 170 175
Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu
180 185 190
His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr
195 200 205
Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr
210 215 220
Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn
225 230 235 240
Aan Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His
245 250 255
Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly
260 265 270
LyB Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin
275 280 285
Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met
290 295 300
Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly
305 310 315 320
Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg
325 330 335
Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr
340 345 350
Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr
355 360 365
Mét Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser
370 375 380
Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu
385 390 395 400
Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile
405 410 415
Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys
420 425 430
Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
435 440 445
Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn
450 455 460
His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser
465 470 475 480
Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
133
2. Informace o sekv. ID. NO.27:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 47 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTL4atg
B. lokace: 1..47
D. Jiné informace: PCR primer
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....20
D. Jiné informace: koncová sekvence přidaná k PCR primerů k usnadnění klonování zesílených PCR fragmentů xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:27:
134 ·· ♦· ♦·] • · · · · 1 • 9 ·· · ♦ • 9 9 · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··
9 9 9 «
9 9 9 9 •9« · ··« ··· · · «· ·♦
GCATGCTATC TCGAGCCACC ATGCTCTCCC AGCTAGCCAT GCTGCAG 47
2. Informace o sekv. ID. NO.28:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 55 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTL4not
B. lokace: 1..55
D. Jiné informace: PCR primer
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....28
D. Jiné informace: koncová sekvence přidaná k PCR primerů k usnadnění klonování zesílených PCR fragmentů xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:28:
GTGTCGACGC GGCCGCTCTA GATCAGACTT AGATGTCCAA AGGCCGTATC ATCAT 5 5
PETR KALENSKY /MTORNEY AT LAW s»ťioi gčwÁ ADVOKÁTNÍ KANvELÁŘ VŠELEGKA ZLLaKÝ SVOPČÍK KALENSKY
A PÁRTNEŘ!
120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika

Claims (50)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní
    TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandu, přičemž první a druhý TIE-2 ligand je volen ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE-2 ligand 3 a TIE-2 ligand 4.
  2. 2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 kódující chimerní TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl TIE-2 ligandu 1 a podíl druhého TIE-2 ligandu 2.
  3. 3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 2 kódující chimerní TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2.
  4. 4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje smyčkově stočenou (coiled coil) doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
  5. 5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, která je modifikována ke kódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku zakódovávaného nukleotidy 784-787 podle obr. 27.
  6. 6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která je modifikována ke kódování serinového zbytku místo cysteinového zbytku.
    - 136
    99 9« 99 ·· »999 9 9 9 9 • · 99 · · · · • 9 9 9 9 9 9 999
    9 9 9 9 9 9 9
    99 9· 99 «9
    9»
    9 9 9 9
    9 999 999
    9 9 (·» 99
  7. 7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5 nebo 6, která je dále modifikována ke kódování odlišné aminokyseliny místo argininového zbytku zakódovávaného nukleotidy 199-201 podle obr. 27.
  8. 8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, která je modifikována ke kódování serinového zbytku místo argininového zbytku,
  9. 9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 Iigand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 Iigand 1, který je modifikován k zakódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku na aminokyselině v poloze 245.
  10. 10. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 9, která je modifikována ke kódováni serinového zbytku místo cysteinového zbytku.
  11. 11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3 se sekvencí podle obr. 27.
  12. 12. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 4 se sekvencí podle obr. 25.
  13. 13. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 Iigand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 Iigand 1 nebo TIE-2 Iigand 2, přičemž Část nukleotidové sekvence, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1 nebo TIE-2 ligandu 2 je vypuštěna.
  14. 14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1 nebo TIE-2 ligandu 2 je vypuště• 9
    137
    9 9
    9 9
    999 9 9 na a část kódující fibrinogenovou doménu je fúzována do struktury konstantní oblasti nukleotidové sekvence kódující lidský imunoglobulin gama-1 (IgGl Fc).
  15. 15. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje fibrinogenovou doménu TIE-2 ligandů 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje fibrinogenovou doménu TIE-2 ligandů 2.
  16. 16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 15, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandů 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandů 2.
  17. 17. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 se sekvencí podle obr. 24.
  18. 18. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 16 se sekvencí podle obr. 26.
  19. 19. Chimérní nebo modifikovaný TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1 až 18.
  20. 20. Chimérní TIE-2 ligand podle nároku 19 se sekvencí podle obr. 24, 25, 26 a 27.
  21. 21. Chimérní TIE-2 ligand podle nároku 19 se sekvencí podle obr. 27 avšak modifikovaný tak, že má odlišnou aminokyselinu místo cysteinového zbytku zakódovaného nukleotidy 784-787
  22. 22. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1 až 18.
  23. 23.
    Vektor podle nároku 22, přičemž molekula nukleové kyše- líny je operativně vázána na expresní řídící sekvenci schopnou řídit expresi v hostující buňce.
  24. 24. Vektor podle nároku 22 nebo 23, kterým je plasmid.
  25. 25. Hostitelský vektorový systém pro produkci chimerního nebo modifikovaného ligandu podle nároku 19, 20 nebo 21, který obsahuje vektor podle nároku 22, 23 nebo 24.
  26. 26. Hostitelský vektorový systém podle nároku 25, přičemž hostitelskou buňkou je bakteriální, kvasnicová nebo savčí buňka
  27. 27., Způsob produkce ligandu podle nároku 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že se nechají růst buňky hostitelského vektorového systému podle nároku 25 nebo 26 za podmínek umožňbujících produkci ligandu a izolaci takto produkovaného ligandu.
  28. 28. Protilátka, která specificky váže ligand podle nároku 19, 20 nebo 21.
  29. 29. Protilátka podle nároku 28, kterou je monoklonální protilátka.
  30. 30. Receptorová látka, která specificky váže ligand podle nároku 19, 20 nebo 21.
  31. 31. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující receptorovou látku podle nároku 30.
  32. 32. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 31.
  33. 33. Vektor podle nároku 32, kterým je plasmid.
  34. 34. Konjugát obsahující ligand podle nároku 19, 20 nebo 21 • · • *
    - 1Í39Í-·*· . ϊ a cytotoxické činidlo, na něj konjugované.
  35. 35. Konjugát podle nároku 34, ppřičemž cytotoxickým činidlem je radioisotop nebo toxin.
  36. 36. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje chimérní nebo modifikovaný ligand podle nároku 19, 20 nebo 21 a farmaceuticky vhodný nosič.
  37. 37. Farmaceutický prostředek, vyznačující se ti m, že obsahuje protilátku podle nároku 28 nebo 29 a farmaceuticky vhodný nosič.
  38. 38. Farmaceutický prostředek, vyznačující se ti m, že obsahuje receptorovou látku podle nároku 30 a farmaceuticky vhodný nosič.
  39. 39. Farmaceutický prostředek, vyznačující se ti m, že obsahuje konjugát podle nároku 34 nebo 35 a farmaceuticky vhodný nosič.
  40. 40. Ligand podle nároku 19, 20 nebo 21 protilátky podle nároku 28, 29, receptorové látky podle nároku 30 nebo konjugátu podle nároku 34 nebo 35 pro ošetřování lidí nebo zvířat nebo pro diagnostické účely.
  41. 41. Ligand přepravitelný způsobem podle nároku 27.
  42. 42. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, 9, 13 nebo 15 v podstatě shora popsaná.
  43. 43. Chimérní nebo modifikovaný TIE-2 ligand podle nároku 19 v podstatě shora popsaný.
  44. 44. Vektor podle nároku 22 nebo 32 v podstatě shora popsaný.
  45. 45. Hostitelský vektorový systém podle nároku 25 v podsta• · • ·
    - lio tě shora popsaný.
  46. 46. Způsob podle nároku 27 v podstatě shora popsaný.
  47. 47. Protilátka podle nároku 28 v podstatě shora popsaná.
  48. 48. Receptorové látka podle nároku 30 v podstatě shora popsaná.
  49. 49. Farmaceutický prostředek podle nároku 36, 37, 38 nebo 39 v podstatě shora popsaný.
  50. 50. Ligand, protilátka, receptporová látka nebo konjugát podle nároku 40 v podstatě shora popsaný.
CZ1999310A 1996-08-02 1997-08-01 Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand CZ295371B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2299996P 1996-08-02 1996-08-02
US08/740,223 US6265564B1 (en) 1996-08-02 1996-10-25 Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ31099A3 true CZ31099A3 (cs) 2000-03-15
CZ295371B6 CZ295371B6 (cs) 2005-07-13

Family

ID=26696604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1999310A CZ295371B6 (cs) 1996-08-02 1997-08-01 Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand

Country Status (20)

Country Link
US (5) US6265564B1 (cs)
EP (1) EP0915974B1 (cs)
JP (1) JP3977434B2 (cs)
KR (1) KR100481560B1 (cs)
CN (1) CN1171997C (cs)
AT (1) ATE262037T1 (cs)
AU (1) AU724032C (cs)
CA (1) CA2262409C (cs)
CZ (1) CZ295371B6 (cs)
DE (1) DE69728149T2 (cs)
DK (1) DK0915974T3 (cs)
ES (1) ES2216163T3 (cs)
HU (1) HU227995B1 (cs)
IL (1) IL128311A (cs)
NO (1) NO990470L (cs)
NZ (2) NZ333994A (cs)
PL (1) PL189639B1 (cs)
PT (1) PT915974E (cs)
RU (1) RU2233880C2 (cs)
WO (1) WO1998005779A1 (cs)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265564B1 (en) 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule
US6030831A (en) * 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
US6348350B1 (en) 1997-09-19 2002-02-19 Genentech, Inc. Ligand homologues
AU4643699A (en) * 1998-06-24 2000-01-10 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
AU776393B2 (en) * 1998-12-23 2004-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing the biological activity of ligands
US6455035B1 (en) 1999-03-26 2002-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of use thereof
JP2003529345A (ja) * 2000-01-20 2003-10-07 ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド 新規走触性ペプチド
AU8022901A (en) 2000-08-21 2002-03-04 Pacific Corp Novel thiourea derivatives and the pharmaceutical compositions containing the same
US6753321B2 (en) 2000-09-15 2004-06-22 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7052695B2 (en) 2001-10-25 2006-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of treating hypertension
AU2002359464A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-17 Genvec, Inc. Angiopioetin related factors
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
WO2004076650A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Angiopoietin and fragments, mutants, and analogs thereof and uses of the same
US8232247B2 (en) * 2003-05-29 2012-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancer, arthritis and/or diabetes with angiopoietins
US7871610B2 (en) * 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
US7348001B2 (en) * 2003-08-12 2008-03-25 Dyax Corp. Tie1-binding ligands
US7485297B2 (en) * 2003-08-12 2009-02-03 Dyax Corp. Method of inhibition of vascular development using an antibody
CN1323723C (zh) * 2003-12-26 2007-07-04 上海新世界基因技术开发有限公司 Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
KR101017301B1 (ko) 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
US20080213253A1 (en) * 2007-01-12 2008-09-04 Dyax Corp. Combination therapy for the treatment of cancer
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2671891A3 (en) 2008-06-27 2014-03-05 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
US9434925B2 (en) * 2009-04-13 2016-09-06 Apceth Gmbh & Co. Kg Genetically modified mesenchymal stem cell that express an exogenous cytotoxic protein
ES2704038T3 (es) 2011-05-24 2019-03-13 Zyngenia Inc Complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos
KR101967345B1 (ko) * 2012-10-18 2019-04-09 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도
CN105451767B (zh) 2013-03-15 2019-10-18 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
RU2538701C1 (ru) * 2013-07-11 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) Способ извлечения куриного эмбриона из яйца для дальнейшего получения клеточных трансплантатов из фетальных тканей
US10670611B2 (en) 2014-09-26 2020-06-02 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
WO2017079556A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of angiopoietins in promoting blood coagulation and in the treatment of blood coagulation disorders

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5070192A (en) * 1988-03-23 1991-12-03 The Johns Hopkins University Cloned human topoisomerase i: cdna expression, and use for autoantibody detection
US5814464A (en) * 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
DE69633121T2 (de) * 1995-04-06 2005-07-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 liganden, herstellungsverfahren und verwendung
US6265564B1 (en) * 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule

Also Published As

Publication number Publication date
EP0915974B1 (en) 2004-03-17
EP0915974A1 (en) 1999-05-19
CZ295371B6 (cs) 2005-07-13
US6441137B1 (en) 2002-08-27
DK0915974T3 (da) 2004-07-12
JP3977434B2 (ja) 2007-09-19
ATE262037T1 (de) 2004-04-15
PL189639B1 (pl) 2005-09-30
CA2262409C (en) 2007-11-20
CN1171997C (zh) 2004-10-20
HUP0400256A3 (en) 2006-01-30
NO990470D0 (no) 1999-02-01
IL128311A0 (en) 2000-01-31
HUP0400256A2 (hu) 2004-04-28
NO990470L (no) 1999-04-06
ES2216163T3 (es) 2004-10-16
CN1232501A (zh) 1999-10-20
US20050106099A1 (en) 2005-05-19
KR100481560B1 (ko) 2005-04-08
HU227995B1 (en) 2012-08-28
DE69728149T2 (de) 2004-10-28
CA2262409A1 (en) 1998-02-12
US6825008B2 (en) 2004-11-30
NZ505684A (en) 2001-12-21
RU2233880C2 (ru) 2004-08-10
AU3968797A (en) 1998-02-25
NZ333994A (en) 2000-09-29
DE69728149D1 (de) 2004-04-22
HK1017379A1 (en) 1999-11-19
WO1998005779A1 (en) 1998-02-12
AU724032B2 (en) 2000-09-07
US6265564B1 (en) 2001-07-24
PT915974E (pt) 2004-05-31
US20030092891A1 (en) 2003-05-15
KR20000029778A (ko) 2000-05-25
IL128311A (en) 2007-08-19
JP2000516807A (ja) 2000-12-19
US7045302B2 (en) 2006-05-16
AU724032C (en) 2001-08-16
US20050186665A1 (en) 2005-08-25
PL331405A1 (en) 1999-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ31099A3 (cs) Modifikovaný TIE-2-receptorový ligand
US6627415B1 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US5814464A (en) Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5851797A (en) Tie ligand-3, methods of making and uses thereof
JP2000513932A (ja) Ｔｉｅ―２レセプターリガンド（ｔｉｅリガンド―３；ｔｉｅリガンド―４）およびそれらの使用
US7063840B2 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US20030166858A1 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US7063965B2 (en) Nucleic acid encoding TIE-2 ligand
CA2595038C (en) Modified tie-2 receptor ligands
AU755337B2 (en) New uses of tie-2 ligands
HK1017379B (en) Modified tie-2-receptor ligands
HK1008230B (en) Tie-2 ligands, methods of making and uses thereof
AU6134100A (en) Novel modified tie-2 receptor ligands

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170801