PL189639B1

PL189639B1 - Wyodrębniona cząsteczka kwasu nukleinowego, chimeryczny ligand TIE-2, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania liganda, przeciwciało, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i chimeryczny ligand

Info

Publication number: PL189639B1
Application number: PL97331405A
Authority: PL
Inventors: Samuel Davis; George D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2005-09-30
Also published as: KR100481560B1; EP0915974A1; KR20000029778A; PL331405A1; CN1232501A; HUP0400256A2; US20050186665A1; JP2000516807A; AU3968797A; CA2262409C; US20050106099A1; US6825008B2; JP3977434B2; CZ31099A3; DK0915974T3; PT915974E; US7045302B2; US6265564B1; NO990470L; US20030092891A1

Abstract

1. Wyodrebniona czasteczka kwasu nukleinowego, kodujaca chimeryczny ligand TIE-2 wiazacy i/lub aktywujacy receptor TIE-2, znamienna tym, ze zawiera N-koncowa domene, domene sklebionej spirali i domene fibrynogeno-podobna, przy czym, co najmniej dwie wspomniane domeny pochodza od róznych ligandów TIE-2 wybranych sposród li- ganda 1 TIE-2, liganda 2 TIE-2, liganda 3 TIE i liganda 4 TIE. 2. Czasteczka wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze domena N-koncowa, domena sklebionej spirali i domena fibrynogeno-podobna pochodza z liganda 1 TIE-2 lub liganda 2 TIE-2. 7. Czasteczka wedlug zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, ze jest dodatkowo zmodyfi- kowana, tak, ze koduje inny aminokwas zamiast reszty argininowej kodowanej przez nu kleotydy 199-201 jak przedstawiono w fig. 27. 22. Sposób wytwarzania chimerycznego liganda jaki zdefiniowano w zastrz. 15, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle komórek ukladu gospodarz-wektor jak zdefi- niowano w zastrz. 20, w warunkach, pozwalajacych na wytwarzanie liganda i odzyskiwa- nie tak wytworzonego liganda. 23. Przeciwcialo, znamienne tym, ze specyficznie wiaze sie z chimerycznym ligan dem TIE-2 jak zdefiniowano w zastrz. 15, ale które nie wiaze sie z natywnym ligandem TIE-2. 27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera chimeryczny lub mo- dyfikowany ligand jak zdefiniowano w zastrz. 15 i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku wyodrębniona cząsteczka kwasu nukleinowego, chimeryczny ligand TIE-2, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania liganda, przeciwciało, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i chimeryczny ligand. Niniejszy wynalazek mieści się w dziedzinie inżynierii genetycznej, a szczególniej genów dla receptorowych kinaz tyrozynowych i ich pokrewnych ligandów·’, ich wprowadzania do rekombinowanych wektorów DNA, oraz wytwarzania kodowanych białek w odbiorczych szczepach drobnoustrojów i odbiorczych komórkach eukariotycznych. Konkretniej, niniejszy wynalazek odnosi się do nowych ligandów znanych jako ligand-3 TIE i ligand-4 TIE, które wiążą się z receptorem TIE-2, jak również do sposobów wytwarzania i zastosowania nowych ligandów^. Wynalazek dotyczy dalej sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących modyfikowany ligand TIE-2, sposób tworzenia kwasów nukleinowych i produktów genowych. Nowe ligandy TIE, jak również kodujące je kwasy nukleinowe, mogą być użyteczne w diagnozowaniu i leczeniu pewnych chorób związanych z komórkami śródbłonka i towarzyszącymi receptorami TIE, tak jakich jak choroby nowotworowe, łącznie z angiogenezą guza, leczenie zranień, choroby zatorowe, miażdżyca tętnic i choroby zapalne. Oprócz tego, ligandy można stosować do pobudzania proliferacji i/lub różnicowania się krwiotwórczych komórek macierzystych.

Ogólniej, opisane w niniejszym modyfikowane ligandy TIE-2 aktywujące receptor, można stosować do pobudzania wzrostu, podtrzymywania życia, migracji i/lub różnicowania i/lub stabilizacji albo destabilizacji komórek, wykazujących ekspresję receptora TLE. Biologicznie aktywny ligand TIE-2 można stosować do utrzymywania w kulturze in vitro komórek, wykazujących ekspresję receptora TIE. Komórki i tkanki, wskazujące ekspresję receptora TIE obejmują np. komórki śródbłonka sercowego i naczyniowego, komórki nabłonkowe soczewki i nasierdzia oraz wczesne komórki krwiotwórcze. Alternatywnie, taki ludzki ligand można stosować do utrzymywania komórek zbudowanych w celu ekspresji receptora TIE. Dalej, modyfikowany ligand TIE-2 i jego pokrewny receptor można stosować w układach testowych do identyfikacji dodatkowych agonistów lub antagonistów receptora.

Bahawior komórkowy odpowiedzialny za rozwój, utrzymanie i naprawę zróżnicowanych komórek i tkanek regulują w większości sygnały wewnątrzkomórkowe przenoszone przez czynniki wzrostu i podobne ligandy oraz ich receptory. Receptory leżą na powierzchniach komórkowych odpowiadających komórek i wiążą peptydy lub polipeptydy znane jako czynniki wzrostu, jak również inne ligandy podobne do hormonów. W wyniku tej interakcji mają miejsce szybkie biochemiczne zmiany w odpowiadających komórkach, a także krótko

189 639 i długoterminowe regulacje ekspresji genów komórkowych. Kilka receptorów związanych z różnymi powierzchniami komórkowymi może wiązać specyficzne czynniki wzrostu.

Fosforylacja reszt tyrozynowych w białkach przez kinazy tyrozynowe, jest jednym z kluczowych sposobów przenoszenia sygnałów poprzez błony plazmatyczne. Kilka aktualnie znanych genów białek kinaz tyrozynowych koduje receptory transbłonowe dla polipeptydowych czynników wzrostu i hormonów, takich jak czynnik wzrostu naskórka (EGF), insulina, insulinopodobny czynnik wzrostu-I (IGF-I), płytkowe czynniki wzrostu (PDGF-A i -B) oraz czynniki wzrostu fibroblastów (FGF). (Heldin i in., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich i in., Cell, 61: 243-54 (1990)). W każdym wypadku, te czynniki wzrostu działają przez wiązanie się z zewnątrzkomórkową częścią pokrewnych receptorów, co prowadzi do aktywacji wewnętrznych kinaz tyrozynowych obecnych na cytoplazmatycznej części receptora. Receptory czynników wzrostu komórek śródbłonkowych są szczególnie interesujące, ponieważ prawdopodobnie są związane z czynnikami wzrostu w kilku ważnych procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak powstawanie naczyń, angiogeneza, miażdżyca tętnic i choroby zapalne. (Folkman i in., Science, 235: 442-447 (1987)). Także, receptory kilku krwiotwórczych czynników wzrostu są kinazami tyrozynowymi; obejmują one c-fms, który jest receptorem czynnika 1 stymulacji kolonii, Sherr i in., Cell, 41: 665-676 (1985) oraz c-kit, prymitywny receptor krwiotwórczego czynnika wzrostu opisywany przez Huanga i in., Cell, 63:225-33 (1990).

Receptory kinaz tyrozynowych podzielono na podrodziny ewolucyjne, na podstawie charakterystycznej struktury ektodomen. (Ullrich i in., Cell, 61: 243-54 (1990)). Takie podrodziny obejmują kinazę receptoropodobną EGF (podklasa I) oraz kinazę receptoropodobną insuliny (podklasa II), z których każda zawiera w swych domenach zewnątrzkomórkowych powtarzające się homologiczne sekwencje bogate w cysteinę. Pojedynczy region bogaty w cysteinę znajduje się także w domenach zewnątrzkomórkowych kinaz podobnych do eph. Hirai i in., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg i in., Mol. Celi. Biol, 10: 6316-24 (1990); Lhotak i in., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). Receptory PDGF, a także kinazy tyrozynowe receptorów c-fms i c-kit można zgrupować w podklasę III; chociaż receptory FGF tworzą podklasę IV. Typowe dla członków obu tych podklas są zewnątrzkomórkowe pofałdowane jednostki stabilizowane przez wewnątrzłańcuchowe wiązania disiarczkowe. Te tak zwane fałdy immunoglobulinopodobne (Ig) znajdują się w białkach nadrodziny immunoglobulin, która zawiera wiele różnych innych receptorów powierzchniowo-komórkowych, posiadających ligandy albo związane z komórką albo rozpuszczalne. Williams i in., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988).

Receptorowe kinazy tyrozynowe różnią się pod względem swej specyficzności i powinowactwa. Ogólnie, receptorowe kinazy tyrozynowe są glikoproteinami, składającymi się z (1) domeny zewnątrzkomórkowej zdolnej do wiązania się ze specyficznym czynnikiem(ami) wzrostu; (2) domeny transbłonowej, która zwykle jest częścią o kształcie alfa-helisy białka; (3) domeny okołobłonowej, gdzie receptor może podlegać regulacji np. przez fosforylację białka; (4) domeny kinazy tyrozynowej, która jest enzymatycznym składnikiem receptora; oraz (5) ogonka karboksyterminalnego, który w wielu receptorach angażuje się w rozpoznawanie i wiązanie substratów dla kinazy tyrozynowej.

Takie procesy jak alternatywny splicing egzonowy i alternatywny wybór promotora genu lub miejsc poliadenylacji, opisywano jako umożliwiający wytwarzanie kilku różnych polipeptydów z tego samego genu. Te polipeptydy mogą lub nie, zawierać różne domeny wymienione powyżej. W konsekwencji, niektóre domeny zewnątrzkomórkowe mogą ulegać ekspresji jako oddzielne, wydzielone białka, a pewne postacie receptorów mogą wykazywać brak domen kinaz tyrozynowych i zawierać tylko domenę zewnątrzkomórkow-ą wprowadzoną do błony plazmatycznej poprzez domenę transbłonową, plus krótki ogonek karboksyterminalny.

Gen, kodujący transbłonową kinazę tyrozynową komórki śródbłonka, początkowo zidentyfikowano przez RT-PCR jako nieznany fragment cDNA homologiczny z kinazą tyrozynową z ludzkich komórek białaczki, opisany przez Partanena i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 8913-8917 (1990). Gen ten i jego kodowane białko nazwano „TIE”, co jest skrótem

189 639 od „kinaza tyrozynowa z domenami homologicznymi do Ig i EGF”. Partanen i in., Mol. Cell.

Biol. 12: 1698-1707(1992).

Doniesiono, że mRNA tie jest obecny we wszystkich tkankach płodu ludzkiego i zarodkach mysich. Po zbadaniu, zlokalizowano informacyjny tie w śródbłonkowych komórkach sercowych i naczyniowych. Konkretnie, mRNA tie zlokalizowano w śródbłonku naczyń krwionośnych i wsierdzia zarodków mysich w wieku 9,5 do 18,5 dni. Wykazano, ze wzmocniona ekspresja tie zachodziła podczas nowounaczynienia związanego z rozwojem pęcherzyków jajnikowych i tkanki ziarninowej przy gojeniu zranień. Korhonen i in., Blood 80: 2548-2555 (1992). Tak więc, sugerowano, że TIE ogrywają rolę w angiogenezie, co jest istotne dla rozwoju sposobów leczenia guzów stałych i kilku innych chorób zależnych od angiogenezy, takich jak retynopatia cukrzycowa, łuszczyca, miażdżyca tętnic i zapalenie stawów.

Opisano dwa strukturalnie spokrewnione białka receptorowe TIE szczura, kodowane przez różne geny o pokrewnych profilach ekspresji. Jeden gen, określony jako tie-1, jest szczurzym homologiem tie człowieka. Maisonpierre, i in., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). Drugi gen, tie-2 może być szczurzym homologiem mysiego genu tek, który, podobnie jak tie, opisywano jako podlegający ekspresji u myszy wyłącznie w komórkach śródbłonka oraz ich przypuszczalnym potomstwie. Dumont i in., Oncogene 8: 1293-1301 (1993). Ludzki homolog tie-2 opisano u Zieglera, złoszenie patentowe U.S. nr 5 447 860, opublikowane 5 września 1995 (w którym przytacza się go jako „ork”), jakie załącza się niniejszym w całości.

Odkryto, ze oba geny podlegają szerokiej ekspresji w komórkach śródbłonka tkanek zarodkowych i noworodka. Istotny poziom transkryptów tie-2 znaleziono także w populacjach komórek zarodkowych, włączając nabłonek soczewki, nasierdzie i regiony mezenchymy. Maisonpierre i in., Oncogene 8: 1631-1637 (1993).

Ekspresja receptora TIE przede wszystkim w śródbłonku naczyniowym sugeruje, że TIE odgrywa rolę w rozwoju i utrzymaniu układu naczyniowego. Może to być rola w określaniu komórki śródbłonkowej, proliferacji, różnicowaniu i migracji komórek oraz odwzorowywaniu w elementach naczyniowych. Analizy zarodków mysich pozbawionych TEE-2 ilustrują jego istotność w angiogenezie, zwłaszcza przy tworzeniu się sieci naczyń w komórkach śródbłonka. T.N. Sato i in., Nature 376: 70-74 (1995). W dojrzałym układzie naczyniowym, TIE mogą oddziaływać na przezywanie komórek śródbłonka, utrzymanie i odpowiedź na wpływ patogeniczny.

Receptory TIE podlegają także ekspresji w pierwotnych krwiotwórczych komórkach macierzystych, komórkach B i podzbiorze komórek megakariocytowych, sugerując w ten sposób rolę ligandów, które wiążą te receptory we wczesnej hematopoezie, w różnicowaniu i/lub proliferacji komórek B oraz w szlaku różnicowania się megakariocytów. Iwama i in., Biochem. Biophys. Research Communications 195: 301-309 (1993); Hashiyama i in., Blood 87: 93-101 (1996); Batard i in., Blood 87: 2212-2220 (1996).

Przedmiotem wynalazku jest wyodrębniona cząsteczka kwasu nukleinowego, kodująca chimeryczny ligand TIE-2 wiążący i/lub aktywujący receptor TIE-2, która zawiera N-końcową domenę, domenę skłębionej spirali i domenę fibrynogeno-podobną, przy czym, co najmniej dwie wspomniane domeny pochodzą od różnych ligandów TIE-2 wybranych spośród liganda 1 TIE-2, liganda 2 TIE-2, liganda 3 TIE i liganda 4 TIE.

Korzystnie, w cząsteczce według wynalazku domena N-końcowa, domena skłębionej spirali i domena fibrynogeno-podobna pochodzą z liganda 1 TIE-2 lub liganda 2 TIE-2.

Bardziej korzystnie cząsteczka ta zawiera sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę N-końcową liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę N-końcową liganda 2 TIE-2.

Jeszcze bardziej korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 2 TIE-2.

Również korzystnie cząsteczka według wynalazku jest tak zmodyfikowana, że koduje inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej kodowanej przez nukleotydy 784-787 jak przedstawiono w fig. 27.

189 639

Najbardziej korzystnie cząsteczka jest tak modyfikowana, że koduje resztę serynową zamiast reszty cysternowej.

Ponadto w innym korzystnym rozwiązaniu cząsteczka według wynalazku jest dodatkowo zmodyfikowana, tak, że koduje inny aminokwas zamiast reszty argininowej kodowanej przez nukleotydy 199-201 jak przedstawiono w fig. 27, a najbardziej korzystnie cząsteczka jest tak modyfikowana, ze koduje resztę serynową zamiast reszty argininowej.

Cząsteczka, według wynalazku koduje chimeryczny ligand TTE-2 posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 27.

W innym korzystnym aspekcie wynalazku cząsteczka koduje chimeryczny ligand TIE-2 posiadający sekwencję przedstawioną na fig. 25.

Także korzystnie cząsteczka według wynalazku kodująca modyfikowany ligand TIE-2 wiążący się z receptorem TIE-2 lecz nie aktywujący receptora TIE-2, charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę fibrynogeno-podobną liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę fibrynogeno-podobną liganda 2 TIE-2.

Korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, że część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencje nukleotydową, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 2 TIE-2.

Bardziej korzystnie cząsteczka ta, posiada sekwencję przedstawioną w fig. 24 lub również korzystnie cząsteczka ta posiada sekwencję przedstawioną w fig. 26.

Przedmioetem wynalazku jest także chimeryczny ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej. Ten chimeryczny ligand TIE-2 może posiadać sekwencję przedstawioną w fig. 27, lecz zmodyfikowany jest tak, że posiada inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej kodowanej przez nukleotydy 784-787.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z kontrolną sekwencją ekspresji zdolną do kierowania jego ekspresją w komórce gospodarza. Najbardziej korzystnie wektor według wynalazku jest plazmidem.

Przedmiotem wynalazku jest także układ gospodarza-wektor do wytwarzania chimerycznego liganda TIE-2, który to ligand jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego taką jak zdefiniowano powyżej, który to układ obejmuje komórkę gospodarza oraz wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej.

Korzystnie układ gospodarza-wektor charakteryzuje się tym, że komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, drożdzowa, owadzia lub ssacza.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania chimerycznego liganda jaki zdefiniowano TIE-2 polegający na tym, że prowadzi się hodowle komórek układu gospodarzwektor do wytwarzania takiego liganda obejmującego komórkę gospodarza i wektor zawierający wyżej zdefiniowaną cząsteczkę w warunkach, pozwalających na wytwarzanie liganda i odzyskiwanie tak wytworzonego liganda.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało, specyficznie wiążące się z ligandem jak zdefiniowanym powyżej ale które nie wiąże się z natywnym ligandem TIE-2.

W korzystnym wykonaniu wynalazku przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat, który obejmuje zdefiniowany powyżej chimeryczny ligand TIE-2 i sprzężony z nim środek cytotoksyczny.

W korzystnym wykonaniu w koniugacie według wynalazku środkiem cytotoksycznym jest radioizotop lub toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca chimeryczny lub modyfikowany ligand TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku może być także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca przeciwciało wiążące się specyficznie z ligandem chimerycznym TIE-2 lecz nie wiążące się z natywnym TIE-23 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

189 639

Kompozycja farmaceutyczna może także zawierać koniugat obejmujący ligand chimeryczny TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnym przedmiotem wynalazku jest także chimeryczny ligand TIE-2 posiadający cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej lub chimeryczny ligand TIE-2 posiadający sekwencję przedstawioną na fig. 27, lecz zmodyfikowany tak, że posiada inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej kodowanej przez nukleotydy 784-787, do stosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

Korzytnie przeciwciało opisane powyżej można zastosować w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

Także korzystnie można stosować koniugat opisany powyżej w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

Przedmiotem wynalazku jest także chimeryczny ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego, który to ligand wiąże się z receptorem TIE-2 lecz nie aktywuje receptora TIE-2, a cząsteczka ta zawiera sekwencję nukleotydową kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji nukleotydowej kodującej domenę fibrynogeno-podobną liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę fibrynogeno-podobną liganda 2 TIE-2.

Korzystnie ligand TIE-2, według wynalazku posiada sekwencję przedstawioną na fig. 24, 25, 26 i 27.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, która zawiera sekwencję nukleotydową kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji nukleotydowej kodującej domenę fibrynogeno-podobną liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę fibrynogeno-podobną liganda 2 TIE-2.

Korzystnie w wektorze według wynalazku przedmiotowa cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z kontrolną sekwencją ekspresji zdolną do kierowania jego ekspresją w komórce gospodarza.

Bardziej korzystnie wektor jest plazmidem.

Przedmiotem wynalazku jest także układ gospodarz-wektor do wytwarzania chimerycznego liganda, jak zdefiniowano powyżej, który obejmuje komórkę gospodarza i wektor jak zdefiniowano powyżej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku układu gospodarz-wektor, komórką gospodarza może być komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia lub ssacza.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania liganda zdefiniowanego powyżej, polegający na tym, ze prowadzi się hodowlę komórek układu gospodarz-wektor w warunkach, pozwalających na wytwarzanie liganda i odzyskiwanie tak wytworzonego liganda. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało, specyficznie wiążące ligand jak zdefiniowano powyżej i który nie wiąże natywnego TIE-2 liganda.

Korzystnie przeciwciało to jest przeciwciałem monoklonalnym.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat, który zawiera chimeryczny ligand TIE-2 i sprzężony z nim czynnik cytotoksyczny. Korzystnie w koniugacie według wynalazku czynnik cytotoksyczny jest radioizotopem lub toksyną.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca chimeryczny ligand TIE-2 jak i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało wiążące specyficznie chimeryczny ligand TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, ze zawiera koniugat chimerycznego ligandu TiE-2 sprzęzonego z czynnikiem cytotoksycznym i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest chimeryczny ligand TIE-2, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

189 639

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało specyficznie wiążące się z ligandem chimerycznym TIE-2, a nie wiążące się z natywnym ligandem TEE-2 do stosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

Przedmiotem wynalazku jest koniugat obejmujący ligand chimeryczny TIE-2 i sprzężony z nim czynnik cytotoksyczny do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.

Zatem kompozycja według wynalazku zawiera chimeryczny ligand-2 TIE, zasadniczo pozbawiony innych białek. W stosowanym tu znaczeniu, modyfikowany ligand TIE-2 odnosi się do rodziny liganda TIE, którą reprezentują opisane tutaj ligandy TL1, TL2, TL3 i TL4, które zmieniono przez addycję, delecję lub substytucję jednego lub więcej aminokwasów, albo przez znaczenie np. częścią Fc ludzkiej IgG-1, lecz które zachowują swą zdolność do wiązania receptora TIE-2. Modyfikowany ligand TIE-2 obejmuje także chimeryczny ligand TIE-2, zawierający co najmniej część pierwszego liganda TIE-2 i część drugiego liganda TIE-2, który różni się od pierwszego. Pierwszy ligand TIE-2 stanowi TL1, a drugi ligand TIE-2 stanowi TL2. Wynalazek uwidacznia inne kombinacje przy użyciu innych członków rodziny liganda TIE-2. Przykładowo, możliwe są inne kombinacje, tworzące chimeryczny ligand TIE-2, włączając kombinacje, w których pierwszy ligand wybiera się z grupy, zawierającej TLI, TL2, TL3 i TL4, a drugi ligand, inny niż pierwszy ligand, wybiera się z grupy, składającej się z TL1, TL2, TL3 i TL4.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego ligand-2 TIE. W jednej postaci realizacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje ligand TIE-2 z rodziny liganda TIE, którą reprezentują ligandy TL1, TL2, TL3 i TL4, jaki tutaj opisano, które zmieniono przez addycję, delecję lub substytucję jednego lub więcej aminokwasów, albo przez znaczenie np. częścią Fc ludzkiej IgG-1, lecz które zachowują swą zdolność do wiązania receptora TIE-2. W innej postaci realizacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje modyfikowany ligand TIE-2, który jest chimerycznym ligandem TIE-2, zawierającym, co najmniej jedną część pierwszego liganda TIE-2 i część drugiego liganda TIE-2, który różni się od pierwszego. Pierwszy ligand TIE-2 stanowi TL1, a drugi ligand TIE-2 stanowi TL2. Wynalazek przedstawia też inne kombinacje przy użyciu innych członków rodziny liganda TIE-2. Przykładowo, możliwe są inne kombinacje, tworzące chimeryczny ligand TIE-2, włączając takie w których pierwszy ligand wybiera się z grupy, zawierającej TL1, TL2, TL3 i TL4, a drugi ligand, inny niż pierwszy ligand, wybiera się z grupy, składającej się z TL1, TL2, TL3 i TL4.

Wyizolowanym kwasem nukleinowym może być DNA, cDNA lub RNA. Wynalazek dotyczy też wektora, zawierającego wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującego modyfikowany ligand-2 TIE. Wynalazek dotyczy tez układu gospodarz-wektor do wytwarzania w odpowiedniej linii komórkowej gospodarza polipeptydu, posiadającego aktywność biologiczną modyfikowanego liganda-2 TIE. Odpowiednią komórką gospodarza może być komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia lub ssacza. Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydu, posiadającego aktywność biologiczną modyfikowanego liganda-2 TIE, który obejmuje hodowlę komórek układu gospodarza-wektor w warunkach, pozwalających na wytwarzanie polipeptydu i odzyskiwanie tak wytworzonego polipeptydu.

Wynalazek dotyczący wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego modyfikowany ligand-2 TIE, przewiduje dalej wykorzystanie tego liganda, jako środka terapeutycznego do leczenia pacjentów, cierpiących z powodu schorzeń związanych z komórkami, tkankami lub narządami, wykazującymi ekspresję receptora TIE-2.

Niniejszy wynalazek dotyczy tez przeciwciała, które specyficznie wiąże taką cząsteczkę terapeutyczną. Przeciwciało może być monoklonalne lub poliklonalne. Wynalazek przewiduje także sposób zastosowania takiego przeciwciała monoklonalnego lub poliklonalnego do pomiaru ilości cząsteczki terapeutycznej w próbce pobranej od pacjenta, w celu monitoringu przebiegu terapii.

Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciało, które specyficznie wiąże modyfikowany ligand-2 TIE. Przeciwciało może być monoklonalne lub poliklonalne. Tak więc wynalazek dostarcza kompozycje terapeutyczne, obejmujące przeciwciało, które specyficznie wiąże

189 639 modyfikowany ligand-2 TIE w farmaeęutyeznie dopuszczalnym nośniku. Wyoalαz.ęk dostarcza też sposób blokowńoia wzrostu naczyń krwionośnych u ssaków przez padanię skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej, zawierającej przeciwciało, które specyficznie wiąże modyfikowany ligand-2 TIE jaki opisano w niniejszym wynalazku farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Wyoalezęk dostarcza też kompozycje terapeutyczne, obejmujące modyfikowany liganS-2 TIE jaki opisano w niniejszym wynalazku, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Wynalazek dostarcza sposób pobudzania nawo-uoaczynięoia u pacjenta, przez podanie skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej, obejmującej modyfikowany ligand- TIE jaki opisano w niniejszym wynalazku, w farmacęutycznię dopuszczalnym nośniku. W jednej postaci realizacji, sposób można stosować do pobudzania gajęnia dranienia. W innej postaci realizacji sposób można stosować do lęezęnia niedokrwienić!. W jeszcze innej postaci realizacji modyfikowany ligand-2 TIE aktywujący receptor stosuje się, pojedynczo lub w połączeniu z innymi czynnikami krwiotwórczymi, do pobudzania proliferacji lub różnieoweoia krwiotwórczych komórek macierzystych, komórek B lub komórek męgakariocytawyeh.

Modyfikowany ligand-2 TIE można sprzęgać ze środkiem toksycznym i kompozycją terapeutyedoą z niego utworzoną.

Krótki opis rysunków

Figura 1A i IB - ciałko receptorowe (TIE-2 RB) hamuje rozwój naczyń krwionośnych w błonie kosmówki omoczniowej zarodka kurzego (CAM). Pojedynczy kawałek absorpcyjnej pianki żelatynowej (Ge^oam) nasyconej 6 pg RB wprowadzono bezpośrednio pod CAM 1-dniowych zarodków kurzych. Po 3 dodatkowych dniach inkubacji, 4-dniowę zarodki i otaczającą CAM usunięto i zbadano. Figura 1A: zarodki traktowane EHK-1 RB (rEHK-1 ekto/hlgGl Fc) były zdolne do życia i posiadały normalnie rozwinięte naczynia krwionośne w otaczającej CAM. Figura IB: wszystkie zarodki traktowane TIE-2 RB (r TIE-2 ekto/h IgGl Fc) padły, miały mniejsze rozmiary i były prawie zupełnie pozbawione otaczających naczyń krwionośnych.

Figura 2 - Wektor pJFE14.

Figura 3 - Mapa restrykcyjna Agtl0.

Figura 4 - Sekwencje kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasawa (kod pojedynczych liter) ludzkiego liganda 1 TIE-2 z klonu I.gtlO, kodującego ligand 1 htie-2.

Figura 5 - Sekwencje kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasawa (kod pojedynezych liter) ludzkiego ligńoda 1 TIE-2 z klonu T98G.

Figura 6 - Sekwencje kwasu nukleinowego i wnioskowana aminakwαsawa (kod pojedynczych liter) ludzkiego liganda 1.

TIE-2 z klonu pBluescript KS, kodującego ludzki ligand 2 TIE-2.

Figura 7 - Western biot, ukazujący aktywację receptora TIE-2 przez ligand 1 TIE-2 (tor LI) lecz nie przez ligand 2 TIE-2 (tor L2) lub kontrolę (Mock).

Figura 8 - Western biot, ukazujący, że wcześniejsze traktowanie komórek HAEC nadmiarem liganda 2 TIE-2 (tor 2) αntagaoizuję późniejszą zdolność rozcieńczonego liganda 1 TIE-2 do aktywacji receptora TIE-2 (TIE2-R), w parównaoiu z wcześniejszym traktowaniem komórek HAEC pożywką MOCK (tor 1).

Figura 9 - Western biot, pokazujący zdolność TL2 do kompetytywnej inhibicji aktywacji TL1 receptora TIE-2, przy użyciu ludzkiej linii komórek hybrydowych, EA.hy926.

Figura 10 - Reprezentacyjny histogram wiązania ze szczurzą IgG TIE-2 unieruchomioną powierzchniowo przez ligand TIE-2 w zatędanej (10x) kondyejanawanej pożywce ras C2C12, ras Rat2, SHEP oraz T98G Specyficzne wiązanie szczerzego TIE-2 (rTIE2) pokazuje się przez doecdącą redukcję aktywności wiązania w obecności 25 jig/ml rozpuszczalnego TIE-2 RB w porównaniu z mniejszą redukcją w obecności rozpuszczalnego trkB RB.

Figura 11 - Wiązanie rekambinowanega ludzkiego liganda 1 TIE-2 (hTLl) i ludzkiego liganda 2 TIE-2 (hTL2) w supęraotαncię komórek COS, z ludzkim ciałkiem recę'ptarowym (RB) TIE-2 unięruchomiaoym powierzchniowo. Specyficzne wiązanie TIE-2 określono przez inkubację próbek z 25 Jg/ml albo rozpuszczalnego ludzkiego TIE-2 RB albo trkB RB; istotną redukcję aktywności wiązania obserwowano tylko dla próbek iokubowanyeh z ludzkim TIE-2 RB.

189 639

Figura 12 - Western blot, ukazujący, że ciałko receptorowe TIE-2 (oznaczone TIE-2 RB albo, jak tutaj, TIE2-Fc) blokuje aktywację receptorów TIE-2 przez ligand 1 TIE-2 (TL1) w komórkach HUVEC, podczas gdy niespokrewnione ciałko receptorowe (TRKB-Fc) nie blokuje tej aktywacji.

Figura 13 - Żele agarozowe, ukazujące seryjne rozcieńczenia [nierozcieńczony (1) do 10'⁴] produktów RT-PCR TL1 i TL2 uzyskane z mysiej wątroby płodowej E14.5 (tory 1

- całość, tory 3 - wzbogacone w zrąb, oraz tory 4 krwiotwórcze komórki prekursorowe c-kit+TER119) oraz mysiej grasicy płodowej E14.5 (tory 2 - całość).

Figura 14 - Żele agarozowe, ukazujące seryjne rozcieńczenia [nierozcieńczony (1) do 10ή produktów RT-PCR TL1 i TL2 uzyskane z mysich komórek zrębu kory grasicy (tory 1

- CDR1+/A2B5-) i komórek zrębu rdzenia (tor CDR-/A2B5+).

Figura 15 - Schematyczne przedstawienie hipotetycznej roli ligandów TIE-2/TIE w angiogenezie. TL1 pokazano jako (·), TL2 pokazano jako (*), TIE-2 przedstawiono jako (T), VEGF pokazano jako ([]), a flk-1 (receptor VEGF) pokazano jako (Y).

Figura 16 - Płytki hybrydyzacji in situ, ukazujące wzór czasowej ekspresji TIE-2, TL1, TL2 oraz VGEF podczas angiogenezy związanej z rozwojem pęcherzyka jajnikowego i tworzeniem się ciałka żółtego w jajniku szczura, traktowanego surowicą ciężarnej klaczy. Kolumna 1: wczesny pęcherzyk przedowulacyjny; kolumna 2: pęcherzyk przedowulacyjny; kolumna 3: wczesne ciałko żółte; i kolumna 4: zarośnięty pęcherzyk; rząd A: pole jasne; rząd B: VEGF; rząd C: TL2; rząd D: TL1 i rząd E: receptor TIE-2.

Figura 17 - Porównanie sekwencji aminokwasowej dojrzałego białka TL1 i dojrzałego białka TL2. Sekwencja TL1 jest taka sama jak przedłożona w fig. 4 z takim wyjątkiem, że przypuszczalna sekwencja liderowa została usunięta. Podobnie, sekwencja TL2 jest taka sama jak przedłożona w fig. 6 z takim wyjątkiem, że przypuszczalna sekwencja liderowa została usunięta. Strzałki wskazują reszty ARG49, Cys245 i ARG264 TL1, które odpowiadają resztom w pozycjach aminokwasów, odpowiednio 69, 265 i 284 TL1 jak przedłożono w fig. 4.

Figura 18 - Western blot kowalentnej struktury multimerycznej TL1 i TL2 (tablica A) i przemiany wewnętrznej TL1 i TL2 przez mutację jednej cysteiny (tablica B).

Figura 19 - Typowa krzywa wiązania TIE-2-IgG z unieruchonionym TL1 w ilościowym teście wiązania z wolnymi komórkami.

Figura 20 - Typowa krzywa, ukazująca ciałko ligandowe liganda 1 TIE-2, zawierające domenę podobną do fibrynogenu liganda związanego z domeną Fc IgG (TL1-fFc), wiążącego się z unieruchomioną ektodomeną TIE-2 w ilościowym teście wiązania z wolnymi komórkami.

Figura 21 - Sekwencja nukleotydowa i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) liganda-3 TIE. Sekwencja kodująca rozpoczyna się w pozycji 47. Domena podobna do fibrynogenu rozpoczyna się w pozycji 929.

Figura 22 - Porównanie sekwencji aminokwasowych członków rodziny liganda TIE. mTL3 = mysi ligand-3 TIE; hTL1 = ludzki ligand 1 TIE-2; chTL1 = kurzy ligand 1 TIE-2; mTL1 = mysi ligand 1 TIE-2; mTL2 = mysi ligand 2 TIE-2; hTL2 = ludzki ligand 2 TIE-2. Regiony obramowane wskazują zakonserwowane regiony homologii wśród członków rodziny.

Figura 23 - Sekwencje nukleotydową i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) liganda-4 TIE. Strzałka wskazuje pozycję nukleotydową 569.

Figura 24 - Sekwencje nukleotydową i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) chimerycznego liganda TIE oznaczonego 1N1C2F (chimera 1). Przypuszczalna sekwencja liderowa kodowana jest przez nukleotydy 1-60.

Figura 25 - Sekwencje nukleotydową i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) chimerycznego liganda TIE oznaczonego 2N2C1F (chimera 2). Przypuszczalna sekwencja liderowa kodowana jest przez nukleotydy 1-48.

Figura 26 - Sekwencje nukleotydową i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) chimerycznego liganda TIE oznaczonego 1N2C2F (chimera 3). Przypuszczalna sekwencja liderowa kodowana jest przez nukleotydy 1-60.

Figura 27 - Sekwencje nukleotydową i wnioskowana aminokwasowa (kod pojedynczych liter) chimerycznego liganda TIE oznaczonego 2N1C1F (chimera 4). Przypuszczalna sekwencja liderowa kodowana jest przez nukleotydy 1-48.

189 639

Szczegółowy opis wynalazku

Jak opisano poniżej bardziej szczegółowo, zgłaszający utworzyli nowe modyfikowane ligandy TIE-2, które wiążą receptor TIE-2. Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję, obejmującą modyfikowany ligand TIE-2 pozbawiony innych białek. W stosowanym tu znaczeniu, modyfikowany ligand TEE-2 odnosi się do liganda z rodziny liganda TIE, którą reprezentują ligandy TL1, TL2, TL3 i TL4, które zmieniono przez addycję, delecję lub substytucję jednego lub więcej aminokwasów, albo przez znaczenie np. częścią Fc ludzkiej IgG-1, lecz które zachowują swą zdolność do wiązania receptora TIE-2. Modyfikowany ligand TIE-2 obejmuje także chimeryczny ligand TIE-2, zawierający co najmniej jedną część pierwszego liganda TIE-2 i część drugiego liganda TIE-2, który różni się od pierwszego. Pierwszy ligand TIE-2 jest TL1, a drugi ligand TIE-2 jest TL2. Możliwe też są inne kombinacje przy użyciu innych członków rodziny liganda TIE-2. Przykładowo, możliwe są inne kombinacje, tworzące chimeryczny ligand TIE-2, włączając kombinacje, w których pierwszy ligand wybiera się z grupy, zawierającej TL1, TL2, TL3 i TL4, a dnigi ligand, inny niż pierwszy ligand, wybiera się z grupy, składającej się z TL1, TL2, TL3 i TL4.

Wynalazek dostarcza także wyizolowaną częsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2. W jednej postaci realizacji wynalazku wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje ligand TIE-2 z rodziny liganda TIE, którą reprezentują ligandy TL1, TL2, TL3 i TL4, które zmieniono przez addycję, delecję lub substytucję jednego lub więcej aminokwasów, albo przez znaczenie np. częścią Fc ludzkiej IgG-1, lecz które zachowują swą zdolność do wiązania receptora TIE-2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje też modyfikowany ligand TIE-2, który jest chimerycznym ligandem TIE-2, zawierającym co najmniej jedną część pierwszego liganda TIE-2 i część drugiego liganda TIE-2, który różni się od pierwszego. Pierwszy ligand TIE-2 jest TL1, a drugi ligand TIE-2 jest TL2. Możliwe są także inne kombinacje przy użyciu innych członków rodziny liganda TIE-2, tworzące chimeryczny ligand TIE-2, włączając kombinacje, w których pierwszy ligand wybiera się z grupy, zawierającej TL1, TL2, TL3 i TL4, a drugi ligand, inny niż pierwszy ligand, wybiera się z grupy, składającej się z TL1, TL2, TL3 i TL4.

Niniejszy wynalazek obejmuje modyfikowane ligandy TIE-2 i ich sekwencje aminokwasowe, jak również ich funkcjonalne równoważne odmiany, a także białka lub peptydy, zawierające mutanty substytucyjne, delecyjne lub insercyjne opisanych sekwencji, które wiążą receptor TEE-2 i działają jako ich agoniści albo antagoniści. Takie odmiany obejmują te, w których reszty aminokwasowe podstawia się resztami w sekwencji, dającymi ciche zmiany. Przykładowo, jedną lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji można podstawić innym aminokwasem(ami) o podobnej polamości, działającym jako funkcjonalny równoważnik, dając cichą zmianę. Podstawniki dla aminokwasów w sekwencji można wybrać spośród innych członków klasy, do której należy aminokwas. Przykładowo klasa aminokwasów niepolamych (hydrofobowych) obejmuje alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Aminokwasami polarnymi obojętnymi są glicyna, seryna, treonina, cysteina, tyrozyna, asparagina i glutamina. Aminokwasami naładowanymi dodatnio (zasadowymi) są arginina, lizyna i histydyna. Ujemnie naładowane (kwasowe) aminokwasy to kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.

Możliwe są też białka lub ich fragmenty albo pochodne, które wykazują taką samą lub podobną aktywność biologiczną jak opisany niniejszym modyfikowany ligand TIE-2, oraz pochodne różnie zmodyfikowane podczas, lub po translacji, np. przez glikozylację, rozszczepienie proteolityczne, połączenie z cząsteczką przeciwciała lub innym ligandem komórkowym, itd. Cząsteczki funkcjonalnie równoważne obejmują także cząsteczki, zawierające modyfikacje, łącznie z modyfikacjami N-terminalnymi, wynikającymi z ekspresji u poszczególnych rekombinowanych gospodarzy, tak jak np. metylacja N-terminalna, która występuje w pewnych bakteryjnych układach ekspresji (np. E coli). Niniejszy wynalazek opisuje także sekwencję nukleotydową, która koduje białka niniejszym opisane, jako modyfikowane ligandy TIE-2, a także komórki gospodarza, łącznie z drożdżami, bakteriami, wirusami i komórkami ssaków, poddanych zabiegom inżynierii genetycznej, w celu wytworzenia białka, np. przez transfekcję, transdukcję, infekcję elektroporację albo mikroinjekcję kwasu nukleinowego,

189 639 kodującego opisane niniejszym ligandy TIE-2, w odpowiednim wektorze ekspresji. Kwas nukleinowy kodującego modyfikowane ligandy TIE-2 można stosować w technikach terapii genowej, tak jak opisano np. u Finkela i Epsteina FASEB J. 9: 843-851 (1995); Guzmana i in.,

PNAS (USA) 91: 10732-10936 (1994).

Istnieją też sekwencje DNA i RNA, które hybrydyzują z sekwencją nukleotydową, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, w warunkach średnio surowych, jakie określono np. u Sambrooka i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2 wyd. tom 1, strony 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Tak więc, cząsteczką kwasu nukleinowego rozważaną w niniejszym wynalazku jest taka, która posiada sekwencję nukleotydową wnioskowaną z sekwencji aminokwasowej modyfikowanego liganda TIE-2 wytworzonego zgodnie z niniejszym opisem, jak również cząsteczką, posiadającą sekwencję nukleotydów, hybrydyzującą z taką sekwencją nukleotydową, a także sekwencję nukleotydową, która jest zregenerowana w stosunku do powyższych sekwencji z powodu kodu genetycznego, lecz która koduje ligand, wiążący receptor TIE-2 i mający sekwencję aminokwasową oraz inne cechy pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe, będące wystarczającą kopią opisanego niniejszym modyfikowanego liganda TIE-2, aby nadać cząsteczce taką samą aktywność biologiczną jak opisany niniejszym modyfikowany ligand TIE-2.

Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże i aktywuje receptor TIE-2, obejmującą sekwencje nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, w którym część sekwencji nukleotydowej, kodującej domenę N-terminalną liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, kodującą domenę N-terminalną liganda 2 TIE-2. Wynalazek przewiduje także taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, z dodatkową modyfikacją taką, ze część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 2 TIE-2.

Niniejszy wynalazek dostarcza także wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIT-2, który wiąże i aktywuje receptor TIE-2, obejmującą sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, w której część sekwencji nukleotydowej, która koduje N-terminalną domenę liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje N-terminalną domenę liganda 2 TIE-2 i którą dalej modyfikuje się tak, aby kodowała inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej, kodowanej przez nukleotydy 784-787 jak przedłozono w fig. 27. Zamiast reszty cysteinowej podstawia się korzystnie resztę serynową. W innej postaci realizacji, cząsteczkę kwasu nukleinowego modyfikuje się dodatkowo tak, aby kodowała inny aminokwas zamias reszty argininowej kodowanej przez nukleotydy 199-201 jak przedłozono w fig. 27. Zamiast reszty argininowej podstawia się korzystnie resztę serynową.

Niniejszy wynalazek przewiduje także wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże i aktywuje receptor TIE-2, obejmującą sekwencje nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, którą modyfikuje się tak, aby kodowała inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej w pozycji aminokwasu 245. Korzystnie, zamiast reszty cysteinowej podstawia się resztę serynową.

Wynalazek dostarcza wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże lecz nie aktywuje receptora TIE-2, obejmującą sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, w której usuwa się cześć sekwencji nukleotydowej, która koduje N-terminalną domenę liganda 1 TIE-2. Wynalazek przewiduje także taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, modyfikowaną dodatkowo tak, że część sekwencji nukleotydowe, która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 1 TIE-2 usuwa się i część, kodującą domenę podobną do fibrynogenu łączy się w ramce z sekwencją nukleotydową, kodującą stały region ludzkiej immunoglobuliny gamma-1 (IgGl Fc).

Wynalazek dostarcza wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże lecz nie aktywuje receptora TIE-2, obejmującą sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 2 TIE-2, w której usuwa się część sekwencji nukleotydowej, która koduje N-terminalną domenę liganda 2 TIE-2. Wynalazek przewiduje także taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, modyfikowaną dodatkowo tak, ze część sekwencji nukleotydowej,

189 639 która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 2 TIE-2 usuwa się i część, kodującą domenę podobną do fibrynogenu łączy się w ramce z sekwencją nukleotydową, kodującą stały region ludzkiej immunoglobuliny gamma-1 (IgG1 Fc).

Wynalazek dostarcza wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże lecz nie aktywuje receptora TIE-2, obejmującą sekwencje nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, w której część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę podobną do fibrynogenu liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę podobną do fibrynogenu liganda 2 TIE-2. Wynalazek przewiduje także taką częsteczkę kwasu nukleinowego dodatkowo modyfikowaną tak, ze część sekwencji nukleotydowej, która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleotydową, która koduje domenę zwiniętej spirali liganda 2 TIE-2.

Wynalazek dostarcza dalej modyfikowany ligand TIE-2 kodowany przez każdą z cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dostarcza także chimeryczny ligand TIE-2, obejmujący co najmniej część pierwszego liganda TIE-2 i część drugiego liganda TIE-2, który jest inny niż pierwszy, w którym pierwszy i drugi ligand TIE-2 wybiera się z grupy, składającej się z liganda-1 TIE-2, liganda-2 TIE-2, liganda-3 TIE i liganda-4 TIE. Korzystnie, chimeryczny ligand TIE obejmuje, co najmniej część liganda-1 TIE-2 i część liganda-2 TIE-2.

Wynalazek dostarcza także cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje chimeryczny ligand TIE jak przedłożono w fig. 24, 25, 26 lub 27. Wynalazek dostarcza także chimeryczny ligand TIE jaki przedstawiono w fig. 27, modyfikowany tak, że posiada inny aminokwas zamiast reszty cysteinowej kodowanej przez nukleotydy 784-787.

Do konstrukcji wektorów ekspresji, kodujących modyfikowany ligand TIE-2 można zastosować każdą metodę znaną fachowcowi pod względem wprowadzania fragmentów DNA do wektora, przy użyciu odpowiednich sygnałów kontrolnych transkrypcji/translacji i sekwencji kodujących białko. Metody te mogą obejmować rekombinację DNa in vitro oraz techniki syntezy, a także rekombinacje in vivo (rekombinacje genetyczne). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej modyfikowany ligand TIE-2 lub jego fragmenty peptydowe, można regulować przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, operacyjnie połączoną z sekwencją kodującą modyfikowany ligand TlE-2, tak, że białko lub peptyd modyfikowanego liganda TIE-2 podlega ekspresji w gospodarzu transformowanym rekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresję modyfikowanego liganda TIE-2 można kontrolować każdym elementem promotor/wzmacniacz znanym w technice. Promotory, których można użyć do kontroli ekspresji liganda obejmują, lecz bez ograniczenia, długie powtórzenie terminalne jaki opisano u Squinto i in., (Cell, 65: 1-20 (1991)); wczesny region promotorowy SV40 (Bemoist i Chambon, Nature, 290: 304-310), promotor CMV, powtórzenie 5' terminalne M-MuLV, promotor zawarty w długim powtórzeniu 3' terminalnym wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i in., Cell 22: 787-797 (1980)), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 144-1445 (1981), promotor adenowirusa, sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster i in., Nature 296: 39-42 (1982)); prokariotyczne wektory ekspresji, takie jak promotor β-laktamazy (Vina-Kamaroff i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 (1978)), lub promotor tac (DeBoer i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)), patrz także „Useful proteins fom recombinant bacteria” w Scientific American, 242: 74-94 (1980); elementy promotorowe drożdży lub innych grzybów, tak jak promotor Gal 4, promotor aDh (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor fosfatazy alkalicznej oraz następujące zwierzęce regiony kontrolne transkrypcji, które wykazują specyficzność tkankową i wykorzystywane w zwierzętach transgenicznych; region kontrolny elastazy I, który jest aktywny w komórkach groniastych trzustki (Swift i in., Cell 38: 639-646 (1984); Omitz i in., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987); region kontrolny genu insuliny, aktywny w komórkach beta trzustki [Hanahan, Nature 315: 115-122 (1985)]; region kontrolny genu immunoglobuliny, aktywny w komórkach limfoidalnych (Grosschedl i in., 1984, Cell 38: 647-658; Adames i in., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander i in., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), wirusowy region kontrolny guza sutka myszy, aktywny w komórkach jądrowych,

189 639 piersi, limfoidalnych i tucznych (Leder i in., 1986, Celi 45: 485-495), region kontrolny albuminy, aktywny w wątrobie (Pinkert i in., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), region kontrolny genu alfa-fetoproteiny, aktywny w wątrobie (Krumlauf i in., 1985, Mol. Celi. Biol. 5:1639-1648; Hammer i in., 1987, Science 235: 53-58); region kontrolny genu alfa 1-antytrypsyny, aktywny w wątrobie (Kelsey i in., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), region kontrolny genu beta-globiny, aktywny w komórkach szpikowych (Mongram i in., 1985, Naturę 315: 338-340; Kollias i in., 1986, Celi 46: 89-94); region kontrolny genu białka podstawowego mieliny, aktywny w oligodendrocytach w mózgu (Readhead i in., 1987, Celi 48: 703-712), region kontrolny genu lekkiego łańcucha 2 miozyny, aktywny w mięśniach szkieletowych (Shani, 1985, Naturę 314: 283-286), oraz region kontrolny genu gonadotropowego hormonu uwalniającego, aktywny w podwzgórzu (Mason i in., 1986, Science 234: 1372-1378). Wynalazek obejmuje dalej wytwarzanie związków antysensownych, zdolnych do specyficznej hybrydyzacji z sekwencją RNA, kodującą modyfikowany ligand TIE-2, w celu modulacji ekspresji. Ecker, opis patentowy U.S. nr 5 166 195, opublikowany 24 listopada 1992.

Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, opisane wektory ekspresji zdolne do powielania u gospodarzy bakteryjnych lub eukariotycznych, obejmujące kwas nukleinowy, kodujący opisany w niniejszym modyfikowany ligand TIE-2, stosuje się do transfekcji gospodarza i przez to do kierowania ekspresją takiego kwasu nukleinowego, w celu wytworzenia modyfikowanego liganda TIE-2, które można potem odzyskiwać w postaci aktywnej biologicznie. Postać biologicznie aktywna obejmuje postać zdolną do wiązania receptora TIE i powodowania odpowiedzi biologicznej, takiej jak zróżnicowane działanie lub wpływanie na fenotyp komórki, wykazującej ekspresję receptora. Takie postacie aktywne biologicznie mogłyby, np. indukować fosforylację domeny kinazy tyrozynowej receptora TIE. Alternatywnie, aktywność biologiczna może być takim efektem, jak antagonistyczny wobec receptora TIE. W alternatywnych postaciach realizacji, postacią aktywną modyfikowanego liganda TIE-2 jest taka, która rozpoznaje receptor TIE i działa przez to jak czynnik kierujący wobec receptora, do użytku zarówno w diagnostyce jak i leczeniu. Zgodnie z takimi postaciami realizacji, postać aktywna nie musi nadawać żadnej zmiany w fenotypie w jakiejkolwiek komórce, wykazującej ekspresję TIE.

Wektory ekspresji, zawierające inserty genowe można identyfikować w czterech generalnych podejściach: (a) hybrydyzacji DNA-DNA, (b) obecności lub nieobecności funkcji genu „markerowego”, (c) ekspresji wtrąconych sekwencji oraz (d) detekcji PGR. W pierwszym podejściu, obecność obcego genu wprowadzonego do wektora ekspresji, można wykrywać przez hybrydyzację DNA-DNA, przy użyciu sond, zawierających sekwencje homologiczne z wprowadzonym genem, kodującym modyfikowany ligand TIE-2. W podejściu drugim, rekombinowany układ wektor/gospodarz można identyfikować i poddawać selekcji przy obecności lub nieobecności pewnych funkcji genu „markerowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, odporności na antybiotyki, fenotypu transformacji, tworzenia się ciał okluzyjnych w bakulowirusie, itd.) powodowanych przez wprowadzenie do wektora obcych genów. Przykładowo, jeśli kwas nukleinowy, kodujący modyfikowany ligand TIE-2 wprowadza się do sekwencji genu markerowego wektora, rekombinanty, zawierające insert można identyfikować przez nieobecność funkcji genu markerowego. W trzecim podejściu, rekombinowane wektory ekspresji można identyfikować przez testowanie produktu obcego genu podlegającego ekspresji w rekombinancie. Takie testy można oprzeć np. o właściwości fizyczne lub funkcjonalne produktu genowego modyfikowanego liganda TIE-2, np. przez wiązanie liganda z receptorem TIE lub jego częścią, którą można oznakować, np. za pomocą wykrywalnego przeciwciała lub jego części albo przez wiązanie przeciwciał wytworzonych przeciw białku modyfikowanego liganda TIE-2 lub ich części. Komórki według niniejszego wynalazku mogą krótkotrwale, albo korzystnie konstytutywnie i w sposób stały, wykazywać ekspresję modyfikowanego liganda TIE-2, jak opisano niniejszym. W czwartym podejściu, można wytworzyć primery nukleotydowe DNA, odpowiadające sekwencji DNA specyficznej wobec tie. Primery te moznaby potem używać do PGR fragmentu genu tie. (PGR Protocols: A Guide To Methods and Applications, wydane przez Michael A. Innis i in., Academic Press (1990)).

189 639

Rekombinowany ligand można oczyszczać każdą techniką, która pozwala na późniejsze utworzenie stabilnego aktywnego biologicznie białka. Korzystnie, ligand wydziela się do środowiska hodowli, z którego jest odzyskiwany. Alternatywnie, ligand można odzyskać z komórek, albo w postaci rozpuszczalnych białek, albo w postaci ciałek inkluzyjnych, z których można go ekstrahować ilościowo z użyciem 8 M chlorowodorku guanidyny i dializować zgodnie z dobrze znaną metodologią. W celu dalszego oczyszczenia liganda, można stosować chromatografię powinowactwa, konwencjonalną chromatografię jono-wymienną, chromatografię interakcji hydrofobowej, chromatografię z odwrotną fazą lub filtrację żelową.

W innych postaciach realizacji wynalazku, co opisano bardziej szczegółowo w przykładach, do inaktywacji lub „znokautowania” endogenicznego genu przez rekombinację homologiczną, można użyć rekombinowanego genu, kodującego modyfikowany ligand TIE-2, i utworzyć przez to komórkę, nie posiadającą modyfikowanego liganda TIE-2, tkankę lub zwierzę. Przykładowo, można skonstruować gen, kodujący rekombinowany ligand-4 TIE, tak aby zawierał mutację przez insercję, np. genu neo, który inaktywowałby natywny gen, kodujący modyfikowany ligand-4 TIE. Taką, konstrukcję, pod kontrolą odpowiedniego promotora, można wprowadzić do komórki, takiej jak komórka macierzysta zarodka, techniką taką jak transfekcja, transdukcja lub injekcja. Komórki, zawierające konstrukcję, można potem poddać selekcji przez odporność wobec G418. Komórki, nie posiadające nieuszkodzonego genu, kodującego ligand-4 TIE można następnie identyfikować np. przez Southern blotting, detekcję PCR, Nothem blotting lub test ekspresji. Komórki, nie posiadające nieuszkodzonego genu, kodującego ligand-4 TIE można następnie poddać fuzji z wczesnymi komórkami zarodkowymi, aby wytworzyć zwierzęta transgeniczne z niedoborem takiego liganda. Takiego zwierzęcia można użyć do określenia specyficznych procesów in vivo, normalnie uzależnionych od liganda.

Niniejszy wynalazek zapewnia także przeciwciała wobec opisanego w niniejszym modyfikowanego liganda TIE-2, które są użyteczne do detekcji liganda, np. w zastosowaniach diagnostycznych. Do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych w kierunku modyfikowanego liganda TIE-2, można stosować każdą technikę, przewidującą wytwarzanie cząsteczek przeciwciał przez ciągłe linie komórkowe w hodowli. Przykładowo, technika hybrydomy, wykorzystana początkowo przez Kohlera i Mlleteina (1975, Naturę 256:495-497), jak również technika triomy, technika hybrydomy ludzkiej komórki B (Kozbor i in., 1983, Immunology Today 4: 72), oraz technika EBV-hybrydomy, do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i in., 1985, w „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy” Alan R. Liss, Inc. strony 77-96) i inne, wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

Przeciwciała monoklonalne mogą być ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi lub chimerycznymi ludzko-mysimi (lub innych gatunków) przeciwciałami monoklonalnymi. Ludzkie przeciwciała monoklonalne można wytworzyć każdą z licznych technik znanych w tej dziedzinie (np. Teng i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308-7312; Kozbor i in., Immunology Today 4: 72-79; Olsson i in., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Można wytworzyć cząsteczki przeciwciała chimerycznego, zawierające mysią domenę, wiążącą antygen, z ludzkim regionem stałym (Morrison i in., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; Takeda i in., 1985, Naturę 314: 452).

Można stosować różne procedury znane w tej dziedzinie do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych wobec epitopów modyfikowanego liganda TIE-2 opisanego w niniejszym. Do wytwarzania przeciwciała, różne zwierzęta żywicielskie, włączając, lecz bez ograniczenia króliki, myszy i szczury, można immunizować przez injekcję modyfikowanego liganda TIE-2 albo ich fragmentu lub pochodnej. Można stosować różne adjuwanty do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, w zależności od gatunku gospodarza, włączając lecz bez ograniczenia Freunda (kompletne i niekompletne), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaniny doświadczalnego zapalenia stawów, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne ludzkie adjuwanty, takie jak BCG (Bacille Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum.

Klon molekularny przeciwciała wobec wybranego epitopu modyfikowanego liganda TIE-2, można wytworzyć znanymi technikami. Do konstrukcji sekwencji kwasu nukleinowego,

189 639 które kodują cząsteczkę przeciwciała monoklonalnego lub jego regionu wiążącego antygen, można uzyć metodologii rekombinowanego DNA (patrz np. Maniatis i in., 1982, Molecular

Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nowy Jork).

Niniejszy wynalazek zapewnia cząsteczki przeciwciał, a także fragmenty takich cząsteczek przeciwciał. Fragmenty przeciwciał, które zawierają idiotyp cząsteczki, można wytworzyć znanymi technikami. Przykładowo, takie fragmenty obejmują, lecz bez ograniczenia: fragment F(ab)2, który można wytworzyć przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała; fragmenty Fab', które można utworzyć przez redukcję mostków disiarczkowych fragmentu F(ab)2 oraz fragmenty Fab, które można wytworzyć przez traktowanie cząsteczki przeciwciała papainą i czynnikiem redukującym. Cząsteczki przeciwciała można oczyszczać znanymi technikami, np. przez chromatografię immunoabsorpcyjną lub powinowactwa immunologicznego, metodami chromatograficzymi, takimi jak HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) lub ich połączeniem.

Na podstawie niniejszego wynalazku można skonstruować test immunologiczny do pomiaru ilości modyfikowanego liganda TIE-2 w próbce biologicznej przez

a) zetknięcie próbki biologicznej, z co najmniej jednym przeciwciałem, które specyficznie wiąże modyfikowany ligand TIE-2 tak, ze przeciwciało tworzy kompleks z każdym modyfikowanym ligandem TIE-2 obecnym w próbce biologicznej;

oraz b) pomiar ilości kompleksu i przez to pomiar ilości modyfikowanego liganda TIE-2 w próbce biologicznej.

Można też utworzyć test do pomiaru ilości receptora TIE w próbce biologicznej przez a) zetknięeie p^rćibki biegłogiconej, z co najmniej jednym liyandem według wyna lazku tak, ze ligand tworzy kompleks z receptorem TIE;

oraz b) pomiar ilości kompleksu i przez to pomiar ilości receptora TIE w próbce biologicznej.

Możliwe jest także wykorzystanie modyfikowanego liganda TIE-2, który aktywuje receptor TIE-2 jak opisano w niniejszym, w celu podtrzymania przeżycia i/lub wzrostu i/lub migracji i/lub różnicowania się komórek, wykazujących ekspresję receptora TIE-2. Tak więc, ligand można stosować jako uzupełnienie do podtrzymania, np. komórek śródbłonka w hodowli.

Dalej, utworzenie przez Zgłaszających modyfikowanego liganda TIE-2 dla receptora TIE-2, umożliwia wykorzystanie układów testowych użytecznych do identyfikacji agonistów lub antagonistów receptora TIE-2. Takie układy testowe byłyby użyteczne do identyfikacji cząsteczek zdolnych do pobudzania lub hamowania angiogenezy. Przykładowo, w jednej postaci realizacji, antagonistów receptora TIE-2 można identyfikować jako cząsteczki testowe, zdolne do zakłócania interakcji receptora TEE-2 z modyfikowanym ligandem TIE-2, który wiąże receptor TIE-2. Takich antagonistów identyfikuje się przez ich zdolności do 1) blokowania wiązania biologicznie aktywnego modyfikowanego liganda TIE-2 z receptorem, zgodnie z pomiarem, np. przy użyciu technologii bioczujnika BIAcore (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ); lub 2) blokowania zdolności biologicznie aktywnego modyfikowanego liganda TIE-2 do wywoływania odpowiedzi biologicznej. Takimi odpowiedziami biologicznymi są, lecz bez ograniczenia, fosforylacja receptora TIE lub składniki położone niżej w h-a^d^cyjnym szlaku sygnałowym TIE, albo przeżycie, wzrost lub różnicowanie się komórek, niosących receptor TIE.

W jednej postaci realizacji, komórki skonstruowane do ekspresji receptora TIE, mogą być zalezne od względem wzrostu od dodania modyfikowanego liganda TIE-2. Takie komórki dostarczają uzytecznych układów testowych do identyfikacji dodatkowych agonistów receptora TIE lub antagonistów zdolnych do zakłócania aktywności modyfikowanego liganda TIE-2 na takich komórkach. Alternatywnie, komórki autokrynowe, skonstruowane tak, aby były zdolne go wspólnej ekspresji zarówno modyfikowanego liganda TIE-2 jak i receptora, mogą dostarczyć uzytecznych układów do testowania potencjalnych agonistów lub antagonistów.

Zatem, niniejszy wynalazek zapewnia wprowadzenie receptora TIE-2 do komórek, które normalnie nie wykazują ekspresji tego receptora, pozwalając w ten sposób tym komórkom na ukazanie całkowitych i łatwo odróżnialnych odpowiedzi na ligand, który wiąże ten receptor.

189 639

Typ wywołanej odpowiedzi zależy od wykorzystanej komórki, a nie od specyficznego receptora wprowadzonego do komórki. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe do uzyskania odpowiedzi o największym wykorzystaniu w testach, jak również odkrywania, cząsteczek, które mogą oddziaływać na receptory kinazy tyrozynowej. Cząsteczki mogą być każdego typu, włączając, lecz bez ograniczenia, cząsteczki peptydowe i niepeptydowe, które będą oddziaływać na opisywane układy w sposób specyficzny dla receptora.

Jednym lub więcej wykorzystywanych użytecznych układów jest wprowadzenie receptora TIE (lub receptora chimerycznego, zawierającego zewnątrzkomórkową domenę receptora innej kinazy tyrozynowej, tak jak np. trkC oraz wewnątrzkomórkową domenę receptora TIE) do linii komórkowej fibroblastów (np. komórek NIH3T3), a więc takiego receptora, który normalnie nie pośredniczy w odpowiedziach proliferacyjnych lub innych, po wprowadzeniu do fibroblastów, niemniej można go testować różnymi dobrze ustalonymi metodami, do oceny ilościowej wpływu czynników wzrostu fibroblastów (np. włączenia tymidyny lub innych rodzajów testów proliferacji; patrz van Zoelen, 1990, „The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors” w Progress Factor Research, tom 2, strony 131-152; Zhan i M.Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., tom 6, str. 3541-3544). Testy te mają dodatkową korzyść, że można testować każdy preparat zarówno na linii komórkowej, posiadającej receptor wprowadzony, jak również na linii rodzicielskiej bez receptora; tylko specyficzny wpływ na linię komórkową z receptorem będzie oceniony jako taki, w którym pośredniczy wprowadzony receptor. Takie komórki można dodatkowo konstruować do ekspresji modyfikowanego liganda TIE-2, tworząc w ten sposób autokrynowy układ użyteczny do testowania cząsteczek, działających jako antagoniści/agoniści tej interakcji. Tak więc, niniejszy wynalazek przewiduje komórki gospodarza, zawierające kwas nukleinowy, kodujące modyfikowany ligand TIE-2 i kwas nukleinowy, kodujący receptor TIE.

Interakcja receptor TIE/modyfikowany ligand TIE-2 zapewnia także użyteczny układ do identyfikacji agonistów lub antagonistów receptora TLE o małych cząsteczkach. Przykładowo, można identyfikować fragmenty, mutanty lub pochodne modyfikowanego liganda TIE-2, które wiążą receptor TIE lecz nie indukują żadnej innej aktywności biologicznej. Alternatywnie, charakteryzacja modyfikowanego liganda TIE-2 umożliwia dodatkową charakteryzację aktywnych części cząsteczki. Dalej, identyfikacja liganda umożliwia określenie struktury krystalograficznej w promieniach rentgenowskich kompleksu receptor/ligand, umożliwiając w ten sposób identyfikację miejsca wiązania na receptorze. Znajomość miejsca wiązania dostarczy pożytecznego wglądu do racjonalnego planu nowych agonistów i antagonistów.

Specyficzne wiązanie testowych cząsteczek z receptorem TIE można mierzyć na wiele sposobów. Przykładowo, aktualne wiązanie testowanej cząsteczki z komórkami, wykazującymi ekspresję TIE, można wykrywać lub mierzyć przez detekcję lub pomiar (i) cząsteczki testowej związanej z powierzchnią nieuszkodzonej komórki; (ii) cząsteczki testowej usieciowanej z białkiem TIE w lizatach komórkowych; lub (iii) cząsteczki testowej związanej z TIE in vitro. Specyficzne interakcje między testowaną cząsteczką i TIE można ocenić przez użycie odczynników, które pokazują unikalne właściwości tej interakcji.

W przypadku, gdy dokonuje się pomiaru modyfikowanego liganda TIE-2 w próbce, zmieniające się rozcieńczenia próbki (cząsteczki testowej) równolegle z kontrolą ujemną (NC), nie wykazującą aktywności modyfikowanego liganda TIE-2 oraz kontrolą dodatnią (PC), zawierającą znaną ilość modyfikowanego liganda TIE-2, można poddać ekspozycji wobec komórek, wykazujących ekspresję TIE w obecności znakowanego w sposób wykrywalny modyfikowanego liganda TIE-2 (w tej próbce, ligand znakowany jodem radioaktywnym). Ilość modyfikowanego liganda TIE-2 w próbce testowej można ocenić przez określenie ilości znakowanego ¹²⁵I modyfikowanego liganda TIE-2, który wiąże kontrole i w każdym z rozcieńczeń, a następnie porównanie wartości próbek z krzywą standardową. Więcej modyfikowanego liganda TIE-2 w próbce, mniej liganda znakowanego ¹²⁵I, który wiąże się z TIE.

Ilość związanego liganda znakowanego ¹²⁵I można określić przez pomiar ilości radioaktywności na komórkę, lub przez sieciowanie modyfikowanego liganda TIE-2 z białkami powierzchniowo-komórkowymi, przy użyciu DSS, jak opisano u Meakina i Shootera, 1991, Neuron 6: 153-163, i detekcję ilości znakowanego białka w ekstraktach komórkowych przy

189 639 użyciu np. elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, która może ujawnić znakowane białko o wielkości, odpowiadającej receptorowmi TIE/modyfikowanemu ligandowi TIE-2. Specyficzną interakcję cząsteczka testowa/TIE można testować dodatkowo przez dodanie do próby różnych rozcieńczeń nieznakowanego liganda kontrolnego, który nie wiąże receptora TIE i przez to nie powinien mieć istotnego wpływu na współzawadnictwo między znakowanym modyfikowanym ligandem TIE-2 i cząsteczką testową, pod względem wiązania TIE. Alternatywnie, cząsteczkę, o której wiadomo, że jest zdolna do przerywania wiązania receptor TIE/modyfikowany ligand TIE-2, tak jak, lecz bez ograniczenia, przeciwciało anty-TIE lub ciałko receptorowe TIE jakie opisano w niniejszym, można oczekiwać, ze zakłóci współzawodnictwo między ¹²⁵I-modyfikowanym ligandem TIE-2 i cząsteczką testową, pod względem wiązania receptora TIE.

Znakowany w sposób wykrywalny modyfikowany ligand TIE-2 obejmuje, lecz bez ograniczenia modyfikowany ligand TIE-2 połączony kowalentnie lub niekowalentnie z substancją radioaktywną, substancją fluorescencyjną, substancją, posiadającą aktywność enzymatyczną, substancją, służącą jako substrat dla enzymu (zaleca się enzymy i substraty związane z reakcjami kolorymetrycznie wykrywalnymi) lub substancją, którą może rozpoznać cząsteczka przeciwciała korzystnie cząsteczka przeciwciała znakowana w sposób wykrywalny.

Alternatywnie, specyficzne wiązanie cząsteczki testowej z TIE można mierzyć przez ocenę wtórnych efektów biologicznych wiązania modyfikowanego liganda TIE-2/receptor TIE, łącznie, lecz bez ograniczenia, ze wzrostem komórkowym i/lub różnicowaniem lub bezpośredniej wczesnej ekspresji genowej albo fosforylacji TIE. Przykładowo, można testować zdolność cząsteczki testowej do indukcji różnicowania w komórkach, które wykaziyą brak tie i w porównywalnych komórkach, które wykazują ekspresję tie; różnicowanie komórek z ekspresją tie, ale nie porównywalnych komórek bez tie, byłby wskaźnikiem specyficznej interakcji cząsteczka testowa/TIE. Podobną analizę można przeprowadzić przez detekcję indukcji bezpośredniego wczesnego genu (np. fos i jun) w komórkach tie-ujemnych i tie-dodatnich, lub przez detekcję fosforylacji TEE przy użyciu standardowych testów fosforylacji znanych w tej dziedzinie. Taka analiza może być użyteczna do identyfikacji agonistów lub antagonistów, które nie wiążą kompetytywnie TIE.

Podobnie, niniejszy wynalazek pozwala na identyfikację cząsteczki, która posiada aktywność biologiczną modyfikowanego liganda TIE-2, obejmujący (i) ekspozycję komórki, wykazującej ekspresję tie na cząsteczkę testową oraz (ii) wykrycie specyficznego wiązania cząsteczki testowej z receptorem TIE, w którym specyficzne wiązanie z TIE dodatnio koreluje z aktywnością podobną do TIE. Specyficzne wiązanie można wykrywać albo testując pod względem bezpośredniego wiązania, albo wtórnych efektów biologicznych wiązania, jaki omówiono powyżej. Taki sposób może być szczególnie użyteczny w identyfikacji nowych członków rodziny liganda TIE albo, w przemyśle farmaceutycznym, do przesiewu wielkiego zakresu cząsteczek peptydowych lub niepeptydowych (np. naśladowców peptydowych) pod względem aktywności biologicznej związanej z TIE, W zalecanej, konkretnej, nieograniczającej postaci realizacji wynalazku, można sporządzić wielką sieć studzienek hodowlanych, które zawuerają. w przeciwległych rządkach, komórki PC 12 (lub fibroblasty, patrz poniżej), będące albo tie-ujemne albo tak skonstruowane, aby były tie-dodatnimi. Następnie można dodawać rozmaite cząsteczki testowe tak, ze każda kolumna w sieci lub jej część, zawiera różne cząsteczki testowe. Każdą studzienkę można potem ocenić ilościowo pod względem obecności lub nieobecności wzrostu i/lub różnicowania. W ten sposób można przesiać niezwykle wielką liczbę cząsteczek testowych, pod względem takiej aktywności.

Wynalazek umożliwia tez sposoby detekcji lub pomiaru aktywności podobnej do liganda TIE lub identyfikacji cząsteczki jako mającej taką aktywność, obejmujące (i) ekspozycję cząsteczki testowej na białko receptora TIE in vitro w warunkach, które pozwalają na wystąpienie wiązania, oraz (ii) detekcję wiązania cząsteczki testowej z białkiem receptora TIE, w którym wiązanie cząsteczki testowej z receptorem TIE koreluje z aktywnością podobną do liganda TIE. Zgodnie z takimi sposobami, receptor TIE może lub nie, być zasadniczo oczyszczony, może być utrwalony na stałym podłożu (np. jak kolumna powinowactwa lub jak test ELISA) albo może być wprowadzony do sztucznej błony. Wiązanie cząsteczki testowej można

189 639 ocenić każdą metodą znaną w tej dziedzinie. W zalecanych postaciach realizacji, wiązanie cząsteczki testowej można wykrywać lub mierzyć przez ocenę jej zdolności do współzawodniczenia za znakowanymi znanymi Ugandami TlE pod względem wiązania receptora TIE.

Wynalazek umożliwia także detekcję zdolności cząsteczki testowej do działania jako antagonisty o aktywności podobnej do liganda TIE, obejmujący detekcję zdolności cząsteczki do hamowania wpływu wiązania liganda TIE z receptorem TIE, na komórkę, wykazującą ekspresję receptora. Taki antagonista może lub nie, zakłócać wiązanie receptor Tffi/modyfikowany ligand TIE-2. Wpływ wiązania modyfikowanego liganda TIE-2 z receptorem TIE jest korzystnie wpływem biologicznym lub biochemicznym, włączając, lecz bez ograniczenia, przeżycie komórki lub różnicowanie, transformację komórkową, indukcję bezpośredniego wczesnego genu lub fosforylację TIE.

Wynalazek zapewnia dalej zarówno sposób identyfikacji przeciwciał jak i innych cząsteczek zdolnych do zobojętniania liganda lub blokowania wiązania z receptorem, jak również cząsteczek zidentyfikowanych sposobem. Sposób można przeprowadzić poprzez test, który jest zasadniczo podobny do testu ELISA. Przykładowo, ciałko receptorowe TIE można związać ze stałym podłożem, takim jak plastikowa płytka o wielu studzienkach. Jako kontrolę, można potem wprowadzić znaną ilość modyfikowanego liganda TIE-2, którą oznakowano Myc i następnie można identyfikować każdy oznakowany modyfikowany ligand TIE-2, który wiąże ciałko receptorowe, przez przeciwciało reporterowe skierowane przeciw oznakowaniu Myc. Ten układ testowy można następnie stosować do przesiewu próbek pod względem cząsteczek zdolnych do i) wiązania z oznaczonym ligandem lub ii) wiązania z ciałkiem receptorowym i przez blokowania wiązania z ciałkiem receptorowym przez oznaczony ligand. Przykładowo, próbkę testową zawierającą przypuszczalną interesującą cząsteczkę razem ze znaną ilością oznaczonego liganda, można wprowadzić do studzienki i mierzyć ilość oznaczonego liganda, który wiąże ciałko receptorowe. Przez porównanie ilości związanego oznaczonego liganda w próbce testowej z ilością w kontroli, można zidentyfikować próbki, zawierające cząsteczki zdolne do blokowania wiązania liganda z receptorem. Cząsteczki interesujące zidentyfikowane w ten sposób, można wyodrębnić przy użyciu metod dobrze znanych fachowcowi.

Po znalezieniu blokera wiązania liganda, fachowiec będzie umiał przeprowadzić drugorzędne testy, określające, czy bloker wiąże receptor, czy ligand, jak również testy, określające czy cząsteczka blokera może zobojętnić aktywność biologiczną liganda. Przykładowo, przez użycie testu wiązania, które wykorzystuje technologię bioczujnika BIAcore (lub równoważną), w której albo ciałko receptorowe TIE albo ciałko ligandowe modyfikowanego liganda TIE-2, łączy się kowalentnie ze stałym podłożem (np. dekstranem karboksymetylu na powierzchni złota), fachowiec będzie zdolny do określenia, czy cząsteczka blokera wiąże specyficznie ligand, ciałko ligandowe lub ciałko receptorowe. Aby określić, czy cząsteczka blokera może zobojętnić aktywność biologiczną liganda, fachowiec będzie umiał przeprowadzić test fosforylacji (patrz przykład 5) lub alternatywnie, funkcjonalny biotest, taki jak test przeżycia, przez użycie kultur pierwotnych, np. komórek śródbłonka. Alternatywnie, cząsteczka blokera, która wiąże ciałko receptorowe może być agonistą i fachowiec wiedziałby jak go określić przez przeprowadzenie odpowiedniego testu identyfikacji dodatkowych agonistów receptora TIE.

Oprócz tego, wynalazek dostarcza kompozycje, w których ligand TIE jest domeną wiążącą receptor liganda TIE-2 opisanego w niniejszym. Przykładowo, ligand 1 TIE-2 zawiera domenę „skłębionej spirali” (rozpoczynająca się przy końcu 5' i rozciągająca się do nukleotydu w pobliżu pozycji 1160 z fig. 4 i około pozycji 1157 z fig. 5) i domenę podobną do fibrynogenu (którą koduje sekwencja nukleotydową z fig. 4, rozpoczynająca się około pozycji 1161 i około pozycji 1158 z fig. 5). Domenę podobną do fibrynogenu liganda 2 TIE-2 uważa się za rozpoczynającą się na albo koło tej samej sekwencji aminokwasowej jak w ligandzie 1 (FRDCA), która koduje nukleotydy, rozpoczynające się około 1197 z fig. 6. Domenę podobną do fibrynogenu liganda-3 TIE uważa się za rozpoczynającą się na lub koło sekwencji aminokwasowej kodowanej przez nukleotydy, zaczynające się koło pozycji 929 jak przedłożono w fig. 21. Multimeryzacja domeny zwiniętej spirali podczas wytwarzania liganda, utrudnia

189 639 oczyszczanie. Jak opisano w przykładzie 19, Zgłaszający odkryli jednak, że domena podobna do fibrynogenu zawiera domenę wiązania receptora TIE-2. Nie wydaje się jednak, że monamęryezne postacie domeny podobnej do fibrynogenu wiążą receptor. Badania, wykorzystujące domenę podobną do fibrynogenu aznacdaną myc, którą „skupiono” przy użyciu przeciwciał anty-myc, wiążą receptor TIE-2. [Metody wytwńrdaoia „skupionych” ligandów i ciałek ligandowych opisano u Davisa i in., Science 266: 816-819 (1994)]. Na podstawie tych odkryć, Zgłaszający wytworzył „ciałka ligandowe”, obejmujące domenę podobną do fibrynagęou ligńoSów TIE-2 sprzężone z domeną Fc IgG („fFc's”). Te ciałka ligandawe, które tworzą Simęry, skutecznie wiążą receptor TIE-2. W związku z tym, niniejszy wynalazek przewiduje wytwarzanie ciałek ligandowych modyfikowanego Uganda TIE, które można stosować jako środków kierujących dla guzów i/lub towarzysdąeęga uoaedyoięnia, w którym wskazuje się antagonistę TIE.

Wynalazek niniejszy opisuje także wykorzystanie liganda, jego fragmentu lub poehoSnej albo innej cząsteczki, będącej agonistą lub antagonistą receptora, jako środka terapeutycznego do lęcdęnia pacjentów, cierpiących z powodu schorzeń związanych z komórkami, tkankami lub narządami, wykazującymi ekspresję receptora TIE. Takie cząsteczki można stosować w sposobie lęcdęoia ciała ludzkiego lub zwierzęcego albo w sposobie diagnozowania.

Ponieważ receptor TIE zidkntyfikawαna w związku z komórkami śródbłonka oraz, jak tu pakadana, blokowanie liganda 1 TIE-2 okazuje się zapobiegać unaezynieniu. Zgłaszający oczekują, że opisany w niniejszym modyfikowany ligand TIE-2 może być użyteczny w indukcji unaezynienia w chorobach lub schorzeniach, gdzie takie uoαcdyoięnię jest wskazane. Takimi chorobami lub schorzeniami są gojenie zranień, niedokrwienie i cukrzyca. Ligandy można testować w modelach zwierzęcych i stosować leedoicdo jak opisano dla innych czynników, tak jak czynnika wzrostu śródbłssoka naczyniowego (VEGF), drugiego czynnika specyficznego dla komórek śródbłonke, który jest angiagęoiedny. Ferrara i in., opis patentowy U.S. nr 5 332 671, opublikowany 26 lipca 1994. Odnośnik Ferrary, jak również mne badania opisują badania in vitro oraz in vivo, które można stosować do pokadaoia wpływu cdyonika angiogęoieznęgo na wzmacnianie przepływu krwi do mięśnia sercowego po niedokrwieniu, wzmacnianie gojenia rany i w innych układach terapeutycznych, w których pożądana jest nowa angiagęoęda. [Patrz Sudo i in., Europejskie zgłoszenie patentowe 0 550 296 A2, opublikowane 7 lipca, 1993; Banai i in., Circulatian 89:2183-2189 (1994); Unger i in., Am. J. Physiol. 266: H1588-H1595 (1994); Lazarous i in., Circulatian 91: 145-153 (1995)]. Według wynalazku, modyfikowany ligand TIE-2 można stosować pojeSyncda lub w połączeniu z jednym lub więcej dodatkowych farmaeeutycdnię aktywnych związków, np. VEGF lub czynnikiem wzrostu fibrablastów zasadowych (bFGF), a także cytokinami, neutrofioαmi, itd.

Odwrotnie, antagoniści receptora TIE, które wiążą lecz nie aktywują receptora jak opisano w niniejszym wynalazku ciałka receptorowe jakie opisano w niniejszych przykładach 2 i 3 oraz ligand 2 TIE-2, jak opisano w przykładzie 9, byłby użyteczni do zapobiegania lub osłabiania unaedyoieoia, zapobiegając w ten sposób lub osłabiając np. wzrost guza. Czynniki te mazne stosować pojedynczo lub w połączeniu z innymi kompozycjami, takimi jak przeciwciała anty-VEGF, które jak się okazało są użyteczne w leczeniu stanów, w których intęocją terapeutyczną jest blokowanie angiagenedy. Zgłaszający oczekują, że modyfikowany ligand TIE-2 opisany niniejszym można także stosować w połączeniu ze środkami, takimi jak antagoniści cytokin, tak jak antagoniści IL-6, o których wiadomo, że blokują zapalenie.

Przykładowo, Zgłaszający określili, że ligandy TIE podlegają ekspresji w komórkach wewnątrz, lub blisko związanymi z guzami. Przykładowo, okazało się, że ligand 2 TIE-2 jest ściśle związany z komórkami śródbłonka guza. W związku z tym, ten i inni antagoniści TIE mogą być także użytecznymi w zapobieganiu lub osłabianiu np. wzrostu guza. Oprócz tego, ligandy TIE lub ciałka liganSowę mogą być użyteczne przy dostarczaniu toksyn do komórek, niosących receptor. Alternatywnie, inne cząsteczki, takie jak ezyoniki wzrostu, cytokiny lub składniki odzywcze, mazoa dostarczyć do komórek, niosących receptor TIE, poprzez ligandy lub ciałka ligaoSawe TIE. Ligandy TIE lub ciałka ligandawk, takie jak modyfikowany ligand TIE-2 można także stosować jako odczynniki Siagnastycdoe pod względem receptora TIE, do wykrywania receptora in vivo lub in vitro. Jeśli receptor TIE towarzyszy stanowi chorobowemu,

189 639 ligandy lub ciałka ligandowe TIE, takie jak modyfikowany ligand TIE-2, mogą być użyteczne jako odczynniki diagnostyczne do wykrywania choroby, np. przez barwienie tkanki lub obrazowanie całego organizmu. Takie odczynniki obejmują radioizotopy, fluorochromy, barwniki, enzymy i biotynę. Takie czynniki diagnostyczne lub nakierowujące można wytwarzać zgodnie z opisem Alitalo i in., WO 95/26364 opublikowanym 5 października 1995 oraz F.Burrowsa i P. Thorpe'a, PNAS (USA) 90:8996-9000 (1993), które załącza się niniejszym w całości.

W innych postaciach realizacji, ligandy TIE, aktywujący receptor modyfikowany ligand TIE-2 opisany niniejszym, stosuje się jako czynniki krwiotwórcze. Różne czynniki krwiotwórcze i ich receptory wiążą się z proliferacją i/lub różnicowaniem i/lub migracją różnych rodzajów komórek zawartych we krwi. Ponieważ receptory TIE podlegają ekspresji we wczesnych komórkach krwiotwórczych, oczekuje się, ze ligandy TIE odgrywają porównywalną rolę w proliferacji lub różnicowaniu albo migracji tych komórek. Tak więc, np. kompozycje, zwierające TIE można wytworzyć testować, badać w układach biologicznych in vitro oraz in νινο i stosować leczniczo, jak opisano w jakimkolwiek z następujących: Sousa opis patentowy U.S. nr 4 810 643, Lee i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4360-4364 (1985), Wong i in., Science, 228: 810-814 (1985); Yokota i in., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81: 1070 (1984); Bosselman i in., WO 9105795 opublikowane 2 maja 1991, zatytułowane „Stern Cell Factor” oraz Kirkness i in., WO 95/19985 opublikowane 27 lipca 1995 zatytułowane „Haemopoietic Maturation Factor”. W związku z tym aktywujący receptor modyfikowany ligand TIE-2 można stosować do diagnozowania lub leczenia stanów, w których zahamowane jest normalne tworzenie się krwinek, włączając, lecz bez ograniczenia, anemię, małopłytkowość, leukopenię i granulocytopenię. W zalecanej postaci realizacji, aktywujący receptor modyfikowany ligand TIE-2 można stosować do stymulacji różnicowania prekursorów krwinek w sytuacjach, w których pacjent choruje na chorobę, taką jak zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), powodujący zmniejszenie normalnego poziomu krwinek, albo w układach klinicznych, w których pożądane jest wzmocnienie populacji krwiotwórczej, tak jak w połączeniu z przeszczepem szpiku kostnego lub w leczeniu aplazji lub zahamowania czynności szpiku kostnego spowodowanego promieniowaniem, leczeniem chemicznym lub chemoterapią.

Modyfikowany ligand TIE-2 aktywujący opisany receptor można stosować pojedynczo lub w połączeniu z innym czynnikiem aktywnym farmaceutycznie, takim jak np. cytokiny, neutrofiny, intereleukiny, itd. W zalecanej postaci realizacji, ligandy można stosować w połączeniu z każdym z licznych czynników wymienionych powyżej, o których wiadomo, że indukują proliferację komórek macierzystych lub innych prekursorów krwiotwórczych, albo czynników, działających na późniejsze komórki w szlaku krwiotwórczym, włączając, lecz bez ograniczenia, krwiotwórczy czynnik dojrzewania, trombopoetynę, czynnik komórek macierzystych, erytropoetynę, G-CSF, GM-CSF itd.

W alternatywnej postaci realizacji, antagonistów receptora TIE stosuje się diagnozowania lub leczenia pacjentów, u których pożądana jest inhibicja szlaku krwiotwórczego, tak jak przy leczeniu schorzeń proliferacyjnych szpiku lub innych proliferacyjnych schorzeń narządów, tworzących krew, tak jak trombocytemia, policytemia i białaczki. W takich postaciach realizacji, leczenie może obejmować stosowanie terapeutycznie skutecznej ilości modyfikowanego liganda TIE-2, przeciwciała TIE, ciałka receptorowego TIE, koniugata modyfikowanego liganda TIE-2 lub ciałka ligandowego albo fFC, jakie opisano niniejszym.

Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycje farmaceutyczne, zawierające modyfikowany ligand TIE-2 albo ciałka ligandowe opisane niniejszym, ich fragmenty peptydowe lub pochodne w farmakologicznie dopuszczalnym nośniku. Białka modyfikowanego liganda TIE-2, fragmenty peptydowe lub pochodne, można podawać układowo lub miejscowo. Można stosować każdy odpowiedni sposób podawania znany w tej dziedzinie, włączając, lecz bez ograniczenia dożylny, dokanałowy, dotętniczy, donosowy, doustny, podskórny, dootrzewnowy łub przez miejscowe injekcje albo wszczep chirurgiczny. Przewiduje się także preparaty o przedłużonym uwalnianiu.

Niniejszy wynalazek przewiduje także przeciwciało, które specyficznie wiąże taką cząsteczkę terapeutyczną. Przeciwciało może być monoklonalne lub poliklonalne. Wynalazek przewiduje także sposób zastosowania takiego przeciwciała monoklonalnego lub poliklonalnego

189 639 do pomiaru ilości cząsteczki terapeutycznej w próbce pobranej od pacjenta do celów monitoringu przebiegu terapii.

Wynalazek przewiduje dalej kompozycję terapeutyczną, zawierającą modyfikowany ligand TIE-2 albo ciałko ligandowe oraz środek cytotoksyczny z nim sprzężony. W jednej postaci realizacji, środkiem cytotoksycznym może być radioizotop lub toksyna.

Wynalazek przewiduje także przeciwciało, które specyficznie wiąże modyfikowany ligand TIE-2. Przeciwciało może być monoklonalne lub poliklonalne.

Wynalazek przewiduje także sposób oczyszczania modyfikowanego liganda TIE-2, obejmujący:

a) sprzęganie co najmniej jednego substratu wiążącego TIE ze stałą macierzą;

b) inkubację substratu a) z lizatem komórkowym tak, że substrat tworzy kompleks z każdym modyfikowanym ligandem TIE-2 w lizacie komórkowym;

c) przemycie stałej macierzy;

oraz d) elucję modyfikowanego liganda TIE-2 ze sprzężonego substratu.

Substratem może być każda substancja, która specyficznie wiąże modyfikowany ligand TIE-2. W jednej postaci realizacji, substrat wybiera się z grupy, składającej się z przeciwciała anty-modyfikowanego liganda TIE-2, receptora TIE i ciałka receptorowego TEE. Wynalazek przewiduje dalej ciałko receptorowe, które specyficznie wiąże modyfikowany ligand TIE-2, jak również kompozycję terapeutyczną, zawierającą ciałko receptorowe w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, oraz sposób blokowania wzrostu naczyń krwionośnych u człowieka, obejmujący podawanie skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej.

Wynalazek przewiduje także kompozycję terapeutyczną, zawierającą modyfikowany ligand TIE-2 albo ciałko ligandowe w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, jak również sposób pobudzania nowo-unaczynienia u pacjenta, obejmujący podawanie pacjentowi skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej.

Poza tym, niniejszy wynalazek przewiduje sposób identyfikacji komórki, która wykazuje ekspresję receptora TIE, obejmujący zetknięcie komórki ze znakowanym w sposób wykrywalny modyfikowanym ligandem TIE-2 albo ciałkiem ligandowym, w warunkach, pozwalających na wiązanie znakowanego w sposób wykrywalny liganda z receptorem TIE i określenie, czy znakowany w sposób wykrywalny receptor TIE związał się z receptorem, identyfikując przez to komórkę jako tę, która wykazuje ekspresję receptora TIE. Niniejszy wynalazek przewiduje także kompozycje terapeutyczną, zawierającą modyfikowany ligand TIE-2 albo ciałko ligandowe oraz sprzężony z nim czynnik cytotoksyczny.

Czynnikiem cytotoksycznym może być radioizotop lub toksyna.

Wynalazek przewiduje także sposób detekcji ekspresji modyfikowanego liganda TIE-2 przez komórkę, który obejmuje otrzymanie mRNA z komórki, zetknięcie tak otrzymanego mRNA z oznakowaną cząsteczką kwasu nukleinowego, kodującego modyfikowany ligand TIE-2, w warunkach hybrydyzacji, określenie obecności zhybrydyzowanego mRNA z oznakowaną cząsteczką, a przez to wykrycie ekspresji modyfikowanego liganda TIE-2 w komórce.

Wynalazek zapewnia dalej sposób wykrywania ekspresji modyfikowanego liganda TIE-2 w przekrojach tkankowych, który obejmuje zetknięcie przekrojów tkankowych z oznakowaną cząsteczlką kwasu nukleinowego, kodującą modyfikowany ligand TIE-2 w warunkach hybrydyzacji, określenie obecności zhybrydyzowanego mRNA z oznakowaną cząsteczką, a przez to wykrycie ekspresji modyfikowanego liganda TLE-2 w przekrojach tkankowych.

Przykład 1- Identyfikacja linii komórkowej ABAE, jako komórek reporterowych dla receptora TIE-2

Dorosłe komórki BAE zarejestrowano w Europejskiej Składnicy Kultur Komórkowych pod numerem ECACC#92010601. (Patrz PNAS 75:2621 (1978)). Analizy Nothem (RNA) ujawniły średni poziom transkryptów tie-2 w linii komórkowej ABAE (dorosła bydlęca śródbłonka tętnic), zgodnie z wynikami hybrydyzacji in situ, które pokazały prawie wyłączną lokalizację RNA tie-2 w komórkach śródbłonka naczyniowego. Zbadaliśmy zatem lizaty komórkowe ABAE pod względem obecności białka TIE-2, jak również obszar, na jakim to białko TIE-2 ulega fosforylacji tyrozynowej w normalnych warunkach wzrostu przeciwko warunkom pozbawienia surowicy. Lizaty komórkowe ABAE zebrano i poddano immunoprecypitacji,

189 639 po czym analizom Western blot białek po immunoprepicytacji z antyserami specyficznymi dla TIE-2 oraz specyficznymi dla fosfotyrozyny. Ominięcie lub wtrącenie peptydów TIE-2 jako cząsteczek specyficznie blokujących podczas immunoprecypitacji TIE-2 pozwoliło na jednoznaczną identyfikację TIE-2 jako białka średnio wykrywalnego o ~150 kD, którego ustalony poziom fosfotyrozyny zmniejsza się do prawie nie wykrywalnego poziomu przez wcześniejsze pozbawienie komórek surowicy.

Hodowla komórek ABAE i zbiór lizatów komórkowych wykonano następująco. Komórki ABAE o małej liczbie pasazowania umieszczono na płytce jako pojedynczą warstwę o gęstości 2 x 10⁶ komórek/150 mm plastikową płytkę Petriego (Falcon) i hodowano w pożywce Dulbecco modyfikowanej przez Eagle'a (DMEM), zawierającej 10% bydlęcej surowicy cielęcej (10% BGS), 2 mM L-glutaminy (Q) i penicylinę oraz streptomycynę, każda po 1%o (P-S) w atmosferze, zawierającej 5% CO2. Przed zbiorem lizatów komórkowych, komórki pozbawiono surowicy na 24 godziny w DMEM/Q/P-S, po czym aspirowano pożywkę i przemyto płytki lodowatą solanką buforowaną fosforanem (PBS) uzupełnioną ortowanadanem sodu, fluorkiem sodu i benzamidyną. Komórki poddano lizie w małej objętości tego buforu przemywającego, który uzupełniono 1%o detergenta NP40 oraz inhibitorami proteazy PMSF i aprotyniną. Nierozpuszczalne resztki komórkowe usunięto z lizatów komórkowych przez wirowanie przy 14 000 xG przez 10 minut, w temperaturze 4°C i supematanty poddano immunoprecypitacji z antyserami specyficznymi dla receptora TIE-2, przy obecności albo nieobecności peptydów blokujących dodanych do -20 pg/ml lizatu. Białka po immunoprecypitacj i rozpuszczono przez PAGE (7,5% zel Laemmli), a następnie poddano elektrotransferowi na błonę PVDF i irikubowano albo z różnymi TIE-2 albo antyserami specyficznymi dla fosfotyrozyny. Białko TIE-2 uwidoczniono przez inkubację błony z wtórnymi antyserami połączonymi z HRP, po czym traktowano odczynnikiem ECL (Amersham).

Przykład 2 - Kloning i ekspresja ciałka receptorowego TIE-2 do badań interakcji liganda TIE-2 na podstawie powinowactwa

Utworzono konstrukcję ekspresji, która dawałaby wydzielone białko, składające się z całej części zewnątrzkomórkowej szczurzego receptora TIE-2 połączonego przez fuzję z ludzkim stałym regionem immunoglobuliny gamma-1 (IgG1 Fc). To białko fuzyjne nazywa się „ciałkiem receptorowym” TIE-2 (RB) i oczekuje się, że będzie normalnie istnieć jako dimer w roztworze, w oparciu o tworzenie się wiązań disiarczkowych między poszczególnymi ogonkami IgG1 Fc. Część Fc ludzkiej IgG1, która rozciąga się od regionu zawiasowego do końca karboksylowego białka, powielono z cDNA ludzkiego łożyska przez PGR, za pomocą oligonukleotydowe, odpowiadających opublikowanej sekwencji ludzkiej IgG1; uzyskany fragment DNA klonowano w wektorze plazmidowym. Odpowiednie fragmenty restrykcyjne DNA z plazmidu, kodującego receptor TIE-2 o pełnej długości i z plazmidu ludzkiej IgG1 Fc, poddano ligacji w obu miejscach krótkiego fragmentu pochodzącego z PGR, który przeznaczono do fuzji, w ramce, z sekwencjami, kodującymi białko TIE-2 i ludzką IgG1 Fc. W ten sposób otrzymane białko fuzyjne ektodomena TIE-2-Fc dokładnie podstawiono IgG1 Fc w miejsce regionu, obejmującego domeny transbłonową TIE-2 i cytoplazmatyczną. Alternatywną metodę wytwarzania RB opisano u Goodwina i in., Cell 73: 447-456 (1993).

Miligramowe ilości RB TIE-2 otrzymano przez kloning fragmentu DNA RB TIE-2 do wektora bakulowirusa pVL1393 i następnym zakazeniu owadziej linii komórkowej Spodoptera frugiperda SF-21AE. Alternatywnie można stosować linię komórkową SF-9 (ATCC numer dostępu CRL-1711) lub linie komórkową BTI-TN5bl-4. DNA, kodujący TIE-2 Rb klonowano jako fragment EcoRI-Notl do plazmidu transferowego bakulowirusa pVL1393. DNA plazmidu oczyszczony przez wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu, rekombinowano do DNA wirusa przez mieszanie 3 pg DNA plazmidu z 0,5 pg DNA Baculo-Gold (Pharminigen), po czym wprowadzono do liposomów, przy użyciu 30 pe Lipofectin (GIBCO-BRL). Mieszaniny DNA-liposom dodano do komórek SF-21AE (2x 1(0¹ komórek/60 mm płytkę) w pożywce TMN-FH (modyfikowana pożywka komórek owadzich Grace'a (GIBCO-BRL)) przez 5 godzin w temperaturze 27°C, po czym inkubowano w temperaturze 27°C przez 5 dni w pożywce TMN-FH uzupełnionej 5% surowicą płodu cielęcego. Pożywkę hodowli tkankowej zebrano przy użyciu metod opisanych wcześniej (D.R.O'Reilly, L.K. Miller i Y.A.Luckow,

189 639

Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, Nowy Jork: W.H.Freeman, z takim wyjątkiem, że nalana warstwa agarozowa zawierała 125 pg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-lndolilo-β-D-galaktopiranoęyd; GffiCO-BRL). Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 27°C, nie rekombinowane łysinki oceniono ilościowo przez dodatnią reakcję chromogeniczną wobec substratu X-gal i zaznaczono ich pozycje. Łysinki rekombinowane uwidoczniono potem przez dodanie drugiej nadlewki, zawierającej 100 pg/ml MTT (bromku 3-[4,5-dimetyiotiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolium; Sigma). Łysinki z przypuszczalnie rekombinowanym wirusem zebrano przez podłączenie aspiracji i oczyszczono przez wydorębnianie z wielokrotnym okrążeniem łysinek, aby zapewnić jednorodność. Utworzono zbiory wirusów przez seryjne pasażowanie z niską wielokrotnością oczyszczonych łysinek wirusa. Wytworzono zbiory o niskim pasaźowaniu jednego klonu wirusa (ciałko receptorowe vTIE-2).

Komórki SF-21AE hodowano w pożywce pozbawionej surowicy (SF-900 II, Gibco BRL), zawierającej IX roztworu antybiotyk/środek przeciwgrzybowy (Gibco BRL) i 25 mg/litr Gentamycyny (Gibco BRL). Jako środek powierzchniowo czynny dodano Pluronic F-68 do końcowego stężenia, wynoszącego 1 g/litr. Hodowlę (4 litry) pobudzono w bioreaktorze (Artisan Cell Station System) przez, co najmniej trzy dni przed infekcją. Komórki hodowano w temperaturze 27°C, przy traktowaniu rozpuszczonym 50% tlenem, przy prędkości przepływu gazu, wynoszącym 80 ml/minutę (napowietrzanie przy pierścieniu zraszającym). Mieszano za pomocą wirnika okrętowego przy prędkości 100 obrotów na minutę. Komórki zebrano w fazie wzrostu środkowo-logarytmicznej (~2 XI O⁶ komórek/ml), zatężono przez wirowanie i zakażono 5 jednostkami tworzącymi łysinki ciałka receptorowego vTIE-2 na komórkę. Komórki i szczep doprowadzono do 400 ml za pomocą świeżej pożywki i wirus adsorbował przez 2 godziny w temperaturze 27°C w obracanej kolbie. Następnie hodowlę zawieszono ponownie w końcowej objętości 8 litrów świeżej pożywki pozbawionej surowicy, a komórki inkubowano w bioreaktorze stosując wcześniej opisane warunki.

Pożywkę hodowlaną komórek SF21AE infekowanych ciałkiem receptorowym vTIE-2 zebrano przez wirowanie (500 x g, 10 minut) 72 godziny po infekcji. Supematanty komórkowe doprowadzono do pH 8 za pomocą NaOH. Dodano EDTA do końcowego stężenia 10 mM i pH supematantów ponownie wyregulowano na 8. Supematanty przesączono (0,45 pm, Millipore) i załadowano na kolumnę A dla białek (protein A sepharose 4 fast flow albo HiTrap protein A, oba od Pharmacia). Kolumnę przemyto PBS, zawierającym 0,5 M NaCl dotąd, az absorbancja przy 280 nm zmniejszyła się do linii podstawowej. Kolumnę przemyto w PBS i wymywano 0,5 M kwasem octowym. Frakcje kolumnowe natychmiast zobojętniono przez elucję do rur, zawierających 1 M Tris pH 9. Frakcje szczytowe, zawierające ciałko receptorowe TIE-2 zlano i dializowano przeciw PBS.

Przykład 3 - Ukazanie, ze TIE-2 odgrywa krytyczną rolę w rozwoju unaczynienia

Zyskano wgląd w działanie TIE-2 przez wprowadzenie „nadmiaru” rozpuszczalnego ciałka receptorowego TIE-2 (TIE-2 RB) do rozwijającego się układu. Potencjalna zdolność wiązania TIE-2 RB, a przez to zobojętniania dostępnego liganda TIE-2 mogłaby być wynikiem możliwego do zaobserwowania przerwania normalnego rozwoju unaczynienia i charakteryzacji liganda. Aby zbadać, czy TIE-2 RB możnaby użyć do przerwania rozwoju unaczynienia u wczesnych zarodków kurzych, małe kawałki pianki zdolnej do wchłaniania biologicznego nasycono TIE-2 RB i wprowadzono bezpośrednio poniżej błony kosmówki omoczniowej w pozycji tuż z boku w stosunku do prymitywnego zarodka.

Wczesne zarodki kurze rozwijają się na szczycie żółtka z małej płytki komórek, którą przykrywa błona kosmówki omoczniowej (CAM). Komórki śródbłonea, które staną się wyściólką unaczynienia zarodka, powstają ze źródeł komórkowych zarówno zewnątrz- jak i wewnątrz zarodkowych. Komórki śródbłonka pochodzące z zewnątrz zarodka, które zapewniają główne źródło komórek śródbłonkowych w zarodku, pochodzą z narastania mezenchymy umieszczonego bocznie wokół przedniej części zarodka, tuż pod CAM. Gdy te komórki mezenchymy dojrzeją, dają wzrost wspólnych potomków linii komórek zarówno śródbłonkowych jak i krwiotwórczych, określanych jako hemangioblast. Odwrotnie, hemangioblast daje wzrost mieszanej populacji angioblastów (potomstwa komórek śródbłonkowych) i hematoblastów (wielokierunkowy prekursor erwloiwórcęy). Tworzenie się zaczątków układu krążenia

189 639 rozpoczyna się, gdy potomne komórki śródbłonkowe rozdzielają się, tworząc pęcherzyk o grubości jednej komórki, otaczający pierwotne krwinki. Proliferacja i migracja tych składników komórkowych tworzy ewentualnie rozległą sieć mikronaczyń wypełnionych krwią, pod

CAM, która będzie ostatecznie wrastać do zarodka, łącząc się z ograniczonymi, pochodzącymi z wnętrza zarodka, elementami naczyń.

Świeżo zapłodnione jaja kurze otrzymane od Spafas, Inc. (Boston, MA), inkubowano w temperaturze 99,5°F (37,5°C), 55% wilgotności względnej. Po około 24 godzinach rozwoju, przetarto skorupę jaja 70% etanolem i użyto wiertła dentystycznego, aby wykonać 1,5 cm otwór w tępym końcu każdego jaja. Błonę wyściełającą skorupę usunięto, aby odsłonić przestrzeń powietrzną bezpośrednio nad zarodkiem. Małe kwadratowe kawałki jałowej Gelfoam (Upjohn) pocięto skalpelem i nasycono w równych stężeniach albo ciałka receptorowego TIE-2 albo EHK-1. Ciałko receptorowe EHK-1 wykonano tak jak przedłożono w przykładzie 2 przy użyciu zewnątrzkomórkowej domeny EHK-1 zamiast zewnątrzkomórkowej domeny TIE-2 (Maisonpierre i in., Oncogene 8: 3277-3288 (1993). Każdy kawałek Gelfoam absorbował około 6 pg białka w 30 μΐ. Jałowych szczypczyków zegarmistrzowskich użyto do wykonania małego rozerwania CAM w pozycji kilka milimetrów w bok w stosunku do pierwotnego zarodka. Większość kawałków Gelfoam nasyconej RB wprowadzono pod CAM i skorupę jaja uszczelniono kawałkiem taśmy klejącej. Inne jaja w podobnych etapach rozwoju traktowano równolegle RB niespokrewnionego receptora kinazy tyrozynowej podlegającego ekspresji w neuronach, EHK-1 (Maisonpierre i in., Oncogene 8: 3277-3288 (1993). Pozwolono na rozwój przez 4 dni i następnie zarodki zbadano przez inspekcję wzrokową. Zarodki usunięto przez ostrożne potłuczenie skorup na płytkach z ogrzanym PBS i ostrożne odcięcie zarodka z otaczającą CAM. Z 12 jaj traktowanych każdym RB, 6 zarodków traktowanych TIE-2 RB i 5 zarodków traktowanych EHK-1 RB rozwinęło się ponad etap obserwowany na początku doświadczenia. Dramatyczną różnicę zaobserwowano między tymi rozwiniętymi zarodkami, jaki ukazano w fig. 1A i 1B. Te traktowane EHK-1 RB okazały się być stosunkowo normalnie rozwinięte. Cztery z pięciu zarodków EHK-1 były żywe, co oceniono przez obecność bicia serca. Ponadto unaczynienie poza-zarodkowe, które jest wzrokowo wyraźne z powodu obecności krwinek czerwonych, było obfite i rozprzestrzenione kilka centymetrów w bok pod CAM. Przeciwnie, zarodki traktowane TIE-2 RB miały poważnie zahamowany wzrost, w zakresie 2-5 mm średnicy, w porównaniu z ponad 10 mm średnicy dla zarodków EHK-1 RB. Wszystkie zarodki traktowane TIE-2 były martwe, a ich CAM były pozbawione naczyń krwionośnych. Zdolność TIE-2 RB do blokowania rozwoju naczyń u kurcząt pokazuje, że ligand TIE-2 jest konieczny dla rozwoju unaczynienia.

Przykład 4 - Identyfikacja aktywności specyficznej dla TIE-2 w kondycjonowanej pożywce z mysiej linii komórkowej mioblastów C2C12 transformowanej onkogenem ras

Przesiew zatęzonych dziesięciokrotnie kondycjonowanych pożywek komórkowych (10X CCM) od różnych linii komórkowych, pod względem obecności rozpuszczalnej aktywności wiązania specyficznej dla TIE-2 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) ujawnił aktywność wiązania w pożywce pozbawionej surowicy z komórek C2C12 transformowanych onkogenem ras (C2C12-ras), RAT 2-ras, (która jest linią komórkową fibroblastów transformowaną ras), ludzkiego glejaka T98G oraz linii komórkowej ludzkiego nerwiaka niedojrzałego znanego jako SHEP-1.

C2C12-ras 10X CCM pochodziły od stabilnie transfekowanej linii mioblastów C2C12, które transformowano onkogenicznie przez transfekcję mutantem T-24 H-ras standardową metodą opartą o fosforan wapnia. Plazmid ekspresji z opornością na neomycynę na podstawie SV40 połączono fizycznie z plazmidem ekspresji ras w celu umożliwienia selekcji tranfekowanych klonów. Uzyskane komórki ras-C2C12 odporne na G418, rutynowo utrzymano jako pojedynczą warstwę na plastikowych płytkach w mieszaninie DMEM/glutamina/penicylinastreptomycyna uzupełnionej 10% surowicą płodu cielęcego (FCS). Wykonano pozbawione surowicy C2C12-ras 10X CCM, przez powleczenie komórek przy 60% konfluencji w określonych pożywkach pozbawionych surowicy, przez 12 godzin. [Zhan i Goldfarb, Mol. Celi. Biol. 6: 3541-3544 (1986)); Zhan i in., Oncogene 1: 369-376 (1987)]. Pożywkę usunięto i zastąpiono świeżą DMEM/Q/P-S, przez 24 godziny. Pożywkę tę zebrano i komórki ponownie

189 639 potraktowano świeżą DMEM/Q/P-S, którą także zebrano po dalszych 24 godzinach. Te CCM uzupełniono inhibitorami proteazy PMSF (1 mM) i aprotyniną (10 pg/ml), a dziesięciokrotne stężenie wykonano na jałowych błonach ekskluzji wielkościowej (Amicon). Aktywność wiązania TIE-2 moznaby zobojętnić przez inkubację pożywki z nadmiarem TIE-2 RB, lecz nie przez inkubację z EHK-1 RB, przed analizą BIAcore.

Aktywność wiązania 10x CCM mierzono przy użyciu technologii bioczujnika (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), który monitoruje interakcje w czasie rzeczywistym przez rezonans powierzchniowy plazmonu. Oczyszczone TIE-2 Rb sprzężono kowalentnie przez aminy pierwszorzędowe z warstwą dekstranu karboksymetylu płytki czujnika klasy badawczej CM5 (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Powierzchnia płytki czujnika aktywowano przy użyciu mieszaniny N-hydroksysukcynoimidu (NHS) oraz N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC), po czym przez unieruchomienie TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) i deaktywację miejsc, które nie przereagowały 1,0 M etanoloaminą (pH 8,5). Powierzchniową kontrolę ujemną ciałka receptorowego EHK-1 wytworzono w podobny sposób.

Buforem do przebiegu stosowany w układzie był HBS (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% środek powierzchniowo czynny P20, pH 7,4). Próbki 10x CCM wirowano przez 15 minut w temperaturę 4°C i dalej sklarowano przy użyciu jałowego filtru wiążącego małe białka 0,45 pm (Millipore; Bedford, MA). Dekstran (2 mg/ml) i środek powierzchniowo czynny P20 (0,005%) dodano do każdej próbki CCM. Równe ilości 40 pl wstrzyknięto przez unieruchomioną powierzchnię (albo TIE-2 albo EHK-1) przy prędkości przepływu 5 pl/minutę, i monitorowano wiązanie receptora przez 8 minut. Aktywność wiązania (jednostki rezonansowe, RU) mierzono jako różnicę między wartością linii podstawowej 30 sekund przed injekcją próbki, a pomiarem pobranym 30 sekund po injekcji. Regenerację powierzchni uzyskano za pomocą jednego pulsu 12 pl 3 M MgCf.

Poziom hałasu przyrządu wynosi 20 RU; zatem każda aktywność wiązania o sygnale powyżej 20 RU można interpretować jako rzeczywistą interakcje z receptorem. Dla kondycjonowanych pożywek C2C12-ras, aktywności wiązania wchodziły w zakres 60-90 RU dla TIE-2 RB unieruchomionego powierzchniowo. Dla takich samych próbek testowanych na powierzchniowo unieruchomionego EHK-1 RB, pomiary aktywności były mniejsze niż 36 RU. Specyficzne wiązanie z ciałkiem receptorowym TIE-2 oceniono przez inkubację próbek z nadmiarem albo rozpuszczalnego TIE-2 albo EHK-1 RB przed testowaniem aktywności wiązania. Dodanie rozpuszczalnego EHK-1 RB nie miało wpływu na aktywność wiązania każdej z próbek, podczas gdy w obecności rozpuszczalnego TiE-2 wiązanie z powierzchnią jest o dwie-trzecie mniejsze niż zmierzone przy nieobecności TIE-2. Powtórzenie testu przy użyciu C2C12-ras CCM stężonych > 50x dało w wyniku czterokrotne wzmocnienie ponad tło, sygnału wiązania specyficznego TIE-2.

Przykład 5 - C2C12-ras CCM zawierają aktywność, która indukuje fosforylacje tyrozynową receptora TIE-2

C2C12-ras 10X CCM zbadano pod względem ich zdolności do indukcji fosforylacji tyrozynowej TIE-2 w komórkach ABAE. Komórki ABAE pozbawione surowicy inkubowano krótko z C2C12-ras CCM, poddano lizie i immunoprecypitacji oraz analizom Western, jak opisano powyżej. Stymulację komórek ABAE pozbawionych surowicy z C2C12-ras 10X CCM pozbawionych surowicy, wykonano następująco. Pożywkę z komórkami ABAE głodzoną jak opisano powyżej, usunięto i zamieniono albo na określoną pożywkę lub 10X CCM, którą wstępnie ogrzano do temperatury 37°C. Po 10 minutach, pożywki usunięto i komórki przepłukano dwukrotnie na lodzie z nadmiarem ochłodzonego PBS uzupełnionego ortowanadanem/NaF/benzamidyną. Lizę komórkową oraz immunoprecypitację specyficzną dla TIE-2 wykonano jak opisano powyżej.

Komórki ABAE inkubowano przez 10 minut z określoną pożywką, wykazującą brak indukcji fosforylacji tyrozynowej TIE-2, podczas gdy inkubacja z C2C12-ras CCM stymulowała, co najmniej 100 X wzrost fosforylacji TIE-2. Tę aktywność prawie całkowicie wyczerpano przez wstępną inkubację z C2C12-ras 10X CCM przez 90 minut w temperaturze pokojowej z 13 pg TlE-2 RB sprzęzonym z białkowymi kulkami G-Sepharose. Pożywki inkubowanej z samym białkiem G Sepharose nie pozbawiono tej aktywności fosforylacji.

189 639

Przykład 6 - Kloning ekspresji liganda TIE-2

Komórki COS-7 hodowano w pożywce Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (DMEM), zawierającej 10% surowicę płodu bydlęcego (FBS), po 1% penicyliny i streptomycyny (P/S) i 2 mM glutaminę w atmosferze 5% CO2. Mysią linię komórkową mioblastów C2C12 ras hodowano w minimalnej podstawowej pożywce Eagle'a (EMEM) z 10% FBS, (P/S) i 2 mM glutaminą. Klony cDNA o pełnej długości mysiego liganda TIE-2 uzyskano przez przesiew biblioteki cDNA C2C12 ras w wektorze pJFE14, podlegającym ekspresji w komórkach COS. Wektor ten, jak ukazano w fig. 2, jest modyfikowaną wersją wektora pSRa (Takebe i in., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Bibliotekę utworzono przy użyciu dwóch miejsc restrykcji BSTX1 w wektorze pJFE14.

Komórki COS-7 krótkotrwale transfekowano albo biblioteką pJFE14 albo wektorem kontrolnym z użyciem protokołu transfekcji DEAE-dekstran. W skrócie, komórki COS-7 powleczono przy gęstości 1,0 x 10⁶ komórek/100 mm płytki 24 godziny przed transfekcją. W celu transfekcji komórki hodowano w DMEM pozbawionej surowicy, zawierającej 400 μ g/ml DEAE-dekstran, 1 |iM chlorochiny i 2 mM glutaminę oraz 1 pg odpowiedniego DNA przez 3-4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Pożywki transfekcyjne aspirowano i zamieniono na PBS z 10% DMSO przez 2-3 minuty. Po tym „szoku” DMSO, komórki COS-7 umieszczono w DMEM z 10% FBS, po 1% penicyliny i streptomycyny oraz 2 mM glutaminą na 48 godzin.

Ponieważ ligand TIE-2 wydziela się, konieczne było uczynienie komórek przepuszczalnymi, w celu detekcji wiązania sondy ciałka receptorowego, z ligandem. Dwa dni po transfekcji, komórki przepłukano PBS, a następnie inkubowano z PBS, zawierającym 1,8% formaldehyd przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki następnie przemyto PBS i inkubowano przez 15 minut z PBS, zawierającym 0,1% Triton Χ-100 i 10% bydlęcą surowicę cielęcą, aby uczynić komórki przepuszczalnymi i zablokować miejsca wiązania nie specyficznego.

Przeprowadzono przesiew przez bezpośrednią lokalizację zabarwienia, przy użyciu ciałka receptorowego (RB) TIE-2, które składało się z zewnątrzkomórkowej domeny TIE-2 połączonej ze stałym regionem IgG1. To ciałko receptorowe wytworzono jak przedłożono w przykładzie 2. 100 mm płytkę transfekowanych, utrwalonych i przepuszczalnych komórek COS sondowano przez 30 minutową inkubację z TIE-2 RB. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS i inkubowano przez dodatkowe 30 minut z PBS/10% bydlęcą surowicą cielęcą/koniugatem anty-ludzka IgG-fosfatazą alkaliczną. Po trzykrotnym przemyciu PBS, komórki inkubowano w substracie fosfatazy alkalicznej przez 30-60 minut. Potem płytkę zbadano pod mikroskopem pod względem obecności zabarwionych komórek. Dla każdej zabarwionej komórki, zdrapano z płytki mały obszar komórek łącznie z komórką zabarwioną, przy użyciu plastikowej końcówki pipety, odzyskano DNA plazmidu i użyto do elektroporacji komórek bakteryjnych. Zebrano pojedyncze kolonie bakteryjne uzyskane z elektroporacji i DNA plazmidu wypreparowany z tych kolonii użyto do transfekcji komórek COS-7, które sondowano pod względem ekspresji liganda TIE-2, co wykazano przez wiązanie z ciałkami receptorowymi TIE-2. Potwierdzenie ekspresji liganda TIE-2 otrzymano przez fosforylację receptora TIE-2 przy użyciu metody przedłożonej w przykładzie 5. Klon plazmidowy, kodujący ligand TIE-2 złożono z ATCC 7 października 1994 i oznaczono jako „pJFE14, kodujący ligand TIE-2” z numerem dostępu ATCC 75910.

Przykład 7 - Izolacja i sekwencjonowanie klonu cDNA o pełnej długości, kodującego ludzki ligand TIE-2

Bibliotekę cDNA płuca płodu ludzkiego w lambda gt-10 (patrz fig. 3) uzyskano z Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Ca). Łysinki powleczono przy gęstości 1,25 x 106/20x20 cm płytkę i otrzymano filtry z kopiami po standardowych procedurach (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2-gie wydanie, strona 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork).

Izolację klonów ludzkiego liganda tie-2 przeprowadzono następująco. Fragment XhoI o 2,2 kb ze złożonego klonu liganda tie-2 (ATCC nr 75910 - patrz przykład 6 powyżej) oznakowano przez losowy priming do specyficznej aktywności, wynoszącej około 5x10⁸ cpm/ng.

189 639

Hybrydację przeprowadzono w temperaturze 65°C w roztworze hybrydyzacyjnym, zawierającym 0,5 mg/ml DNA spermy łososia. Filtry przemyto w temperaturze 65°C w 2 x SSC, 0,1% SDS i poddano ekspozycji na błonę Kodak XAR-5 przez noc, w temperaturze -70°C. Fagi dodatnie oczyszczono w fysinkach. Lizaty fagowe czystego faga o wysokich mianach użyto do izolacji DNA poprzez kolumnę Qiagen, przy użyciu standardowych technik (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, katalog 1995, strona 36). dNa faga trawiono EcoRI, aby uwolnić klonowany fragment cDNA w celu późniejszego subkloningu. Wektor faga lambda, zawierający DNA ludzkiego liganda tie-2 złożono z ATCC 26 października 1994 z oznaczeniem λ gt10, kodujący ligand 1 htie-2 (numer dostępu ATCC 75928). DNA faga można poddać bezpośrednio analizie sekwencji DNa metodą terminacji łańcucha dideoksy (Sanger i in., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467).

Subkloning DNA ludzkiego liganda tie-2 do wektora ekspresji ssaka można uzyskać następująco. Klon λ gt10, kodujący ligand 1 htie-2 zawiera miejsce EcoRI położone 490 par zasad w dół od początku sekwencji kodującej dla ludzkiego liganda TIE-2. Region kodujący można wyciąć, stosując unikalne miejsca restrykcji w górę i w dół odpowiednio od kodonów inicjatorowych i przestankowych. Przykładowo, miejsce SpeI, położone 70 bp 5' wobec kodonu inicjatorowego i miejsce Bpu1102i (znane także jako BlpI), położone 265 bp 3' wobec kodonu przestankowego, można stosować do wycięcia pełnego regionu kodującego. Można go potem subklonować do wektora kloningowego pJFE14, przy użyciu miejsc XbaI (zgodny z nawisem SpeI) i PstI (oba miejsca PstI i Bpu1102i wytworzono z lepkimi końcami).

Region kodujący z klonu λgt10, kodującego ligand 1 htie-2 sekwencjonowano przy użyciu sekwencera DNA ABI 373A oraz Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekwencję nukleotydową i wnioskowaną aminokwasową ludzkiego liganda TIE-2 z klonu λ gt10, kodującego ligand 1 tie-2, ukazano w fig. 4.

Oprócz tego, otrzymano pełnej długości klony cDNA ludzkiego ligada tie-2, przez skrining biblioteki cDNA ludzkiego glejaka T98G w wektorze pJEE14. Klony, kodujące ludzki ligand TIE-2 zidentyfikowano przez hybrydyzację DNA przy użyciu fragmentu Xhol o 2,2 kb ze złożonego klonu liganda tie-2 (ATCC nr 75910), jako sondy (patrz przykład 6 powyżej). Region kodujący sekwencjonowano przy użyciu sekwencera DNa ABI 373A oraz Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekwencja ta była prawie identyczna z otrzymaną z klonu λ gt10, kodującego ligand 1 htie-2. Jak ukazano w fig. 4, klon λgt10, kodujący ligand 1 htie-2 zawiera dodatkową resztę glicynową, kodowaną przez nukleotydy 1114-1116. Sekwencja kodująca klon T98G nie zawiera tej reszty glicynowej lecz z drugiej strony, jest identyczna z sekwencją kodującą klonu λgt10, kodującego ligand 1 htie-2. Fig. 5 ukazuje sekwencję nukleotydową i wnioskowaną aminokwasową ludzkiego liganda TIE-2 z klonu T98G

Przykład 8 - Izolacja i sekwencjonowanie drugiego klonu cDNA pełnej długości, kodującego ludzki ligand TIE-2

Bibliotekę cDNA płuca płodu ludzkiego w lambda gt-10 (patrz fig. 3) uzyskano z Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Łysinki powleczono przy gęstości 1,25 x 106/20x20 cm płytkę i otrzymano filtry z kopiami po standardowych procedurach (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie, strona 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork). Filtry z kopiami przesiano w warunkach niskiej surowości (2 x sSc, 55°C) za pomocą sond wykonanych wobec sekwencji ludzkiego liganda 1 TIE-2. jeden z powielonych filtrów sondowano sondą 5', 1 kodującą aminokwasy 25-265 ludzkiego liganda 1 TIE-2 jak przedłożono w fig. 4. Drugi powielony filtr sondowano sondą 3', kodującą aminokwasy 282-498 sekwencji ludzkiego liganda 1 TIE-2 (patrz fig. 4). Obie sondy hybrydyzowano w temperaturze 55°C w roztworze do hybrydyzacji, zawierającym 0,5 mg/ml DNA spermy łososia. Następnie filtry przemyto w 2 x SsC w temperaturze 55°C i poddano ekspozycji przez noc na błonę rentgenowską. Oprócz tego, filtry z kopiami hybrydyzowano także w normalnych warunkach (2 x SSC, 65°C) z sondą kodującą pełnej długości mysiego liganda 1 TIE-2 (F3-15, insert Xhol). Zebrano trzy dodatnie klony, wypełniające następujące kryteria: i. hybrydyzacji nie obserwowano wobec pełnej długości (mysiej) sondy w warunkach normalnej surowości, oraz ii. zaobserwowano hybrydyzację w warunkach niskiej surowości zarówno dla

189 639 sondy 5' jak i 3'. Trawienie EcoRI DNA faga uzyskane z tych klonów wskazało dwa niezależne klony o wielkości insertów, wynoszącej około 2,2 kb i około 1,8 kb. Insert EcoRI o 2,2 kb subklonowano do miejsc EcoRI zarówno pBluescript KS (Stratagene) jak i ssaczego wektora ekspresji odpowiedniego do stosowania w komórkach COS. Zidentyfikowano dwie orientacje dla wektora ekspresji ssaka. Insert o 2,2 kb w pBluescript KS złozono w ATCC 9 grudnia 1994 i oznczono jako pBluescript KS, kodujący ludzkie ligand 2 TIE-2. Miejsce początku sekwencji kodującej ligand 2 TIE-2 znajduje się około 355 par zasad w dół od miejsca EcoRI pBluescript.

Komórki COS-7 krótkotrwale transfekowano albo wektorem ekspresji albo wektorem kontrolnym z użyciem protokołu transfekcji DEAE-dekstran. W skrócie, komórki COS-7 powleczono przy gęstości 1,0 x 10⁶ komórek/100 mm płytki 24 godziny przed transfekcją. W celu transfekcji komórki hodowano w DMEM pozbawionej surowicy, zawierającej 400 pg/ml DEAE-dekstran, 1 jiM chlorochiny i 2 mM glutaminę oraz 1 pg odpowiedniego DNA przez 3-4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Pożywki transfekcyjne aspirowano i zamieniono na solankę buforowaną fosforanem z 10% DMSO przez 2-3 minuty. Po tym „szoku” DMSO, komórki COS-7 umieszczono w DMEM z 10% FBS, po 1% penicyliny i streptomycyny oraz 2 mM glutaminą na 48 godzin.

Ponieważ ligand TIE-2 wydziela się, konieczne było uczynienie komórek przepuszczalnymi, w celu detekcji wiązania sondy ciałka receptorowego, z ligandem. Transfekowane komórki COS-7 powleczono przy gęstości 1,0 x 10⁶ komórełkl00 mm płytkę. Komórki przepłukano PBS, a następnie inkubowano z PBS, zawierającym 1,8% formaldehyd przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki następnie przemyto PBS i inkubowano przez 15 minut z PBS, zawierającym 0,1% Triton Χ-100 i 10% bydlęcą surowicę cielęcą, aby uczynić komórki przepuszczalnymi i zablokować miejsca wiązania nie specyficznego. Przeprowadzono przesiew przez bezpośrednią lokalizację zabarwienia, przy użyciu ciałka receptorowego TIE-2, które składało się z zewnątrzkomórkowej domeny TIE-2 połączonej ze stałym regionem IgGl. To ciałko receptorowe wytworzono jak przedłożono w przykładzie 2. Transfekowane komórki COS sondowano przez 30 minutową inkubację z ciałkiem receptorowym TIE-2. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS, utrwalono w metanolu i potem inkubowano przez dodatkowe 30 minut z PBS/10% bydlęcą surowicą cielęcą/koniugatem antyludzka IgG-fosfataza alkaliczna. Po trzykrotnym przemyciu PBS, komórki inkubowano w substracie fosfatazy alkalicznej przez 30-60 minut. Potem płytkę zbadano pod mikroskopem pod względem obecności zabarwionych komórek. Komórki, wykazujące ekspresję jednej orientacji klonu, lecz brak drugiej orientacji, jak się okazało, wiążą ciałko receptorowe TIE-2.

Fachowiec łatwo zauwazy, że opisane metody można stosować do dalszej identyfikacji innych pokrewnych członków rodziny liganda TIE.

Region kodujący z klonu pBluescript KS, kodującego ludzki ligand 2 TIE-2 sekwencjonowano przy użyciu sekwencera DNA aBi 373A oraz Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekwencję nukleotydową i wnioskowaną aminokwasową ludzkiego liganda TIE-2 z klonu pBluescript KS, kodującego ludzki ligand 2 TIE-2, ukazano w fig. 6.

Przykład 9 - Ligand TIE-2 jest antagonistą receptora

Kondycj onowane pożywki z komórek COS, wykazujących ekspresję albo liganda 2 TIE-2 (TL2) albo liganda 1 TIE-2 (TL1) porównano pod względem ich zdolności do aktywacji receptorów TIE-2 naturalnie obecnych w ludzkiej linii komórek śródbłonka.

Odczynik Lipofektaminę (GIBCO-BRL, Inc.) oraz zalecane protokoły, użyto do transfekcji komórek COS-7 albo samym wektorem ekspresji pJFE14, wektorem pJFE14, zawierającym cDNA ludzkiego liganda 1TIE-2 albo wektorem ekspresji pMT21 (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693), zawierającym cDNA ludzkiego liganda 2 TIE-2. Pożywki COS, zawierające wydzielone ligandy zebrano po trzech dniach i zatężono 20-krotme przez diafiltrację (błony ultrafiltracyjne DIAFLO, Amicon, Inc.). Określono ilość aktywnego liganda 1 TIE-2 oraz liganda 2 TIE-2 obecnego w tych pożywkach i wyrażono jako ilość (jednostkach rezonansowych, R.U.) specyficznej aktywności wiązania receptora TIE-2 mierzonej w teście wiązania BIAcore.

189 639

Analizy Nothem (RNA) ujawniły istotny poziom transkryptów TIE-2 w ludzkich pierwotnych komórkach śródbłonkowych (Clonetics, Inc.) HAEC (ludzkie aortalne komórki śródbłookowę). Zatem, tych komórek użyto do badania czy receptor TIE-2 uległ fosforylacji tyrodynowej po poddaniu ekspozycji na pożywki COS, zawierające ligandy TIE-2. Komórki HAEC utrzymywano w kompletnej pożywce do hodowli komórek śródbłonkowych (Claoetics, Inc.), która zawierała 5% płodowej surowicy bydlęcej, rozpuszczony ekstrakt mózgu bydlęcego, 10 ng/ml hydrokortyzonu, 50 mg/ml gentamycyny i 50 ng/ml amfaterycyoy-B. Dokonano oceny czy TL1 i TL2 mogły aktywować receptor TIE-2 w komórkach HAEC, w następujący sposób. Semi-konflueotnę komórki HAEC pozbawiono surowicy na dwie godziny w MEM Dulbecco z wysoką zawartością glukozy, z dodatkiem L-glutaminy i penicylinystreptomycyny w tęmępraturze 37°C, po czym damięniono ubogą pożywkę na kandycjonowane pożywki COS, zawierające ligand, na 7 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Komórki poddano następnie lizie i odzyskano białko receptora TIE-2 przez immunaprecypitację lizatów za pomocą antysęrum peptydu TIE-2, następnie przez Western blotting z aotyserum aotyfasfotyrodynowym, dokładnie jak opisano w przykładzie 1. Wyniki ukazano w fig. 7. Poziom fasfatyradyny na receptorze TIE-2 (TIE-2-R) indukowano przez traktowanie komórek HAEC ligandem 1 TIE-2 (tor L1) lecz nie ligandem 2 TIE-2 (tor l2) konSycjaoowanych pożywek COS. MOCK jest konSycjonową pożywką z COS transfekowanych pustym wektorem JFE14.

Dowód, że oba TL1 i TL2 specyficznie wiążą się z receptorem TIE-2 przedstawiono stosując 'BIAcOre do testowania specyficznej aktywności wiązania receptora TIE-2 w transfekowanych pożywkach COS i przez immunobarwieoię komórek COS, wykazujących ekspresję TL1 i TL2 za pomocą ciałek receptorowych TIE-2.

Ponieważ TL2 nie aktywuje receptora TIE-2, zgłaszający postanowili określić, czy TL2 mógłby służyć jako antagonista aktywności TL1. Przeprowadzono testy fosforylacji HAEC, w których komórki inkubawaoa najpierw z „nadmiarem” TL2, po czym dodano rozcieńczony TL1. Spowodowane to było tym, ze wcześniejsze zajęcie receptora TIE-2 w związku z wysokim poziomem TL2 mogło zapobiec późniejszej stymulacji receptora po ekspozycji wobec TL1 obecnego w ograniczonym stężeniu.

Semi-konfluęntne komórki HAEC pozbawiono surowicy jak opisano powyżej, a potem iokubowano przez 3 minuty w temperaturze 37°C z 1-2 ml kondycjonowanej pożywce z 20X COS/JFE14-TL2. Płytki kontrolne potraktowano pożywką tylko z 20X COS/JFE14 (MOCK). Płytki usunięto z inkubatora i następnie dodaoa różne rozcieńczenia pożywki COS/JFE14-TL1, po czym dodatkowo ίnkubawana płytki przez 5-7 minut w temperaturze 37°C. Później komórki przepłukano, poddano lizie i zbadano fosforylację tyrozynową specyficzną dla TIE-2 w lizatach przez immunoprecypitację receptorową i Western blotting, jak opisano powyżej. Wykaoeno rozcieńczenia TL1 przy użyciu pożywki 20X COS/JFE14-TL1 rozcieńczoną do 2X, 0,5X, 0,1X lub 0,02X, przez dodanie samej pożywki 20X COS/JFE14. Test początkowych pożywek 20X TL1 i 20X TL2 COS przy użyciu technologii bioczujnika BIAcore wskazał, ze zawierały one podobne ilości aktywności wiązania specyficznych dla TIE-2, to jest 445 R.U. i 511 R.U. dla TL1 oraz TL2 odpowiednio. Wyniki Western biot antyfosfotyrazyny, ukazane w fig. 8, wskazują, ze w porównaniu z wcześniejszym traktowaniem komórek COS pożywką MOCK (tor 1), wcześniejsze trektawenię komórek HAEC nadmiarem liganda 2 TIE-2 (tor 2) antagonizuje późniejszą zdolność liganSa 1 TIE-2 do aktywacji receptora TIE-2 (TIE-2-R).

Zdolność TL2 do kompetytywnego hamowania aktywacji TL1 TIE-2-R pokazono dodatkowo przy użyciu ludzkiej hybrydowej linii komórkowej, EA.hy926 (patrz przykład 21 pod względem szczegółowego opisu tej linii komórkowej i jej utrzymywania). Przeprowadzono doświadczenia, w których niezatężone pożywki komórek COS, zawierające TL1 mięszooo przy zmieniających się razcięńezeniaeh albo z kanSycjanowanymi pożywkami MOCK albo TL2 i umieszczono na pojedynczej warstwie komórkowej EA.hy926 pozbawionej surowicy, na 5 minut w temperaturze 37°C. Następnie pożywki usunięto, komórki zebrano przez lizę i zbadano fosforylację tyrozynową specyficzną dla TIE-2 przez Western blot, jak apisaoa powyżej. Fig. 9 ukazuje doświadczenie, które obejmuje trzy grupy traktoweoia, jak uwidoczniono

189 639 od lewej do prawej. Jak ukazano w czterech torach z lewej, traktowanie komórek EA.hy926 samym lx COS-TL1 silnie aktywowało endogeniczny 'ΠΕ-2-R w tych komórkach, podczas gdy pożywka lx TL2 COS była nieaktywna. Jednakże mieszanina TL1 albo z mOCk albo TL2 wykazała, że TL2 może blokować aktywność TL1 w sposób zależny od dawki. W środkowych trzech parach torów udział TL2 (lub MOCK) był zmniejszony, podczas gdy ilość TL1 w mieszaninie była odpowiednio zwiększona od 0,lx do 0,3x. W każdej z tych mieszanin stosunki torów TL1:TL2 wykazały mniejszy poziom fosforylacji TIE-2-R w porównaniu z odpowiadającymi torami TLl:MOCK. Gdy ilość TL1 utrzymywała się na stałym poziomie i ilość TL2 (lub MOCK) zmniejszała się, osiągano jednak punkt (ukazane w trzech parach torów po prawej), w którym TL2 w próbce był zbyt rozcieńczony, aby skutecznie hamować aktywność TL1. Relatywną ilość każdego z ligandów obecnych w tych kondycjonowanych pożywkach COS, można było oszacować z ich jednostek wiązania, jak zmierzono przez test BIAcore i z Western biot pożywek COS za pomocą przeciwciał specyficznych dla liganda. W konsekwencji, możemy wnioskować, że tylko nadmiar o kilkukrotnej molamości TL2 jest konieczny do skutecznego blokowania aktywności TL1 in vitro. Jest to istotne, ponieważ zaobserwowaliśmy różne przykłady in vivo (patrz przykład 17 i fig. 16), gdzie mRNA TL2 występuje w znacznej ilości w stosunku do TL1. Tak więc, TL2 może pełnić ważną fizjologiczną rolę w skutecznym blokowaniu sygnału przez TIE-2-R w tych miejscach.

Biorąc razem, dane te wskazują, że inaczej niż TL1, TL2 nie jest zdolny do stymulowania endogenicznej ekspresji TIE-2-R na komórkach śródbłonka. Ponadto, nadmiar TL2 o kilkakrotnej molamości może blokować stymulację TL1 receptora TIE-2, wskazując, że TL2 jest naturalnie występującym antagonistą receptora TIE-2.

Przykład 10 - Identyfikacja aktywności wiązania specyficznego dla TIE-2 w kondycjonowanej pożywce i supematantach komórek COS

Aktywność wiązania 10x CCM z linii komórkowych CsC12-ras, Rat2ras, SHEP i T98G lub supematantów komórkowych COS po transfekcji albo ludzkim ligandem 1 TIE-2 (hTLl) albo ludzkim ligandem 1 TIE-2 (hTL2) mierzono przy użyciu technologii bioczujnika (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), który monitoruje interakcje biomolekulame w czasie rzeczywistym przez rezonans powierzchniowy plazmonu (SPR). Oczyszczone szczurze lub ludzkie TIE-2 RB sprzęzono kowalentnie przez aminy pierwszorzędowe z warstwą dekstranu karboksymetylu płytki czujnika klasy badawczej CMS (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Powierzchnię płytki czujnika aktywowano przy użyciu mieszaniny N-hydroksysukcynoimidu (NHS) oraz N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC), po czym przez unieruchomienie TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) i deaktywację miejsc, które nie przereagowały 1,0 M etanoloaminą (pH 8,5). Ogólnie, z płytką czujnika sprzężono 9000-10000 RU każdego ciałka receptorowego.

Buforem do przebiegu stosowany w układzie był HBS (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,005% środek powierzchniowo czynny P20, pH 7,4). Próbki wirowano przez 15 minut w temperaturze 4°C i dalej sklarowano przy użyciu jałowego filtru wiążącego małe białka 0,45 (im (Millipore; Bedford, MA). Dekstran (2 mg/ml) i środek powierzchniowo czynny P20 (0,005%) dodano do każdej próbki. Równe ilości 40 pil wstrzyknięto przez unieruchomioną powierzchnię (albo szczurzą albo ludzką) przy prędkości przepływu 5 pl/minutę, i monitorowano wiązanie receptora przez 8 minut. Aktywność wiązania (jednostki rezonansowe, RU) mierzono jako różnicę między wartością linii podstawowej określoną 30 sekund przed injekcją próbki, a pomiarem pobranym 30 sekund po injekcji. Regenerację powierzchni uzyskano za pomocą jednego pulsu 12 fil 3 M MgCl₂.

Próbki CCM (C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP, T98G) testowano na powierzchni unieruchomionej szczurzym TIE-2 RB, podczas gdy rekombinowany hTLl i hTL2 testowano na powierzchni unieruchomionej ludzkim TIE-2 RB. W każdym wypadku, specyficzne wiązanie ciałka receptorowego TIE-2 oceniono przez inkubację próbek z 25 jjg/ml albo rozpuszczalnego TIE-2 RB (szczurzego lub ludzkiego) albo trkB RB przed testowaniem aktywności wiązania. Jak ukazano w fig. 10 i 11, dodanie rozpuszczalnego trkB RB powoduje lekkie zmniejszenie aktywności wiązania TIE-2, podczas gdy dodanie rozpuszczalnego TlE-2 RB znacznie zmniejsza aktywność wiązania w porównaniu z mierzoną przy nieobecności TIE-2 RB.

189 639

Przykład 11- TIE-2 RB specyficznie blokuje aktywację receptora TIE-2 przez ligand 1 TIE-2

Zgłaszający starał się określić, czy rozpuszczalne TIE-2 RB może służyć jako kompetytywny inhibitor do blokowania aktywacji receptora TIE-2 przez ligand 1 TIE-2 (TL1). Aby to wykonać, pożywki COS, zawierające TL1 inkubowano wstępnie albo z TIE-2 RB albo TrkBRB, a potem porównano pod względem ich zdolności do aktywacji receptorów TIE-2 naturalnie obecnych w ludzkiej linii komórkowej śródbłonka.

Wytworzono kondycjonowane pożywki COS z komórek COS-7 transfekowanych albo samym wektorem ekspresji pJFE14 (MOCK), albo wektorem pJFE14, zawierającym cDNA ludzkiego liganda 1 TIE-2 (TL1) i zebrano zgodnie z opisem w przykładzie 9 powyżej, z takim wyjątkiem, ze pożywki poddano jałowej filtracji lecz nie zatężano. Określono ilość TL1 i wyrażono jako ilość (w jednostkach rezonasowych R.U.) aktywności wiązania specyficznej dla receptora TIE-2 mierzonej w teście wiązania BIAcore.

Analizy Nothem (RNA) ujawniły istotny poziom transkryptów tie-2 w ludzkich pierwotnych komórkach śródbłonkowych HUVEC (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej) (Clonetics, Inc.). Zatem, komórki te użyto do zbadania, czy receptor TIE-2 może ulegać fosforylacji tyrozynowej po ekspozycji w obecności TIE-2 lub TrkB-RB wobec pożywek COS, zawierających TL1. Komórki COS utrzymywano w temperaturze 37°C, 5% CO2 w kompletnej pożywce do hodowli komórek śródbłonka (Clonetics, Inc.), która zawierała 5% płodowej surowicy bydlęcej, rozpuszczalnego ekstraktu mózgu bydlęcego z 10 pg/ml heparyny, 10 ng/ml ludzkiego EGF, 1 pg/ml hydrokortyzonu, 50 pg/ml gentamycyny i 50 ng/ml amfoterycyny-B. Ocenę, czy TL1 mógł aktywować receptor TIE-2 w komórkach HUVEC, przeprowadzono następująco. Konfluentne płytki z komórkami HUVEC pozbawiono surowicy na dwie do czterech godzin w MEM Dulbecco z niskim poziomem glukozy w temperaturze 37°C, 5% CO2, po czym inkubowano przez 10 minut w ubogiej pożywce, która zawierała 0,1 mM ortowanadan sodu, silny inhibitor fosfataz fosfotyrozynowych. W międzyczasie, kondycjonowane pożywki COS inkubowano wstępnie 30 minut w temperaturze pokojowej albo z TIE-2 RB albo TrkB-RB dodanych do 50 pg/ml. Ubogą pożywkę usunięto następnie z płytek HUVEC i inkubowano z pożywkami COS, zawierającymi RB przez 7 minut w temperaturze 37°C. Komórki HUVEC poddano potem lizie i odzyskano białko receptora TIE-2 przez immunoprecypitację za pomocą antyserum peptydu TIE-2, następnie przez Western blotting z przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym, jak opisano w przykładzie 1. Wyniki ukazano w fig. 12. Poziom fosfotyrozyny na receptorze TIE-2 indukowano przez potraktowanie komórek HUVEC ligandem 1 TIE-2 (TL1) w stosunku do widocznego dla pożywki kontrolnej (MOCK) i indukcja ta jest specyficznie blokowana przez wcześniejszą inkubację z TIE-2-RB (TIE-2-Fc), lecz nie przez inkubację z TrkB-RB (TrkB-Fc). Dane te wskazują, ze rozpuszczalne TIE-2 RB może służyć jako selektywny inhibitor blokowania aktywacji receptora TIE-2 przez ligand 1 TIE-2.

Przykład 12 - Konstrukcja ciałek ligandowych TIE-2

Utworzono konstrukcję ekspresji, która dawałaby wydzielone białko, składające się z całej sekwencji kodującej ludzki ligand 1 TIE-2 (TL1) lub ligand 2 TIE-2 (TL2) połączony przez fuzję z regionem stałym ludzkiej immunoglobuliny gamma-1 (IgG1 Fc). Te białka fuzyjne nazywa się „ciałkami ligandowymi” (TL1-Fc lub TL2-Fc). Część Fc tL1-Fc i TL2-Fc wytworzono następująco. Fragment DNA, kodujący część Fc ludzkiej IgG1, który rozciąga się od regionu zawiasowego do końca karboksylowego białka, powielono z cDNA ludzkiego łożyska przez PGR, za pomocą oligonukleotydów, odpowiadających opublikowanej sekwencji ludzkiej IgG1; uzyskany fragment DNA klonowano w wektorze plazmidowym. Odpowiednie fragmenty restrykcyjne DNA z plazmidu, kodującego TL1 lub TL2 o pełnej długości i z plazmidu ludzkiej IgG1 Fc, poddano ligacji w obu miejscach fragmentu pochodzącego z krótkiej PGR, który przeznaczono do fuzji, w ramce, z sekwencjami, kodującymi białko TL1 lub TL2 i ludzką IgG1 Fc.

Miligramowe ilości TL2-Fc otrzymano przez kloning fragmentu DNA TL2-Fc do wektora bakulowirusa pVL1393 i następne zakazenie owadziej linii komórkowej Spodoptera frugiperda SF-21AE. Alternatywnie można stosować linię komórkową SF-9 (ATCC numer

189 639 dostępu CRL-1711) lub linię komórkową BTI-TN5bl-4. DNA, kodujący TL2-Fc RB klonowano jako fragment EcoRI-Notl do plazmidu transferowego bakulowirusa pVL1393. DNA plazmidu rekombinowano do DNA wirusa przez mieszanie 3 pg DNA plazmidu z 0,5 |ig DNA Baculo-Gold (Pharminigen), po czym wprowadzono do liposomów, przy użyciu 30 jg Lipofectin (GIBCO-BRL). Mieszaniny DNA-liposom dodano do komórek SF-21AE (2x 10° komórek/60 mm płytkę) w pożywce TMN-FH (modyfikowana pożywka komórek owadzich Grace'a (GE3CO-BRL)) przez 5 godzin w temperaturze 27°C, po czym inkubowano w temperaturze 27°C przez 5 dni w pożywce TMN-FH uzupełnionej 5% surowicą płodu cielęcego. Pożywkę hodowli tkankowej zebrano do oczyszczania łysinek rekombinowanych wirusów, co wykonano przy użyciu metod opisanych wcześniej (D.R.O'Reilly, L.K. Miller i V.A.Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, Nowy Jork: W.H.Freeman, z takim wyjątkiem, ze nalana warstwa agarozowa zawierała 125 pg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-p-D-galaktopiranozyd; GIBCO-BRL). Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 27°C, nie rekombinowane łysinki oceniono ilościowo przez dodatnią reakcję chromogeniczną wobec substratu X-gal i zaznaczono ich pozycje. Łysinki rekombinowane uwidoczniono potem przez dodanie drugiej nadlewki, zawierającej 100 pg/ml MTT (bromku 3-[4,5-di-metylotiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolium; Sigma). Łysinki z przypuszczalnie rekombinowanym wirusem zebrano przez podłączenie aspiracji i oczyszczono przez wyodrębnianie z wielokrotnym okrążeniem łysinek, aby zapewnić jednorodność. Utworzono zbiory wirusów przez seryjne pasażowanie z niską wielokrotnością oczyszczonych łysinek wirusa. Wytworzono zbiory o niskim pasażowaniu jednego klonu wirusa (vTL2-Fc Klon #7).

Komórki SF-21AE hodowano w pożywce pozbawionej surowicy (SF-900 II, Gibco BRL), zawierającej IX roztworu antybiotyk/środek przeciwgrzybowy (Gibco BRL) i 25 mg/litr Gentamycyny (Gibco BRL). Jako środek powierzchniowo czynny dodano Pluronic F-68 do końcowego stężenia, wynoszącego 1 g/litr. Hodowle (4litry) pobudzono w bioreaktorze (Artisan Cell Station System) przez, co najmniej trzy dni przed infekcją. Komórki hodowano w temperaturze 27°C, przy traktowaniu rozpuszczonym 50% tlenem, przy prędkości przepływu gazu, wynoszącym 80 ml/minutę (napowietrzanie z pierścieniem zraszającym). Mieszano za pomocą wirnika okrętowego przy prędkości 100 obrotów na minutę. Komórki zebrano w fazie wzrostu środkowo-logarytmicznej (~2 XI O⁶ komórek/ml), zatęzono przez wirowanie i zakazono 5 jednostkami tworzącymi łysinki ciałka receptorowego vTL2-Fc na komórkę. Komórki i szczep doprowadzono do 400 ml za pomocą świeżej pożywki i wirus adsorbowano przez 2 godziny w temperaturze 27°C w obracanej kolbie. Następnie hodowlę zawieszono ponownie w końcowej objętości 8 litrów świeżej pożywki pozbawionej surowicy, a komórki ipkubowapo w bioreaktorze stosując wcześniej opisane warunki.

Pożywkę hodowlaną komórek SF21AE infekowanych vTL2-Fc zebrano przez wirowanie (500 x g, 10 minut) 72 godziny po infekcji. Supematanty komórkowe doprowadzono do pH 8 za pomocą NaOH. Dodano EDTA do końcowego stężenia 10 mM i pH supematantów ponownie wyregulowano na 8. Supematanty przesączono (0,45 pm, Millipore) i załadowano na kolumnę A dla białek (protein A sepharose 4 fast flow albo HiTrap protein A, oba od Pharmacia). Kolumnę przemyto PBS, zawierającym 0,5 M NaCl dotąd, aż absorbancja przy 280 nm zmniejszyła się do linii podstawowej. Kolumnę przemyto w PBS i wymywano 0,5 M kwasem octowym. Frakcje kolumnowe natychmiast zobojętniono przez elucję do rur, zawierających 1 M Tris pH 9. Frakcje szczytowe, zawierające TL2-Fc zlano i dializowano przeciw PBS.

Przykład 13 - Ekspresja TIE-1, TIE-2, TLI i Tl 2 w raku komórek nerkowych

Przeprowadzono doświadczenia hybrydyzacji in situ na ludzkiej tkance guza raka komórek nerkowych, przy użyciu sond cDNA TIE-1, TIE-2, TLI i TL2. Ekspresja TIE-2, TIE-1, TLI i TL2 była podwyzszona w unaczypieniu guza. Ekspresja liganda zlokalizowana była jak się okazało, albo w komórkach śródbłonka naczyniowego (TL2) albo tuż przy komórkach śródbłonka naczyniowego w mezenchymie (TLI). Okazało się, ze VEGF był dramatycznie podwyzszony w tej tkance guza. Brown i in., Am. J. Pathol. 143:1255-1262 (1993).

189 639

Przykład 14 - Ekspresja TIE-1, TIE-2, TLI i TL2 podczas gojenia rany

Przeprowadzono doświadczenia hybrydyzacji in situ na przekrojach poprzecznych tkanki otrzymanych z modelu gojenia naskórka szczura, przy użyciu sond cDNA TIE-1, TIE-2, TLI i TL2. Model gojenia rany obejmuje wciśnięcie małego korkowego przyrządu do nacinania w skórę szczura i usunięcie małego cylindrycznego kawałeczka skóry. Gdy gojenie rozpoczyna się u podstawy rany, pobiera się pionowe skrawki tkanki i stosuje do hybrydyzacji in situ. W testowanej próbce tkanki, TLI i TL2 wykazały lekko podwyższoną ekspresję cztery dni po uszkodzeniu. W przeciwieństwie do lekko podwyższonej ekspresji TLI i TL2 w tej tkance, ekspresja VEGE, która może poprzedzać ekspresję TLI i TL2, jest podwyższona dramatycznie.

Przykład 15 - Ekspresja ligandów w wątrobie i grasicy płodu

Przeprowadzono PGR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) na mysiej wątrobie płodowej E14.5 i mysiej grasicy płodowej El7.5. Elektroforeza w żelu agarozowym produktów RT-PCR ujawniła, ze w mysiej wątrobie płodowej, RNA liganda 1 TIE-2 (TLI) jest liczny w regionie zrębowym, lecz jest nieobecny w krwiotwórczych komórkach prekursorowych c-eiΐTER119. W tej samej tkance, ligand 2 TIE-2 (TL2) jest liczny w komórkach zrębu lecz nieobecny w krwiotwórczych komórkach prekursorowych (fig. 13). W mysiej grasicy płodowej, TL2 jest liczny w komórkach zrębu (fig. 14).

Przykład 16 - Układ receptor TIE/ligand w angiogenezie

Mimo, że okazuje się, że układ TIE-2/ligand TIE odgrywa istotną rolę w biologii komórek śródbłonkowych, nie wykazano, że odgrywa on znaczącą, aktywną rolę we wczesnych i pośrednich etapach unaczynienia (np. proliferacji i migracji komórek angioblastu lub śródbłonka, tworzenia rurek i innych wczesnych zdarzeń etapowych w kształtowaniu naczyń). Przeciwnie do receptorów i czynników znanych jako pośredniczących w tych aspektach rozwoju unaczynienia, czasowo późny wzór ekspresji TIE-2 i TLI w przebiegu unaczynienia, sugeruje, że ten układ odgrywa inną rolę w ostatnich etapach rozwoju unaczynienia, łącznie z różnicowaniem strukturalnym i funkcjonalnym oraz stabilizacją nowych naczyń krwionośnych. Wzór ekspresji TIE-2/TL1 jest także zgodny z ciągłą rolą w utrzymaniu spójności strukturalnej i/lub charakterystyką fizjologiczną ustabilizowanego unaczynienia.

Ligand 2 TIE (TL2) jest jak się okazuje inhibitorem kompetytywnym TLI. Charakterystyka przestrzenno-czasowa ekspresji TL2 sugeruje, ze ta pojedyncza cząsteczka hamująca może odgrywać wieloraką, zależną od okoliczności rolę zasadniczą wobec prawidłowego rozwoju naczyniowego lub ponownego modelowania (np. destabilizacji/innego różnicowania dojrzałych komórek śródbłonkowych, pozwalając na tworzenie się nowych naczyń z istniejącego unaczynienia, hamowanie nieprawidłowego tworzenia się naczyń krwionośnych oraz regresję/inwolucję dojrzałych naczyń krwionośnych). Fig. jest schematycznym przedstawieniem hipotetycznej roli TIE-2/ligand TIE w angiogenezie. W tym rysunku TLI przedstawiono przez (·), TL2 przedstawiono jako (*), TIE-2 przedstawiono jako (T), VEGF przedstawiono jako ([]), a flk-1 (receptor VEGF) przedstawiono jako (Y).

Przykład 17 - Ekspresja ligandów TIE w żeńskim układzie rozrodczym: ekspresja w jajniku

Wstępne obserwacje uczynione w doświadczeniach, badających ekspresję receptorów TIE i ligandów w żeńskim układzie rozrodczym, są zgodne z hipotezą, że TLI odgrywa rolę w nowounaczynieniu, które w czasie postępuje za VEGF. Wzór ekspresji TL2 jest także zgodny z antagonizmem działania TLI i specyficzną rolą w regresji unaczynienia. Aby to zweryfikować, można zbadać ekspresję omawianych mRNA, po doświadczalnej indukcji rozwoju pęcherzyków i ciałka żółtego tak, ze ich czasową relację do różnych aspektów nowounaczynienia/regresji unaczynienia można dokładniej określić (np. w połączeniu z barwieniem komórek śródbłonkowych, wypełnieniem naczyń). Przeprowadzono angiogenezę związaną z rozwojem pęcherzyka i tworzeniem się ciałka żółtego w jajnikach na odpowiednim etapie dojrzałych samic szczurów lub po indukowanej owulacji u zwierząt przed dojrzewaniem, przy użyciu hybrydyzacji in situ. Fig. 16 zawiera fotografie płytek hybrydyzacji in situ, ukazujące wzór ekspresji w czasie TIE-2, TLI, TL2 i VEGF, podczas cyklu owulacyjnego [Kolumna 1: wczesny pęcherzyk przedowulacyjny; kolumna 2: pęcherzyk przedowulacyjny; kolumna 3:

189 639 wczesne ciałko żółte; kolumna 4: zarośnięty pęcherzyk; rząd A: pole jasne; rząd B: VEGF;

rząd C: TL2; rząd D: TLI; i rząd E: receptor TIE-2]. Badania te ujawniły, że VEGF, TLI i TL2 ulegają ekspresji w sposób skoordynowany w czasie i przestrzeni pod względem rozwoju i regresji unaczynienia w jajniku, konkretnie pod względem ustalenia układu naczyniowego tworzonego w przebiegu przemiany pęcherzyka Graafa w ciałko żółte (CL).

W skrócie, ekspresja VEGF zwiększa się w warstwie ziarnistej pęcherzyka przed jego unaczynieniem w czasie procesu luteinizacji. Podczas procesu tworzenia się CL, widoczny jest wyższy poziom ekspresji VEGF w środku rozwijającego się CL, w sąsiedztwie luteinizujących komórek, które nie uległy jeszcze unaczynieniu. Poziom VEGF pozostaje średnio wysoki i rozkłada się równomiernie w rozwiniętym CL. Przeciwnie, widocznie wzmocniona ekspresja liganda 1 TIE-2 występuje tylko na późnym etapie procesu tworzenia się CL, po ustaleniu pierwotnego splotu naczyniowego.

TL2 wykazuje bardziej złożony wzór ekspresji niż VEGF czy TLI. W rozwoju CL, ekspresja TL2 zachodzi przy wyzszym poziomie z przodu rozwijającego się splotu naczyniowego - między środkowym regionem nie unaczynionym CL, gdzie ekspresja VEGF jest najwyzsza, a najbardziej obwodową częścią CL, gdzie przede wszystkim zachodzi ekspresja TLI i gdzie proces luteinizacji jest zakończony, a układ naczyniowy jest najbardziej dojrzały. Wydaje się także, ze ekspresja TL2 zachodzi na wysokim poziomie w warstwie pęcherzykowej wielkich pęcherzyków, w których ma miejsce zarastanie.

Wzór ekspresji opisany powyżej, jest najbardziej zgodny z rolą VEGF w inicjowaniu angiogenezy, przy czym TLI działa późno w tym procesie, np. w modelowaniu i/lub stabilizacji ostatecznej sieci naczyniowej. Przeciwnie, TL2 jest obecny zarówno w obszarach aktywnej ekspansji nowo tworzącej się sieci naczyń (w czasie tworzenia się CL) oraz w regionach, które wykazują brak ustalonego nowego unaczynienia i postępuje regresja naczyń (zarośnięte pęcherzyki). Sugeruje to bardziej dynamiczną i kompleksową rolę dla TL2, prawdopodobnie związaną z destabilizacją istniejącego unaczynienia (konieczną do regresji) lub rozwojem unaczynienia (koniecznym do dynamicznego modelowania nowo tworzących się naczyń).

Przykład 18 - Test wiązania ciałka receptorowego i test wiązania oraz współzawodnictwa liganda

Ilościowy test wiązania z wolną komórką z dwoma kolejnymi formatami, wykorzystano do detekcji wiązania ciałka receptorowego TIE-2 albo wiązania liganda oraz współzawodnictwa. W wersji testu wiązania ciałka receptorowego, ligandy TIE-2 (oczyszczonego lub częściowo oczyszczonego; albo TLI albo TL2) powleka się na płytkę ELISA. Następnie dodaje się ciałko receptorowe o zmieniających się stężeniach, które wiąże się z unieruchomionym ligandem, w sposób zależny od dawki. Po dwóch godzinach, wypłukuje się nadmiar ciałka receptorowego, potem ocenia się ilość związaną z płytką przy użyciu specyficznego anty-ludzkiego przeciwciała Fc, które oznakowano fosfatazą alkaliczną. Nadmiar przeciwciała reporterowego wypłukuje się, następnie wywołuje się reakcję AP przy użyciu barwnego substratu. Test ocenia się ilościowo przy użyciu spektrofotometru. Fig. 19 ukazuje typową krzywą wiązania TIE-2-IgG. Test ten stosowano do oceny spójności TIE-2-IgG po injekcji szczurów i myszy. Test można także stosować w tym formacie jako test współzawodnictwa liganda, w którym oczyszczone lub częściowo oczyszczone ligandy TIE współzawodniczą z unieruchomionym ligandem pod względem ciałka receptorowego. W wersji testu wiązania liganda i współzawodnictwa, ektodomenę TIE-2 powleka się na płytce ELISA. Fragmenty domeny podobnej do fibrynogenu oznakowanej Fc ligandów TIE (TLl-fFc i TL2-fFc) wiążą się potem z ektodomeną i można je wykrywać przy użyciu tego samego anty-ludzkiego przeciwciała Fc, jak opisano powyżej. Fig. 20 ukazuje przykład wiązania TLl-fFc z ektodomeną TIE-2. Tą wersję testu można także stosować do oceny ilościowej poziomu TLl-fFc w surowicy lub innych próbkach. Jeśli dodaje się ligand nieoznaczony (znów oczyszczony lub nieoczyszczony) w tym samym czasie co TLl-fFc, wtedy zachodzi współzawodnictwo między oznaczonym fragmentem liganda i ligandem o pełnej długości. Ligand o pełnej długości może obrazować fragment oznaczony Fc i tworzy się krzywą współzawodnictwa.

189 639

Przykład 19 - Linię komórkową EA.hy926 można stosować jako reporterową linię komórkową dla aktywności liganda TIE

EA.hy926 jest linią hybrydową, którą ustalono przez fuzję HUVEC z linią pochodzącą od raka płuca człowieka, A549 [Edgell i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 3734-3737 (1983). Komórki EA.hy926 wykazują, jak się okazało, ekspresję istotnego poziomu białka receptora TIE-2 przy niskim podstawowym poziomie fosfotyrozyny. Gęstość, przy której komórki EA.hy926 poddaje się pasażowaniu przed ich użyciem w testach receptora, a także ich stopień konfluencji w czasie testu, może wpływać na obfitość receptora TIE-2 i relatywną zdolność do indukcji w odpowiedzi na traktowanie ligandem. Przez dostosowanie następującego trybu do hodowli tych komórek, linię komórkową EA.hy926 można stosować jako niezawodnego układu do testowania aktywności liganda TIE-2.

Komórki EA.hy926 posiewa się przy 1,5 x 106 komórek w kolbach T-75 (Falconware) i odżywia co drugi dzień MEM Dulbecco z wysokim poziomem glukozy, 10% surowicą bydlęca, L-glutaminą, penicyliną-streptomycyną i lx hipoksantyną-aminopterynątymidyną (HAT, Gibco-BRL). Po trzech do czterech dni wzrostu, komórki pasażuje się ponownie przy 1,5 x 106 komórek na kolbę T-75 i hoduje przez dodatkowe trzy do czterech dni. Do testów fosforylacji, komórki wytworzone zgodnie z powyzszym opisem, pozbawiono surowicy przez zamianę pożywki hodowlanej na DMEM z wysokim poziomem glukozy i inkubację przez 2-3 godziny w temperaturze 37°C. Tę pożywkę aspirowano z kolby i próbki kondycjonowanej pożywki lub oczyszczonego liganda dodano do kolby w całkowitej objętości 1,5 ml, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Kolby usunięto z inkubatora i umieszczono na łaźni lodowej. Pożywkę usunięto i zamieniono 1,25 ml Lysis Buffer, zawierającym 1% substancję o nazwie nonidet P-40, 0,5% deoksycholanu, 0,1% SDS w 20 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM ortowanadan sodu, 5 mM benzamidynę i 1 mM EDTA, zawierający inhibitory proteazy PMSF, aprotyninę i leupeptynę. Po 10 minutach na lodzie, pozwalających na rozpuszczenie błony, płytki zeskrobano i lizaty komórkowe sklarowano przez mikrowirowanie przy najwyzszej prędkości przez 10 minut w temperaturze 4°C. Receptor TIE-2 poddano immunoprecypitacji ze sklarowanego supematantu przez inkubację w chłodzie z antyserum poliklonalnym anty-TIE-2 i kulkami Protein G-conjugated Sepharose. Kulki przemyto trzy razy zimnym buforem do lizy komórkowej i gotowano 5 minut w buforze do próbek Laemmli, który następnie załadowano na 7,5% żele poliakrylamidowe SDS. Rozpuszczone białka poddano elektrotransferowi na błonę PVDF (Lamblia-P), a następnie analizie Western biot, przy użyciu przeciwciała anty-fosfotyrozynowego i odczynnika ECL. Kolejno przeprowadzono porównanie całkowitego poziomu białka TIE-2 na tych samych odciskach przez usunięcie przeciwciała anty-fosfotyrozynowego i ponowną inkubację z antyserum poliklonalnym specyficznym dla ektodomeny TIE-2.

Przykład 20- Wyodrębnianie i sekwencjonowanie klonu cDNA o pełnej długości, kodującego ligand-3 TIE ssaka

Ligand-3 TIE (TL3) klonowano z mysiej biblioteki genomowej BAC (Research Genetics) przez hybrydyzację kopii bibliotek, albo z sondami mysimi TLI albo mysimi TL2, odpowiadającymi całości sekwencji kodującej tych genów. Każdą kopię biblioteki hybrydyzowano przy użyciu buforu fosforanowego o temperaturze 55°C, przez noc. Po hybrydyzacji, filtry przemyto stosując 2xSSC, 0,1% SDS w temperaturze 60°C, po czym filtry poddano ekspozycji na błonę rentgenowską. Zidentyfikowano silne sygnały hybrydyzacyjne, odpowiadające mysiej TLI i mysiej TL2. Poza tym, zidentyfikowano sygnały, które słabo hybrydyzowały zarówno z mysim, TLI jak i mysim TL2. DNA, odpowiadające tym klonom oczyszczono, potem trawiono enzymami restrykcyjnymi i dwa fragmenty, hybrydyzujące z oryginalnymi sondami subklonowano do plazmidu bakteryjnego i sekwencjonowano. Sekwencja fragmentów zawierała dwa egzony z homologią zarówno do mysiego TLI jak i mysiego TL2. Primery specyficzne dla tych sekwencji użyto jako primery pCr do identyfikacji tkanek, zawierających transkrypty, odpowiadające TL3. Zidentyfikowano wstęgę PCR, odpowiadającą TL3, w bibliotece cDNA mysiej macicy w lambda gt-11 (Clontech Laboratories, Inc., Pało Alto, CA).

189 639

Powleczono łysinki przy gęstości 1,25 x 10⁶/płytkę 20x20 cm i po standardowych procedurach otrzymano filtry z kopiami (Sambrook i in., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 wydanie, strona 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork). Filtry z kopiami poddano skriningowi w warunkach o „normalnej” surowości (2 x SSC, temperatura 60°C) z radioaktywną sondą PCR o 200 bp wykonaną dla sekwencji mysiego TL3. Hybrydyzację przeprowadzono w temperaturze 65°C w roztworze, zawierającym 0,5 mg/ml DNA spermy łososia. Filtry przemyto w 2 x SSC w temperaturze 65°C i poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej przez 6 godzin. Otrzymano dwa klony dodatnie, które hybrydyzowały w kopii. Z tych klonów uzyskano trawienie EcoRI DNA faga, wskazujące na dwa niezależne klony o wielkości insertów około 1,2 kb i około 2,2 kb. Insert EcoRI o 2,2 kb subklonowano do miejsca EcoRI pBluescript KS (Stratagene). Analiza sekwencji wykazała, ze dłuższy klon był pozbawiony inicjatorowej metioniny i peptydu sygnałowego lecz z drugiej strony kodował sondę homologiczną zarówno dla mysiego TL1 jak i mysiego TL2.

Potem zsynstetyzowano następujące primery PCR specyficzne dla TL3:

US2: cctctgggctcgccagtttgttagg

US1 cccagctggcagatetaagg

Przeprowadzono następujące reakcje PGR przy użyciu bibliotek ekspresji uzyskanych z mysich linii komórkowych C2C12ras i MG87. W pierwotnej reakcji PCR użyto specyficznego primera US2 w połączeniu z oligonukleotydami specyficznymi dla wektora, co pozwoliło na powielenie w obu orientacjach. PGR przeprowadzono w całkowitej objętości 100 ml, stosując 35 cykli w temperaturze 94°C, 1 minutę; w temperaturze 42°C lub 48°C przez 1 minutę; w temperaturze 72°C 1 minutę. Wtórna reakcja PCR obejmowała drugi primer specyficzny US1, który zawierał się w pierwotnym produkcie PCR, w połączeniu z takimi samymi oligonukleotydami wektorowymi. Wtórne reakcje przeprowadzono przez 30 cykli, przy użyciu tych samych temperatur i czasów co poprzednio. Produkty PCR wyodrębniono w żelu i poddano analizie sekwencji. Na podstawie sekwencji uzyskanych ze wszystkich czterech niezależnych reakcji PCR, przy użyciu dwóch różnych bibliotek cDNA, wywnioskowano koniec 5' sekwencji TL3. Analiza Nothem ujawniła średnie do niskich poziomów mysiego transkryptu TL3 w łożysku myszy. Ekspresja TL3 myszy składała się z transkryptu o około 3 kb. Sekwencję kodującą TL3 o pełnej długości przedłożono w fig. 21.

Sekwencję TL3 myszy można stosować do otrzymywania ludzkiego klonu, zawierającego sekwencję kodującą jego ludzki odpowiednik przez hybrydyzację albo ludzkiej biblioteki cDNA albo genomowego z sondą, odpowiadającą mysiemu TL3, jak opisano poprzednio, np. w przykładzie 8 jak wyżej.

Przykład 21- Wyodrębnianie klonu genomowego o pełnej długości, kodującego ludzki ligand-4 TIE

Ligand-4 TIE (TL4) klonowano z mysiej genomowej biblioteki BAC (BAC HUMAN (II), Genome Systems Inc.) przez hybrydyzację kopii biblioteki, albo z radioaktywną sondą ludzkiego TL1, odpowiadającą całej sekwencji kodującej fibrynogenu TL1 (nukleotydy 1153 do 1806) albo radioaktywną sondą mysiego TL3, odpowiadającą segmentowi o 186 nukleotydach z regionu fibrynogenu TL3 myszy (nukleotydy 1307 do 1492 z fig. 21). Każdą sondę znakowano przez PCR przy użyciu właściwych oligonukleotydow i standardowych warunków PCR, z wyjątkiem, że dCTP zamieniono na P³²dCTP. Mieszaninę PCR przepuszczono następnie przez żelową kolumnę filtracyjną, w celu oddzielenia sondy od wolnego P³²dCTP. Każdą kopię biblioteki hybrydyzowano przez użycie buforu fosforanowego i sondy radioaktywnej w temperaturze 55°C przez noc, stosując standardowe warunki hybrydyzacji. Po hybrydyzacji, filtry przemyto przy użyciu 2xSSC, 0,1% SDS w temperaturze 55°C, po czym poddano ekspozycji na błonę rentgenowską. Zaobserwowano silne sygnały hybrydyzacji, odpowiadające ludzkiemu TL1. Poza tym, zidentyfikowano sygnały, które słabo hybrydyzowały zarówno z ludzkim TL1 jak i mysim TL3. DNA, odpowiadający tym klonom oczyszczono przy użyciu standardowych procedur, następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi i jeden fragment, który hybrydyzował z oryginalnymi sondami, subklonowano do plazmidu bakteryjnego i sekwencjonowano. Sekwencja fragmentu zawierała jeden egzon z homologią zarówno do ludzkiego TL1

189 639 jak i mysiego TL3 i innych członków rodziny liganda TIE. Primery specyficzne dla tych sekwencji można użyć jako primerów PCR do identyfikacji tkanek, zawierających transkrypty, odpowiadające TL4.

Pełną sekwencję ludzkiego TL4 można otrzymać przez sekwencjonowanie pełnego klonu BAC, zawartego w złozonych komórkach bakteryjnych. Egzony można zidentyfikować przez homologię do znanych członków rodziny liganda TIE, takich jak TLI, TL2 i TL3. Pełną sekwencję kodującą TL4 można potem określić przez składanie razem z egzonami z klonu genomowego TL4, który, odwrotnie, można stosować do wytworzenia białka TL4. Alternatywnie, egzony można stosować jako sondy do otrzymywania pełnej długości klonu cDNA, który następnie można użyć do wytworzenia białka Tl4. Egzony można także identyfikować z sekwencji klonu BAC przez homologię do domen białkowych, takich jak domena fibrynogenowa, domeny zwiniętej spirali lub sygnały białkowe, takie jak sekwencje peptydu sygnałowego. Wyrzucenie egzonów z klonu BAC można otrzymać przez identyfikację ciągłych klonów BAC, np. przez użycie końców złożonego klonu BAC jako sond do przesiewu ludzkiej biblioteki genomowej, tak jak ta użyta w niniejszym, przez stosowanie sekwencji egzonu, zawartego w klonie BAC do przesiewu biblioteki cDNA lub przez przeprowadzenie procedury albo 5' albo 3' RACE, przy użyciu primerów oligonukleotydowych na podstawie sekwencji egzonowych TL4.

Identyfikacja innych członków rodziny liganda TIE

Nową sekwencję liganda-4 TIE można stosować w racjonalnym badaniu innych członków rodziny liganda TIE, wykorzystując podejście, które czerpie korzyści z istnienia zakonserwowanych segmentów silnej homologii między znanymi członkami rodziny. Przykładowo, uszeregowanie sekwencji aminokwasowych ligandów TIE ukazuje kilka regionów zakonserwowanej sekwencji (patrz regiony zakreślone w fig. 22). Zdegenerowane Ollgonukleotydy zasadniczo oparte o te kasety, w połączeniu albo z wcześniej poznanymi albo nowymi segmentami homologii liganda TIE, można stosować do identyfikacji nowych ligandów TIE.

Wysoko zakonserwowane regiony wśród TLI, TL2 i TL3 można stosować w planowaniu zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych, kierującymi reakcjami PCR przy użyciu cDNA. Matiyce cDNA można wytwarzać przez odwrotną transkrypcję tkankowego RNA, przy użyciu oligo d(T) lub innych odpowiednich primerów. Równe ilości środowisk reakcyjnych PCR można następnie poddawać elektroforezie na żelu agarozowym. Otrzymane powielone fragmenty DNA można klonować przez insercję do plazmidów, sekwencjonować i sekwencje DNA porównywać ze znanymi ligandami TIE.

Powielone fragmenty DNA o wybranych wielkościach z tych reakcji PCR, można klonować do plazmidów, wprowadzać do E. coli przez elektroporację i transformanty powlekać na wybiórczym agarze. Kolonie bakteryjne z transformacji PCR można analizować przez sekwencjonowanie DNA plazmidów, które oczyszcza się standardowymi procedurami dla plazmidów.

Klonowane fragmenty, zawierające segment nowego liganda TIE można stosować jako sondę hybrydyzacji do otrzymywania klonów cDNA o pełnej długości z biblioteki cDNA. Przykładowo, sekwencję genomową ludzkiego TL4 można uzyć do otrzymania ludzkiego klonu cDNA, zawierającego pełną sekwencję kodującą ludzkiego TL4, przez hybrydyzację ludzkiej biblioteki cDNA z sondą, odpowiadającą ludzkiemu TL4, co opisano wcześniej.

Przykład 22- Kloning sekwencji kodującej hTL4 o pełnej długości

Otrzymano oba końce 5' i 3' sekwencji kodującej z genomowego klonu ludzkiego TL-4, kodującego ludzki ligand-4 TIE (hTL-4 ATCC numer dostępu 98095), przez trawienie enzymem restrykcyjnym, Southern blotting i hybrydyzację klonu hTL-4 z sekwencjami kodującymi mysi TL3, po czym subkloning i sekwencjonowanie hybrydyzowąnych fragmentów. Sekwencje kodujące, odpowiadające aminokwasom N-terminalnemu i C-terminalnemu hTL4 użyto do zaplanowania primerów PCR (ukazanych poniżej), których, odwrotnie, użyto do powielenia PCR TL4 z cDNA ludzkiego jajnika. Zidentyfikowano wstęgę PCR jako odpowiadającą ludzkiemu TL4 przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu sekwencera ABI 373A DNA oraz Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Następnie wstęgę PCR subklonowano do wektora pCR-script i kilka klonów

189 639 plazmidowych analizowano przez sekwencjonowanie. Zestawiono potem pełną sekwencję kodującą dla ludzkiego TL4 i ukazano ją w fig. 23. W innej postaci realizacji wynalazku, nukleotyd w pozycji 569 zamienia się z A na G, co daje zmianę aminokwasu z Q na R.

Primery PCR stosowane zgodnie z powyższym opisem zaplanowano następująco:

hTL4atg 5'-gcatgctatci^ciTi^g_?c_<2_i^_i^₍^^T^C^CT^CT^CCCA^^^I^AGCCATGC TGCAG-3' hTL4not 5’-gtgtcgacgcggccgctcUgatcagaITΓAGAΓGTCCAAAGGCCGI ATCATCAT-3'

Litery małe wskazują sekwencje „ogonka” dodane do primerów PCR, w celu ułatwienia kloningu powielonych fragmentów.

Przykład 23- Konstrukcja i charakteryzacja modyfikowanych ligandów TIE

Przeprowadzono analizę genetyczną liganda-1 TIE-2 i liganda-2 TIE-2 (TL1 i TL2), aby zyskać wgląd w ich liczne zaobserwowane właściwości. Mimo, ze TL1 i TL2 dzielą podobną homologię strukturalną, wykazują one różne właściwości fizyczne i biologiczne. Najbardziej wydatną cechą, która różni te dwa ligandy jest to, ze chociaż oba wiążą się z receptorem TIE-2, TL1 jest agonistą, a TL2 jest antagonistą. W nie redukujących warunkach elektroforezy, oba białka wykazują kowalentne multimeryczne struktury. TL1 wytwarza się w postaci mieszaniny multimerów usieciowanych mostkami disiarczkowymi, przede wszystkim trimerów i struktur wyższego rzędu, bez żadnych struktur dimerycznych. Także, podczas gdy TL2 wytwarza się dobrze w większości układów ekspresji, TL1 podlega ekspresji słabo i jest trudny do wytworzenia w wielkich ilościach. Wreszcie, warunki wytwarzania i oczyszczania predysponują TL1, jak się także okazało, do inaktywacji przez rozszczepienie proteolityczne w miejscu przy końcu aminowym.

Aby zbadać te różnice, skonstruowano kilka następujących modyfikowanych ligandów.

23.1. Substytucja cysternowa - badania jakie czynniki mogłyby nadawać różne właściwości fizyczne i biologiczne dwóch cząsteczek, ujawniły obecność w TL1 reszty cysteinowej (CYS 265 w fig. 4; CYS 245 w fig. 17) poprzedzającej domenę podobną do fibrynogenu w TL1 lecz nieobecną w TL2 - to jest nie było odpowiadającej reszty cysteinowej w TL2. Reszta CYS265 w TL1 jest kodowana przez TGC i leży około nukleotydów 1102-1104 (patrz fig. 4) w pobliżu połączenia między domenami zwiniętej spirali i podobnej do fibrynogenu. Ponieważ reszty cysteinowe generalnie angażują się w tworzenie wiązań disiarczkowych, obecność których nadaje zarówno strukturę trzeciorzędową jak i właściwości biologiczne cząsteczki, sądzono, ze może obecność reszty CYS265 w TL1 mogła być choć częściowo odpowiedzialna za różne właściwości dwóch cząsteczek.

Aby przetestować tę hipotezę, zbudowano plazmid ekspresji, który zawierał mutację w TL1, w której CYS (resztę 265 w fig. 4; resztę 254 w fig. 17) zamieniono na aminokwas (serynę), który nie tworzy wiązań disiarczkowych. Oprócz tego mutanta TL1/CYS', zbudowano drugi plazmid ekspresji, który mutował w przybliżeniu odpowiadającą pozycję w TL2 (Met247 w fig. 17) tak, że reszta ta była obecnie cysteiną. Zarówno nie zmutowany jak zmutowany plazmid ekspresji TL1 i TL2 krótkotrwale transfekowano do komórek COS, zebrano supematanty komórkowe, zawierające rekombinowane białka i próbki poddano zarówno redukującej jak i nie redukującej elektroforezie SDS/PAGE i potem Western blotting.

Figura 18 ukazuje Western blot w warunkach nieredukujących zarówno nie zmutowanego jak i zmutowanego białka TL1 i TL2, ujawniając, że mutant TL1/CYS' biegnie jako dimer, bardziej jak TL2, oraz ze mutant TL2/CYS+ jest zdolny do tworzenia trimera, jak również multimerów wyzszego rzędu, bardziej jak TL1. Gdy przetestowano oba zmutowane białka pod względem ich zdolności do indukcji fosforylacji w komórkach, wykazujących ekspresję TIE-2, mutant TL1/CYS' był zdolny do aktywacji receptora TIE-2, podczas gdy mutant TL2/CYS+ nie.

Tak więc, gdy resztę cysteinową (reszta 265 w fig. 4; reszta 245 w fig. 17) TL1 zmieniono genetycznie na serynę, odkryto, ze kowalentna struktura TL1 stała się podobna do TL2, to jest przede wszystkim dimeryczna. Zmodyfikowana cząsteczka TL1 wciąż zachowywała się jak agonista, a więc, struktura trimeryczna i/lub multimeryczna wyższego rzędu nie jest

189 639 ezyooikięm, dętęrmioującym zdolność TLI do aktywacji. Mimo, że usunięcie cysteiny dało cząsteczce bardziej pożądane właściwości, nie poprawiło poziomu wytwarzania TLI.

23.2. Delecje demem' m koywencłe knkleotydowe, koduj ące TIU i TL2 dTielą sfrektutr genetyczną, którą mażoa podzielić na trzy domeny na podstawie sekwencji aminokwasowych dojrzałych białek. Ostatnie około 215 reszt aminakwasowych każdego dojrzałego białka, zawiera sześć cystein i odznacza się silnym podobieństwem do domeny fibrynogenu. Region ten oznaezona więc jako domenę „podobną do fibr^ogenu” lub „domenę F”. Środkowy region dojrzałego białka, zawiera około 205 reszt, posiada z wysokim prawdopodobieństwem strukturę „zwiniętej spirali” i ozoaezono go jako domenę „zwiniętej spirali” lub „domenę C”. Około 55 reszt aminoterminalnych dojrzałego białka zawiera dwie cysteiny i posiada z niskim prawdopodobieństwem strukturę zwiniętej spirali. Region ten aznaezona jako domenę „N-terminalną” lub „domenę N”. Opisane w niniejszym madyfikawanę ligandy oznacza się przy użyciu tęrmioalagii, w której N = domena N-terminalna, C = domena zwiniętej spirali, F = domena podobna do fibrynogenu i liczby 1 i 2 odnoszą się odpowiednio do TLI i TL2. Tak więc, IN wskazuje domenę N-terminalną z TLI, 2F wskazuje domenę podobną do fibryoagęou z TL2 i tak dalej.

W celu przetestowania, czy domena podobna do fibrynogenu (domena F) ligandów TIE-2 zawierała aktywność aktywacji TIE-2, zbudowano plazmidy ekspresji, które usuwały domeny zwiniętej spirali i N-terminalną, pozostawiając jedynie tę część sekwencji DNA, która kodowała domenę F (dla TLI, rozpoczynającą się w fig. 4 około nukleotydu 1159, reszta amioakwαsowα ARG284; dla TL2, odpowiadająca nuklęatydowi około 1200 w fig. 6, reszta amioakwasowα 282). Tą zmutowaną konstrukcją transfękowana krótkotrwale komórki COS. Supernatant, zawierający rekombinawanę białko, zebrano. Mutanta TLl/domeoa F przetestowano pod względem jego zdolności do wiązania receptora TIE-2. Wyniki ukazały, ze jako monomer, mutant TLl/domena F nie był zdolny do wiązania TIE-2 na wykrywalnym poziomie.

Lecz gdy monomer TLl/domena F nazneczooo myc i potem ścięto przeciwciałem, skierowanym przeciw znacznikowi myc, wykazał on wykrywalne wiązanie TIE-2. Jednak mutant Tel/damena F ścięty przeciwciałem nie był zdolny do indukcji fosforylacji w linii komórkowej, wykazującej ekspresję TIE-2.

Tak więc, akreślona, że domena F ligandów TIE-2 angażuje się w wiązanie receptora lecz skrót, składający się tylko z samej domeny F nie wystarcza do związania receptora. Wzbudziło to możliwość, że domena zwiniętej spirali jest odpowiedzialna za utrzymywanie razem kilku domen podobnych do fibrynogenu, które mogły być zasadnicze dla wiązania receptora. W próbie potwierdzenia tej hipotezy, domenę F połączono z sekcją Fc ludzkiego przeciwciała IgGl. Ponieważ sekwencje Fc dimeryzują w czasie ekspresji w komórkach ssaków, te rękombmoweoę białka naśladowały teoretyczną konfigurację domen F i były natywnymi ligandami, które dimeryzują. Ta konstrukcja domena F-Fc związała, lecz nie mogła aktywować receptora. Najwyraźniej multimeryzacja spowodowana przez inne regiony ligandów jest kanięezna do umożliwienia Ugandom związanie receptora TIE-2. Poza tym, jakiś inny czynnik z zewnątrz domeny F musi stanowić o fosforylacji receptora.

Następnie zbudowano mutanty, które pozbawiono domeny podobne do fibrynogenu i przez to zawierały tylko domeny N-termmalną i zwiniętej spirali. Nie były one zdolne do wiązania receptora. Aby oszacować rolę domeny N-terminalnej w wiązaniu i aktywacji receptora, ligandy skrócono tylko do domen C i F i adnakawαno dnaeznikięm FLAG na końcu N, tworząc konstrukcje określone FLAG-1C1G i FLAG-2C2F. Mimo, ze cząsteczki te barwiły się silnie w komórkach COS7 transfekawanych krótkotrwale w celu ekspresji receptora TIE-2, nie zdołały odpowiedzieć w teście fosforylacji. Talk więc domena N zawiera zasadniczy czynnik aktywacji receptora, chociaż, jak ujawniooa poniżej, zdolność chimerycznej cząsteczki 2N2C1F do aktywacji receptora ukazuje, ze nawet domena N nieaktywnego liganda może pełnić tę rolę.

Różnice zachowania między skróconą domeną F oznakowaną myc i skróconą domeną F oznakowaną Fc opisanymi wcześniej, sugerowały, ze ligandy TIE mogą wiązać jedynie w postaciach dimerycznych lub wyzszego rzędu. W rdeczywistaści, nie redukująca SDS-PAGE

189 639 wykazała, że ligandy TIE istnieją naturalnie w postaciach dimerycznych, trimerycznych i multimerycznych. Skrócone FLAG-1C1F i FLAG-2C2F mogą wiązać się z receptorem TIE-2 bez dimeryzacji przez syntetyczny znacznik (taki jak Fc), podczas gdy skrócone F nie mogą, sugerując, że region C jest przynajmniej częściowo odpowiedzialny z agregację domen F.

23.3. Konstrukcje zamienione (chimery):

Zgłaszający zauwazyli, ze poziom wytwarzania TLI w komórkach COS7 był w przybliżeniu dziesięciokrotnie niższy niż wytwarzanie TL2. Zatem zbudowano chimery TLI i TL2 w celu wyjaśnienia tej różmicy, a także dodatkowej charakteryzacji aktywności agonistycznej TL1 w porównaniu z aktywnością antagonistyczną TL2.

Zbudowano cztery chimery, w których zamieniono albo domenę N-terminalną albo domenę fibrynogenu między TL1 i TL2 i oznaczono przy użyciu terminologii opisanej wcześniej tak, że np. 1N1C2F odnosi się do chimery, posiadającej domenę N-terminalną i zwiniętej spirali TL1, razem z domeną podobna do fibrynogenu od TL2. Zbudowano następujące cztery chimery:

chimera 1 - 1N1C2F chimera 2 - 2N2C1F chimera 3 - 1N2C2F chimera 4 - 1N1C1F

Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe chimer 1-4 ukazano odpowiednio w fig. 24-27.

Każdą chimerę wprowadzono do odzielnego wektora ekspresji pJFE14. Następnie chimerę transfekowano do komórek COS7, razem z pustym wektorem pJFE14, natywnym TL1 i natywnym TL2 jako kontrolami, i zebrano supematanty hodowlane.

W celu określenia jak zamiana wpłynęła na poziom ekspresji ligandów; rozcieńczenie 1:5 i rozcieńczenie 1:50 supematantów COS7 poddano procedurze dot-blot na nitrocelulozę. Trzy ligandy, które zawierały domenę N TL1 (to jest natywnego TL1, 1N2C2F i 1N1C2F) sondowano potem z króliczym przeciwciałem specyficznym wobec końca N TL1. Trzy Ugandy, zawierające domenę N TL2 (to jest natywnego TL2, 2N1C1F i 2N2C1F) sondowano z króliczym przeciwciałem specyficznym wobec końca N TL2. Wyniki pokazały, ze komórki COS7 wykazywały ekspresję każdej cząsteczki, zawierającej domenę N TL2 przy prawie dziesięć razy takim poziomem jak poziom każdej cząsteczki, zawierającej domenę N TL1, bez względu na zawartość reszty białka. Wniosek był taki, że domena N musi przede wszystkim kontrolować poziom ekspresji liganda.

Następne pytanie dotyczyło zdolności lub niezdolności chimer do aktywacji receptora TIE-2. Komórki Eahy926 sprowokowano czterema chimerami, jak również TL1 jako kontrolą dodatnią dla fosforylacji i TL2 lub supematantami komórkowymi COS7 transfekowanymi pustym pJFE14, jako kontrolami ujemnymi dla fosforylacji. Komórki poddano lizie, a receptor TIE-2 poddano immunoprecypitacji z lizatów komórkowych i uruchomiono na SDSPAGE. Próbki poddano Western blotting i sondowano z przeciwciałem anty-fosfotyrozypowym w celu detekcji wszystkich receptorów, które zostały ufosforylowane. Niespodziewanie, tylko konstrukcje, zawierające domenę podobną do fibrynogenu TL1 (2N1C1F i 2N2C1F) mogły fosforylować receptor TIE-2. Tak więc, mimo, że region N-terminalny TL1 jest zasadniczy dla aktywacji, można go zamienić na region N-terminalny TL2, czyli informacja, która determinuje, czy ligand jest agonistą, czy antagonistą, zawiera się aktualnie w domenie podobnej do fibrynogenu.

W ten sposób określono, że domena F, oprócz wiązania receptora TIE-2, odpowiada za aktywność fosforylacji TL1. Dalej, gdy TL2, z drugiej strony cząsteczkę nie aktywną, zmieniono przez zastąpienie jej domeny F domeną F TL1, zmieniony TL2 działał jako agonista.

Konstrukcja 2N1C1F była jdnakże nieco silniejsza. Sygnał powodowany przez chimerę 2N1C1F wydawał się nieznacznie silniejszy niż chimery 2N2C1F, prowadząc do spekulacji, ze domena C TL1 choć nie decydująca wobec fosforylacji, mogła wzmacniać siłę TL1. Jednak, ponieważ próbki użyte do testu fosforylacji nie były normalizowane w kategoriach stężenia liganda, możliwe było, że silniejszy sygnał fosforylacji wskazywał jedynie obecność

189 639 większej ilości liganda. Test fosforylacji powtórzono zatem ze zmiennymi ilościami liganda, aby określić, czy aktywne chimery wykazują różne siły. Stężenie liganda w supematantach COS7 transfekcji liganda, określono poprzez technologię bioczujnika BIAcore, zgodnie z metodami opisanymi wcześniej (Stitt, T.N. i in., (1995) Celi 80: 661-670). BIAcore mierzył aktywność wiązania superantantu z receptorem TEE-2 w arbitralnych jednostkach zwanych jednostkami rezonansowymi (RU). Zaobserwowano generalnie całkiem dobrą korelację między RU i stężeniem liganda, przy czym 400 RU odpowiada około 1 (ig białka na ml superanatantu. Próbki rozcieńczono do stężeń 100 RU, 20 RU i 5 RU każda i powtórzono test fosforylacji. Wyniki pokazały, ze chimera 2N2C1F była wyraźnie silniejsza niż natywna TLI czy chimera 1N1C2F przy tych samych stężeniach.

Innym interesującym aspektem tych wymiennych konstrukcji jest ich poziom ekspresji. Każdą z czterech chimer testowano pod względem ich poziomu wytwarzania w komórkach COS, ich zdolności do wiązania TEE2 i ich zdolności do fosforylacji TIE2. Wyniki tych doświadczeń pokazały, że chimery 1 i 3 były wytwarzane na poziomie porównywalnym z TLI, podczas gdy chimery 2 i 4 były wytwarzane na poziomie porównywalnym z TL2. Tak więc, wysoki poziom wytwarzania białka był skorelowany z domeną N-terminalną TL2. Dodatkowo, po testowaniu na komórkach śródbłonka Eahy926, chimery 2 i 4 były aktywne, podczas gdy 1 i 3 nie. Tak więc aktywność (fosforylacja receptora) koreluje z domeną podobną do fibrynogenu TLI. Zatem każda z chimer 2 i 4 posiadała pożądane właściwości wysokiego poziomu wytwarzania jak również aktywność agonistyczną.

23.4. Konstmkcjeodoome proteoHtyeznie - Na podstawie oN^i^rw^acj^,i^e: wielka frakajf preparatów TLI często ulegała proteolitycznemu rozszczepieniu przy końcu N, zaproponowano, że reszta argininowa położona w pozycji 49 dojrzałego białka (patrz fig. 17) jest prawdopodobnym miejscem rozszczepienia, które mogło być związane z regulacją aktywności białka in vivo, i że zastąpienie a^i^iiAiny seryną (R49—>S) mogłoby zwiększyć s^tabilru^ość bez koniecznego wpływania na aktywność. Zbudowano takiego mutanta TLI i odkryto, że jest prawie tak samo aktywny jak natywny TLI, lecz nie wykazywał odporności na rozszczepienie proteolityczne.

23.5 Mutanty kombikowane w Naj siinisjczą koslę1ieknję ch-me-ycdną, 2Ν1ΟΕ, zmieniono dodatkowo tak, że cysteinę kodowaną przez nukleotydy 784-787 jak ukazano w fig. 27, zamieniono na serynę. Cząsteczka ta (oznaczona 2N1C1F (C246S)) dobrze podlegała ekspresji, silnie aktywowała receptor, była odporna na rozszczepienie proteolityczne i była przede wszystkim raczej dimerem niz multimerem wyższego rzędu. Tak więc, domena 2N okazała się nadawać cząsteczce odporność proteazową. Wrecz2ie, cząsteczkę tę zmieniono dodatkowo, w celu eliminacji miejsca potencjalnie wrażliwego na proteazy, kodowanego przez nukleotydy 199-201 jak ukazano w fig. 27, uzyskując cząsteczkę (oznaczoną 2N1C1F (R51->S, C246->S)), która jak oczekiwano, aktywowała, miała dobrą ekspresję, była dimeryczna i odporna na proteazy.

Tabela 1 streszcza konstrukcje modyfikowanego liganda TIE-2, które wykonano, oraz charakteryzuje każdą z nich w kategoriach zdolności do wiązania receptora TIE-2, zdolności do oetywa2ji receptora TIE-2, typu utworzonej struktury (monomer, dimer itd.) oraz ich relatywnego poziomu wytwarzania. Nie modyfikowany TLI (prosty) i TL2 (prążkowany) ukazano z trzema domenami w ramkach. Tak więc, prążkowane ramki oznaczają domeny TL2. Cysteinę położoną w pozycji 245 dojrzałego białka TLI oznaczono przez „C”. „X” do „C” wskazuje, że tę resztę cysternową podstawiono innymi aminokwasami, tek jak np. w mutancie TLI CYS”. Podobnie, „X” do „R” w ostatniej konstrukcji wskazuje cuastytu20r dla reszty Arg w pozycji 49 dojrzałego białka TLI. „C” jest obecny w jednej modyfikowanej konstrukcji TL2, pokazując mutanta TL2 CYS+. Zaznaczono także konstrukcje, posiadające ogonki Fc lub znakowanie flag.

Na podstawie niniejszych pouczeń, fachowiec może łatwo zobaczyć, że można wykonać dodatkowe konstrukcje, w celu utworzenia dodatkowych modyfikowanych i chimerycznych ligandów TIE-2, które posiadają zmienione właściwości. Przykładowo, można utworzyć konstrukcję, składającą się z domeny N-terminalnej TL2 i domeny F TLI połączonej z sekcją Fc ludzkiego przeciwciała IgGl. Jak się oczekuje, konstrukcja ta wiązałaby i aktywowała receptor TIE-2. Podobnie, można utworzyć inne konstrukcje przy użyciu niniejszych pouczeń, o zatem uważa się je za wchodzące w zakres tego wynalazku.

189 639

23.6 Materiały i metody

Konstruowanie chimer

Konstrukcje zamienne wrowadzono do wektora pJFE14, w którym miejsce XbaI zamieniono na miejsce AscI. Wektor ten trawiono Ascl i Notl, uzyskując szkielet AscI-Notl. Utworzono fragmenty DNA dla chimer przez PCR, przy użyciu odpowiednich oligonukleotydów.

Inserty FLAG-1C1F i FLAG-2C2F subklonowano do szkieletu wektora pMT21, który trawiono EcoRI i Notl. Przez PCR uzyskano skrócone fragmenty „CF”, a znacznik FLAG i poprzedzającą sekwencję sygnałową trypsyny zbudowaną przez annealing syntetycznych oligonukleotydów.

Transfekcje

Wszystkie konstrukcje transfekowano krótkotrwale do komórek COS7 przy użyciu standardowych protokołów DEAE-Dextran lub LipofectAMINE. Hodowle komórkowe zebrano 3 dni po transfekcji i odwirowano przy 1000 obrotów na minutę, a superanatanty przeniesiono do świeżych rurek i przechowywano w temperaturze -20°C.

Barwienie komórek transfekowanych FLAG-1C1F i FLAG-2C2F

Płytki o 6 studzienkach komórek COS7 transfekowano krótkotrwale receptorem TIE-2. Superantant COS7 z różnych transfekcji ligandowych inkubowano na komórkach przez 30 minut, po czym przemyto dwukrotnie solanką buforowaną fosforanem (PBS) bez magnezu ani wapnia. Komórki utrwalono w metanolu o temperaturze -20°C przez 3 minuty, przemyto raz w PBS i inkubowano z przeciwciałem anty-FLAG M2 (TBI; rozcieńczenie 1:3000) w PBS/10% bydlęcej surowicy cielęcej (BCS) przez 30 minut. Komórki przemyto raz PBS i inkubowano z kozim anty-mysim przeciwciałem IgG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (AP) (Promega, 1:1000) w PBS/10% BCS. Komórki przemyto dwukrotnie PBS i inkubowano z substratem fosforanowym, BCIP/NBT, z 1 mM lewamisolem.

Testy fosforylacji

Wykonano rozcieńczenie supematantów COS7 do badań odpowiedzi na dawkę, w supematantach komórek COS7 transfekowanych pustym wektorem pJFE14. Komórki EA, które naturalnie wykazują ekspresję receptora TIE-2 głodzono przez > 2 godziny w pożywce pozbawionej surowicy, po czym sprowokowano odpowiednim supematantem COS7 przez 10 minut w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Komórki następnie przepłukano w lodowatym PBS i poddano lizie za pomocą 1% buforu do lizy NP40, zawierającego inhibitory proteaz (10 pg/ml leupeptyny, 10 pg/ml aprotyniny, 1 mM PMSF), po czym poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem specyficznym dla receptora TIE-2. Próbki poddano potem analizie odcisku immunologicznego, przy użyciu przeciwciał anty pTyr.

Próbki nałożono na błonę nitrocelulozową, którą zablokowano i sondowano odpowiednimi przeciwciałami.

23.7 Wytwarzanie chimerycznego liganda TIE-2 z komórek owadzich infekowanych CHO i bakulowirusem

Wytwarzanie wirusa

Gen dla chimerycznego liganda (oznaczonego 2N1C1F (C246S)) wbudowano do plazmidu ekspresji bakulowirusa i rekombinowano z DNA wirusa, aby utworzyć rekombinowanego bakulowirusa, powielono i zebrano przy użyciu metod opisanych wcześniej (O'Reilly, D.R., L.K. Miller i V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, Nowy Jork: W.H. Freeman). Komórki owadzie (Spodoptera frugiperda) otrzymane od Invitrogen, przystosowano i rozłożono w temperaturze 27°C w pożywce pozbawionej surowicy Gibco SF900 II. Nie zainfekowane komórki hodowano do gęstości 1x106 komórek/ml. Gęstość komórek określono przez liczenie żywych komórek przy użyciu hemacytometru. Zbiór wirusa dla liganda dodano do bioreaktora przy niskiej wielokrotności 0,01-0,1 PFU/komórkę, aby rozpocząć infekcję. Proces infekcji kontynuowano przez 3-4 dni, pozwalając na maksymalną replikację wirusa bez narażania się na późniejszą lizę komórek. Zawiesinę komórkową podzielono aseptycznie na równe ilości do jałowych butelek wirówki i komórki usunięto przez wirowanie (1600 RPM, 30 minut). Supernatant pozbawiony komórek zebrano w jałowych butelkach i przechowywano w temperaturze 4°C przy braku światła do dalszego użycia.

189 639

Miano wirusa określono przez test łysinek jak opisano u O'Reilly'ego, Millera i Luckowa. Metodę przeprowadzono w 60 mm płytkach do hodowli tkanek, które posiano 1,5x106 komórek. Do przyczepionych komórek dodano seryjne rozcieńczenia zbioru wirusa i mieszaninę inkubowano przy kołysaniu, pozwalając wirusowi na adsorpcję do poszczególnych komórek. Dodano nadlewkę agarową i płytki inkubowano przez 5 dni w temperaturze 27°C. Żywe komórki zabarwiono obojętną czerwienią, ujawniając okrągłe łysinki, które policzono, uzyskując miano wirusa wyrażone w jednostkach tworzących łysinkę na mililitr (PFU/ml).

Infekcja komórek w celu wytworzenia białka

Nie zainfekowane komórki SF21 hodowano w płytkach do hodowli tkanek i dodano wirus, zawierający gen chimerycznego liganda, przy wielokrotności 1-10 pfu/komórkę. Wirus pozostawiono do adsorpcji przez 90 minut w temepraturze 27°C przy delikatnym kołysaniu, po którym komórki odżywiono świeżą ilością pożwyki pozbawionej surowicy Sf-900 II. Po 3 dniach wzrostu w temperaturze 27°C, hodowlę tkankową zebrano i ligand wykrywano przez immunoblotting.

Ekspresja CHO chimer liganda TIE-2

Chimery liganda Tie-2 klonowano do jakiegokolwiek z kilku wektorów ekspresji komórek ssaka, łącznie (lecz bez ograniczenia) z pJFE, pcDNAS, pMT21, pED lub innych. Plazmidy transfekowano do komórek CHO DG44 (Urlaub, G i Chasin, L.A. 1980, Isolation of Chinese hamster celi mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 4216-4220; Urlaub, G Kas, E., Carothers, A.M., oraz Chasin, L.A. 1983. Deletion of the diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells. Cell 33: 405-412) przez precypitację fosforanem wapnia lub liposomy kationowe. W wypadku wektorów pozbawionych markera selekcji dhfr, plazmid pSV2.dhfr kotransfekowano w stosunku molarnym 20% do plazmidu, zawierającego chimerę liganda TIE. Komórki DHFR+ poddano selekcji przez hodowlę w pożywce selekcyjnej (pożywka pozbawiona nukleozydów i nukleotydów, zawierająca 10% dializowaną płodową surowicę cielęcą), i klony przesiano pod względem wytwarzania chimerycznych ligandów TIE przez immunoblotting z ciałkiem receptorowym TIE2. Klony, wykazujące ekspresję pożądanego białka poddano kilku okrążeniom powielenia genowego przy użyciu stopniowanych stężeń metotraksatu w pożywce selekcyjnej. Zidentyfikowano klony o wysokiej ekspresji po poowieleniu genowym, z użyciem podobnych technik immunoblottingu.

Linie komórkowe, wykazujące ekspresję ligandów TIE hodowano w pojedynczej warstwie, kolbach z zawiesinami, obracanych butelkach i bioreaktorach w pożywce selekcyjnej lub w pożywce bez selekcji, oraz można je hodować w preparatach pożywek pozbawionych surowicy.

189 639

Tabela 1

ANALIZA MUTACJI LIGANDÓW i i .......-1 ~1 _u ZWINIĘTA PODOBNA DO _u ^N SPIRALA FIBRYNOGENU E a Π ,, s ml i »i i +

777777777777777 II X Ί ♦

V777777777777/7A

I i T3

W7Z7ZZ7&

ΓΖ~~Ί )777777

I—„i * i ♦

VT2?7A * 1 «· i i ^gi -- i * i *

77?77/777Χ777777Γ*-\ ♦ t| ~1 + .^%kW//W/Z3 + <- - ^ci I +

Ό •EZWdW/l CL, W//A

W77777A ~i

Γ7777777Χ77777Λ

W7 «Γ ~Ί

Π M;... -· I

GT «I......1

	.3
<9 i	§ « sl Π ia ε	1 * n
< H +	WYŻSZEGO RZĘDU	NISKI
-	DIMER	WYSOKI
+	DIMER	NISKI
*	WYŻSZEGO rzędu	WYSOKI
N.D.	N.D.	NISKI
ND	N.D.	WYSOKI
-	MONOMER	WYSOKI
	MONOMER	WYSOKI
•	DIMER	NISKI	• NAJWYŻSZE WYTWARZANIE RU
•	DIMER	WYSOKI	••najsilniejsza AKTYWACJA
+	WYŻSZEGO RZĘDU	NISKI	Nl) = NIL OKREŚLONO
-	WYŻSZEGO RZĘDU	NISKI
+	N.D.	NISKI
•	N.D.	WYSOKI
•	ND.	WYSOKI
•	N.D	WYSOKI
•	ND.	NISKI
+	ND	WYSOKI ·
-	ND	NISKI
+	N.D	WYSOKI
+ ”	DIMFR	WYSOKI
+	N 1)	NISKI

Depozyty

189 639

Następujące złożono w American Type Culture Collection (Amerykańska Kolekcja Typów Kultur), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 zgodnie z Układem budapesztańskim. Rekombinowany bakulowirus Autographa califomica, kodujący ciałko receptorowe TIE-2 złożono w ATCC 7 października 1994 i oznaczono jako „ciałko receptorowe vTIE-2” z numerem dostępu VR2484. Szczep E. coli DH10B, zawierający plazmid pBeLoBacll z insertem ludzkiego genu TL-4, kodującym ludzki ligand-4 TIE złożono w ATCC 2 lipca 1996 i oznaczono jako „hTL-4” z numerem dostępu 98095.

Niniejszy wynalazek nie ogranicza się w zakresie do konkretnych postaci realizacji opisanych w niniejszym. W rzeczywistości, różne modyfikacje wynalazku oprócz opisanych niniejszym, stają się widoczne dla fachowców z powyższego opisu i towarzyszących rysunków. Takie modyfikacje wchodzą w zamierzeniu w zakres załączonych zastrzeżeń.

189 639

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: NOWE MODYFIKOWANE LIGANDY (iii) LICZBA SEKWENCJI: 28 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRES: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

(B) ULICA: 777 Old Saw Hill Road (C) MIASTO: Tarrytown (D) STAN: NY (E) KRAJ: USA (F) KOD: 10591 (v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Zgodny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSEO wersja 2.0 (vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JESZCZE NIE ZNANY (B) DATA ZŁOŻENIA: ZŁOŻONA W ZAŁĄCZENIU (C) KLASYFIKACJA:

(V11) WCZEŚNIEJSZE DANE ZGŁOSZENIOWE:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: USSN 08/740,223 (B) DATA ZŁOŻENIA: 25-PAŹDZ-1996 (C) KLASYFIKACJA:

(vn) WCZEŚNIEJSZE DANE ZGŁOSZENIOWE:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: USSN 60/022/999 (B) DATA ZŁOŻENIA: 02-SIERPNIA-1996 (viii)INFORMACJE O PEłNOMOCNIKU/POŚREDNIKU

189 639 (A) NAZWISKO: Cobert, Robert J (B) NUMER REJESTRACYJNY: 36,108 (C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: REG 333 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: 914-345-7400 (B) TELEFAKS: 914-345-7721 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2149 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA::

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 310...1803 (D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand 1 TIE-2 (B) POŁOŻENIE: 1...2149 (D) INNE INFORMACJE^: z klonu λρή10, kodującego ligand htie-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 1:

CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA 60

GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA 120

AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA 180

AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA 240

CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT 300

GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG 351

Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu

189 639

10

ACT

CAC

ATA

GGG

TGC

AGC

GCT

CCG

CGC

CGA ACT

CCA

GAC

wac

ATG

GGG

399

Thr

His

Ile

Gly

Cys

Ssr

Asn

Gln

Arg

Arg Ser

Pro

Glu

Asn

Ssr

Gly

15

20

30

AGA

TAT

TACC

CGG

ATT

cgcc

ACT

GGG

cena tgt

GCC

TAA

ACT

TTC

ATT

00 7

Arg

Tyr

Asn

Arg

Ile

Gin

His

Gly

Gin Cys

Ala

Tyr

Thr

Phe

Ile

35

40

CTT

CCA

GAA

CAC

GGC

GGG

GCC

TGT

CGT

GGC ACG

ATA

ACA

G^T

GAC

GTT

0 95

Leu

Pro

Glu

UHi

Aap

GGe

Ans

Cys

Arg

GGe Sse

STr

Thr

Αημι

GGl

Sts

50

55

60

AAC

ACA

AAC

CAC

CCT

ce^n

ATG

GCT

CCA SAC

SGG

GCC

CCC

GGC

TTG

!S4 3

Asn

Thr

Asn

ACa

Lue

GGn

Ang

Csp

Ala

Pro Shi

Gal

Glu

P^o

Ans

PPr

65

70

75

TCT

TCC

CAC

nana

CCT

CCC.

CAC

ATG

GCCG

CAT GGG

ATG

GCT

/CCT

TAT

ACT

5 91

Ser

Gin

Aus

Luu

GG.n

Hhi

Leu

Glu

Hhi Val

Mee

Glu

Asn

Tyr

TGr

80

85

90

CAG

TGG

CTC!

CCCA

Gana

CAT

GAG

GCCT

TAC

ATT GGG

GGCC

GCTC

ATG

GACG

TCG

699

Gln

Trp

Leu

Ggi.

Lus

Lee

Glu

Csn

Tyr

Ile Val

GGu

Asn

Met

Lls

Ssr

95

100

U0

110

GAG

ATG

GCG

CAG

ATA

CAT

CAG

CCT

GCA

GGT CAG

AAC

CCC

ACG

GCT

ACC

877

Glu

Met

Ala

GJn

Ile

GGn

Asn

Ala

Val GGe.

Asn

His

Thr

Ala

Thr

115

110

115

ATG

CTG

gag;

ATA

GGA

ACA

AGC

ATC

CTC

TCT CAG

ACT

GCA

GAG

CAG

ACC

S 55

Met

Leu

Glu

Ile

Gly

Thr

Ssr

Leu

Ssr Gin

Thr

Ali

Glu

Gln

Thr

130

15A

1401

AGA

AAG

CTG

aca

GAT

GGT

GAG

CAA

CAG

GTA CTA

GCCT

CAC

ACT

TCT

CGA

8 S3

Arg

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Glu

Thr

Gin

Val Leu

Asn

Gln

Thr

Ser

Arg

145

100

555

189 639

CTT

GAG ATA CAG

CTG

CCT

CAG AT

TCA

TTA CTC

Ad

CTA

AG

CCA

ClA

531

Leu

Glu Ile Gln

Leu

Llu

Clu Asn

Sse

Leu See

CTt

CTy

Cyy

Clu

160

165

110

AAG

CAA CTT CTT

CCA

ACA AT

GGA

ATC TTT

AA

AAT

CCA

GA

WA

50 0

Lys

Gln Leu Leu

Gln

Cln

Thr Asn

Glu

1ll L^u

Lyy

Ilu

His

Glu

Ley

175

180

185

110

AAC

AGT TTA TTA

GA

CCA

AA ATCC

TTA

GTA ATG

GA

GGA

CAA

CAC

AG

020

Asn

Ser Leu Leu

GGl

His

Lys Ile

Leu

Glu Mee

Glu

Gly

Ly/y

His

Lys

195

200

225

GAA

GAG TTG GAC

AAC

TTT

CAG GAA

GAG

AA GAG

AC

CTT

CA

GGC

TTG

015

Glu

Glu Leu Asp

TTh

Clu

Lys Glu

Glu

Lys Glu

Asn

Leu

Gln

Gly

Leu

210

215

220

GTT

ACT CGT CA

AAA

TTA

ATA ATC

CAG

GAG CTG

GAA

AG

CA

TTA

A^tC

1023

Val

Thr Arg Gln

TTh

TTr

Ile Ile

Gln

Glu Leu

Glu

Lys

Gln

Leu

Asn

225

230

235

AGA

GCT ACC ACC

AAC

AGT GTC

CTT

CAG AAG

CAA

CA

CTA

GAA

CTA

1011 Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu

Leu

240

245

220

ATG

GAC ACA GTC

CCA

AC

CTT GTC

LA

CTT TG<C

ACT

ITGT

GAA

GGT

GTT

1119

Met

Asp Thr Vai

His

CAn

Leu Val

Asn

Leu Cys

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

255

260

225

270

TTA

CTA LA GGA

GGA

/AA

AGA GAG

GAA

GAG -AA.

CCA

TTT

AGA

GAC

TGT

1167

Leu

Leu Lys Gly

Gln

Ley

A^<g Glu

Glu

Glu Lys

Pro

Phe

A^«g

Asp

Cys

275

220

225

GCA

GAT GTA TAT

CCA

CAC

GGT TTT

AT

AAA AGT

GGA

ATC

TAC

ACT

ATT

1215

Ala

Asp Val Tyr

Gln

CAl

Gly Phe

Asn

Lys Ssr

Gly

IJ^e

Tyr

Thr

I(^e

290

295

300

TAT

ATT /AAT ΑΤ

AA^

CCA

GAA C<^<C

AA

CAG GTG

TTT

TGCC

AT

ATG

GAT

12 (53

Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp

189 639

305 310 315

GTC

AAT

GGG

TGA

GTT

GTG

AAC

GTA

ATA

CCA

CC^T

GCT

MCA

GTT

AGA

ATT

1111

Val

Asn

Gli'

Gly

GTp

Thr

Val

Ile

Gln

His

Sap

G1u

Ass

Aly

Sst

320

330

CTA

GAT

TTC

CCGC

AGA

GTC

TGG

SATG

GAA

TAT

GATT

ATG

GTT

ttt

GGA

GATT

1359

Leu

Asp

Phe

Gln

Arg

Gly

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Gly

PPs;

Gly

Asn

335

340

344

330

CCC

TCC

GGT

CGA

GTC

GTT

GCT

GTT

GAC

SlG

TCC

ACT

TTT

GTC

ATT

ACC

14(40

Pro

Ser

Gly

GTu

Gtg

GTp

Glu

Gl'

As^

Gln

SPh

Alu

Gph

ATn

Sln

TCh

355

330

AGT

CAG

AGT

TAC

GTC

AGC

GCtA

AGA

ATT

GlG

TTT

AGC

GTT

TTG

AlA

GTT

114 5

Ser

Gln

Arg

gCn

Ttg

Met

Glu

Asr

Ilu

Gln

Glu

Met

Ass

Ttp

Glu

Gli'

370

337

330

AAC

CGA

GCT

CTC

TCC

GCC

TTC

GTC

AGA

TTC

t^t

AGA

GGA

AAT

GGAC

AAG

1150

Asn

Arg

Ais

Ttg

See

Gln

Ttg

Asp

Asg

PPh

His

Ilu

Gly

Asn

Glu

Llg

385

390

395

CAA

AAC

TAT

ACG

TTC

TTG

TTA

SAAC

GGT

CC:C

ACT

GTT

ACA

GCA

GGA

gagt

1155

Gln

Asn

Tyc

Asg

Llu

Gtg

Llu

LyG

Gly

His

TCh

Gly

TTr

Ala

Gly

Llg

400

4^5

440

CAG

AGC

CTT

ATC

TTA

CAC

GGT

GCT

GAT

TTT

AGC

ACT

GATT

GAT

GTT

1159

Gln

Ser

SeS

Llu

Ile;

Llu

His

Gly

Ala

Asp

PPti

Ser

Thr

Llg

Asp

Ala

415

440

442

440

GAT

AAT

gag;

AAC

TGT

ATG

TGC

SAST

TTT

GTC

CTC

ATG

TTA

ACA

GGA

1164

Asp

Asn

Asa

Agn

Ccs

Met

Cys

Lys

Cys

ATa

Llu

Met

Leu

Thr

Gly

435

444)

445

TGG

TTT

GAT

GTT

TGT

GGC

CCC

TCC

GATT

CTA

AGAT

GGA

ATG

TTC

TAT

1105

Trp

PhP

As p

Ala

Cys

Gly

Ppo

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Phe

Tyr

450

455

460

189 639

ACT

GCG

GGA

AAA AAC

AAC

TGA

CCT

AAA

GGG

ATA

AAA

TGG

CAG

TAC

1743

Thr

Ala

Gly

Ali Asn

His

HGy GLy

Lee

Aah

G!^yy

Ile

Ley

Trp

Hss

Tyr

465

470

475

TTC

AAA

GGG

ACC AGT

GAC

CTC TTA

CGT

tcc:

ACA

ACC

AAG

ATG

ATT

CGA

17 91

Phe

Lys

Gly

Gro Ger

eor

Oee Leu

Arg

See

Thr

Met

11 e

Arg

480

485

4 90

CCT

TTA

GAT

TTT TGA

AAG

CGCA ACGCCCGCCA

CACCCCCAAC CAcCCCCCCA

ACCCC

1848

Pro Leu Asp Phe

495

CAGCACAGCC	GACAGGCGAG	AAA^C T (9 TTTG	?AAA^(CTT(^C^G	AAACCAACAC	TACTCACCCC	1908
Α^^^Α^	CACGCGGCAA	TTATGAGMC		CCCCGACAGC	GACCCACGAG	1968
CCACCCACGC	CCACCAAAGC	CTCTACTTGG	GGTGACAGTG	CCACAGCGGC	TCAACTATAG	2028
CACCACCCAC		GCTττrCAAAC		CGCCGAACCC	GGCTTGCTTC	2088
CAACCAACAC	CGGCCACCAC	TTTGGAACTA	TGGTAGCCAG	ACGACCACCC	TGGTTMTTT	2148

A 2149 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 2:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 498 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand 1 TIE-2 (B) POŁOŻENIE: 1...498 (D) INNE INFORMACJE: z klonu kgt10, kodującego ligand htie-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 2:

189 639

Met Thr Val Phe

Ile Gly Cys Ser

Tyr Asn Arg Ile

Glu His Asp Gly

Asn Ala Leu Gin

Gin Lys Leu Gin

Leu Gin Lys Leu

100

Ala Gin Ile Gin

115

Glu Ile Gly Thr

130

Leu Thr Asp Val

145

Ile Gin Leu Leu

Leu Leu Gin Gin

180

Leu Leu Glu His

195

Leu Asp Thr Leu

210

Leu Ser Phe Ala

Asn Gin Arg Arg

Gin His Gly Gin

Asn Cys Arg Glu

Arg Asp Ala Pro

His Leu Glu His

Glu Asn Tyr Ile

Gin Asn Ala Val

120

Ser Leu Leu Ser

135

Glu Thr Gin Val

150

Glu Asn Ser Leu

165

Thr Asn Glu Ile

Lys Ile Leu Glu

200

Lys Glu Glu Lys

215

Phe Leu Ala Ala

Ser Pro Glu Asn

Cys Ala Tyr Thr

Ser Thr Thr Asp

His Val Glu Pro

Val Met Glu Asn

Val Glu Asn Met

105

Gin Asn His Thr

Gin Thr Ala Glu

140

Leu Asn Gin Thr

155

Ser Thr Tyr Lys

170

Leu Lys Ile His

185

Met Glu Gly Lys

Glu Asn Leu Gin

220

Ile Leu Thr His

Ser Gly Arg Arg

Phe Ile Leu Pro

Gin Tyr Asn Thr

Asp Phe Ser Ser

Tyr Thr Gin Trp

Lys Ser Glu Met

110

Ala Thr Met Leu

125

Gin Thr Arg Lys

Ser Arg Leu Glu

160

Leu Glu Lys Gin

175

Glu Lys Asn Ser

190

His Lys Glu Glu

205

Gly Leu Val Thr

Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala

189 639

225 230 235 240

Thr

Thr Asn

Asn

Ser 245

Val

Ler t!n Lys

Gln Gln 250

Lm

Glu

Leu

Met 225

Aas

Thr

Val

His

Asn

Ler

Val

Asn

Leu

Cys

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Cmi

tLe

260

225

227

Lys

Gly

Lys

Arg

Glu

Giu

Lys

Pro

Phe

Arg

Aas>

Cys

AAl

Aas

275

220

Val

Tyr

Gln

Ala

Gly

Phr

Asn

Lys

Ser

Ile

Tyr

Thr

III

Tyr

Ill

290

225

300

Asn

Ann

Met

Pro

Glu

Pro

Lys

Les

Val

Phe

Cys

Asn

Met

Asp

Val

AAn

305

310

31B

332

Gly

Trp

Thr

Val

Ile

Gln

iss

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Leu

Aas

325

330

333

Phe

Gln

Arg

Gly

Trp

Lys

Glu

Tyt

lls

Met

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

340

33 5

330

Gly

Glu

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

Ile

Phe

Ala

III

Thr

Ser

Gln

355

330

335

Arg

Gln

Tyr

Leu

Arg

Ile

Glu

Leu

Met

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Arg

370

335

380

Ala

Tyr

Ser

Gln

Tyr

Asp

Arg

Phe

iss

lit

Gly

Asn

Glu

Lyt

Gln

A=^n

385

330

3!9ió

400

Tyr

Arg

Leu

Tyt

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ser

405

4 10

415

Ser

Leu

Ile

Le t 420

His

Gly

Ala Asp

PPh 442

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala 4 40

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

Met

Cys

Lys

Cys

AAl

Leu

Met

Leu

Thr

Gly

Trp

435

440

4H

Phe

Asp

Al a

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

PPh

Tyr

ΤΙ^ι:

Ala

455 460

450

189 639

Gly

Gln

Asn

His

Gly

Lys Leu

Asn

Gly

Ile

Lys Trp

His

Tyr

Phe

Lys

465

470

475

480

Gly

Pro

Ser

Tyr

Ser

Leu Arg

Ser

Thr

Met Met

Ile

Arg

Pro

Leu

485

490

495

Asp

Phe

(2)

IN

FORMACJE O

SEQ ID

nr

3:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2146 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

(li)	TYP CZĄSTECZKI: DNA
(ix)	CECHA:
(A)	NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca
(B)	POŁOŻENIE: 310...1800
(D)	INNE INFORMACJE:
NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand 1 TIE-2
(B)	POŁOŻENIE: 1...2146
(D)	INNNINFORMACJE: z Z łonu U 9898
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 3:

CAGCTGACTC	AGGCAGGCTC	CATGCGGAAC	CGTTGGGGAG		GTGGGTCTCG	60
GCTACTATGC	AATAAATATC	TCAAGTGTTA	ATGAGGATGG	GGGTCGCTGG	GGTGAGGCGG	120
AAAATTTTAA	AATTTTAGAA	CAGATGTGAC	GGATTGGGAT	TTCCCTGTGG	CTGTTCTTCG	110
AACGCTTTCT	TTGAGGGGGA	GGGGGTCGGG	CGAGCGGGGA	GCCTTAGCTG	GGGTGGGGGG	04 0
CTAGTTTTAG	AGGTCAGAAG	GGGGGAGCGG	GTCTCGCGGG	GGGCACGGAG	GGGGTGTGGC	300

GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG 351

Met Thr Val

Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala ile Leu

189 639

ACT

CAC

ATA

GGG

TGC

AGC

AAA

AAG

CGC

CGA

AGT

CCC

AM

TAA

TAG

TGG

039

Thr

His

Ile

Gly

Cys

SSe

Tm

Aln

Arg

Ser

Prr

TGu

Tm

Tse

TGu

15

20

15

30

AGA

TAT

AAC

CGG

AAT

ACA

CAT

GGG

cm

TCT

GGC

ATA

ACC

TTC

AAT

447

Arg

Tyr

Asn

Arg

Ilu

AGu

iss

Gly

Gln

Cys

AAn

TTy

Ttir

PPh

Ilu:

35

40

45

CTT

CCA

GAA

CAC

GAT

GGG

AAA

TGT

CGT

GAG

AGT

AAC

ACA

GAC

CAG

TAC

499

Leu

Pro

Glu

His

Asp

GGl

Am

Cys

AgA

Glu

Ser

Thr

Asp

Gln

Tyr

50

55

60

AAC

ACA

AAC

GCT

CTG

CAA

AAG

GAT

CTT

CCA

CAC

GTG

GM

CCG

GAT

TTC

543

Asn

Thr

Asn

Ala

Leu

GGn

Arg

Asp

Ulo

Poo

Hio

Val

Glu

Pro

Asp

PPe

65

70

75

TCT

TCC

CAG

AAA

CTT

CAA

CAT

CTG

AAA

CAT

GTG

ATG

GM

MT

TAT

ACT

551

Ser

ser

Gln

Lys

Leu

GGu

His

Leu

G1t

Sso

Val

Met

Glu

Asn

Tyr

Thr

80

85

90

CAG

TGG

CTG

CAA

AAA

CTT

GGA

AAT

ACT

ATT

GTG

GM

MC

ATG

MG

T CG

639

Gln

Trp

Leu

Gln

Lys

Llu

GGu

Asn

yro

ilT

Val

Glu

Asn

Met

Lys

Se r

95

10 0

100

110

GAG

ATG

GCC

CAG

ATA

CC^CG

CAG

AAT

CAT

GTT

CAG

MC

CAC

ACG

GCT

ACC

667

Glu

Met

Ala

Gln

Ile

GGu

Asn

Ulo

Vu4

Gln

Asn

His

Thr

Ala

Thr

115

100

115

ATG

CTG

GAG

ATA

GGA

AAC

AGC

CTC

TCT

CAG

ACT

GCA

GAG

CAG

ACC

735

Met

Leu

Glu

Ile

Gly

Thr

Ssr

Leu

eio

Sro

Gln

Thr

Ala

Glu

Gln

Thr

130

135

110

AGA

AAG

CTG

ACA

GAT

GGT

GAG

ACC

AGT

GTA

CTA

MT

CM

ACT

734

Arg

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

GGu

Thr

U1o

Va0

Leu

Asn

Gln

TłTr

Ser

Arg

145

1 SC

155.

CTT

GAG

ATA

CAG

CTG

CCT

GGA

AAT

CAA

TTA

TCC

ACC

TAC

MG

CTA

GAG

331

,eu Glu Ile Gln Leu Lee: Glu Asn Se r Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu

189 639

160 165 170

CCG

CCC

CTA

GCG

GCC.

GAC

GCA.

Gana

GCC.

ACA

tgt;

GAG

ATTC

CAC

GGA.

GCA.

87 9

Lys

Gln

LeL

Llu

GGn

STh

Aan

GGu

Ile

Llu

Lys

He

Hhi

GGu

Lys

175

180

185

190

CCC

AGT

TTA

GGCC

CAT

Sana

ATC

TTA

GGA

ATG

GGA

SCAC

CAC

GAG

907

Asn

ser

Leu

Glu

Hhi

Lys

Ile

Leu

Glu

Met

Glu

Gly

Lys

H Ls

Lys

195

000

005

GCC

GCG

TTG

GGCC

ACC

TTA

GAG

GGCC

GAG

Gcna

GAG

TAC

CTT

CAA

GGC

TTG

97 5

Glu

Leu

Asp

Thr

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Asn

Leu

Gln

Gly

Leu

010

201

200

GTT

ACT

CGC

TCC.

ACA.

GTC

STA

GAC

GAT

GAC.

GAC

SAC.

STA

GAC

1003

Vil

Thr

Ar.

GGu

STh

Sts

Siu

Sie

SGu

Lee

GGu

Lys

GGn

Leu

Ann

005

233

203

AGC

GCT

ACT

ACC

SAC

ACC

SAG

CCT¹

SAC

GAG

CAG

CCA.

CTG

GAG

CTG

1071

Crg

Cli

ThT

TGr

Ann

Sse

Val

Llu

GGu

Lys

GGn

Leu

GGu

Leu

000

Σ05

050

ATG

GCC

ACA

GAC

CAC

gac

CCG

GAG

SCT

CCG

TGC

ACT

GCA

GGCC

GTT

TTA

11^9

Met

Asp

ThT

Val

Hhi

Aan

Leu

Val

Ann

Leu

Cys

Thr

Lys

Glu

Val

Leu

055

060

065

070

CTA

ccg

GGA

Gana

AGA

GAG

Gnca

GAG

ACC.

CCA

ttt

AGA

GAC

TGT

GCA

1167

Leu

Lys

Gly

LyS

Aco

GGu

Lys

Pro

PPh

Arg

Asp

cys

Ala

075

080

085

GCT

GGC

tat;

cena

GCT

GGA

TTT

GAT

GCCC

AGT

GGA

ATC

TAC

ACT

ATT

TAT

1215

Csp

Vil

Tyr

Gln

Ala

GGy

PPe

Asn

Lys

Ser

Gly

II e

Tyr

Thr

Ile

Tyr

090

209

300

CTT

ACT

AAT

ATG

CCA

GGCC

CCC

GCTC

GAG

GTG

ttt

TGC

TAT

ATG

GAT

GTC

12 (53

eie

Asn

Met

Pro

Glu

Pro

Lys

Val

Phe

Cys

Asn

Mer

Asp

Val

3115

305

330

189 639

AAT

GGG

GGA

GGT

TGG

ACT

GTA

ATA

CAA

CAT

CGT

GAA

GAT

GGA

AGT

CTA

1311

Asn

Gly

Trp

Thr

Val

Ile

Gln

His

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Leu

320

325

330

GAT

TTC

CAA

AGA

GGC

TGG

AAG

GAA

TAT

AAA

ATG

GGT

TTT

GGA

AAT

CCC

1359

Asp

Phe

Gln

Arg

Gly

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

335

340

345

350

TCC

GGT

GAA

TAT

TGG

CTG

GGG

AAT

GAG

TTT

ATT

TTT

GCC

ATT

ACC

AGT

1407

Ser

Gly

Glu

Tyr

Trp

Leu

Gly

A8n

Glu

Phe

Ile

Phe

Ala

Ile

Thr

Ser

355

360

365

CAG

AGG

CAG

TAC

ATG

CTA

AGA

ATT

GAG

TTA

ATG

GAC

TGG

GAA

GGG

AAC

1455

Gln

Arg

Gln

Tyr

Met

Leu

Arg

Ile

Glu

Leu

Met

Asp

Trp

Glu

Gly

Aen

370

375

380

CGA

GCC

TAT

TCA

CAG

TAT

GAC

AGA

TTC

CAC

ATA

GGA

AAT

GAA

AAG

CAA

1503

Arg

Ala

Tyr

Ser

Gln

Tyr

Asp

Arg

Phe

His

Ile

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

385

390

395

AAC

TAT

AGG

TTG

TAT

TTA

AAA

GGT

CAC

ACT

GGG

ACA

GCA

GGA

AAA

CAG

1551

Asn

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

400

405

410

AGC

CTG

ATC

TTA

CAC

GGT

GCT

GAT

TTC

AGC

ACT

AAA

GAT

GCT

GAT

1599

Ser

Leu

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

415

420

425

430

AAT

GAC

AAC

TGT

ATG

TGC

AAA

TGT

GCC

CTC

ATG

TTA

ACA

GGA

TGG

1647

Asn

Asp

Asn

Cys

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Leu

Thr

Gly

Trp

435

440

445

TGG

TTT

GAT

GCT

TGT

GGC

CCC

TCC

AAT

CTA

AAT

GGA

ATG

TTC

TAT

ACT

1695

Trp

Phe

Asp

Ala

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Phe

Tyr

Thr

450

455

460

GCG

GGA

CAA

AAC

CAT

CGA

AAA

CTG

AAT

GGG

ATA

AAG

TGG

CAC

TAC

TTC

1743

Ala Gly Gln Asn His Arg Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe

189 639

465

470

475

AAA

GTT

CCC

ATT

TAC

TCC

TTA

CGT

TCC

ACA

ACT

ATT

ATG

ATT

CTA

CCC 1791

Lgs

GlG

Pro

Ser

TGr

Ser

Ltu

Arg

Sur

Thr

Wet

Het

lle

Arg

Pro

400

405

490

TTG TTT TTT TGA ASGTTTA ΑΤΙ^ΑΤΑ^ CTTTTTCGGT τyTTTTCGGy ΤΑΤ^α^ΤΑ 18 4 9

Leu Asp Pht

495

GAATTTTTTA	TGTTATAAAT	TTTTTGAAAA	TTTTAGAAGT	TAACAATATT	GTTTTTTTTT	1909
TATTAATAAG	TGGTAGTTAT	GTGASGTTAT	CAATTTTCTT	TATTGTGAAT	TTGTTGTTGT	1909
TTTTTCCCAC	ΑΤΤ^^Τ^	ACTTTTGGTG	TGATTGCTCA	CyTGTCTCGA	CTTTATAASA	2029
	TTTCTGTCCT	TAAAAAGTTA	ATAAACTTCT	ΤΑ^Τ^^Τ	TTTTTTAAST	2009
TTCTACCGGT	CCTTATTTTG	TAACTATTTT	ΑΙ^ΑΙΑ^Α	TAAATATGTT	TATTTTC	214 0

(2) INFORMACJE O SEQ ID nr 4:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 497 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand 1 TIE-2 (B) POŁOŻENIE: 1...2146

	(D) INNE	UNOOMACJE	: z kloou	k98G
	(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID nr	4 :
Net	Thr VvT PPe	Leu Ses Ptie	Ala Phe Les	Asa Ala	Ile	Les	Thr	His
1		5	0S				15
Ile	GlG Ccg Set	Asn Gin Arg	Arg Ser Prs	Glu Asn	Ser	Gly	Arg	Asp

189 639

Tyr

Am

Arg 35

He

Gln

ins

Aly

Aln 40

Csc

Ala

Tyr

Tiar

Phh 45

Iln

Leu

Pho

Gls

ins

Asp

Gly

Asn

Cys

Arg

Glu

Sse

Thr

Aas

Cln

TTy

Ann

TTr

50

55

60

Asn

Ala

Leu

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro

ins

Val

Alu

Pro

Asp

Phe

Ser

Ssr

65

00

75

80

Gln

Lys

Leu

Gln

His

Leu

Glu

His

Val

lU^I

Glu

Asn

Tyr

Thr

Gln

T rp

55

90

95

Leu

Gln

Lys

Leu

Glu

Asc

Tyr

Ue

V^1

Glu

Am

Mas

Mut

Sec

Gls

net

100

115

110

Ala

Gln

lle

Gln

Asn

Ala

Val

nnc

Asn

His

Thr

AGn

Thr

Me t

Leu

115

120

112

Gls

Ile

Gly

Thr

Ser

Leu

Ser

Gln

Thr

Ala

Glu

Gln

Thr

Ly/r

130

135

110

Les

Thr

Asp

Val

Glu

Thr

Gln

Val

luu

Asn

Aln

Thr

Ser

Arg

Leu

Glu

145

150

155

110

Ile

Gln

Leu

Glu

Asn

Ser

Leu

Sur

Thr

TyT

Lys

Leu

Glu

Ls-

Gln

165

170

117

Lus

Leu

Gln

Tlr

Z\sc

Glu

An

Leu

Lys

llcy

A ll

iSs

Lys

Asn

ser

150

115

110

Leu

Glu

His

Ly^^

Ile

Luu

Tlu

MtA

Glu

Gly

Lys

His

Llu

Clu

Glu

105

200

220

Les

Asp

Thr

Luu

Lys

Glu

Gls

Lys

Glu

Asn

Leu

Gln

Cly

Leu

Vvl

TTr

210

215

222

Arg

Gln

Thr

Ul

Ile

Gln

Glu

Leu

Tls

Lys

Gln

Luu

Asn

Arg

AAn

225

230

235

224

Thr

Asn

Am

Ssu

Val

Leu

Gln

Lys

Tln

Gln

Leu

Glu

Leu

Met

Aas

245

250

225

Thr Vvl· Cis Ain Leu UuI Asn Leu Cyc Thr Lys Cly Ali anC Leu Lys

189 639

260

265

270

Gly

LyT

Arg

Glu

Lys

Pro

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Asp

Val

075

280

28 5

Tyr

Gln

ATa

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Gly

Ile

Top

TOp

Ile

Tyr

Ile

Asn

090

205

330

Asn

Met

Pro

Glu

Ppo

Lys

Val

Phe

Cys

Acn

Met

Ατρ

Val

Ann

dar

305

310

330

Gly

Trp

Thr

Val

ile

Gln

Hii

Arg

du

Pas

Gly

Sst

Llu

Acn

PPs;

305

330

333

Gln

Arg

Gly

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lls

Met

dlT

PPh

dy

Asn

P^o

Sse

dy

340

335

330

Glu

TTr

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

PPe

Ile

Phe

Ala

ne

Thr

Ser

Gln

Arg

355

330

335

Gln

TTr

Met

Leu

Arg

Ile

Glu

Leu

MeP

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Arg

ATa

370

375

330

Tyr

Ssr

Gln

Tyr

Asp

Arg

[?he

His

Ile

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

Asn

Tyr

385

390

395

4 40

Arg

Leu

Tyr

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ser

405

440

445

Leu

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

400

445

430

Asn

cCy

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Leu

Thp

GSp

Gly

Trp

Phe

435

440

445

Asp

ATa

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asp

Gly

MeP

Phe

Tyo

Thr

Ala

Gly

450

455

4 60

Gln

Acn

His

Arg

Lys

Leu

Asn

Gly

Ile

Lsp

Trp

His

Tyo

Phe

Sn P

Gly

465

4 '70

475

440

Pro

Ser

Tyr

Ser

Leu

Arg

Ser

Tnr

Tho

Met

I le

Arg

Pro

Leu

Asp

Phe

435

4 90

495

189 639 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 5:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2282 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 357...1844 (D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand 2 TIE-2 (B) POŁOŻENIE: 1...2282 (D) INNE INFORMACJE: z klonu pBluescript KS, kodującego ludzki ligand 2 TIE-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 5:

CAATTTCTTC	TTTTTCTTTT	GTTTTCTCCT	ATTTTTTATT	CACTTACTTA	TATTGTACGA	00
TTTGCCGAGA	GATTATCATA	GGACCGTCAA	ATCTTCTTTT	TAAATTACTA	CACAGCCTTC	120
TTAAGTGAGT	aatactgtcc	TTCCCACTGC	GATCTTATAT	TTTTCTTTAT	GCCTGGTGAG	180
TACTCATCAG	ttaaaaccac	STTTGCTACT	CGTAAAA1AG	GTAATAA1AG	ATTTTCATTG	24 0
ACGGACCCAG	CTACTTTACT	ttagcagccc	TTTTCTTTAT	ACTGGACGAG	TCTCCGATCC	300
τιττατιττ	TTTTTCCTCA	AGTTTGCTGAS	TCTTTTTTTT	TTCTTCCC1A.	GAAACA ATG	359

eiet

TCC

CAG

ATT

GCC

TTC

TTT

ACT

CTG

AGC

TGT

GAT

CTT

GCC

TTG

GCC

GCA

4 47

Trp

Cln

11i

V vT

SPe

Pht

TTr

Leu

Ser

Cgs

Asp

Leu

Vvl

Leu

Ala

AAn

5

10

15

GTT

TTT

AAC

AAA

Ttt

TGC

JAG

AGC

ATG

TAC

PAT

ATA

GGA

ATG

C_CG

CCA.

4 S5

Ala Tyr Asn AAn khe Arg Lys kSr Met Asp Ser IIe Gly Lys Lys Gil

189 639

25 30

TAT CGG

GTG

CCG

ccg

GGG

TCC

TGC

GGC

TAC

GCT

TTC

CCC

CUG

S03

Tyr

Gln

VaV

Gin

tii

Gly

eer

Cys

err

Tyr

Thr

PPh

Cer

Aro

AGu

35

40

45

ATG

GAC

AAA

CTG

ccg

TCT

TCC

AGC

CCC

TAC

GUC

CCC

SAG

CUG’

AUT

S51

Met

Asp

Asa

Ccs

Asg

ero

eer

Pro

Tyr

Val

ter

AGn

AGu

Val

50

55

60

65

CGG

GGG

GAG

CGC

CCC

CTC

GAA

TAC

GAT

GAC

TCG

GUT

CCG

AGG

CCG

CCA

5599

Gln

Arg

Ass

AGn

Pro

Leu

Glu

Tyr

Asp

eer

Val

Cin

Ago

Leu

Gin

70

75

80

GTG

CTG

GAG

GAC

ATC

GTG

GGGC

GAC

ACT

CAG

TCG

CCA

ATG

SAG

CCT

647

Val

Leu

Glu

Asn

Ilu

Mrt

Glu

Asn

Thr

Gln

Tto

Ler

Mit

Lls

Lur

05

90

95

GAG

AAT

TAT

ATC

CAG

GAC

ATG

GAG

AGA

GAA

ATC

GTA

GGG

ATA

CCG

695

Glu

Asn

Tyc

Ile:

Gln

Gsp

Asn

Met

Lys

Glu

Mit

Val

GUu

Ile

Gin

100

10t

111

CAG

AAT

GCA

GTTG

CAG

GGC

CAG

ACG

GCT

GTG

ATG

ATA

GUA

ATA

GGG

ACA

74 S

Gln

Asn

Ais

Gil

Gsn

Gln

Thr

Ala

VaS

ir^t

Ill

Giu

Ilu

GJ^US

Thr

115

120

122

AAC

CTG

TTT

GAC

CCA

ACG

GCT

GAG

CGA

ACG

CGG

AAG

TTA

AGT

GAT

GTG

t S1

Asn

Leu

Asn

Gln

Tho

Ala

Glu

Gln

Thr

Arg

Lls

Ler

TTh

Asp

Val

130

135

14C

115

GAA

GCC

CA

GTA

TTA

GGT

CAG

ACC

ACG

AGA

CTT

GUGG

CCT

CAG

CTC

TTG

8 S9

Glu

Ala

Gln

Val

Leu

Gsn

Gln

Thr

Arg

Leu

Giu

Leu

Gln

Leu

150

15C

110

UGA

CAC

TCT

CCC

TCC

ACG

GAC

GAA

TTG

GAA

GGA

CCG

AGT

TTG

GAC

CAG

887

Glu

iis

See

Ler

Ser

Thr

Asn

Lys

Leu

Glu

Lys

Gin

Ill

Ler

Asp

Gin

165

170

175

189 639

CAA

CAG

GTGC

ATA

GCA

SACC

TTG

ccca

GAC

SAG

SCT

GCG

STA

GGA

SAG

935

Thr

ser

Glu

Ile

Asn

Lys

Leu

GGn

Αήρ

Syr

Gan

Gst

SPi

Seu

GGu

Sys

190

115

119

aan

ATG

CTA

a^u^T

ATG

GAA

GAC

GGA

CCC

STA

SCT

SAA

SAG

S^G

SAG

ATA

98 3

Lys

ail

Leu

Ala

Met

Glu

Asp

Lys

Hii

Ile

Sie

SGu

Leu

SUe

Sse

Het

195

200

205

ATA

ACC

GAG

GACA

GAT

CAG

CTA

CAG

GGT

TTA

GAA

SAC

GAC

STA

GCA

TCC

4554

Lys

Glu

Lys

Asp

Gln

Leu

Gln

Val

Leu

Sal

Gsr

Lys

SUn

Asn

Ssr

010

205

220

200

CTA

CTT

G7GC

Guna

CTA

GGCC

AAA

GCCC

ATA

GTG

ATT

SAC

ATG

GAG

GAT

GCCT

107 9

Ile

I le

Glu

Leu

Glu

Lys

IIl

Val

Thir

ACl

Thr

Val

Asn

030

205

200

TAC

GTT

CTT

cena

SCCG

CAG

cena

CAT

GAT

CTC

ACG

SAG

ACA

GTT

GATT

GClC

4420

ser

ail

Leu

Gln

Lys

Gln

His

Asp

Leu

Met

GGu

Thr

Val

Asn

005

050

055

TTC

ATG

ACT

TCTG

ATG

TCC

AAA

TCA

GCCC

TCA

GAT

SCCG

GAC

CCC

ACT

GTT

440 5

Leu

Thr

Met

Ser

Tl^ir

Ser

Asn

Ser

Ale

Lys

Asp

Pro

Thr

Val

060

206

200

GAT

CCA

GTAC

GAA

ceaa

ATC

AGC

TTC

AGA

GAC

TTG¹

SCT

GGCC

GTA

TTC

SGAC

4225

Cli

Lys

Glu

Gln

Ile

Ser

Phe

Arg

Asp

Ser

Ala

GGu

Val

Phe

Lys

075

200

205

TAC

nna

CAC

acc

ACA

GCCT

GGC

ATC

TAC

ACG

GGA

ACA

TAC

CCT

GACT

TCT

4204

ser

Gly

Hih

Tiar

Thr

Asn

Gly

Ile

Tyr

Thr

Geu

Thr

PPh

Pro

Asn

Ssr

090

205

300

335

CAC

ACA

GAG

ATC

SCCG

GCC

TAC

TGT

GAC

ATT

SGA.

GAT

GGA

GGC

GGG

4349

Thr

Alu

Glu

He

Lys

Aal

Tyr

Ces

Aap

Get

GGu

Gle

GGy

Gly

310

331

330

GGG

CAC

ATT

ACT

CCAG

CGA

CGT

GAG

GGl

SAG

STA

GGT'

GAT

TTT

CAG

AGG

13 67

Trp Thr Ile Ile Gir. Arg Arg Glu Asp Ole 0er Oal Osp Phe Gln Arg

189 639

325 330 335

CCT

TGG

ATC\

GGA

GCT

TAT

GGG

ggg

GTT

ggg

vcc

GCC

GTC

GGG

GGA

kcn

144^

Thr

Trp

Lys

siu

Tts

kys

Vv1

GCn

PPe

Gln

Gns

kPr

Gsu

Gin

kle

Gcr

340

358

330

TGG

CTG

GGA

GAT

GAC

TTT

GGT

gtc

GCA

GCC

gtc

GTT

GCC

GCA

GCC

kcn

146 6

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

PPe

Vvl

Geu

kin

Glu

GTr

Gnn

Glu

Gin

GAr

kcs

355

330

335

GTG

CTT

atat

TATTC

CAC

CCT

kCAC

GAC

TTG

GGA

GGG

GAT

GGC

GCT

GTC

1511

Vai

Luu

Lys

IIe

Hhs

Llu

Lys

Asp

Ττρ

Glu

klas

Ann

kle

ATa

ker

Geu

370

337

336

TTG

TAT

GTGT

CAT

TTC

TAT

CTC

TCA

AGT

gccc

GGA

CCC

TAT

kcn

ACG

ATT

1559

Leu

Tyr

Glu

His

PPe

Tyr

Lyu

Ser

Glu

Llu

Αηπ

ker

AAr

GIl

390

33^

440

CAC

CTT

ATCC

GGA

CTT

ACA

GGG

ACA

GCC

GGC

GACA

ATA

acc

ACG

ATC

atc

V<507

His

Leu

Lys

Gly

Leu

Tiar

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ssu

Seu

He

Ser

405

440

441

CAA

CCA

GGA

TTTT

GAT

TTT

AGC

ACA

TTTG

GAT

GGA

GAC

TT\C

GAC

TATT

TTG

1655

Gln

Pro

Gly

Asn

Asp

Phe

Ser

TPr

Lys

Asp

GCy

Asp

Ann

Asp

Lys

CCs

420

445

443

ATT

TGC

ATCC

TGT

TCA

CCCT

ATG

CTA

ACA

GGA

ggc

TTG

TTT

GAT

GCA

1703

Ilu

Cys

Lys

Cys

Ser

GCn

Me t

Lyu

Ther

G1.S

Gl./

Ττρ

PPe

Asp

ATa

435

440

488

TGT

GGT

CCT

TCC

TCTC

TTG

tctc

GGA

ATG

TAC

TTT

CCA

CAG

AGG

CC^CJ

PAC

1-751

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Llu

Ann

Gly

Me^t

Tyr

T9S

Ppo

Gln

aao

Gln

Αηπ

450

445

446

ACA

AAT

AAG

TTC

tctc

GC^C

ATT

TCAT

TGG

TAC

TTC

TTG

GATT

GGC

TCA

GGC

1-799

Thr

Asn

Lys

PPe

Asn

Gly

IIa

Lys

Trp

Tyr

Ττρ

Lys

GJ^y

Ser

Glos

470 447» 480

189 639

TAT TCG CTC MG CΑΑ ACA ACC ATG ATG ATC TCΑ CCA GCA GAT TTC TAMC 187 9

Tyr Ser Lei Lys Ala Thr Thr Met Met lle Arg Pro Ala Asp Phe

785 790 795

ATACCAGhAC	TCChCTCCGT	ChGTChCCGT	ATAhThhCM	TGACThGTGC	ACTCTCCACT	1909
CGATCTCGCC	GChCCCATCh	GTGhAChChh	ACGCCTCGCT	GGGCGhChCA	TAGGTCCTGT	1969
CCCGGCCCTC	AhGATCCGGA	TTTCAGCATG	TAATCThhAT	CACTTATTAh	hCCTTCACTT	1019
AAAGCGCCTT	ACCATCTCCC	hAATAThCCT	hGAhTGhCGh	TACTATGGTA	TCATGTCCAT	1089
GGAhCATCCC	GGCCAhGAGA	GhCTGAChCG	CGChThGCGC	GCGCTGAhGT	AACATCCATC	1179
AThGTTGTGh	GCATChTTGT	CGGhTAATGT	ChGGTTATCA	GAACACTTAT	ChTGTΑCΑΑh	1109
GΑΑGΑTCTTΑ	TTGCGTCTGA	ThTAThCTCG	CCGChGhTTA	TACACTChCT	GTATGCAAAh	H69
GhCTCChGTT	TTC					1181

(2) INFORMACJE O SEQ ID ne 6:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 496 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTECCZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CEHHA:

(A) NACWA/ZLUCC: Ludzki ligand 2 TIE-2 (B) POŁOŻENIE: 1...496 (D) INNE INFORMACJE: z klonu pBluescript ZS, kodującego ludzkie ligand 2 TIE-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 6:

Met 1

Trp

GJLn

IIL5

Val 5

Phe

Thr

Leu

Ser 10

Cys

Asp

Leu

Vu0

Lei 15

Ala

Tyr

Am

Asn

Phie

Arg

Lys

Ser

Met

Asp

Seo

Ile

G1t

Lys

150

189 639

Gli

Tyr

dn 35

Val

dn

Hss

Gly

Ser 40

Cys

See

Arr

Tho

Ple e 45

Llu

LLe

Ppo

Glu

Met

Aah

Asn

C(s

AAg

Ser

See

Gee

Pro

T^

Aal

Ser

Aim

AAa

50

55

60

Val

Gln

ArA

AAp

Ala

Pro

Leu

Glu

Tyr

Asp

Seo

Val

Gln

Aog

Llu

65

70

75

80

Gli

Val

LeL

du

Asn

Ile

Met

Glu

Asn

Thr

Gln

Top

Leu

Met

LLy

85

90

95

Leu

Glu

Asn

Tyr

Ile

Gln

Asp

Asn

Met

Lys

Glu

Met

Val

dl

AIe

100

105

111

Gln

Asn

Ala

Val

Gln

Asn

Glo

Thr

Ala

Val

Met

Ua

Glu

Ile

Gly

115

12 0

255

Thr

Asn

Leu

Asn

Gln

Thr

Ala

Glu

Gln

Thr

AA^

Lys

Leu

Thr

Asp

130

135

110

Val

Glu

Ala

Gln

Val

Leu

Asn

aln

Thr

Tiar

Arg

Leu

du

Leu

Gln

Leu

145

150

1.55

1150

Leu

Glu

His

Ser

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

Leu

Glu

Lys

Gln

He

Leu

Asp

165

170

115

Gln

Thr

Ser

Glu

Ile

Asn

Lys

Leu

Gln

Asp

Lys

Asn

Ser

Phe

Ll!

Glu

180

185

119

Lys

Val

LeA

Ala

Met

du

Hsa

Lys

His

Ile

do

Leu

Gln

Seo

195

00 0

005

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gln

Leu

Gln

Val

Leu

Vvl

Ser

Lys

Gln

Asn

210

215

222

Ser

Ile

Glu

Leu

Glu

Lys

Ile

Val

Thr

Ala

Thr

Val

Asn

225

230

235

240

Asn

Ser

Val

Leu

Gln

Lys

Gln

His

Asp

Leu

Me t

mu

Thr

Val

Asn

245

250

225

fsi Leu Leu Thr Met Mec Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp ?rr Th

189 639

260 276 270

Val

Ala Lys 275

Glu

Glu Gln

Ile

Ssu Phe Ang Asp Cys ATu

Glu

Vvl

Chh

225

Lys

Ser

Gly

Hic

TTr

Thr

Am

Gly

lle

Tur

Thr

Leu

TTr

Chh

Cpo

Asn

200

220

330

Sur

Thr

Glu

Ile

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Glu

GUi

Aty

Gty

Gly

305

310

315

320

Gly

Trp

Tiar

Ile

Gln

Arg

Alu

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

hhe

Gln

325

330

333

Grg

Thr

tiop

Lys

Glu

Tye

Ly/r

Vat

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Gly/

Glu

340

345

350

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

PUe

Vvl

Sur

Gln

Leu

Thr

Am

Gln

Ang

355

336

Tyr

Val

Leu

Lse

Ile

H i s

Lnu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Am

Glu

ATu

Tyn

370

3355

380

Sur

Luu

Tyr

Glu

Hi s

Phe

Tyr

Leu

Ser

Sur

Glu

Gtu

Leu

Am

Ttu

Ang

355

300

305

400

lle

ins

Leu

Lys

Aly

Lee

TTr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

lle

Ser

Ssu

Ue

405

410

4 41

Ser

Aln

Pro

Gly

Asn

Asp

Phh

Sur

Thr

Lys

Asp

Aly

Asp

Asn

Aap

Lys

420

425

430

Cys

llu

Cys

Lye

Cse

See

Gln

MeU

leu

Thr

Gly

Aly

Tto

Trp

Phh

Asp

435

444

Ala

Cys

Gly

Pro

SSr

Asn

Lnu

Asn

Tly

Met

Tyr

Pho

Cln

Ann

Gln

450

445

460

Asn

Thr

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

lle

lys

Trp

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

465

440

445

4 £30

Tly

Tyr

Ser

Leu

Ly/r

Ala

Thr

Mut

Met

Ile

Arg

hro

Ala

Asp

Phe

455

440

189 639 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 7:

(x) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 478 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Dojrzałe białko TLI (B) POŁOŻENIE: 1...478 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 7:

Gsn

Gln

Ano

Arg

Ser

Pro

GLg

Asn

Ser

Gly

Trg

Arg

Tyc

Asn

Arg

IIe

0

5

20

25

GUn

HiH

n ty

G Go

Cys

SA4

Tyr

Thr

Ile

Lp u

Pro

Glu

Hi g

Asp

G ly

00

2P

30

Gsn

CyC

A nr

GGa

Ser

Thr

hOp

Asp

Gln

Tyo

Gsn

Thp

Asn

Ala

Llh

Gln

35

40

45

Arg

Ast

A Tu

Ppo

His

\^^1

GLg

Pro

Asp

rhe

Ser

Sep

Gln

Lys

Llu

Gln

50

55

00

His

Leu

Glu

His

VaU

Met

G1p

Asn

Typ

Tho

GUn

Trp

Leu

Gln

Lys

Leu

05

7G

75

80

Glu

Gsn

T^^io

Ile

Val

Glu

Asg

Met

Lag

Ser

GUu

MeP

AU a

Gln

Ile

Gln

85

90

95

Gln

Asn

A Tu

Gvl

Gln

Asn

Hu

Thr

Ala

Thr

Met

Lep

Glu

ile

Giy

Thr

200

15 G

no

Ser

Leu

L lh

Psh

Gln

rnp

Ala

G lu

TUa

Thr

Ar g

Lgu

Leu

hO p

Asp

V al

115

'120

105.

Glu ThT Gil Zal Leu Asr. Glz Thr Srz Arg Leu Glz IIe Gln Leu Leu

189 639

130 115 140

Glu

Asn

Sei;

Leu

SSr

Thr

Tyi

Lys

Leu

Glu

Lji

Gli

Lru

Gln

GGn

175

HO

H5

116

Thr

Asn

Glu

Ile

Leu

Lys

IIu

iss

Glu

Lys

Asn

Ser

Leu

Glu

His

165

117

Lys

Iie

Leu

G1t

Me t

Glu

Gly

Lys

His

Lys

Glu

Leu

Asp

Thr

Llu

180

115

119

Lys

Glu

Gli

is 0

Glu

Asn

Llu

Gli

Gly

Lei

Val

Thr

Arg

Gln

Thr

Tyr

195

100

105

Ile

Iie

Gli

Lei

Gli

Lys

Gln

Lri

Asn

Arg

Ala

Thr

Asi

110

215

220

Ser

aan

Leu

Gln

Lys

Gln

GJLn

Lei

Glu

Leu

Met

Asp

Thr

Val

Hio

Asn

115

230

235

240

Lei

aan

Asn

Leu

Cys

Thr

Lys

Gli

Gly

Val

Leu

Lyo

Gly

Lys

175

210

255

Arg

Gli

Glu

G1o

Lys

?PC:

PPe

Arg

Asp

Cys

Ala

Asp

Va0

Tyr

Gln

Ala

160

215

210

Gly

Phr

Asn

Lys

Ser

Gly

IIe

Tyr

Thr

IlT

Tyr

Ile

Asn

Met

Ppo

175

210

2 8 53

Glu

Pro

Lys

Val

Phr

Cyi

Asn

Met

Asp

Val

Asn

dy

Gly

Trp

190

215

300

Thr

aal

Ile:

Gln

His

Arg

GGu

Asp

G^^y

Ser

Llu

Asp

Pho

Gln

Ar g

Gly

305

310

331

330

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lli

Met

G1 y

Phe

Gly

Asn

Prr

Ser

G1 y

Glu

Tyo

Trp

315

333

330

Lei

Gly

Asn

Glu

PPe

He

PPe

Ala

IIs

Thr

Ser

Gln

Arg

Gln

Tyr

MmU

370

337

335

Lei

Arg

Ile

GGu

Llu

Met

Aas

4ιψ

Gli

Gly

Asn

Arg

AAn

Tyr

Ser

Gln

355

336

335

189 639

Tyr

Asp

Arg

Phe

His

Ile

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

Asn

Tyr

Arg

Leu

Tyr

370

375

380

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ser

Leu

Ile

Leu

385

390

395

400

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

Met

405

410

415

Cys

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Leu

Thr

Gly

Trp

Phe

Asp

Ala

Cys

420

425

430

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Phe

Tyr

Thr

Ala

Gly

Gln

Asn

Hie

435

440

445

Gly

Lys

Leu

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

His

Tyr

Phe

Lys

Gly

Pro

Ser

Tyr

450

455

460

Ser

Leu

Arg

Ser

Thr

Met

Ile

Arg

Pro

Leu

Asp

Phe

465

470

475

(2) INFORMACJE O SEQ ID nr 8:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 480 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Dojrzałe białko TL2 (B) POŁOŻENIE: 1...480 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 8:

Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys

10 15

Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro

189 639

25 30

Glu

Met

Asp Asn 35

Cys

Arg

Ser

Sho Ssr 40

Ser

Pro Tyr

Vv1 45

Gee

Ann

ATo

Val

GUn

Arg

Asp

Ala

Pro

Lhl

Glu

Ty^sc

Asp

Aap

See

Pv1

GG^n

Arg

Lue

50

55

60

Gln

Val

Leu

Glu

Asn

Iie

Met

Glu

Asn

Cnn

Thr

Gln

T^i^p

Leu

Me t

Lys

05

70

7G

80

Leu

GUu

Asn

Tyr

11 e

GUn

Asp

Asn

Met

Lys

Glu

Me t

Val

Glu

IUe

85

90

95

Gln

dn

Asn

Ala

Val

Gln

Asn

Gln

Thr

TLIp

Val

Met

lip

Glu

Ile

Gly

200

205

120

Tho

Csn

Leu

Lei

Asn

Gln

Thr

AOa

Glu

Gln

Thr

Arg

Lys

Luu

Thr

Asp

225

000

125

VaU

GUu

Ala

Gln

Val

Leu

Gsn

Gln

Ttrno

Tho

Arg

Luu

du

Luu

Gln

Leu

230

H5

no

Lhl

GOu

His

Ser

Leu

Sec

Thr

Asn

Lys

Leu

Glu

Lyp

Gln

IIP

Leu

Asp

245

2550

15G

100

Gln

Tho

Ser

Glu

Ile

Asn

Lys

Leu

Gln

Asp

Lys

Asn

Ser

Php

Leu

Glu

005

270

105

Lys

VaO

Leu

Ala

Met

GUu

Asp

Lys

Hag

IlG

I1p

Gln

Luu

Gln

Ser

280

285

109

IUe

Lys

Glu

Lys

Asp

Gln

Lei

dn

VaO

Leu

VaP

Ssh

Lys

Gln

Asn

295

000

200

Ser

IlH

IlI

Glu

Luu

Glu

Lys

Ile

!^^1

TTr

ATa

TTr

Val

Asn

020

025

200

Gsn

Sho

Val

Luu

Gln

Lys

Gln

dn

HHs

Asp

Leu

Me t

Glu

Thr

Val

Ann

005

030

035

240

Gsn

Leu

Lhr

Mmh

Met

Thr

Ssh

Gsn

Ser

Ala

Lys

Asp

Pro

TTr

045 050 055

189 639

Va1

ASa

Lys

Alu 200

Glu

Gln

ISe

Set

PPh Arg 2^^

Asp Cys

Ala

Glu 220

Va1

Phe

Lgs

Ser

Gly

His

Thr

Ass

Gly

Ile

TGr

Thr

Leu

Thr

PPh;

Pro

Asn

275

280

1285

Str

Thr

Glu

ulu

ISt

Lys

ASa

TGr

Cgs

Asp

ett

Gle

A Ca

Gle

Te

Tle

290

229

300

TlG

Trp

Thr

IIe

Ile

Gln

Asp

Glu

Asp

GlG

Sur

Va1

Asp

Phe

Gln

305

310

315

332

Arg

Thr

Trp

Lys

Glu

TGr

Llg

TvT

GlG

Phe

ClG

Asn

Pro

Seo

ClG

Glu

325

333

TGr

Ttp

Luu

TlG

Asn

Glu

Phe

Val

Ser·

Gln

Ltu

Thr

Asn

Gln

Arg

340

334

335

TGr

VvT

Leu

Lgs

ISt

Hss

Leu

Llg

Asp

Trp

Glu

Gly

Ass

Glu

Ala

Tyr

355

330

Str

Leu

Tyr

Glu

Hss

his

Tyr

Ltu

Ser

Glu

Leu

Ac^n

Typ

Arg

370

335

338

Ile

iss

Leu

Lys

GlG

Luu

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Ile

Ser

Ile

385

390

395

4 00

Str

Tln

Pro

Gly

Asn

Asp

PPe

Ser

Thr

Lys

Asp

Gly

Asp

Asn

Asp

Lys

405

441

415

Tgs

IIe

Tys

Lys

Cys

Ser

Tln

Met

Leu

Thr

Gly

Trp

Phe

Asp

420

442

443

Ala

CTG

Gly

Pro

Ser

.sst

Leu

Asn

GlG

Met

Tyr

Ppo

Gln

Aog

Gln

435

4 40

444

Asn

Thr

Ass

Lys

Phe

.sst

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

TT^r

Top

Llg

TlG

Ser

450

445

440

ClG

TGr

Ser

S eu

Lys

Ala

Thr

TTr

eet

MeS

lis

Ars

Prs

Ala

Asp

Phe

405

470

47S

480

(2) INFORMACJE O SEQ IG nv 9:

189 639 (i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1849 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 47...1573 (D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ludzki ligand-3 TIE (B) POŁOŻENIE: 47...1549 (D) INNE INFORMACJE: Domena podobna do fibrynogenu zaczyna się w pozycji 929.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 9:

CTGTCCTGGT ACCTGACAAG ACCACCTCAC CACCACTTGG TCTCAG ATG CTC TGC 55

Met Leu Cys

CAG

CCA

GCT

ATG

CTA

GAT

GGC

CTC

CTG

GCC

ACC

ATG

GCT

103

Gln

Pro

Ala

Met

Leu

Asp

Gly

Leu

Ala

Thr

Met

Ala

5

10

15

GCA

GCC

CAG

CAC

AGA

GGG

CCA

GAA

GCC

GGT

GGG

CAC

CGC

CAG

ATT

CAC

151

Ala

Gln

His

Arg

Gly

Pro

Glu

Ala

Gly

His

Arg

Gln

Ile

His

20

25

30

35

CAG

GTC

CGG

CGT

GGC

CAG

TGC

AGC

TAC

ACC

TTT

GTG

CCG

GAG

CCT

199

Gln

Val

Arg

Gly

Gln

Cys

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Glu

Pro

40

45

50

GAT

ATC

TGC

CAG

CTG

GCG

CCG

ACA

GCG

CCT

GAG

GCT

TTG

GGG

GGC

247

Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly

189 639 (50

TCC	GCT	AGT	CTC	CAT	ATG	GCC	TTG	CCT
Sur	Csn	SeS	Olu	Cln	Arg	Gsp	Leu	Pro
		00					7A
GGC	TAA	CGC	TGC	CAG	AGG	GCC	CAG	CGG
Gsp	Top	Aru	AC. u	Cln	Arg	Cla	Gln	G^^g
	Θ5					00
GGA	GCA	ATA	CTA	GAG	IGGT	CCC	ACT	CAG
Alu	Lys	Ue	Ulu	Glu	Asn	Asn	T^^r	Gln
100					U5
TCC	CTC	AAG	GTG	AA^CC	TTG	GAA	TCA	CAC
Sen	lle	Lyn	Val	Asn	Leu	Ang	Une	Hsi
				120
GCG	GTC	CAG	/CGC	CAG	ACA	ACT	ACC	ATG
Thn	lle	Gln	Asn	Gln	Thr	Thn	hOe	[UeA
			135					44A
GTA	GCC	CAG	ACC	AAA	GCT	CCA	ACC	CAC
Met	Asn	Gln	Thr	Lys	Ala	AGn	hOe	Sse
		150					55 I
CAA	ATC	CTA	GCGC	CAG	ACA	TTG	TCC	ATT
Gln	Vil	Leu	Asn	Gln	Thr	Luu	Ss A	MeA
	165					100
TCA	CTG	TCC	ACC	-ACC	/CGG	CTA	TAC	CGC
Sen	Luu	Ser	Thr	Asn	Lys	Luu	GSe	Ar-
150					185
AGA	CTA	CAG	CGG	CTG	CAG	GAT	ACC	AAT
Glu	Luu	Gln	Arg	Leu	Gln	Gly	Ar-	Ane

700

65
GGC	TTG	ATG	CTC	CCC	CTA	AAA	2 A5
ATu	Asu	Ano	Teu	TiS	Lnu	TTh
			80
GGC	CAG	CCG	GTT5	AGC	CAG	CTG	34 3
Ain	Gin	Arg	Vvl	Sse	Gln	Lnu
		95
TGG	CTG	CTG	CAG	CTG	GAG	CAG	301
Trp	Leu	Leu	Lys	Leu	Glu	Gln
	110					115
CTG	GTG	CAG	GCC	CAG	CAG	GAC	4 30
Leu	Val	Gln	Ala	Gln	Gln	Asp
115					130
CTG	GCA	CTG	GGT	GCC	AAC	CTC	4 β0
Leu	Ala	Leu	Gly	Ala	Asn	Leu
				115
/CGG	CTG	ACT	GCT	GTG	GAG	GCA	535
Lys	Leu	Thr	Ala	Val	Glu	Ala
			160
/CCG	ACC	CAA	ATG	CTG	GAG	A^<C	553
Lys	Thr	Gln	Met	Leu	Glu	Asn
		1*7^
CAG	ATG	CTG	A*^G	CAG	AGC	CGA	631
Gln	Met	Leu	Met	Gln	Ser	Arg
	190					195
AGG	GCC	CTG	GAG	ACC	AGG	CTG	67 0
Arg	Ala	Leu	Glu	Thr	Arg	Leu

205

270

189 639

CAG

GCG

CTC

GGGG

CCA

GCC

CAG

CCC

GUC

GCT

SSAC

CCG

CCC

CCC.

CGC

S27

Gln

Gla

Leu

Glu

ST a

Gin

His

Gin

AGl

Gin

Aur

Am

Ser

Cer

CUu

Giu

215

222

GGG

CUG

G/GG

CCAG

CCG

CAG

AGT

CCT

GGG

GCC

CCC

ACC

CGG

ACC

GCT

S75

Lys

Grg

Glu

Gil.

Luu

His

Ser

Luu

Gin

Ais

CUu

GCh

CUu

GCh

tur

230

223

224

GCT

AGC

CTC

GGGG

CAC

ATT

CTG

CAG

GUC

GCT

ccg:

ACG

AGC

ccc:

ACG

TGC

S 2 03

Gla

Gsn

Leu

Lys

Hi s

Asn

Leu

His

AGl

Aur

See

Set

Ass

Set

Ser

See

245

220

255

CTG

CGG

CAC

CAG

CCGG

CTG

AGC

GGC

ATT

CGA

CCC

CCG

CCC

GTA

871

Leu

Gln

Luu

TTh

Giu

APh

Cal

Ciu

Asp

Luu

Val

250

225

270

227

CUG

GTT

GTA

GCC

CAG

GUT

CAG

CAT

CCC

GUT

ccc:

GTA

AAT

ACA

CCT

SAGG

911

Grg

llr

Val

Al a

Gln

Asp

Gln

His

Prr

Cal

See

Cur

Sus

GCh

Pro

Lus

280

205

290

CCG

GTG

TTC

CAG

GAC

TG^

GCA

GAG

AGC

/CC

ccg:

ccc:

CGG

GUT

AGAT

ACC

9iT

Pro

Val

Phr

Gln

Asp

Cys

Ala

Giu

Ilu

tes

Ago

Set

Giy

Val

Asn

Thr

295

330

3305

GUC

GGT

GTC

TAT

ACCC

ATC

TAT

GAG

ACC

SCAC

ATG

ACA

CCGG

CCT

CTC

/CG

1015

3er

Gly

Val

Ty r

Thr

Ile:

Tyr

Giu

Thr

Cm

Cet

GCh

tes

Pro

Luu

Les

310

331

332

UTU

TTC

TGT

GAC

ATG

GAG

ACT

GAT

GGA

TG

GGG

TAG

ACC

CCC

ATC

CAG

1053

Val

Phr

Cyy

Asp

Met

Giu

Thr

Asp

Gi|

Giu

Cep

GCh

Lue

Ile:

Gin

325

330

3235

CCC

CGG

GAG

GAT

GGA

AGC

GTA

ATT

TTT

GCC

ccg:

CCC

GAG

GGTG

GGCG

TAC

1111

iis

Arg

Glu

Ass

Gly

Ser

Val

Am

PPh

Gin

Asg:

GCh

Cep

Clii

Giu

Tts

340

335

3^0

335

GGG

UGG

GGG

TTT

GGG

/CC

GTG

GUC

AGA

CUT

CCT

GAG

CCC

CGG

tsTC

GAC

1159

Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu

189 639

360

365

370

GAT

ATA

CAC

CCC

CAC

ACC

AGA

AGG

GAC

SAG

TGC

CTA

GCA

GTG

GGA.

1207

Cli

Vil

Hu

Arg

Leu

TGr

Sst

Arg

TCh

Ala

Sir

Leu

Llu

Arg

Val

GGu

375

338

385

TTG

CAT

GAC

TGG

g/ac

GGC

CC^C

CAG

ACC

TAC

AGC

GAG

TAT

GCG

/AAC

TTC

4355

Leu

His

Asp

Trp

Glu

Gly

Arg

Gln

Thr

Ssr

Ile

Gln

Tyr

Glu

Asn

PPh

390

335

400

TCG

ATA

uGC

AGC

GAG

AGG

CAG

CGG

TAC

AGC

CTC

TCT

GTG

G.AC

GAC

AGC

1303

Gln

Leu

Gly

Ssr

Glu

Arg

Gln

Arg

Tyr

Sst;

Llu

ser

Val

Csn

Asp

Ser

005

4 10

415

CAC

AAG

TCA

GCA

GGG

CGC

GAAG

SACC

AGC

CTG

GCT

ACT

CAG

GCC

ACC

/ACG

1351

str

Ser

Ala

Gly

Arg

Lys

Asn

Ser

Leu

Ala

Pro

Gln

Gly

Thr

Lys

000

005

030

035

TTG

CGG

ACC

cana

GAC

ATG

GAC

/ACT

GAT

SACC

TGC

CTA

TGT

acc

TGT

GCT

1399

Phe

ser

Thr

Lys

Asp

Met

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

000

005

050

ACG

CTG

TCT

GGA

GGG

TGG

TTT

GAT

GCC

TGT

GGC

GTC

TCC

AAC

14 0 7

Gln

Met

Leu

Ser

Gly

Trp

T rp

Phe

Asp

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Asn

055

460

655

ATC

CTG

GGC

ATC

TAC

TAT

TCA

GTT

CAT

CAG

CAC

TTC

CAC

CCAG

ATC

AAT

14 95

Ltu

Csn

Gly

Ile

Tyr

Ser

Val

His

Gln

His

Ltu

His

Lys

Ile

Asn

070

4 75

400

AAC

ATA

CGC

TGG

CAC

TAC

TTC

CGA

GGC

CCC

AGC

TCC

TCA

CTG

CAC

GGC

154 3

Gly

Ile

Ar ar

Trp

His

Tyr

Phe

A^rg

Gly

Pro

Ser

Tyr

Ser

Leu

His

Gly

085

490

495

CCC

AGC

ATG

CTG

AGG

CCA

CGG

GGT

GAG

TGA

CGGACCG

CCCTGCAGAG ACT

1596

Thr Crg Met Het Leu Crg Pro Met Gly Cli

50A

505

189 639

ACrGAAACCC	GAAAcrrArA	AACCCCCGGTG	ACCCCCACGA	Α^Α^ΚΑΑ	AGCCCAGCAGA	1656
CCCGCACACA	GGAACCCCCC	TGACATTCTG	GACCACCCGA	ACCACGACAC	ATTGCCCCTG	1716
CCrCCCACGC	CCCAACCCAC	CTCCCTGTTG	CCCCCCCACC	AGCAACCCCA	AGGGTGCTTG	1777
AAGGCCCCCA	ACCArGCCGG	AACCATACTC	Gcrccccccc	ACCAACAACC	ACCGGGAATC	1833
CCrACCACGA	AAT					184 9

(2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 10:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 509 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny

(ix)	CECHA:
(A)	NAZWA/KLUCZ: Ludzki	ligand-3 TIE
(B)	POŁOŻENIE: 1...509
(D)	INNE INFORMACJE:
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ	ID nr 10:

Met

Leu

Cys

Gln

Pro

Ala

Met

Leu

Asp

Gly

Leu

dli

1

5

00

15

Thr

Met

Ala

dn

Hss

Arg

Gly

Pro

Glu

Ala

Gly

His

Arg

20

25

30

Gln

Ile

His

dn

Val

Arg

Aog

Gly

Gln

Cha

Seo

Tyr

Thr

Pho

V^ć^1

Val

35

40

45

Pro

Glu

Pro

AAp

Ile

Ccy

Gln

Leu

Ala

Pro

Tho

Ala

Pro

du

AAa

50

55

60

Leu

Gly

See

Asn

Sno

Leu

G ln

Aeu

Asp

Le u

PAA

Ala

Hp 0

Are

Leu

65

00

75

80

Hss

Leu

Thr

Aah

Trp

Aro

Ala

G ln

Ala

G1 n

Aaa

Ala

ii a

Arl

Val

189 639

9P 95

Sur Gli Llu Glu Lys 100

Ile

Leu GUi Asn Asn Thr 10^

GUn

Hp

Lee m

Alu

Tji

Lri

Gli

GGn

Str

Ile

Lys

vai

Am

Leu

Arg

Sur

Hss

Llu

AsI

AGn

TAu

115

111

Gli

Aas

T^r

Ile

Gin

Am

Gli

Thr

Met

Teu

AAu

Leu

GG

130

m

117

Ala

Asi

Llu

Mrt

Asn

G:n

TT^

Lys

Ala

GUi

TT^

Hss

Lys

Leu

Thr

AAu

175

1^50

H5

116

aal

GUi

AA u

GUi

Val

Llu

Am

Gli

Thr

Lru

His

Mrt

Lys

Thr

GGu.

Met

165

700

117

Lri

Gli

Am

Ser

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

Lru

Glu

Arg

Gln

Met

Leu

Mm t

180

185

110

Gli

Ser

Arg

Glu

Leu

Gln

Arg

Llu

Gli

GUy

Arg

Asn

Arg

Ala

Leu

Glu

195

210

21^^

Thr

Arg

Leu

Gln

Ala

Leu

GGu

Ala

Gln

His

Gln

Ala

Gin

Leu

Asn

Ser

110

215

210

Lei

GUn

Glu

Lys

Arg

Glu

Gln

Lri

His

Ser

Leu

Lru

Gly

His

Gin

Thr

004

230

213

210

Gly

Thr

Leu

Al a

Asn

Leu

Lji

iss

Asn

Leu

His

Ala

Leu

Ser

Asn

175

50 0

215

Ser

Leu

Gln

Leu

Thr

Glu

Phe

Val

Gin

160

265

210

Arg

Lei

val

Arg

IUa

Va0

Ala

GGn

Asp

Gln

His

Pro

Val

Ser

Leu

Lys

175

2^0

215

Thr

Pro

Lys

Pro

Va4

PPie

Gln

Asp

Cys

Ala

Giu

He

Lys

Arg

Se r

Gly

190

215

330

aal

Asn

Thr

Ser

Gly

Val

Tyr

Thr

IlT

Tyr

Giu

Thr

Asn

M^t

Thr

Lys

305

330

3H

330

189 639

Pro Leu

Lys VeS

Phe htc AspMet Mtu nur Asp GGu Gly Gly Trp Thr

305

330

333

Leu

IHe

Gln

HUl

Arg

OGu

u g p

G ly

Ger

tol

Asn

PPh

Gln

Cog

Thr

Top

300

305

350

Glu

GGu

Tyo

LpG

Glu

Gly

Pht

Gly

Aan

Vil

Ala

Cog

GGe

His

Trp

Ltu

355

360

336

Gly

Ann

GGu

ACe

Vil

His

Arg

Ltu

Tho

E^^r

Cog

Thr

Ali

Tyo

Leu

Atu

370

337

338

Arg

Vil

Glu

L et

Lis

Asp

Trę

Glu

GGer

Tog

Gln

Tho

Ser

Ile

Gln

Tyo

385

390

335

000

Alu

Asn

Phr

G Gu

Leu

Glu

Sse

Alu

Ang

Gln

Arg

Tyo

Ser

Leu

str

Vil

005

410

405

Asa

Rap

Ser

Ssr

Ser

tos

O la

G ly

Any

Ogs

Asn

Ssr

Ltu

Ala

Pl^O

Gln

000

005

430

Gly

ΤΤγ

Lys

PltS

Ser

Tho

Lys

Asp

(fet

Csp

Asn

Asp

Aan

Cys

Met

Cys

035

440

400

Lys

Ccr

Gle

GGn

Met

Ltu

Ssr

Gls

Gly

Trp

Tęp

PPh

Csp

Ali

Cys

Gly

050

4 05

400

Ltu

5eo

Asn

L ee

Asn

AAu

Sin

Tyo

Ter

str

Val

His

Gln

His

Ltu

His

065

070

4Ί5

480

Lys

Ile

Ast

G Gu

5 le

lup

Grę

Haa

Ter

Pht

Arg

Gly

Pro

ser

Tyo

sto

085

4 90

405

Leu

Hii

Gly

TAn

Ahg

OgM

tAt

T eu

Atu

Ogp

Metr

GGy

Ali

500

505

(2) INFORMACJE O SEQ ID nr 11:

(u) CECHY SEKWECJH:

CA) DŁUGOŚĆ: 503 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

189 639 (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mCL3 (B) POŁOŻENIE: 1...503

	(D) (xi)	INNE OPIS	INFORMACJE SEKWENCJI:	: mysi SEQ ID	Uganda TIE
> nr	11:
ert	Luu	Leu Asp	TlG Leu Luu	Leu Luu	Ala	Thr eet Ala Ala Ala Cln
1			5		10	15
Hss	Acp	TlG Pro	G1u Ala Gly	Gly Hss	Arg	Gln lle His Tln VaT Acr
		20		25		30
Arg	GlG	Gln Ttg	Ser Ttg Tho	Pht Val	Va1	Ppo Glu Ppo Ass Ile Ctg
		35		40		45
Gln	Leu	Ala Ppo	Thr hic TSa	Pro Piu	Al a	Le u GL; Gly Ser Ass Ser
	50		55			60
Luu	Tln	Asp Asp	Ltu Pio Ala	Ser Asp	Leu	Hss Leu Thr Asp Ττρ Arg
05			70			75 80
Ala	Gln	Asp ASe	Gln Aig Ala	G1n Acr	Va1	Ser Gln Leu Glu Llg Ale
			85		90	95
Luu	Gin;	Asn Asn	Thr Gln Trp	Leu Leu	Lys	Leu Glu Gln Sur IIe Lys
		100		105		110
Va1	Asn	Leu Acp	Ser tii seu	Val VTe	Ala	SAn GSn Asp USc iTh lln
		115		1^0		125
Asn	Cln	ThrTTh	Thr hit Leu	Ala Cea	ei y	AAa Asn LeuMet Asn Gln
	130		135			114
Tho	Lgs	ASa Tle	Thr Hss Lys	Leu Thr	Ala	Va1 Glu Ala Gln Vv1 Leu
145			150			1^5 160
Asn	Tln	TCh Lee	i_s Met Lss	Thr Gln	ett	Luu Glu Asn Ser Leu Sei

165

JL7k

115

189 639

Thr

Asn

Lys

Leu 280

du

Ang Gln

Me t

Luu 128

Mut

dn

Sho Arg

dn 109

Leu

Gln

Tog

Leu

Gln

Gly

Arg

Ann

Trg

ATo

Leu

du

Thr

Arg

Leu

dn

Ala

Leu

295

200

205

Gli

TUa

Gln

His

Glon

Ala

dn

Lei

Asn

Ser

Luu

da

GGu

Pyr

Pto

Glu

000

200

GUn

Leu

Hu

S ee

Lui

Luu

GOy

Hig

Gln

Thr

Ln

Thr

Leu

Ala

Csn

Leu

005

200

203

240

Lys

His

Asn

L uu

His

Ala

Luu

Sep

Ser

Asn

Ssh

Sur

Ser

Leu

Gln

GUn

045

200

205

Gln

Gnp

Leu

Thr

du

Phe

Vv1

Gln

Arg

Leu

Val

Ano

Ile

VaU

000

200

207

Ala

Gln

Asp

Gln

H H. s

Pro

VaO

Ser

Leu

Lys

Thr

Pro

Lys

Ppo

Val

Phi

075

200

285

Gln

Asp

Cys

Ala

Glu

Ile

Lys

Trg

Ser

Gly

Val

Asn

Tlir

See

Gly

Val

090

295

330

Tyr

Tho

I1i

T Tr

Glu

Thr

Gsn

MeG

Thr

Lys

Pro

Luu

Lys

!^ć^l

Phe

Cys

305

3K0

3H

300

Cnp

Met

Glu

T Th·

Csp

Gly

Trp

Thr

Luu

IUe

Gln

His

Arg

GOu

305

333

Csp

GOy

Ser

VnG

Asn

Phe

GUn

Arg

TTn

Trp

Glu

Tyr

Lys

GOi

GOy

340

33 4

335

Phe

Gly

Asn

Val

Al. li

Arg

Glu

Hhi

Trp

Leu

GOy

Asn

Glu

ATa

VaU

His

355

330

365

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

TTir

ATa

Tyr

Leu

Arg

Vv1

Glu

Llh

Pu

Asp

370

335

3M

Trp

Glu

Gly

Arg

Gln

TTr

Ssh

Ile

^ZLn

Tyr

Glu

Ann

PPh

dn

Guu

Gly

385

390

395

400

Ser Glu Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser Ser Ser Ser

189 639

405 410 415

Ala Gly Arg Lys Asn

Ser Leu Ala

Pro Gln Gly Thr Lys 425

Phe 430

Ser

Thr

420

Lys

Asp

Met

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

Gln

Met

Leu

435

440

445

Ser

Gly

Trp

Phe

Asp

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

450

455

460

Ile

Tyr

Ser

Val

His

Gln

His

Leu

His

Lys

Ue

Asn

Gly

Ue

Arg

465

470

475

480

Trp

His

Tyr

Phe

Arg

Gly

Pro

Ser

Tyr

Ser

Ile

His

Gly

Thr

Arg

Met

485

490

495

Met

Leu

Arg

Pro

Met

Gly

Ala

500 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 12:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 490 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI: białko
(ix)	CECHA:
(A)	NAZWA/KLUCZ: hTL4
(B)	POŁOŻENIE: 1...490
(D)	INNE INFORMACJE: ludzki	ligand 1
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	nr 12:

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

His

Ue

Gly

Cys

Ser

Asn

Gln

Arg

1

5

10

15

Arg

Ser

Pro

Glu

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Asn

Arg

Ue

Gln

His

Gly

189 639

Gln Cys AA a Tyr

Glu Seo Thr Thr

Pro Hss Val Glu

Hss Val Glu

Ile Val Glu Asn

100 aal Gln Asn His

115

Seo Gln Thr Ala

130

Val Leu Asn Gln

145

Leu Ser TIiia Tyr

Ile Leu Lys IIa

180

Glu Met Glu Gly

195

Lys Glu Asn Leu

210

Glu Leu Glu Lys

225

Gln Lys dn dn

Leu Cys Thr Lys

Thr	Ph^e	IIl	Leu
			40
Asp	dn	Tyr	Asn
	55
Pro	Asp	Phe	Ser
	70
Asn	Tag	Thr	Gln
85
Met	Lys	StA	Glu
Thr	Ala	TI^ia	Met
			120
Glu	Gln	Tho	Arg
		135
Tho	Sro	Arg	Leu
	50 0
Lha	Ług	Glu	Lys
165
Hhs	Glu	Lys	Asn
Lyo	His	Lys	Glu
			200
Aln	lnG	you	A al
		215
Gln	Leo	Asn
	2330
Leu	Glu	Leu	MMt
245
Glu	Val	Leu	Leu

Pro Glu Hss Asp

Thr Asn Ala Leu

Ser Gln Lys Leu

Trp Leu Gln Lys

AMt Ala Gln Ile

110

Leu Glu He Gly

Lyo Leu Thr Asp

110

Glu Ilo Gln Leu

155

Gln Leu Leu Gln

117

Set Leu Leu G1u

115

Glu Leu Asp Thr

Th i ArT A 0n Thr

220

Ala Thr Thr Asn

235

Asp Thr Val His

250

Lys Gly Gly Lys

Asn Cct Aao

GGn Arg AAp AAl

Gln His Leu du

Leu Gd Asn Tyr

Gln Gln Asn AAa

110

Thr Ser Leu Leu us

Val Gd TI^ia dn

Leu Glo Asn Ser

110

Gln TAo Asn du

11:5

Hso Łys He Leu

110

Leu Lys Glu Glu

205

Tyr Ile Ile GtI

Asn Seo Va0 Leu

240

Asn Leu VaA Asn

200

Arg Glu Glu Glu

189 639

260

265

270

Lys

Poo

Phe

Cog

Csp

Ays

Cli

Csp

Vil

Tyg

Gln

Cli

Gly

Phe

Asa

Lys

075

080

085

sto

Gly

IIe

Tyr

Thr

Ile

Ter

Ilt

Asa

Csn

Mtt

Pro

Glu

Pro

Lys

090

209

330

Vil

Pht

Cys

Asn

Met

Alp

Vil

Aan

Ulr

GGe

SUe

Trp

Thr

Vil

Ile

GGn

305

331

330

His

Cog

G1 u

Asp

G1 y

Sst

Ltu

Asp

Plt

GGu

Lag

GGIr

Trp

Lys

Glu

Trs

305

333

335

Lys

Met

Gly

Phe

Gly

Asn

Poo

Ssr

Gly

Glu

Tyr

Top

Ltu

Gly

Asa

GGl

300

330

Pht

Ilt

Phe

Ala

ItT

Th.

Ses

GGe.

SAg

Gln

Tyr

Met

Leu

Arg

Ilt

GGu

355

3(50

365

Ltu

Met

Asp

Trp

Glu

G1t

Asn

Aog

Al 5

Tyr

Ser

GGn

Tyo

Asp

Cog

PPi

370

3-775

338

His

Ilt

Gly

Asn

Gis

Lys

Gln

Asn

Tyg

Aag

Lee

Tyo

Leu

Lys

Gly

Hii

385

390

339

400

Tlo

Gly

Tho

Al 5

Gly

Lys

Gln

Setr

sto

Lee

IIl

Ltu

Hi 5

Gly

Ais

Asp

005

400

155

Pht

sto

Tho

Lpi

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Asa

(Sys

Met

Cys

Lys

Ays

Ala

000

405

430

Ltu

Met

Leu

ThT

Gly

GlT

Trs

Trp

PPr

Csp

Ala

Cys

Gly

Pro

str

Asn

035

440

005

Ltu

CSA

Gly

MMt

Phe

hu t

Thr

A1o

Gly

Glu

Asn

Gia

Gly

Lyi

Gia

As s

050

455

400

Ulr

Ilt

Lys

Trp

iST

Tyo

Phe

Lys

Gly

Pro

Ssr

Tyr

Ses

Its

Agi

Ssr

0 65

4 70

407

400

Tir

Thr

Met

Me 5

ItT

Arg

Poo

Leu

Asp

Phe

085 400

189 639 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 10:

(s) CECHY SEKWENCJI:

(l) DŁUlOŚĆ: 091 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOlIl: lsniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: bsałko (sx) CECil:

(l) NlZWl/KLUCZ: chTLl (B) POŁOŻENIE: 1...091

	(D) INNE (xs) OPIS	INFORMACJE SEKWENCJI:	: kurzy ligand 1	TIE-2
SEQ ID nr	10:
Tli	PAt Luu AGn	Ala Ile Lel	ULt His Ile	Gs c Cys:	Thr Uli Gln ser
1		5	0S		15
Grg	Ser Pro Giu	Csn Ser Gle	Psg Arg Phe	Psc Arg	Ile Tin HisGlu
	20		25		30
Gln	Cys Thr Τ’ΐ	Ghr Phe llr	Usu Pro Glu	UGr Asp	G ly Gin Cys Arg
	35		40		45
Ulu	Ser Ghr TTh	Asp Gln Tyn	Csn Thr Asn	APg Leu	Gln Ltu As. AGs
	50	55		50
Pro	im Val Giu	Gln Asp Phs	Srr She Gln	Aus Leu	Gln Lis LeuGii
65		7S		75	80
im	ail Met Giu	Asn Tyr The	PTh Trp Leu	PSg Lys	Leu Gln Ser set
		05	0S		95
lit	aai Giu Ass	Cet Lys Seu	sSu Met Ala	lGe Lgu	Gln Gln AsnAGn
	100		105		11(0
aai	Gin Am Ais	Ghr Ala Ths	ist Leu Glu	Ile Gly	Thr lie Leu icr
	115		120		H2

Str GlnTGir AGl Glu Gln Thn Asg Lys Leu ys s Asp Vrl Css iirGln

189 639

130

113

144

Va1

Ltu

Asc

S ln

T hr

hre

Asg

L eu

Atu

Ilu

uSn

Leu

d t

Asu

Ser

145

115

110

Ltu

Ser

Thr

i cg

Tys

Gse

u Au

L ys

AGs

Leu

St u

Gan

Gln

USt

Atu

Glu

105

117

lle

Leu

Lys

Ile

His

Glu

Lys

Asn

Ser

Aru

Leu

Glu

iss

Llg

Ale

Llu

180

110

119

Glu

eet

Glu

Arg

His

Lig

Glu

Met

A^^p

Thr

Llu

Llg

Glu

195

220

Lgs

Glu

Asn

Leu

Gln

Gly

Leu

VvT

Thp

Arg

Gln

Ser

Tyr

Ile

Gln

210

2215

222

Glu

Leu

Glu

L lg

Gln

USA

u sn

L ys

AGs

Thc

TTr

Asn

sn s

Vcs

Leu

225

230

223

220

Gln

Lgs

Gln

G ln

Leu

ruu

u eu

Met

Att

Thc

Vs 1

Hi s

Ths

s,e u

ICh

Thr

245

220

2:5:5

Ltu

Tgs

Ser

Lss

Glu

GlG

VaS

Leu

Lgs

Asn

Ala

Lys

Arg

Glu

200

220

Alu

Lgs

Pro

PPe

Arg

Asp

Cys

Ala

Asp

VaS

Tys

Gln

Ala

Giy

Phe

Asn

275

220

225

Lgs

Str

Gly

Ile

Tyr

Thr

Ile

Tyr

llr

Asn

VaS

Ser

Asp

Pro

LyS

290

2 25

330

Lgs

Va1

Phe

C TG

Asn

ssA

Ls p

V al

Vtu

Gig

SA y

Gly

Trp

UG s

Vri

Ale

305

330

3113

320

Cln

Hss

Arg

G ln

Asp

dy

G sr

T eu

Atu

Phc

p A n

Lys

USt

Tr p

Lye

Glu

400

330

335

Tgo

Lgs

Met

Gis

Phe

GlG

Ses

Pro

Ser

CUG

Glu

Tys

Trp

Leu

Gly

Asn

340

3371

330

Alu

Phe

Ile

?Pe

Ala

Ile

Thr

Ser

Gln

Arg

GSt

Grs

Ser

Leu

Arg

Ile

355

330

33:5

189 639

GUi Llu 370

Met Aep

Trp

ric

UlyAsn As. AlaTyu 0Tf SiriTyi Ars Arg

375

380

Pht

Hss

I le

Gly

Asn

Gln

Lys

Gln

Arn

Tyr

Arg

Ltu

Tyr

Leu

Lys

Gly

385

339

400

Hss

Str

Gly

Thr

Ala

GCy

Lys

Gln

Set

Str

Leu

IUt

Leu

Hss

Gly

Ala

705

410

475

Gli

Phu

Ser

Thr

Lys

Ai(

Te a

Asp

Aia

Asp

Asn

Cso

Met

Cys

L ys

Cys

710

15 0

4 30

Ala

Ltu

Met

Leu

Thr

GlT

Gly

Trp

Tip

Plie

Asp

Ala

Cys

Gly

Pro

Ser

735

400

745

Asi

Leu

Asn

GAy

Met

thr

t yr

T hr

Mr

Gly

GCn

Ag

Gis

GC

A ys

Leu

750

4^4

760

Asi

Gly

Iie

Lys

Trp

His

Tyr

Phe

Lei

Gly

Pro

Arg

Tyr

Ser

Ile

Arg

765

770

475

4 80

Ser

Thr

Mrt

Met

Hu

Arg

Pro

Leu

Asp

Phe

785

790

(2) INFORMACJE O SEQ ID nr 14:

(i) CECHY SEKWENCJ!

(A) DŁUGOŚĆ: 497 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TTY PCCET^C^: Piałło (ix) CECHA:

(A) NACWA/ZLUCC: mTLl (B) POŁOŻENIE: 1...497 (D) INNE INFORMACJE: mysi ligand 1 TIE-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 14:

Mrt Thr Sal Pht Lri Ser Phr Ala Phe Phe Ala Ala Ilt Lru Thr Hss

189 639

1

5

10

15

llu

Gly

Cys

Ser

Asn

Gln

Arg

Grg

Asn

hro

Gtu

Asn

Ser

Tly

Ang

Arg

20

25

30

Tyo

Asn

Ann

Ilu

Cln

inn

Gly

GGn

Cys

All

Tyr

Thr

Phh

Ilu

Cnu

Apr

35

40

45

TGs

ins

Ast

Gly

Ann

Ccu

Crg

Gtu

Ser

Thr

Ac;

Cle

Cy/u

Ann

ATr

50

55

60

Asn

All

Leu

Gin

Arg

Asp

ACt

hro

iis

Val

Tlu

PhO

Cc;

Phu

Sse

Ase

65

00

75

80

GGn

Lys

Leu

Gln

His

Leu

Glu

ins

Val

Met

Glu

Asn

TTr

Thn

Cln

Tto

Θ5

90

95

Lus

Gln

Lys

Leu

Glu

AGn

Tyr

Ile

Vat

Glu

Asn

Met

Ly/r

Ssr

Glu

MmU

100

105

110

Cti

Aln

Ilu

Gln

Asn

Ale

VaI

Gln

Asn

Hia

Thr

ATt

TTr

MmŁ

Lnu

115

22 A

115

TGu

llu

Gly

Thr

Ser

Leu

Luu

Ser

Gln

Thr

Ala

Glu

G/n

Thr

Arg

Leu

130

135

110

Luu

Thn

Asp

Val

Glu

Thr

Gln

Vat

Leu

Asn

Gle

Thr

Ser

Grg

Leu

GlLu

145

150

55A

160

llu

Gln

Leu

Glu

Csn

Ser

Luu

See

The

Tye

Lys

Leu

Alu

Lys

Gln

165

70A

115

Luu

Les

Gln

TOa

Asn

Glu

Ile:

Leu

Lys

lita

ins

Glu

Lys

Asn

Ser

Leu

150

155

l<30

Lus

Gls

Hns

Lys

Ile

Leu

GSe

MtA

Gic

Gly

L;a

Hsi

Lys

Glu

Met

105

20A

205

Asp

Tho

Leu

Lys

Gls

Glu

Lys

Gtu

unn-

Lec

Gnc

Gly

Leu

Val

Ser

Arg

210

215

220

Ttn

Sun

Phe

Ile

Gln

Glu

Luu

GSe

un a

Gnc

Leu

Se r

Arg

Ala

Thr

775

7(30

5

270

189 639

Csn

Seo

lir 245

Leu Gin Lys Gln

Gin 250

Luu

Giu Leu

Mrt

Csp 255

Thr

ail

in

Asn

Lur

Ile

Ser

Luu

Cys

TTh

Lys

Ulu

Gly

Vlll

Luu

Lls

250

225

220

Gly

Lys

Arg

Glu

Les

hoo

Phe

Arg

Asp

Cys

Ala

Asp

Vi1

275

220

Tyr

Gin

Ala

Gly

Phe

Asn

Lys

Str

G1 y

lls

Tyr

Thr

Ile

Tyr

Phr

Asn

290

225

330

Gsn

Val

Pro

Glu

Pro

Lys

Val

Pht

Cys

Asn

Met

Asp

Asn

Gly

305

32LO

331

332

Gly

Trp

Thp

Val

Ile

Gln

iss

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Leu

Asp

Phe

325

330

335

Gln

Lys

Gly

TpC

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Gly

Phe

Gly

Ser

Pro

Ser

Gly

040

335

330

Giu

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

Phr

llr

Phe

Ala

Ile

Thr

Ser

Gln

Arg

355

330

335

Gln

Tyr

Met

Leu

Arg

Ile

GGu

Leu

Me t

Asp

Trp

Glei

Gly

Asn

Arg

AGs

370

33 7

330

Tyr

Ser

Gln

Tyr

Asp

Arg

PPe

in

Ile

Gly

Asn

Giu

Lys

Gln

Asn

Tyr

305

330

339

400

Grg

Leu

Ty_r

Leu

Lys

Gly

His

TAo

Gly

Thr

AGn

Gly

Lys

Gln

Ser

Ssr

405

410

415

Leu

lie

Leu

His

Gly

AGa

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

420

442

440

Csn

Cys

Met

Cys

Lys

Ccs

Cli

Lut

MiI

Leu

Thr

GA.y

Gly

Trp

PPe

405

444

Gsp

Cia

Cys

Gly

Pro

Ser

Am

Leu

Csn

Gly

Mrt

Phr

Cer

Thr

AGa

Giy

450

445

lln lsn His Gly Lls Leu Gsn lly Ilu Lys Trp His Gtp PPe Lls Gly

189 639

465	470 475	440
Pro	Arg Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Thr Met Met	Ile Arg Pro	Leu Asp Pht
		485 490		495
(2)	INFORMACJE O SEQ ID nr 15:
	(i) CECHY SEKWENCJI:
	(A)	DŁUGOŚĆ: 496 aminokwasów
	(B)	TYP: aminokwas
	(C)	ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI: białko
	(ix)	CECHA:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: mTL2
	(B)	POŁOŻENIE: 1...496
	(D)	INNE INFORMACJE: mysi ligand	2 TIE-2

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 15:

Met

Top

dn

IIl

Ile

Phe

Leu

Thr

Pho

Gly

Trp

Asp

Alo

Val

Lru

Thr

1

5

10

15

Ser

Ala

Tyr

See

Asn

Pho

Aao

Lys

Ser

wi

Asp

Ser

Tl^lA

Gly

Aao

Arg

20

30

Arg

Tyr

AAg

IIl!

Gln

Asn

dlz

Pro

Cys

AAa

Tyr

Thr

PPe

Leu

Ppo

35

40

45

Glu

Thr

Aap

Ser

Gly

Arg

Sro

Ser

Thr

Tyr

MuG

Thr

Asn

Ala

50

55

00

Val

Gln

Arg

Aah

Ala

lao

Pro

Arp

Ayr

GlT

Aop

Ser

wo

(31 n

Saa

Leu

65

70

75

80

Gln

Leu

du

Asn

Hn A

Met

Mtu

Am

TyA

nGr

Gln

hAA

Le u

MtA

Lys

85

90

95

Leu

Glu

Asn

TT^r

Ile

lt G

Asp

Asn

LyM

tey

GIh

Met

Ala

Gla

U1i

100

A

110

189 639

Gln Gln Asn Val Val Gln Asn His

115 120

Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala

130 135

Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln

145 150

Leu Gln His Ser Ile Ser Thr Tyr

165

Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Ile

180

Gln Lys Val Leu Asp Met Glu Gly

195 200

Met Lys Glu Gln Lys Asp Glu Leu

210 215

Ser Val Ile Asp Glu Leu Glu Lys

225 230

Asn Ser Leu Leu Gln Lys Gln Gln

245

Ser Leu Leu Thr Met Met Ser Ser

260

Ile Arg Arg Glu Glu Gln Thr Thr

275 280

Lys Ala Gly Leu Thr Lys Ser Gly

290 295

Ser Pro Glu Glu Ile Lys Ala Tyr

305 310

Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg

325

Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly

125

Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp

140

Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu

155 160

Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp

170 175

His Asn Lys Asn Ser Phe Leu Glu

185 190

Lys His Ser Glu Glu Met Gln Thr

205

Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Ser

220

Lys Leu Val Thr Ala Thr Val Asn

235 240

His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn

250 255

Pro Asn Ser Lys Ser Ser Leu Ala

265 270

Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Phe

285

Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn

300

Cys Asn Met Asp Val Gly Gly Gly

315 320

Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln

330 335

Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Mec Gly Phe Gly Asn Pro Leu Gly Glu

189 639

355

540

Tyr	Trp	Lee	U 0(7
		355
Tyr	Vaa	Leu	Lj:
	370
Sur	Leu	Tyr	Asp
385
Ilu	Hss	Leu	Hr
Srr	Cli	Pro	G ly
			710
Cys	Ile	Cys	L y s
		735
Ala	CCS	Gly	Pen
	750
Asi	Thr	Am	Lyo
765
ll	Tyr	Ser	IlA

im TCn Pht Ile

336

Ale isn Uac 1as

375

Hso PP^ Tir Ilu

339

Gly Leu hee Cly

705

Set Asp Pht Ser

CCi Ser Ltu Met

470

Ter roe ror lon

755 hto Asn GUy IIa

7 0 iso Ala Hr ΤΚιτ

785

Ser GUi Ile hee

Auu Lis Glu GTs

338

Ala Gly GCu TCn

395

Thr Ala AT Aji

410

Thr Lys Asp Ser

425

Leu Thr Gly Gly

Ltu Asi Phe T(

70 iso Ti( Tyr· Tyr

475

Me0 Me0 Ile Arg

790

Gly Gln Ais Arr

336

Tri Uu Ala His

Ser Am Tir Arr

770

Ile Ser Ser II

471

Asp Am Asp Lji

470

Trp Trp Phe Arp

445

Cul Gln Prs Ule

Trp Lys Gly Ser

470

Pro Ala Asp PPe

79 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 16:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 496 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NACWA/KLUCC: hTL2 (B) POŁOŻENIE: 1... 496

189 639

	(D) (xi)	INNE OPIS	INFORMACJE SEKWENCJI:	: ludzki l SEQ ID nr	igand 2 16:	TIE-2
Met	Tto	Gln Iie	Val Phi Phi	Tho Luu Ser	Cys Gsp	AUl Val Lei Thr
0			5	20		15
Tla	Ala	Tts Asn	Asn Phe Arg	Lyn Sur MmU	Asp Ser	IlG GG^as Gys Lys
		00		05		30
Trg	Tyr	Anr He	Gln His Gly	Sur Cyn ATa	Tyr Ttn	PPh Luu Luu Pro
		35		40		45
Gli	Mut	Ann Asn	Gly Trg Ser	Sur Ser Ser	Thr Tyr	Vv1 Thr Ann Ala
	50		55		60
VaU	Gln	Aro Asp	Ala Pro Pro	Giu Tyc? Gli	Asp Ser	ViU Gln Sur Lei
05			70		5G	80
Gln	Luu	Luu Glu	Asn Val Met	G1g Csn Ty·	ThG Gln	Cop Luu Met Lyn
			05	90		95
Lhl	Glu	Ann Tyr	Ile Gln Asp	Gsn Met Lys	Lys G1g	MeG Ala Glu Ilu
		200		10G		120
Gln	Gln	Ατη Ala	Val Gln Asn	his Thr Ala	Vel Met	He Glu Ile Gly
		205		100		120
Tho	Sur	Leu Leu	Ser Gln TT^3O	Tli Glu Gln	Thr Arg	Lys Leu Thr Asp
	230		235		120
Val	GOu	Thr Gln	Val Leu Cnn	Gln Thr Tho	Arg Leu	Glu Leu GUn Luu
145					55G	100
Lei	Gln	Hhs Ser	Ile Ser Tho	Tr? Lys Leu	G1g Lys	GUn IIe Luu Csp
			205	170		175
Gln	Thr	Ser Glu	Iie Gsn Lys	Iie His Asp	Lys Asn	Sog Phe Luu Gli
		200		1(55		100
Lyn	Lys	Vnl Luu	Gsp Mut Glu	Gsp Lys Hu	IIe Ile	Glu Met dn Tho
		2 95		000		205

Iie Lys du Glu Lys Csp Glu Lei Gln Vv1 Leu Val Ser Lys Gln Csn

189 639

210

Ser Ile Ile Glu

225

Asn Ser Val Leu

Asn Leu Leu Thr

260

Val Ala Arg Glu

275

Lys Ala Gly His

290

Ser Pro Glu Glu

305

Gly Trp Thr Ile

Lys Gly Trp Lys

340

Tyr Trp Leu Gly

355

Tyr Val Leu Lys

370

Ser Leu Tyr Asp

385

Ile His Leu Lys

Ser Gln Pro Gly

420

Cys Ile Cys Lys

435

215

Glu Leu Glu Lys

230

Gln Lys Gln Gln

245

Met Met Ser Thr

Glu Gln Ile Ser

280

Thr Lys Asn Gly

295

Ile Lys Ala Tyr

310

Ile Gln Arg Arg

325

Glu Tyr Lys Val

Asn Glu Phe Ile

360

Ile His Leu Lys

375

His Phe Tyr Ile

390

Gly Leu Thr Gly

405

Asn Asp Phe Ser

Cys Ser Leu Met

440

220

Lys Ile Val Thr

235

His Asp Leu Met

250

Ser Asn Ser Ala

265

Phe Arg Asp Cys

Ile Tyr Thr Leu

300

Cys Asn Met Asp

315

Glu Asp Gly Ser

330

Gly Phe Gly Ser

345

Ser Gln Ile Thr

Asp Trp Glu Gly

380

Ser Gly Glu Glu

395

Thr Ala Ala Lys

410

Thr Lys Asp Gly

425

Leu Thr Gly Gly

Ala Thr Val Asn

240

Asp Thr Val Asn

255

Lys Asp Ser Thr

270

Ala Asp Val Phe

285

Thr Phe Pro Asn

Ala Gly Gly Gly

320

Leu Asp Phe Gln

335

Pro Ser Gly Glu

350

Asn Gln Gln Arg

365

Asn Glu Ala Tyr

Leu Asn Tyr Arg

400

Ile Ser Ser Ile

415

Asp Asn Asp Lys

430

Trp Trp Phe Asp

445

189 639

Ala Cys

Gly

Pro

Ser

Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr

Pro

Gln

Arg

Gln

450

455

460

Asn

Thr

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Trp

Lys

Gly

Ser

465

470

475

480

Gly

Tyr

Ser

Ile

Lys

Ala

Thr

Met

Ile

Arg

Pro

Ala

Asp

Phe

485

490

495

(2) INFORMACJE O SEQ ID nr 17:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1512 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (IX) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1...1509 (D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Ligand-4 TIE (B) POŁOŻENIE: 1...1512 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 17:

ATG

CTC

TCC

CAG

CTA

GCC

ATG

CTG

CAG

GGC

AGC

CTC

CTT

GTG

GTT

48

Met

Leu

Ser

Gln

Leu

Ala

Met

Leu

Gln

Gly

Ser

Leu

Val

1

5

10

15

GCC

ACC

ATG

TCT

GTG

GCT

CAA

CAG

ACA

AGG

CAG

GAG

GCG

GAT

AGG

GGC

96

Ala

Thr

Met

Ser

Val

Ala

Gln

Thr

Arg

Gln

Glu

Ala

Asp

Arg

Gly

20

25

30

TGC

GAG

ACA

CTT

GTA

GTC

CAG

CAC

GGC

CAC

TGT

AGC

TAC

ACC

TTC

TTG

144

Cys Glu Thr Leu Val Val Gln His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu

189 639

40 45

CTG

CAA

AAG TCT

GAG

CCC

TTT

CCT

CAA

TTT

CCT

GAG

TCA

ATT

tac

192

Aru

Pro

Lys

Ser

Glu

Ppo

Tgs

Pio

Ppo

TUg

Pro

Glu

Vt1

Ser

Arp

Ass

50

5A

60

TCC

AAA

ACC

CTC

CAG

AGA

AAA

CTA

CTG

ACT

AATC

CCA

TTT

CAC

CTG

GGG

24 0

Ser

Asn

Thr

Leu

Gln

Arg

TUu

Sua

Llu

Ala

Asn

Pro

Aru

His;

Llu

Gly

05

70

7A

80

GAC

CTT

CCC

ACC

CAG

CAC

GCT

AAA

CAG

TTT

GAG

CAG

TTA

CTG

CAG

asac

000

Lgs

Luu

Pro

Thr

Gln

Vt1

Ags

Gln

Aru

Glu

Gln

Ala

Leu

Gln

Asn

85

90

95

TAC

AAT

CAG

TGG

CTG

ACG

SAT

TTA

GAG

ATA

^^C

ATC

AAG

ACG

ATC

TTG

330

Asn

ThA

Gln

Trp

Leu

Lys

Lgs

Aru

Glu

Aog

A1t

IlA

Ags

Thr

Ile

Leu

100

105

110

AGA

CTT

AAG

CTG

GAG

CAG

GCT

TAG

CAG

ASA

ATT

GCC

TAG

ACT

CAG

ACG

30 4

Aog

Sua

Lys

Leu

Glu

Gln

Vt1

Tln

Gln

Tln

MlA

ATa

Tln

Asn

Gln

Thr

115

120

125

TTC

AAA

ATG

CTA

GAG

CTG

TTA

ATC

AGC

TTT

CTG

aat

TAT

ACC

ACT

GCC

4 32

Ala

Pro

Met

Leu

Glu

Leu

GlG

Thr

Ser

Luu

Uut

sst

Tln

Thr

Ala

130

35 S

140

TAT

ACA

CGC

AAT

CCT

ACT

GAT

ACT

GAG

ACT

TAG

TCG

TTT

ATC

CAG

AAA

4 00

Tln

lUu

Acp

Lgs

Leu

Thr

Asp

e^et

Glu

Ala

USt

Uum

Lru

Asn

Gln

Thr

145

1^^A

55 A

160

TCA

ATA

ATT

GAT

GCT

CAG

ATT

TCA

GAG

ACC

ttt

TGG

CCC

ACC

ATC

ATG

528

Sei

Aog

Met

Asp

AUt

Gln

AuL

Pro

Glu

Thr

hU t

Uu A

Sua

Thr

Asn

Lys

105

170

17 5

CTG

TAT

ATT

CAG

CTC

CTG

CTA

TAG

AGG

TAG

AAG

CTA

CAT

C.TG

CTT

CAG

557 6

Aru

Alu

Ass

Gln

Leu

Luu

Tln

Aog

Gln

Gs a

Uu t

Tln

Gln

Luu

Gln

100 185 190

189 639

GUT

ACA

AAC

ATC

GCG

CTC

GAG

4CTG

CTA

TTT LAT

LUT

ITT

TGG

ATT

SAG

60 4

Gly

UIn

Asn

Aer

Ala

Leu

Alu.

Lys

Ang

Let TTn

LCa

Seu

GGu

STr

Lys

455

200

TCG

TAC

gag;

GAG

CTG

GCC

AGC

ATC

CAC

AGC TAG

LAG

ICC

GAG

CTG

67 0

CIA

Gln

Glu

Leu

Ala

S«sit

IIe

Leu

Sst Lys

Sys

A Ta

Lys

Leu

340

215

200

CCT

CAG

CTG

AGC

cgc

CAG

AGC

GCCC

GCC

CTC AGA

GAC

ATC

GAG

CGC

GGC

700

Asa

Tho

Leu

Ser

Arg

Gln

Ser

Al a

Ala

Leu Thr

Acn

IIl

Glu

Arg

Gly

005

230

235

200

ATG

AGA

GGT

GTC

AGG

CAC

AAC

TCC

AGC

CTC CAT

CAG

GAC

CAG

CAC

7 68

Ltu

Cog

Gly

Val

Arg

His

Asn

Ser

Ssr

Luu Llu

TTn

Asp

Gln

His

005

200

205

CGA

ATU

CGC

CAG

CTG

GTG

TTG

CGG CGC

CAG

GTG

ceaa

GTCT

AGG

540

sto

Leu

Ar cg

Gln

Leu

Val

Leu

Arg Hii

Leu

Val

Gln

Glu

Arg

060

065

070

ATT

TAC

GCC

TCG

GCC

CCG

GCC

TTC

ATA

ATG GCA

GGT

GAG

CAG

GTG

TTC

8 64

CIi

Asa

Ala

Ser

GALa

Pro

Ala

Phe

IIe

Met Ale

Gly

Glu

Gln

Val

Phe

075

200

20^

TTG

GCA

TGT

GCA

GAG

ATC

CAG

CGC

TTT

GGG GUC

AGT

GCC

AGT

GGT

GTC

912

UlA

Csp

Cyc

Ala

Glu

11 e

Gln

Arg

Ssr

Gly ACl

Ssr

Aia

Ser

Gly

Val

090

295

330

TCT

CAC

ATC

CAG

GTG

TCC

AAT

GCA

ACG

GAG CAA

AGG

GACG

GTG

TTC

TGT

960

Tyo

Thr

I1i

Gln

Val

Ser

Asn

Ala

TGr

Lys Pro

Arg

Lys

Val

PPe

Cys

305

310

315

330

ATT

ATU

CAG

AGC

AGT

GGA

GGC

AGG

TTG

ACC CAC

ATC

LAG

CGC

CGT

GAG

1006

Csp

Ltu

Gln

As tr

Ser

Gly

Arg

Trę

TGr Leu

IIl

GGn

Arg

Glu

305

330

3 373

CCT

GUT

ACC

ACG

SAT

TTT

CAG

GAG

STU ACT

TGA

TAC

GCCT

CAG

GGC

10 5 6

Asn Gly ThT CsI Am PPe Glu Arg Am OTg OLy Osp OTy L^/y Gin Gly

822

189 639

240

GTC	1TG	GAG	CCC	CGC	TAG	T1T	TCT
Phe	TGy	Ast	ppo	CCe	Cle?	Tle	Tin
		355					336
CCG	CGC	ACT	CCC	TTA	TAC	CTC	TCC
Ttn	Luu	Thr	oun	Ano	ACe	ACe	Gru
	370					337
GTT	TTC	GGT	CCC	GAG	GTC	CTT	GGC
Grp	llu	Gil	Sin	Glu	ACe	Ty/r	ACe
355					330
TTG	TGT	AAC	CAG	CTA	TAC	ACG	CCT
Sur	lls	Asn	nin	Lnu	Tyr	Aro	Lnu
				405
TCC	1GT	CGC	CAG	AGC	AGC	CC^G	GTC
Ala	Tly	Arg	Gln	Ser	Ser	Lnu	Vvl
			420
CCG	TAC	TCA	GAC	AGC	Gl^TC	CAC	TCT
Les	Tsp	See	Asp	Asn	Asp	His	Cys
		4 35					440
TCC	TGG	GGG	TGG	TGG	TT^TC	GAC	GCC
Sur	Tly	Gly	Trp	Trp	?hh	Asp	Ala
	450					4 45
GTC	GCC	TAC	CAC	GCT	CCC	GAC	IGGC
Vil	Cyr	Tyr·	Hi s	Ala	Pro	Asp	Asn
465					440
TTT	CCC	TAC	TTC	IGTG	GGC	CCC	AGC
Grp	ins	Tyr?	Phe	Lys	Gly	Ppo	Ser

455

325

TCT	CGA	ACC	CCA	GTC	CGC	TCT	T104
Gnu	GlU	Ann	Tlu	Cvl	Cvl	Ais
			336
CCC	CCG	CGC	TCT	CCG	CCTu	GCT	1152
Gnu	AnO	Cvl	Glu	Leu	Gln	Aup
		330
GTT	CAC	CAT	GTC	CAC	CTG	GTC	8902
Gru	Clu	His	PPh	His	Luu	Gly
	330					440
GTG	GTC	GGG	TAC	AGC	GTC	TCA	124 6
Vvl	Vvl	Cly	Tyr	Ser	Gle'	Sst
440					441
CAG	TATC	ACC	AGC	TTT	AGC	ACC	1206
Gln	Asn	Thr	Ser	Phe	Ser	Thr
				430
TGC	IGGG	TG/C	<CCC	CTG	GTG	ATG	134 4
Cys	Lys	Cys	Ala	Gln	Val	Mt
			445
GGC	CC^G	TCA	ITTC	CTC	/TTC	GGC	13 02
Gly	Leu	Ser	Asn	Leu	Asn	Gly
		4 60
TAC	AG	ATG	G/^iC	GGC	ATC	CGC	14 4 0
Tyr	LyD	Met	Asp	Gly	Ile	Arg
	445					440
T^CG	CTG	CGT	GCC	TCT	CGC	ATG	14 55
Ser	Leu	Arg	Ala	Ser	To	Met

440 495

189 639

101

ATG ATA CGl CCT TTC lAC ATC TAA

Met Ile Arg Pro Leu Asp Ilu

500 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 18:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 503 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: iiałko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NACWA/KLUCC: Ligand-4 TIE (B) POŁOŻENIE: 1...503 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 18:

1152

Met

Ltu

Ser

Gln

Leu

Ala

Mt0

Lu u

Gln

GlT

Sro

Leu

Val

1

5

00

15

AUa

hee

Mrt

Ser

Val

Ala

G1a

Gln

Thr

Arg

GlT

Glu

Ala

Asp

Arg

Gly

10

15

30

Cys

llu

Thr

Leu

AsI

aal

G1a

Hss

Gly

hso

Cso

Ser

Tyr

Thr

Phe

Uuu

35

70

75

Leu

Pro

Lys

Set

Alei

Pro

Cso

Pro

Gly

Pro

Glu

Sal

Ser

Arg

Aip

50

55

60

Ser

Asi

TTr

Llu

Aln

Grg

G1a

Ser

Leu

Ala

Asn

Prr

Lru

His

Leu

Gly

65

70

50

00

Lys

Leu

Prr

TTr

Aln

Gln

Va0

Lys

Gli

Leu

Glu

Gln

AUa

Llu

Gli

Asn

85

90

95

Asn

Thr

Gln

Trp

Leu

Lys

Leu

Glu

Arg

Al a

Iie

Lys

TTr

IIe

Lls

102

189 639

100

Arg Ser Lys Leu

115

Ala Pro Met Leu

130

Gln Ile Arg Lys

145

Ser Arg Met Asp

Leu Glu Asn Gln

180

Gly Gln Asn Ser

195

Gln Gln Glu Glu

210

Asn Thr Leu Ser

225

Leu Arg Gly Val

Ser Leu Arg Gln

260

Ala Asn Ala Ser

275

Gln Asp Cys Ala

290

Tyr Thr Ile Gln

305

Asp Leu Gln Ser

Glu Gln Val Gln

120

Glu Leu Gly Thr

135

Leu Thr Asp Met

150

Ala Gln Met Pro

165

Leu Leu Leu Gln

Ala Leu Glu Lys

200

Leu Ala Ser Ile

215

Arg Gln Ser Ala

230

Arg His Asn Ser

245

Leu Leu Val Leu

Ala Pro Ala Phe

260

Glu Ile Gln Arg

295

Val Ser Asn Ala

310

Ser Gly Gly Arg

325

105

Gln Gln Met Ala

Ser Leu Leu Asn

140

Glu Ala Gln Leu

155

Glu Thr Phe Leu

170

Arg Gln Lys Leu

185

Arg Leu Gln Ala

Leu Ser Lys Lys

220

Ala Leu Thr Asn

235

Ser Lau Leu Gln

250

Leu Arg His Leu

265

Ile Met Ala Gly

Ser Gly Ala Ser

300

Thr Lys Pro Arg

315

Trp Thr Leu Ile

330

110

Gln Asn Gln Thr

125

Gln Thr Thr Ala

Leu Asn Gln Thr

160

Ser Thr Asn Lys

175

Gln Gln Leu Gln

190

Leu Glu Thr Lys

205

Ala Lys Leu Leu

Ile Glu Arg Gly

240

Asp Gln Gln His

255

Val Gln Glu Arg

270

Glu Gln Val Phe

285

Ala Ser Gly Val

Lys Val Phe Cys

320

Gln Arg Arg Glu

335

189 639

103

Gsn Gly Tho Val

Gsn

rhe

dn Grg Tsn Trp Lys Tyr Lys

Gln

Glg

340

345

350

Phe

Gig

Asp

Pro

Tla

Gly

GOu

His

Trp

Leu

dy

Asn

Gln

Val

Hhi

355

300

335

GUn

Luu

The

Ato

Grg

A1t

A la

T yr

Asr

Leu

A pg

Val

Glu

Oh

dn

Asp

370

3375

330

Trp

Glu

Gly

H Hi

Glu

Ain

A yr

A la

TUa

Tyl

GTs

GOi

Phe

Hl s

Lrh

dy

385

390

395

4'0

Sho

Glu

Asn

G lu

Geu

Hue

A rg

L eu

Sal

VaS

Av1

dy

Tyr

Os P

GTy

Ser

405

440

415

Tli

Gly

Trg

dn

Sur

See

Luu

Vll

Luu

GAn

Asn

Tho

Sao

PhH

Sho

Thr

550

4 25

430

Lei

Ann

Sho

Asp

Asn

Asp

His

Cys

Leu

Ca?

Lys

Cys

ATa

Gln

Val

Met

435

440

44'

Sho

Gly

T to

Grp

Ohr

A sp

A la

Tgi

Gly

A gu

Suis

Asn

Heu

Asn

Gi]

450

455

460

Val

Tyr

Tye

H ii

Gla

Air

A sp

A sn

Tnn

Tyu

Aer

Met

Asp

(31 y

ITa

Arg

405

470

475

440

Crp

His

Tye

P Ph

Gys

SAg

S ro

P er

Sao

See

Oeu

Arg

Ala

Se r

Ang

Met

485

4 49

495

Muc

IIe

Arg

Ppo

Lei

Ata

IlH

500 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 19:

(i) CECHY SEKWENJJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1497 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA

104

189 639 (lx) CECHA::

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE:

(D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: 1N1C2F (chimera 1) (B) POŁOŻENIE: H..^?

(D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Innu (B) POŁOŻENIE: 1...60 (D) INNE INFORMACJE: Przypuszczalna sekwencja lidurowa jest kodowana przez nukleotydy 1-60 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 19:

TTC

TCA

CTT

TTC

CTT

ttt

ACC

GAC

TCC

ATC

GGT

AGC

GAT

CTC

ACT

CTT

48

eet

Thr

VaU

Phe

Cer

Ser

APh

Ala

PPh

Ser

Ala

ASn

Ale

Llu

Thr

Hss

1

5

10

15

TTT

CGG

TGT

AGC

TAT

MAG

ATT

ATA

ATT

CCA

GCA

MAC

AGT

GCG

AGA

ACT

96

llr

GlG

Cgs

Ses

Ass

Tln

Asg

Agg

Ser

Apo

Glu

Asn

Ser

Gly

Arg

20

25

30

TAT

TAC

CGC

ATC

CAA

GTA

GTG

AAA

TCC

MCC

TCC

ACT

TTC

ATT

CTT

TCA

144

Tgo

Asn

Arg

11l

ein

H i s

Gly

Cln

C.G

Al a

Ter

TCr

PPe

Ile

Leu

Pro

35

40

45

CTA

TAC

CTT

GGC

AAC

tct

CCT

TAG

ATT

ACG

ACA

MAC

CAG

TCC

ASTA

TTT

119

Glu

iss

Asp

Gly

G^sn

TyG

Asg

Giu

Ser

Shr

Thr

Asp

Gin

Tyr

Asn

Thr

50

55

00

AAC

CTT

CTC

CAC

GCG

ATT

GAT

CCA

CAC

GTG

GACA

MCC

GAT

TCC

TCT

CCC

220

Ass

AUa

Leu

Gln

Acr

Asp

Ale

Pio

His

Mai

Glu

Per

Asp

PPh;

Ser

05

70

75

00

TTG

TAA

CTT

CAA

CAT

CTG

G1SA

TTC

GCC

ATG

GTSA

AGAT

TAT

ACT

CAG

TCC

22(3

Gls Sgs Ltu GluSis Leu Glu Hss VvT Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp

189 639

105

90 95

CTG

CAA

AA

CTT

GAG

AAT

TAC

ATT

GTC

GGA

AAA

ATG

AAG

TCG

GAG

ATG

33(5

Ltu

Gln

Lye

Leu

Gd

Asn

Tyr

IIe

Val

du

Am

AMt

Ley

See

Glu

AlMt

100

110

GCC

CAG

ATA

CAG

AAT

GCA

GTT

CAG

AAC

CAC

ACG

GCT

ACC

ATG

CTG

339

Ala

Gln

Ile

Gln

Asn

Ala

Va^l

Gln

Asn

Hhs

Thr

Ala

TTur

Leu

115

110

112

ΑΑΑ

ATA

GGA

ACC

AGC

CTC

TCT

CAG

ACT

GCA

GAG

CAG

ACC

AGA

AAG

40 2

Glu

Ile

Gly

Thr

Ser

Leu

Ser

Gln

Thr

Ala

Glu

Gln

Thr

AArg

Lys

130

135

110

CTC

ACA

GAT

GTT

GAG

ACC

CAG

GTA

CTA

AAT

CCA

ACT

TCT

CISA

C TT

GAG

4 80

Lru

Thr

Asp

Val

Glu

Tho

Gln

Leu

Asn

Gln

Thr

Ser

Ai^ig

Leu

Glu

145

150

115

160

ATA

CAG

CTG

GAG

AAT

TCA

TTA

TCC

ACC

TAC

AAG

CTA

GAG

AAG

CAA

528

Ile

Gln

Leu

Gli

Asn

Ser

Leu

Ser

Thr

Tyr

Lyy

Leu

Glu

Lys

Gln

165

170

175

ATT

CTT

CZA!

CAG

ACA

AAT

G.A

ATC

TTG

AAG

ATC

CAT

GAA

AAA

AAC

AGT

57 6

Lru

Leu

Gln

Thr

Asn

Glu

IIe

Leu

Lys

IIe

Hhs

Glu

Lys

Asn

Ser

180

115

190

TTA

GAA

CAT

AAA

ATC

TTA

GAA

ATG

GAA

GC^A

AAA

CAC

AAG

GGA

GAG

624

Leu

Glu

Hi s

Lys

Ile

Leu

Glu

AMt

du

Gly

LyS

Hhs

Lys

Glu

195

220

22)5

TTC

GAC

ACC

TTA

AAG

GGA

GAG

AAA

GG^G

AAC

CTT

CCA

GGC

TTG

GTT

ACT

672

Leu

Asp

Thr

Leu

Lys

Glu

Lys

GGu

Asn

Leu

Gln

Gly

Leu

Val

Thr

210

2'd

220

CGT

CAA

ACA

TAT

ATA

ATC

CAG

GAG

CCT

GGA

AAG

CCA

TTA

AAC

AGA

GCT

7 20

Arg

Gln

ThT

ryiA

IIe

Gln

Gin

Leu

Gd

Ley

Gd

Leu

Asn

Arg

Ala

225

220

223

2^0

ACA ACC AAC AAC AAT GTC CTT CAG ĆA.G- CAG CCA ATG GAG CTG ATG GG^CC 7 68

106

189 639

TAr	TAr Csn Csn	Ser 245	Val	Ltu	Gln	Lys
CCG	GTC	CAC	CCC	CCT	GGT	ACGC	GCT	GGU
TAr	Val	Hii	Asn	Luu	Vai	Asn	Lur	Cys
			250					225
TAG	GGA	GGA	CCAG	AGA	GG^G	GUGG	GGC	STGG
Lys	Gly	Gly	Lus	Arg	GGu	Giu	Giu	Lls
		275					220
GTC	TTC	ACC	TCA	GGA	CAC	ACC	ACA	ICT
aai	PAr	Lye	Ser	Gly	His	Thr	The	Asn
	290					229
CCT	GAT	TCT	ACA	GAA	GAG	ATC	ICG	GCC
Pro	Asn	Ser	Thr	Glu	Glu	Ile	Lys	Ala
305					33.0
GUC	GGC	GGG	TGG	ACA	ATT	ATT	CAG	CGA
Gly	Gly	GGy	Trp	Thr	Ile	IJ^e	Gln	Arg
				325
TTT	CCG	AGG	ACT	TGG	TAG	GUGG	TAT	CCAG
PAt	Gln	Asg	Thr	Trp	Lys	Glu	Tyr	Lys
			340					345
GUT	GCA	TAT	TGG	CTG	GGA	SCT	GAG	TTT
Gly	Giu	Tyr	Trp	Leu	Gly	Asn	Glu	Phe
		355					360
CCC	CGC	TAT		CTT	TCC	ATA	CAC	CTT
Gln	Grg	Ty_r	Val	Leu	Lys	Ile	His	Leu
	370					335
GCT	TGC	TCA	TTG	TAT	GUGG	CAT	TTC	TAT
Cli	Tyr	Ser	Leu	Tyr	Glu	His	Phe	Tyr

565

90

Gln	Gln	Ltu	Ulu	Leu	Met	Csp
225					225
ACC	STA	GUT	GGG	GGT	GTA	GCTC	S10
GCh	Ces	GGu	Gie	Gal	Guu	Glu
				227
CCA	TTT	AGA	GGC	STU	GGG	GGCG	860
Pro	PPe:	Asg	Ass	Cys	CGn	Giu
			225
GGC	ATC	TAC	ACG	TTA	ACA	TTC	919
Gly	Ue	Τ'Γ	Thr	Leu	Thr	Phr
		330
TAC	TGT	GAC	ATG	GCC	GCT	GGA	969
Tyr	Cys	Asp	Met	Glu	Ala	Gly
	335					330
CGT	GAG	GAT	GGC	AGC	GTT	GAT	100^
Arg	Glu	Asp	Gly	Ser	Val	Asp
330					3^05
GTG	GGA	TTT	GGT	TGC	CCT	TCA	1056
Val	Gly	Phe	Gly	Asn	Pro	Ser
				330
GTT	TCG	CCGG	CTG	ACT	ICT	CAG	1104
Val	Ser	Gln	Leu	Thr	Asn	Gln
			335
ACAG	GAC	TGG	GCTG	GGG	ICT	GAG	115 5.
Lys	Asp	Trp	Glu	Gly	Asn	Glu
		330
CTC	TCA	AGT	GAA	GCC	CTC	AAT	1200
Leu	Ser	Ser	Glu	Glu	Leu	Asa

395

400

189 639

107

TGT	GCG	ATT	CAC	CTT	AAA	GGA	Chh	GCA
Tyr	Grg	Ile	Hss	Leu	Lys	Gly	Luu	Ter
				705
GCC	GTC	AGC	CAA	CCA	CGA	MT	CGG	hhh
Sur	Ile	Ser	lln	Pro	CUy	Asn	Asp	Phe
			700					715
GAC	GAG	TGT	ATT	TCC	AAA	TGT	TCA	CGA
Asp	Lys	Cys	IUe	Cis	Lys	Cys	Sur	Cli
		735					770
GGT	CAT	GCA	Tlh	lGT	CCT	T(^C	MC	TTG
Phr	Gsp	Ala	Cys	Gly	Pro	Ser	Gsn	Leu
	750					755
Aee	CGC	MC	GCA	AAT	TAC	TTC	AAC	CCC
Arg	Cln	Asn	Ter	Asi	Lys	Phe	Asn	Gly
765					770
CGC	GCA	GGC	GAG	hCG	CTC	MG	CCC	ACA
Cly	Srr	Gly	Tyr	Ser	Leu	Lys	Gla	Thr
				785

GAT TTC TAA

GGG	ATA GCC AGC AGA ATT AGC	11 7 8
Gl	Thr	AT	Gly	Lei	IIu	Ter
4 10					471
AGC	ACA	AAT	GAT	GGJT	GlT	0ATC	11 96
Ser		Lei	Asp	Gly	Ars	Asn
				730
ATG	CTA	AT^	GGA	GGC	TGG	TGG	137 7
Met	Leu	Hr	Gly	Gly	Trp	Trp
			775
MC	GGA	ATG	T(^C	TAT	CCA	CAG	1392
Asn	Gly	Met	Tyr	Tyr	Pro	Gln
		7 60
ATT	0AAT	TTC	TAC	TAC	TGG	0TTT	17 7 0
IIe	Lys	Tgo	Tyr	Tyr	Tig	Lys
	775					780
ACC	ATG	ATG	ATC	CGA	CCC.	GCA	17 88
Thr	Tei	Mei	0 Ie	Arg	Pro	Ala

490

Asp Phi (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 20:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 498 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP ECĄSTECCZJ: iiałko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

108

189 639 (A) NAZWA/KLUCZ: 5E5C2O (chimera 1) (B) POŁOŻENIE: 1...498 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 20:

Acl

TCh

Vi1

hhr

Leu

Ser

Phe

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

His

1

5

10

15

Ile

CUg

Cgs

Ser

Asn

GUn

Aog

Asg

Sep

Pro

Glu

Asn

Ssr

Gly

Asg

20

25

30

Tgo

Asn

Arg

Ile

Gln

Hss

Gly

Gln

Tgs

Ali

Cgo

Thr

Phh

Ile;

Lee

Aeo

35

40

45

GUu

iss

Asp

Asn

Cgs

Arg

TUu

Ser

Thr

Chr

Asp

Gln

Tyr

Ass

Thr

50

55

60

Asn

Ala

Leu

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro

His

Va1

^lu

Pro

Asp

PPh

Ser

05

70

75

80

GUn

Lgs

Leu

Gln

His

Leu

Glu

His

Vv1

eet

Giu

Asn

Tyr

Thr

Gl.n.

Trp

05

90

95

Leu

Gln

Lgs

Lru

Glu

Asn

Tyr

Ile

Vi1

Glu

Asn

Met

Lys

Ser

Glu

Met

100

105

110

Ala

Cln

llr

Gln

Asn

Ala

Val

Cls

Asn

iis

Thr

Ala

Thr

MeC

Leu

445

124

125

GUu

lle

Gly

Thr

Ser

Aru

Leu

Ser

GSt

Thr

Ala

Glu

Gln

Thr

Arg

Lys

130

154

HO

Ltu

Thr

Ass

Val

Glu

Chi

Gln

Val

Lsu

Asn

Gln

Chr

Ser

Arg

Leu

Glu

145

150

154

160

IUe

Tln

Leu

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Thr

Tyr

Lys

Leu

Glu

Lag

Gln

105

17S

175

Leu

Ltu

Tln

Gln

Thr

Ass

Glu

Ile

Ltu

Lys

Ile

His

Glu

Lys

Asn

Sei

180

185

190

Leu Ltu Glu Hss Lys Ile Les Glu AcL Glu Gly Lys His Lys Glu Giu

189 639

109

195 220 205

Ltu Asp

Thr

Llu

Lys Glu GGn Lys GIu Acn Llu GGn Gly Leu Vii Thr

010

201

200

Cog

UlA

Thr

Tyr

Its

IIe

GGu

Ulu

Aeu

GGu

Lys

Gln

Leu

Asa

Arg

Ala

005

200

203

200

Tlo

Tir

Asn

Acn

Ser

Vol

Lee

CIa

Lys

GGn

Gln

Leu

Glu

Leu

Met

Asp

005

200

205

Thr

Vil

His

A cs

Seu

Val

Asa

Leu

Cys

Thr

Lys

Glu

Gly

Vii

Seu

Leu

060

265

207

Lys

Gly

L ys

Arg

Glu

Ulu

Glu

Lys

Poo

Phe

Arg

Csp

Ces

Ala

Glu

075

208

2735

Vil

Ple

Lys

Ser

CIa

HSs

Tlut

Tho

Asn

Gly

IIe

Tyr

Thr

Leu

Thi

Pht

0 90

205

300

Pro

Asa

Ser

Ths

Glu

IIa

Lys

Ala

Tyr

Cys

Asp

Met

Glu

Als

Gly

305

330

315

320

Gly

Trp

Thi

IIe

UlA

Ar g

Arg

Glu

Asp

Gly

ser

Vil

Asp

305

330

333

Pht

Gln

Arg

Thr

Tjcj?

Lys

Ulu

Tyr

Lys

VH

Gly

Phe

Gly

Acn

Pro

Seo

300

34 5

335

Gly

GIu

Tyr

T rg

Leu

Gly

Asa

Glu

Phe

Val

Ser

Gln

Leu

TGr

Asn

Gln

355

336

3(05

Gln

Arg

Tyr

Val

Ltu

Lp5

IIa

His

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Glu

370

33 7

380

Ali

Tyo

Ser

Leu

Tyr

Glu

His

Pht

Tyr

Leu

Ser

Glu

Ltu

Asa

385

330

395

400

Tyg

Cog

Ile

His

Lei

Lys

GTa

Ltu

Tir

Gly

Thir

Ala

Gir

Lys

Ilt

Str

400

401

sto

Ilt

Ses;

G Tu

Gro

GGy

Asa

Asp

Phe

sto

Thr

Lys

Asp

GGy

Alp

Asa

000 425 403

110

189 639

Gsp

Lys

Cys 435

eue

Cpi

Lys

Cys

Ser GUn 440

MeA

Lsc

TOg

GS- 455

Gly

Tro

Trp

Phe

Asp

Ala

Cpi

/esc

Pro

Sun

Asn

Luu

Asn

GSe

MtA

•ne

Tyr

Ppo

GGn

450

455

460

Tog

Gln

Asn

TCr

Asn

nnu

S hh

Ann

Gly

lL.u

Lys

Trp

Tyn

Tyr

Trp

Lps

465

410

440

400

Glu

Ser

Gly

Tyr

Ser

urn.

L yr

ACe

Thn

Ghir

MmU

Mut

Ue

Arg

Pro

Ala

455

400

405

Tsp Phu (7) INFORMACJE O SEQ ID nr 71:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1491 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TTY CCĄSTECZKI: DDA (ix) CECHA:

(A) NAAWWa/KLUCZ: Seeweenja kodująca (B) POOOZENIE: 1 ...1488 (D) INNEE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: 2N2C1F (chimrrP 2) (B) POOOŻENIE: 1^.1491 (D) UNE INE^(^!RM^(^,^1E:

(A) Innn (B) PPOOŻENIE: 11..18 (D) UNE II^^^iRRM^(^.JE: Poryypszczalna sskwencja liderowa jest kodowana przez nukleotydy 1-48 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 71:

TCC GGG CTC ATT TTT CTC CTG ACC CTC ACC GTC TAT CTC GTC CTA CCC 45

189 639

111

Met

Top

Gln

IlH

VaU

Phe

Thr

Leu

Ser

Cyn

Asp

Luu

Val

Lei

Al a

1

5

1.0

15

GCA

GCC

TAT

TATC

5CTC

TTT

CGG

ATG

AGC

GTG

GAC

ATG

ATA

GGA

PAG

AAC

90

AAa

Tli

Tyr

Asn

Phe

Trg

Lys

Se r

Met

Asp

Ser

5Iu

Gly

Lys

00

25

30

CGA

TAT

CAG

GTC

CAG

CAT

GGG

TCC

TGC

AGC

TAC

ACT

TTT

CCC

CTG

CCA

24 4

GAn

Tyr

Gln

Val

Gln

His

GOy

Sho

Cys

Sao

Tyo

TTh

Phh

Luu

Ppo

35

40

45

GAG

ATG

GAC

CCTC

TGC

CGC

TCT

TCC

TGC

CCC

TAC

GGG

TCC

GATT

GCT

290

GOu

Met

Asp

Asn

Cys

Arg

Ser

Sep

Sho

Pro

Tyr

Val

Ser

Asn

ATa

50

55

60

GTG

CAG

AGG

GAC

GCG

CCG

CTC

GAA

TAC

GTT

GAC

TCG

GTG

CAG

AGG

CTG

04 0

Vll

GAn

Arg

Asp

Ala

Pro

Lal

Gli

Typ

Gsp

Asp

Ser

Vv1

Gln

Arg

Luu

05

70

75

80

CGA

GTG

CTG

GAG

AAC

ATC

ATG

GTA

AAC

TAC

ACT

CAG

TGG

CTA

ATG

GATG

088

GUn

VaU

Leu

Glu

Asm

IOr

Met

Gli

Asn

Tho

Gln

Tt^Op

Leu

Met

Lys

85

0G

99

CTT

GAG

AAT

TAT

ATC

CAG

GAC

AAC

ATG

TAG

ATA

GGTT

ATG

GTA

GAG

ATA

330

Leu

Glu

Asn

Tyr

Ile

Gln

Trp

Asn

Met

Lys

Glu

Met

Val

Glu

Ile

000

MG

100

CAG

CTG

AAT

GCA

GTA

CAG

TAC

CTG

ACG

GCT

GTG

ATG

ATA

GGTT

ATA

GGG

384

Gln

Asn

Al a

Val

Gln

Tsn

Gln

ThG

Ala

VaU

MmU

He

Glu

Ile

Gly

115

100

125

GCT

TAC

CTC

TTG

5GTC

CAA

ACA

GCT

GAG

CGA

ACG

CGG

5ATG

TTA

ACT

GAT

4 30

Thr

Asn

Leu

Luu

Asrn

Gln

Thr

Ala

Glu

GUn

Tho

Arg

Lys

Leu

Thr

Asp

230

235

120

GTG

GGA

GCG

CCGT

GTA

TTA

TAT

CTG

ACC

ACG

AGA

CCT

GJTT

CTT

CAG

CTC

4 80

Vil

Glu

Ala

Gln

Lei

Tsn

Gln

Thr

Tho

Crg

Luu

Glu

Leu

Gln

Luu

145

150

155

112

189 639

GTG

GAA

CAC

CGC

ACC

TCC

ATA

MC

ossr

TTC

ATT

AGA

TCG

ATC

TGC

TAT

0 51

Leu

lUu

His

set

Alu

Asu

Thr

Asn

Lsi

Llu

Aln

Aji

Aln

IIn

Alu

Ars

165

117

177

CAG

ACC

AGT

TM

ATA

AAC

osss

TTG

cus

GlT

MG

AAT

AGT

Thh

ACA

A1A

051

lli

Thr

See

OTu

He

Asn

Lj/S

Llu

Gln

Asp

Lsi

Asn

Ser

PPe

Asu

ATn

180

118

190

AAC

AA1

GTG

CTA

GCT

ATG

GTGT

GAC

0ATG

CAC

ATC

CCGT

CCC

ACT

TAC

461

Lys

VaV

Leu

Ala

Met

Glu

Asp

Lys

His

IIe

Ile

Gin

Llu

Aln

Ter

555

200

21)5

AGA

AAA

GUT

GAG

UST

GAT

CAG

CTA

CAG

GTG

TTA

GTA

TCC

MG

AM

MS

072

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gln

Leu

Gln

Val

Leu

Val

Ser

Lji

ATn

Asn

m

215

210

TCC

ATC

ATT

GUC

GUT

CTA

GUT

AM

ssr

ATA

GTG

ACT

GCC

AGC

AGA

MT

410

Ser

Ile

IlI

Glu

Leu

Glu

Lys

Ile

Val

Tinie

Ala

The

AsI

Arn

115

130

035

170

AAG

GCA

GTT

(^•^T

CAA

AAG

CAG

CGA

CAT

GAT

CTC

ATG

GAG

ACA

AGT

MS

068

Asi

Sur

Val

Leu

Gln

Lys

Gln

His

Asp

Leu

Met

Glu

Thh

Val

Arn

044

250

215

TAC

GTA

CTG

ACT

ATG

TCC

ACA

TCA

MC

TCA

GCT

MG

G1G

CCC

TTC

0 3.6

Asi

Leu

Thr

Met

Ser

Thr

Ser

Asn

Ser

Ala

Lys

Asp

Pro

The

160

265

270

1GG

GCT

AUT

GM

GUT

CAT

ATC

AGC

TTC

AGA

gac

TGT

GCA

GlT

GGA

TAT

44 6

Sal

Ala

Lys

Glu

Gln

IIe

Ser

Phe

Arg

Asp

Cys

AUa

Ars

Val

Agi

115

280

285

CGA

GCT

GGT

TTT

AAT

ATA

AGT

GGA

ATC

TAC

ACT

ATT

TAT

ATT

MT

992

lli

Ala

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Ile

Tyo

IIn

Arn

295

300

ATG

CCA

GUT

CCC

AUT

MG

GTG

TTT

TGC

AAT

ATG

GAT

GTC

MT

GGG

GCA

960

Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Π)/ Π)/

189 639

113

305

330

335

330

GGC

CGT

ACT

GTA

ATA

CTAc

CAT

CGT

G1T\

GAT

MAT.

AGT

CTA

GAC

MCC

CPCl

10 08

GlG

Cip

The:

Val

Ile

Gln

His

Arg

Giu

Asp

Gly

Ser

Leu

Ass

Chh:

Gln

400

333

ACA

GGC

TGG

CSAG

G1AA

TAT

AATC

ATG

GTT

TTT

ATT.

AGAT

CCC

TCC

ATT

GTA.

1050

Arg

GlG

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Gly

PIw

Gly

Asn

Pro

Ssr

Mly

Glu

340

335

350

CAC

CGG

CTG

GGG

pa^t:

GAG

TTT

ATT

TCT

GCC

ATT

ACC

AGT

CAT

AGG

CAG

1104

TGr

Top

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

lln

Phe

Ala

lln

Thr

Ser

Gln

Asg

Gln

400

330

365

CTC

ACT

CTA

AGA

ATT

GAG

TTA

ATG

GAC

TGG

GCA

GGG

AAC

CGA

GCC

TAT

1152

TGr

AuL

Leu

Arg

Ile

Glu

Leu

Met

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Arg

Ala

Tyr

405

33 5

330

CTA

TAG

TAT

GAC

AGA

TTC

CAC

ATA

GGA

ATAT

GTA

SJAT

C.AT

/TAC

TAT

AGG

1200

Ser

GUn

Tyr

Asp

Arg

Phe

His

Ile

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

Asn

Tyr

Arg

480

390

395

4 00

CCC

CAC

TTTT

TATA

GGT

CTAC

ACT

GTG

ACA

GCA

GGA.

CJAl

CAT

AGC

CTG

124 A

Lru

TGr

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ssr

Leu

050

440

441

ACA

CCA

CAC

GGT

GCT

GAT

TTC

AGC

ACT

AAAA

GAC

GCT

GAT

ATAT

GAC

AAAC

1290

llr

Acu

Hii

GLy

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Las

Ass)

Ala

Asp

Asn

Asp

Asn

005

442

430

CTC

ACT

TGC

CTAc

TGT

GCC

CTC

ATG

TTA

ACA

GAG

GGA

TGG

TTT

GAT

134 4

Cgs

AuL

Cyc

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Llu

Thr

Gly

Trp

Ττρ

Ph^hi

Asp

435

4 4 0

445

CCC

CGC

GGC

CCC

TCC

AAT

CTA

AAT

GGA

ATT

see

TAT

ACT

GTA

GGA

CCA,

1:392

AUi

Ags

Gln-

Pro

Ser

Am

Llc

Am

Gly

MeC

Phh

Tyr

Thr

ASn

Gly

Gln

450

445

460

114

189 639

TCC

CTT

GGA

TTT

CCC

ATT

GGG

CTG

AAG

TCC

CAT

TAT

TTC

ICTG

GGG

CCC

144 0

Asn

ins

Gln

Lys

Lnu

Asn

Gln

Ilu

Lys

Tro

Ain!

Tys

Atu

Lys

Gle·

Ppo

465

400

475

450

ACG

GAC

TAC

CTG

CGT

CCC

ATC

CCT

AGA

ATC

ATT

CGA

CCT

TTA

GAT

TTT

C 4G I 9

Sur

Gyr

See

Leu

Arg

Ser

TG^

Thr

Met

MmU

I

Aug

Pro

Les

Asp

Phe

455 400 405

TT 8498 (7) INFORMACJE O SEQ ID nr 77:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 496 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/1LUCZ: 2N7E1F (chimera 7) (B) POŁOŻENIE: 1...496

	(D) INNE	IN FOFttACJJE:
(xi)	OPIS	SE SWENCJI:	SEQ ID nr	77:
Mut	Grp	Gln Ue	Ve Phe Phe	The Luu Ser	Ccs Tsp Lus Val Lea Ala
1			5	II	15
All	Ala	Tyr Asn	iSri Phe Arg	Lpi Seo Met	Asp Sun lle Gly Lys Lys
		20		25	(30
TUn	Gyo	Gln Val	Gln iis Gly	Soi Cyn Ser	Tyr Thr PPh Luu Lnu Ppo
		35		0I	45
GUs	Met	Asp Asn	Cpi Arg Ser	Sre Sur See	Pro Tyr Vvl Ter Ann G.la
	50		^I		60
VaU	Cln	Arg Tsp	Tli Pro Lus	CUs Tyr Tsp	Asp Ser VaU AGn Arg Lus

5C

189 639

115

GSa	Vil	Ltu	Glu
Ltu	GIu	Asn	Tyi
			455
UlA	CIa	Asn	Ala
		445
Tir	Asa	Leu	Lei
	405
ail	Ulu	Ala	Gln
105
Ltu	Ulu	His	Ser
GIA	Tlo	Seo	Gus
			180
Lys	Lys	Val	Leu
		195
Ilt	Lys	Glu	Gus
	010
sto	Ilt	Ile	Glu
335
Asa	sto	Val	Leu
Asa	Ltu	Leu	Thi
			060
lil	Cli	Lys	Glu
		075
GIa	Cli	Gly	Phi
	090

Asa	Ilt	Mtt	Ulu
85
He	Gln	Asp	Aan
Val	Gin	Asn	GGn
			110
Asn	Gln	Thr	Ala
		115
Val	Leu	Asn	UlA
	1^0
Leu	Ser	Thr	Asa
165
Ile	Asn	Lys	Leu
Ala	Met	Glu	Asp
			200
Lys	Asp	Gln	Leu
		215
Alu	Leu	Glu	Lys
	230
UlA	Lys	Gin	UlA
005
Met	Met	Ser	Thr
Glu	Gln	IIe	Ssr
			200
Asn	Lys	Ssr	G G y
		2 09

Asa	Asa	Thr	UlA
	90
iMt	Lys	Asn	Ulu
U0
Tir	Ala	v^i	Met
Glu	Gln	Thr	Arcg
			HO
Thr	Thr	Arg	Ltu
		1153
Lyi	Leu	Glu	Lys
	175
GGn	Csp	Lys	Asn
11i>
Lys	His	Ile	Its
Gln	l^ć^l	Leu	Val
			200
Lpi	Ile	val	Tho
		203
Hii	Asp	Leu	Met
	250
Sst	Asa	ser	Ala
206
Plt	Arg	Asp	Cys
Iit	Tyr	Tir	II«t

330

Trp Ltu Mtt Lys

Met Vii SGu IIa

111

IIa Glu IIl GGv

110

Lys Let Thr Asp

Glu Leu CIa Leu

110

Gln IIa Ltu Asp

175

Ser PPe Leu Glu

110

Gln Leu Gln Ser

20^

Ser Lys Gln Asn

Ala Thr Vil Asn

0

Glu Thr Vil Asn

255

Lys Asp Pro Thr

200

Ali Asp Val Tyr

2073

Ter Hit Asn Asn

Mtt Poo GGu Pro Lys Lys Vii PPe Ays Asa Met Asp Val Asn Giy Gly

116

189 639

005 300 305 302

Gly

Top TTh Gal

Ili 325

Giu Hss Asp

GGu

Css Gij 333

Ser

Luu

Csp

Phe 333

Ciu

Grg

GGu

Top

Lys

Glu

Ter

Lys

Met

GUj

She

G G e

Asn

Pro

Ser

GGy

GGu

340

345

335

Tyr

Ττρ

Leu

GG|

Css

GGu

Phe

Ue

Phe

Ali

lit

TAr

Set:

Gln

Arg

Gin

355

330

335

Typ

Met

Luu

Asp

lie

Glu

Let

Met

Asp

Trp

Glu

Gly

Acn

Arg

Ala

Tcr

H0

375

33(9

Ser

Gln

Thr

Asp

Ai^<3

Phe

Hu

Ile

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

Asn

Tyr

Arg

305

330

395

4 000

Leu

Tyr

Ler

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ser

Luu

405

452

415

lir

Leu

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Ler

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Asn

420

25 5

440

Cys

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Leu

Thr

Giy

Gly

Trp

Phe

Asp

435

440

445

Gla

Cys

Gly

Phr

Ser

Asn

Uuc

Asn

Gly

MtS

Pht

Tyr

Thr

Cla

Gly

Gln

450

45 S

460

Gsn

Hu

Gly

Lys

Leu

Asn

Gly

I le

Lys

Trp

His

Tyr

AU g

Ln s

Gly

Pro

455

470

475

440

Str

Tyr

Ser

Leu

Arg

Ser

TAo

Thr

Met

Mrt

ULe

Arg

Po G

Uut

Asp

Phe

585 440 495 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 20:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(l) DŁUlOŚĆ: 1500 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOlIl: liniwwa

189 639

117 (li) TTP CZĄSTECZKI: DDA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1...1497 (D) INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: 1N2C2F (chimera 3) (B) POŁOŻENIE: 1...1500 (D) INNE INFORMACJE:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) POŁOŻENIE: 1...60 (D) INNE INFORMACJE: Przypuszczalna sekwencja liderowa jest kodowana przez nukleotydy 1-60 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 23:

ATG

ACA

GTT

TTC

CTT

TCC

ttt

GCT

TTC

CTC

GCT

GCC

AGT

CTG

ACT

CAC

A 8

Met

Thr

Val

Phr

L eu

Se ja

PPe

AA a

PPe

Leu

Ala

Hu

Lru

Thr

His

1

5

10

15

CTC

GGG

TGC

AGC

AAT

CAG

CCC

CGA

AGT

CCA

GAG

AAC

AGG

GGG

AGA

96'

Ilu

Gly

Cys

See

A sn

Gln

Aitaf

Arg

Se (A

Pro

Glu

Asn

Sse

Gly

Arg

20

25

30

TAT

AAC

CGG

ATT

CAA

CAT

GGG

CCA

TGT

GCC

TGC

ACT

TTT

ATT

CTT

CCC

144

Tyr

Asn

Aog

I1i

G ln

Hhs

Gil

Gin

Cys

Ala

Tyr

Tt^r

PPh

Ile

Leu

Pro

35

40

45

GAA

CAC

GCT

GGG

AAC

TGT

CCC

GGG

AGT

ACG

GCA

GAC

CAG

TAC

AAGC

CCC

122

Gli

His

Asp

Gl.

A on

nys

Ago

GAu

Ger

Tt^jr

Thr

Asp

Gin

Tyr

Asn

Thr

50

55

60

AAC

Αcr

CTG

CAC

AGA

GAT

GGC

GCC

GAC

GTG

GGA

CCG

GAG

GAC

TCG

ATG

24C

Asn

Ala

Lei

GIg

A rn

aah

AGl

Apo

Ais

Gal.

Gli

Pro

Aah

Asp

Ser

ViU

118

189 639

TTC

TCC

CTC

GCA,

CTC

MTC

CGC

AUA

GCC

ATG

GGA

AAC

GAT

ACT

MAC

CGC

4

Cis

Aig

Lee

uin

Gv1

Asu

Cln

Asn

Ala

MeL

Gln

Ass

Gm

SCh

Gln

Arp

85

90

95

TCC

ATT

AAC

CTT

MAC

ATAT

CCC

ACC

CAC

CTT

GAC

AAC

AAAA

MATA

ACC

A 36

Stu

McL

Lys

seu

Glu

Am

Acg

Ile

Gln

Asp

Am

GeC

Alg

Llg

Cle

MeC

100

110

111

GTG

GAG

ATA

CAG

AAA

GCA

GTA

CAG

AAAA

CAG

ACC

GTT

MCC

AAG

ATT

484

VaU

Glu

11l

Gln

Am

Ale

Vś^1.

Gln

Asn

Gln

TGr

ASa

Val

MeC

Ile

115

110

112

CCA

TCT

GGG

ACA

AAAC

CTG

TCG

AAAC

CAAA

ATA

GCT

GAC

CAAC

ACG

CGG

AAAA

44 2

Glu

lii

Gli.

Thr

Asn

Leu

Asn

Gln

Chr

Ala

Glu

Gln

Thr

Arg

Lsg

440

113

1«

CCC

GAT

GTG

GACA

GCC

CAAA

GTA

TTA

CAC

CAG

ACC

ACG

AGA

CTT

GAG

440

Sru

Chi

Asp

vai

Glu

Ala

Gln

Val

Leu

Asn

Cln

Thr

Arg

Leu

Gle

440

150

155

100

CTC

TAC

CTC

TTG

GASC

CAC

TCC

CTC

TCG

ACA

ATCC

AAAA

TTG

GACA

ASTA

CAC

048

Stu

CUs

Leu

Glu

His

Ser

Leu

Ser

Gho

Asn

Lys

Leu

Glu

Lys

Gla

105

70A

115

ATT

CCC

GAC

CAG

FCC

AGT

GCAA

ATA

AAAC

AAA

TTG

CAAA

GAT

AAAG

ASAC

ACT

57 A

IUt

Seu

Asp

Gln

Thr

Ser

Glu

Ile

Asn

Lgs

Leu

Gln

Asp

Lys

Asn

Ser

180

115

190

TTC

CTT

GATT

ACAG

ASlG

GTG

CTA

GCT

ATG

CTA

GAC

AAAG

CAC

ATC

CCA,

024

Phe

Leu

Glu

Lys

Val

Leu

Ali

M«ęt

Glu

Asp

Lys

His

Ile

Gln

450

200

22)5

TTA

TAC

TCA

ATA

ASTA

GACA

GAG

AAA

GAT

CAC

CTA

CAG

GTG

TTA

GTA

TCT

07 4

Stu

lln

Ser

He

Lys

Glu

Lys

Asp

Tln

Leu

Gln

Val

Leu

Va1

Set

440

215

220

TAC

TAA

AAT

TCC

ATC

ATT

GAAS

GACA

CTA

TSA

AlAC

AGAT

ATA

GTtl

ACT

GCC

720

Lys Gin Asn Ser IIe Ile Glu Giu Leu Gnu Lys Lys Ile Val Thr ATa

189 639

119

775 270 275 240

CCG

CCA

AAT

CTGT

TCA

GTT

CTT

CCCG

G\CT

CCT

CCA

GAT

C1T

CCC

ATA

GUT

767

Chn

Vil

Asn

Ser

Val

Leu

Gln

Lys

Glu

Clu

Gin

Tup

Tuu

MeU

Glu

245

225

ACT

GCA

AAT

CCkC

TTA

CTG

ACT

ATG

ATA

TCC

ATC

GAA

AAT

GCA

GCC?

GAG

816

Chr

VaG

Asn

Leu

Thr

MeU

Sst

CTh

Teu

Asn

Ser

Ala

Lys

260

265

200

GCC

GGC

ACT

GTT

GCT

ACTG

GUTT

GUAG

CCTG

ATT

ATC

CCC

AGA

GAC

TAT

GCT

867

Asp

Poo

Thr

Val

Ala

Lys

Glu

Gln

Ilu

See

Phh

Arg

Asp

CyS

Ala

205

220

285

ACC

TTC

-TTT

TCA

GGA

CTC

ACC

ACA

GAT

GAA

ATC

TAC

ACG

TTA

TCT

912

Alu

Vil

Phh

Lys

Ser

Gly

His

Thr

TTr

Ann

Glu·

Ile

Tyr

Thr

Leu

Thr

200

295

300

TCC

CCA

AAT

TCT

GATT

GAG

ATC

GAGG

GGC

TAC

TAG

GAC

ATG

GUTT

GCT

966

Phe

Pro

Asn

Ser

Thr

Glu

Ile:

Lys

ATu

Ter

Ccu

Asp

Met

G/gj

Ala

305

310

315

320

GAT

GAC

GGC

GGG

TGG

ACA

ATT

CAG

CGA

CCG

GAT

GGC

AGC

GTT

1005

Gly

Trp

Thr

Ue

Ile

Gln

Arg

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

325

333

335

ATT

TCC

CAG

AGG

ACT

TGG

WAG

GUTT

TAT

GTA.

GTA

CAA

T AT

GGT

GCGC

CCT

1056

Asp

Phu

Gln

Arg

Thr

Trp

Lys

Glu

TC·

Lys

Vvl

Gly

Phh

Gly'

Asn

Pro

340

345

350

ACA

AAC

GGA.

T^C^CT

TGG

CTG

GGA

GCGT

GUT

TAT

GGC?

TAG

GCA,

CTG

ACT

GATT

1104

Ser

Cly

Glu

Tyr

Trp

Leu

Gly

Ann

Glu

PPh

Vvl

Teu

Cln

Lnu

Thr

Asn

355

3361

365

CCG

CAC

CGC

TAT

GTG

CTT

GTTT

ATA

CCT

CCC

GAA

CAT

TC-G

GUTT

GGG

GCTT

1152

Aln

Gln

Arg

Tyr

Vvl

Leu

Lys

Ile

His

Lee

Gyr

Aup

Gro

Glu

Gly

Asn

270

325

380

120

189 639

GTT

GGT

TAC

T CA

TTG

TAT

GGA.

CAG

TTC

TCT

ATT

STA

ATU

STA

SGA

SAT

4200

Glu

AIi

Tyc

S es

Olu

Scr

SGu

Hii

Phe

Τ'Α

Lut

Sse

GGu

SGu

Seu

000

390

339

400

CAT

TCG

AGG

A TT

CAC

ATT

GATT

GCA

CCC

AGA

TAC

AGG

SUA

GGU

SAA

ATT

4004

Asa

Tyg

Arnę

I le

Hii

Lee

Lys

GGy

Leu

Thr

Gly

Thr

ACe

iTn

ses

IIa

005

4H

401

AGA

CGC

ATC

AGC

CAC.

CCA

GGA

GATT

GAC

ttt

AGC

ACA

SCCG

GAT

GGA

GGT

1390

str

ser

IIi

S er

GGn

Pro

Gil/

Acn

Csp

PPe

Ser

Thr

Lys

Asp

G G. y

Aap

000

005

030

CCT

GAG

ATTC

T GT

ATT

TGC

/CCC

TTT

CCC

CGTT

ATG

CTA

ACA

GGA

GGC

TCG

130 0

Asa

Asp

Lys

C ys

I le

Cys

Lys

Cys

ser

Gin

Met

Leu

Thr

Gly

Trg

035

000

005

TGG

TTT

GAT

GCA

TGT

GGT

CCT

TCC

AAA

TTG

JA.C

GGA

ATG

TAC

TAT

CCA

1093

Trp

Plt

Asp

A la

Cys

Gly

Pro

Ser

Asa

Leu

Asn

Gly

Met

Tyr

Pro

050

055

0 60

TAG

ACG

CAG

AAC

ACA

AAT

AAG

TTC

CAA

GGC

ATT

AAA

TGG

TAC

TGG

10 0 0

Gln

Aog

Gln

A sn

Ther

Asn

Lys

Phe

Asn

Gly

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tt^rp

065

070

475

400

CCC

GAA

TCA

GGC

TAT

TCG

CTC

AAG

CCC

ACA

ATT

ATG

ATC

CGA

CCA

10 88

Lys

Gly

Set

L le

Tyr

Ser

Leu

Lys

AIi

Thr

Tho

Met

Ile

Arg

Pro

085 409 4 0^75

ACT GCT TTC TCA	4O05
Cli	Csp Ple
(2)	INFORMACJE O SEQ ID nr 24:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUlOŚĆ: 499 aminokwasów (B) TYP: ammowas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

189 639

121 (ii) TYP ECĄSrEECZI: iiałko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NACWA/KLUCZ: 1N2C2F (chimera 3) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 24:

Mrt

The

aal

Pht

Leu

Ser

Phe

Ala

Phe

Leu

Ala

Aia

Ile

Leu

Thr

His

1

5

1T

15

IUr

CUy

Cys

Ser

Asn

GUi

Arg

Sro

Pra

Glu

Asn

Srr

GT

Tag

Arg

10

15

30

Tyr

Asn

Arg

ILIa

Gli.

Hss

G ly

Gln

Cis

Ala

Gir

Tiar

Phi

IIn

Alu

Areo

35

40

75

Glu

hss

Asa

g Te

Asn

Cio

ArC

n 0u

Ser

Thr

nia

Asu

Gln

Tyr

Ast

OSr

50

55

60

Asi

Ala

Leii

G Te

Arg

Ag.

Ala

isn

Poo

Val

Glu

Teu

Asp

Se a

VAl

65

70

75

80

Gli

Arg

Leu

G Te

Val

1ut

Glu

Aen

as.

Met

liu

luu

Asn

Thr

Gl h

O ap

85

00

95

Lru

Mrt

Lys

Leo

Glu

Asn

Tyr

Ile

Gln

Aip

Asn

Met

Lys

Lj!

Glu

Met

100

na

m

aal

Clu

Ile

Gln

Asn

Ala

aal

Gli.

Aia

Gln

Thr

Ala

Val

Mei

Ile

154

100

115

Glu

Ile

Gly

T Te

Asn

ni.

Leu

U sn

Liu

Thr

Al a

Glu

Gln

ThA

Arg

Lys

1H

135

140

Leu

The

Asp

Val

Glu

Ala

Gis

VeU

San

Asn

Gin

Thr

Arg

La a

g 0u

175

150

545

160

Lru

Gln

Leu

L uu

Glu

(Jia

Sei

Leu

Sri

Thr

Gon

Ani

Leu

Glu

U .1

U 0n

564

700

175

Ile

Lru

Asp

Gln

Thr

Ser

Glu

Ilr

TTor.

isa

Leu

Gln

Asp

Lj!

Asn

Seo

180 185 199

122

189 639

Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala

195 200

Leu Gln Ser Ile Lys Glu Glu Lys

210 215

Lys Gln Asn Ser Ile Ile Glu Glu

225 230

Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gln

245

Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met

260

Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu

275 280

Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr

290 295

Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile

305 310

Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile

325

Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu

340

Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn

355 360

Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile

370 375

Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His

385 390

Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly

405

Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln

205

Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser

220

Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala

235 240

Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu

250 255

Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys

265 270

Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala

285

Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr

300

Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala

315 320

Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val

330 335

Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro

345 350

Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn

365

His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn

380

Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu

395 400

Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile

410 415

Ser Ser Ile Ser Gir Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp

189 639

123

020

025

000

Css

Csp

Lys

Cns

lie

Cys

Lys

Cys

Ser

Gin

Mrt

Leu

Thr

Gly

Trp

4 35

440

4 4 5

Top

Phe

Asp

AGu

Crs

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Gsn

Gly

Met

Tyr

Poo

447

444

407

Gin

Crg

Gln

Asn

TAr

Asn

Lys

Phs

Asn

G1 y

Ile

Lys

Trp

Tyr

Tpp

455

470

475

000

Lys

Gir

Ser

GSc

Tyr

Ser

Leu

Lss

Ala

Thr

Mie t

Me t

Ile

Crg

Poo

405

407

404

Ala Csp PAe (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 25:

(1) CECHY SEKWENCJI:

(l) DŁUlOŚĆ: 1088 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁlŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOlIl: liniowa (is) TYP CZĄSTECZKI: DNl (ix) CECil:

(l) NlZWl/KLUCZ: Sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1...1085 (D) INNE INFORMlCJE:

(l) NlZWl/KLUCZ: 3N1C0F (chimera 0) (B) POŁOŻENIE: 1...1088 (D) INNE INFORMlCJE:

(l) NlZWl/KLUCZ: Inne (B) POŁOŻENIE: 1...08 (D) INNE INFORMUE: Przypuszczalna sekwencja lsdurowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 25:

CTG TGG CGG GTT GTT TTG TTT CCT CTG GGC TGT GCT CTT GTG TTG GGG 43

124

189 639

M.rt

Trp

Gln

Ile

Val

Phe

Tnr

Leu

Ser

C^ys

Csp

Luu

Val

Luu

Ala

1

5

10

15

GCA

GCC

TAT

TAC

TTC

TTT

CGG

TTCG

AGC

ATG

GAC

AGC

TTA

GGA

PAG

AAT

59

Tli

AOa

Tyr

Asn

PhG

Arg

Lag

Sep

Asp

Sur

Ile

C^l^y

Lys.

Lys

00

05

30

CGA

TTT

CCG

GTC

CGG

CAT

GGG

TCC

TGC

ATG

GAC

PTC

PTT

GCG

PTC

GCC

144

GAn

Tyo

Gln

Val

Gln

His

Glg

Sur

Css

Ser

PAS

GTh

GPh

Guu

Grr

35

40

45

GGG

ATG

GTC

GAC

TGC

CGC

TTT

TCC

ATG

GCC

GCT

GGT

GAC

GAT

GGC

190

GAi

Met

Gsp

Tnn

Cyn

Arg

Ser

Sur

Ser

Gpo

Ges

Gv1

Geu

Gan

PTo

50

55

60

GTG

CGG

GTC

GCG

CCG

CCC

GCT4

TAC

GGT

GTT

PTC

GCC

GCT

4ATT

pCe

04 5

Vil

Gln

Arg

Gsp

AOa

Pro

Luu

Glu

Tyr

Ata

PPh

Geu

Per

GGu

Pys

Guu

05

70

75

80

CCA

CTT

CTG

GAA

CTT

GTG

ATG

GTC4

TTTT

TTT

ACC

GCT

GAG

CCG

CCTT

GTA.

088

Gln

His

Luu

Glu

His

Vil

Glu

Asn

Ter

TTh

Gla

Pro

Luu

Gln

Lys

85

90

95

CTT

GGG

GAT

TGC

ATT

GTG

GGTT

TAC

ATG

AAT

TCC

GGT

ATG

GGC

CAG

ATC

330

Luu

GAi

Tnn

er·

Iie

Ul

Glu

Asn

Met

Lys

Ser

GGu

GeH

ATu

GcA

Ili

100

120

CCG

CGG

GAT

GCG

GTT

CAG

TTC

CAC

ACG

GCT

ACC

AT^TG

CCG

GAG

ATA

GGA

W

Gln

GAn

Ann

Ala

Vil

Gln

Asn

Hig

Thr

ATa

Thr

Met

Luu

Glu

Ue

GJLg-

215

10G

100

CCC

AGC

CTC

TCT

CAG

ACT

GCA

GAG

CAG

ACC

ATA

4TTG

CTG

ACA

GAT

4 30

Thr

Sur

Lei

Luu

Sur

GUn

TTiio

Al a

Glu

Gln

TTr

Ang

Lys

Luu

Thr

Aap

130

135

11'

ner

GGG

CCC

CCG

GTC

CTA

war

CTT4

ACT

TCT

CGA

CTT

GAG

ATA

CAG

CTG

4 80

Vil

Gli

Thr

Gln

Val

Luu

Asn

Gln

ThG

Ser

Aag

Luu

Gla:

He

Gln

Luu

5

150

155

116

189 639

125

CTG

GGG

AAT

TCA

TTA

TGC

AAC

tac

AAG

ACC

GAG

AAG

GAG

GCG

ACA

A58

Lei

Gli

Asn

Ser

Leu

See

TAn

GAr

Las

Gee

Gin

Gls

Gin

Geu

Gle

165

117

CAG

ACC

AAT

CAAA

ATC

TTG

AAG

AGC

GCA

AGA

AAG

AGG

GTA

GGA

07 A

G!n

Tho

Asn

Glu

He

Leu

Lys

IIe

His

Glu

Gls

Aah

Ast

Alu

Ger

Alu

180

118

110

CCT

ACG

ATC

TTA

GAG

ATG

GGAG

GGA

AGA!

CCGGC

GAG

GGA

GAG

ATG

GGG

ACC

624

Hss

Lys

Ile

Leu

Glu

Met

Glu

G ly

Las

His

Gls

Glu

Giu

Geu

Aa;

TA^r

195

220

TTA

AAG

GACA

G^G

AAG

GAG

AAGC

CCT

CCA

GGC

TTG

GGT

AGC

GCG

CCA

ACA

672

Ltu

Lys

Glu

Lys

Gd

ASn

Leu

Gin

Gly

Leu

Val

GTi:

Anj

Gin

TA^r

210

225

222

TCT

CTA

ATC

CAG

GAG

CTG

GAA

AGAG

CCGG

TTA

AAGC

AAA

GGC

ACC

AAC

720

Tyr

Ilu

Ile

Gln

Glu

Leu

Glu

Ler

Gin

Leu

Asn

Anj

AAu

ΑΤτ

Thr

Asn

125

230

235

240

ACC

AGT

GTC

(CTT

CAG

AAAG

CAG

CCAG

CCT

GAG

CCG

AGG

GAG

ACA

GGC

CAC

7 08

Csn

Sur

Val

Leu

Gln

Lys

Gln

Lee

Glu

Leu

MM^t

Ag;

TGr

Val

His

245

220

225

CAC

CTT

GTC

CAT

CTT

TGC

ACT

AGAG

GACA

GGT

TTA

CCAG

AGAG

GGA

816

Asn

Leu

Val

Asn

Leu

Cys

Thr

Ler

G’u

Gly

Val

Ler

Lau

Las

Gly

G'y

260

225

220

GAC

GGA

GAG

GGA

GAG

AACA

CC^CA

TTT

AGA

GAC

TTG

GCA

GAG

GTA

TAT

CCGG

8 04

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

PPh

Ang

Asp

Ccr

AA^

Αηρ

Val

Tyr

Gln

275

220

228

GCT

GGT

ttt

AGAT

AGAA

AGC'

GGA

AGC

TAG

ACT

AGT

GG.Gt

ACC

AAT

ATG

912

Ala

Gly

Phr

Asn

Ly y

Ser

Gly

Hn

Trr

GCr

AIn

Arr

Hu

Ann

Ans

Met

290

229

330

CCC

GAA

CCC

CAAA

ACAG

GTG

tgt

TGG

GAG

AGC

GAG

GGC

GAG

GGG

GGA

GGT

960

Pro Glu Pro Lls Lys VvC Phc Cys Asn Met Asp GvC Ass Gly Gly Gly

126

189 639

305

330

331

322

TGG

CAC

GTG

AGA

IGA

SAT

SAG

STA,

GGT

GGG

ATU

ITT

GGT

TGG

GAA

ATG

4000

^Tgp

Tlo

Val

Iiu

ITn

Hii

Acg

GGu

Acn

GGl'

Sst

Sue

Aap

The

AGu

Ano

305

33^

333

GGC

CUG

AAG

GTAT

TAT

GATt

ATT

TGT

TT^T

GGA

4AT

ICC

TGG

IGA

I-AA

ITT

Ι^

Gly

Top

Lys

AGu

Tcr

Lys

t^Mt

SGu

PPr

GGy

Acn

Pro

Gst

SGu

SGn

Tcs

300

335

TGG

TCG

GGG

GATT

GAG

ttt

ATT

TTT

GAC

ATT

AGC

ATT

SAT

ACG

SAT

TAC

1114

Top

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

IIa

Phe

ACl.

IIa

Thr

Ssr

SGn

Ang

GGn

Tta

000

330

336

CTG

TTA

AGAT

ATT

GAG

TTA

AGG

GAC

TGG

GTAC

GGG

STAĆ

CCA

GCC

TAT

TCA

H15

Met

Ltu

Arg

Ile

Glu

Leu

AMt

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Ang

ACa

Tys·

S s tr

370

33 73

330

TCG

CCC

GAC

AGA

TTC

CAC

ATA

GGA

GATT

GUTA

/TCG

C/CA

AAC

TAT

AGG

TTG

1100

Gln

Tyg

Asp

Arg

Phe

H l^

He

Gly

Asn

alu

Lys

Gln

Asn

Tyr

Arg

Leu

385

390

395

4 00

TCT

TTA

AAA

GGT

CAC

ACT

GGG

ACA

GCA

GGA

/ATT

CAG

AGC

CTG

ATC

1108

Tyo

Leu

Lys

^ly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ssr

Leu

Ile

005

410

415

TTA

AAG

GGT

GCT

QAT

TTC

AGC

ACT

AAA

GAT

GCT

GAT

GATT

GAC

GACC

TGT

119 <5

Ltu

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

000

425

400

ATU

Tic

AAA

TaT

GCC

CTC

ATG

TTA

ACA

C-GA

a GA

TGG

TTT

GAT

GCT

1134

Met

Ays

Lys

Cys

Ala

Leu

Mer

Leu

Thr

Gly

Trp

Phe

Asp

Ala

035

440

405

TGT

GGG

CCC

TCC

ATT

CTA

/CAT

GGA

ATG

TTC

TAT

ACT

GCG

GGA

cena

AAT

13 92

Tys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Phe

Tyg

Tl^jr

Ala

Gly

Gln

Asa

47^75

050

460

189 639

127

TAT

CGA

ACA

ATG

ACTT

GGG

AST 4CAG

GCC

CAC

TTC

MASA.

ttg

CCC

TCC

144 A

iss

CUG

Llg

Atu

Asn

GUg

lln Tag

Top

His

TTG

Phe

Llg

Cly

Peo

Str

405

410

475

480

GAC

GTC

TGT

AGC

TCC

ACA

ACT AAG

ATT

CTA

CCT

TGT

MAT

ttt

GGA

144 8

TGr

Sto

Lsu

Arg

Ses

Thi

TCh Met

AuL

Ilu

Arg

Pro

Llu

Asp

Phe

485

490 495 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 26:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 495 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: 2N5C0F (chimera 4) (B) POŁOŻENIE: 1...895 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 26:

McL 1

Trp

Gln

Ile

Val 5

hCs

hhu Chr

LeU

Ses 0A

Ctg

Asp

Llu

Va1

Leu 15

AUa

AUi

Tyr

Ass

Asn

sSs

Arg

L ys

Sos

Met

As p

Ser

Ile

Gly

Ly s

Oli

20

2A

30

GUn

TGr

Gln

ΑΜΙ

Gln

ls A

Gly

S er

CyG

Ser

Ty r

TTg

Phe

Leu

Lee

i AO

35

40

45

TUu

McL

Ass

Mys

Gss

Ser

S sr

Ser

Pr o

Tse

Val

Ser

Ase

A Aa

50

54

60

Vi1

Cln

Asg

Ass

Ala

lis

Lee

G lu

Luu

Asp

Ph e

SCG

Ser

AUn

Lye

t At-

128

189 639

Gis

iss

Luu

U-Lus

His 05

V^AS

Met

Glu

Asn

Tyr <00

Thr

Gis

Trp

Leu

Gin 95

Lus

Ltu

Ulu

Asn

Tyr

lit

V^1

Glu

Asn

Me t

Lys

Ser

Glu

Met

Ala

Gin

lls

100

U0

110

Gln

GGe

Gsn

Ala

Va Α-

Gln

Asn

His

Thr

Ala

Thr

Met

Leu

GALu

Ue

Giy

220

125

112

Thp

Set

Leu

Ltu

εί!

Gln

Thr

Ala

Glu

Gis

Thp

Asp

Lys

Leu

Che

G.sp

130

135

110

Va1

Glu

GS Cr

Gis

Val

Leu

Asn

Gln

Thr

Ser

Arg

Lue

GGu

Hi

Gln

Leu

25 5

110

1155

160

Leu

Glu

A sn

Ser

Leu

Ser

Thr

Tyr

Lys

Leu

GAL u

Lys

Gln

Leu

Gln

154

705

175

Gln

Thr

Asn

Giu

lie

Luu

Lys

lie

His

Giu

Lys

Asn

Sur

Leu

Glu

237

185

190

iss

Lys

lie

Litu

Glu

Met

Glu

Gly

Lys

Hss

Lys

ilu

Glu

Leu

Asp

Thp

195

200

205

Ltu

Lys

Glu

Lys

Glu

Asn

Leu

Gln

Gly

Ltu

V<al

Thr

Asp

Gin

Thr

210

2A15

220

Typ

Ue

I lit

Gln

(Aaj

Leu

Glu

Lys

Gln

Leu

Asn

Arg

Ala

TAr

AT itr

Asn

225

230

2-33>

240

Csn

Ser

A

Leu

Gin

Lys

Gln

Leu

Glu

Leu

Met

Asp

TAr

Vi^l

Hss

245

50 S

240

Csn

Luu

Val

Asn

Leu

Cys

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Leu

Luu

Lys

GGjl

Giy

250

265

270

Lys

Asp

Glu

Lys

Pro

Phe

Gpg

Csp

Cys

Gla

Asp

Vi1

Tcr

Gln

574

280

285

Cla

GGy

Phe

Asn

Lys

Sep

Gly

Ile

Typ

Thr

lls

Tyr

Ile

Asn

Mii

290

295

330

Pro Glu Pro Ly'S Lys Val Phe Cys Ast Met Asp Val Asn Gly Gly lly

189 639

129

305 310 315 320

Trp

Thr Val

Ile

Gln 325

His Arg Glu Asp

Gly Ser Leu Asp 330

Phe

Gln 335

Arg

Gly

Trp

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Gly

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Gly

Glu

Tyr

340

345

350

Trp

Leu

Gly

Asn

Glu

Phe

Ile

Phe

Ala

Ue

Thr

Ser

Gln

Arg

Gln

Tyr

355

360

365

Met

Leu

Arg

Ile

Glu

Leu

Met

Asp

Trp

Glu

Gly

Asn

Arg

Ala

Tyr

Ser

370

375

380

Gln

Tyr

Asp

Arg

Phe

His

He

Gly

Asn

Glu

Lys

Gln

Asn

Tyr

Arg

Leu

385

390

395

400

Tyr

Leu

Lys

Gly

His

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Lys

Gln

Ser

Leu

Ue

405

410

415

Leu

His

Gly

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ala

Asp

Asn

Asp

Asn

Cys

420

425

430

Met

Cys

Lys

Cys

Ala

Leu

Met

Leu

Thr

Gly

Trp

Phe

Asp

Ala

435

440

445

Cys

Gly

Pro

Ser

Asn

Leu

Asn

Gly

Met

Phe

Tyr

Thr

Ala

Gly

Gln

Asn

450

455

460

Hia

Gly

Lys

Leu

Asn

Gly

Ue

Lys

Trp

His

Tyr

Phe

Lys

Gly

Pro

Ser

465

470

415

480

Tyr

Ser

Leu

Arg

Ser

Thr

Met

Ue

Arg

Pro

Leu

Asp

Phe

485 490 495 (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 27:

(l) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

130

189 639 (11) TYP CCZSTECCKI: DNA (ix) CECHA:

(A) NACNA/KLUCC: hTL4atg (B) POŁOŻENIE: 1...47 (D) INNE INFORMACJE: Primer PCR (A) NACWA/KLUCC: Inne (B) POŁOŻENIE: 1...20 (D) INNE INFORMACJE: Sekwencje „ogonka dodane do primera PCR w celu ułatwienia kloningu powielonych fragmentów PCR (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 27:

GESTGETATC TEGAGEEAEE ATGETErCEE AGETAGCEAr GCTGEAG (2) INFORMACJE O SEQ ID nr 28:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP EZĄSTEEZZI: DNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: hTL4not (B) POŁOŻENIE: 1...55 (D) INNE INFORMACJE: Primer PCR (A) NAZWA/ZLUEC: Inne (B) POŁOŻENIE: 1...28 (D) INNE INFORMACJE: Sekwencja „ogonka dodana do primera PCR w celu ułatwienia kloningu powielonych fragmentów PCR (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 28:

189 639

131

GTGTCGAEGC GGCCGCrCTA GA^AGAC^ AGATGrCEAA AUCCG^^ A^AT 55

Wskazania, odnoszące się do złożonego drobnoustroju (PCT reguła 13 iis)

A. Wskazania uczynione poniżej odnoszą się do drobnoustrojów przytaczanych w opisie na stronie 102 , wiersze 5-19
B. Identyfikacja depozytu Dalsze depozyty x identyfikuje się na dodatkowych arkuszach
Nazwa instytucji depozytariuszowej Amerykańska kolekcja typów kultur
Adres instytucji depozytanuszowej (włączając kod pocztowy i kraj) 12301 Parklawn Drive Ros^iIIs, Maryland 20852 U.S.A.
Data złożenia 7 października 1994	Numer dostępu 75910
C. Dodatkowe wskazania Tę informację kontynuuje się (zostaw formularz jeśli na dodatkowym arkuszu nieodpowiedni)
Cgłaszający życzą soiie żeiy, dopóki wzmiankowanej publikacji nie przyzna się statusu eupropsjnkasgo opisu patentowego, lui do daty, w której zgłoszenie zostanie odrzucone lui wycofane lui uznane za wycofane, depozyt iędzie dostępny jak przewiduje reguła 28(3) Jmplementarg Rsgulαtaknnurdsr the Europsαr Patent Co^ent-ion, tylko przez ujawnienie próiki ekspertowi wymienionemu przez osoię, potrzeiującą próikę (Reguła 28(4) przepisów uzupełniających ).

132

189 639

Formularz PCT/RO/134 (Lipiec 1992)

189 639

133

Att. Dkt. Nr - Nr zgłoszenia międzynarodowego: Data złożenia międzynarodowego: Tytuł:

FEG 333-PCT JESZCZE NIE ZNANY ZŁOŻONA Z NINIEJSZYMI NOWE MODYFIKOWANE LIGANDY

Strona uzupełniająca do części B formularza PCT/RO/134

Identyfikacja dodatkowych depozytów - Oprócz depozytu zaznaczonego na załączonym formularzu PCT/RO/134, zgłaszający określa następujące depozyty wykonane dla Amerykańskiej Kolekcji Typów Kultur, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A. Oraz proszą, aby były one także dostępne tylko przez ujawnienie próbki ekspertowi wyznaczonemu przez osobę proszącą, jak zaznaczono na załączo-

nym formularzu: Data depozytu 7 październik 1994 26 październik 1994 9 grudzień 1994 2 lipca 1996

Numer dostępu VR2484 75928 75*6(53 90895

134

189 639

Fig.1 A.

r EHK-1 ecto/h IgGl Fc Gelfoam (6ug)

Fig.lB.

r TIE-2 ecto/h lgG1 Fc Gelfoam (6ug)

189 639

135

Fig.2.

136

189 639 —43340 Rend

. —39000 Hindin —36590 BamHl —34740 Smal 33670 BglD 33g_{10 Bgin}

32710 EooRl

	tn CD i3	o X u
00 _Ó) Ll		ni tn XJ
	σι

32470 Hindin

-30500 BamHl /29500 Xhol 29240 Sali '28750 Sali >—27620 Smal

23970 BamHl I— 23130 Hindm =r22430 BglU '22350 BamHl

19400 Smal ł—18560 Kpnl Ί7050 Kpnl

Z-X — 11930 Pvul

0—2 u- zul cn #<

-O ω

5-=1 e£

Ξ— 5510 Barn HI

4—420 Bgl U

189 639

137

Fig.4.

10	20	10	40	50	£0 •	70	eo
cagctcactcacozaocctccatcctcaa<xctcacacagagagcaaacaataaatctcacctactatccaataaatatc
so	100 •	110 «	120 •	130	140	ISO	160

TCAACTTTTAACGAACAAAAACATCATTGCACTCAAATAAAAAATTTTAAAATTTrACAACAAACCTAACAAATGOCTAC

170	ieo •	190 •	200 •	210	220	230 •	240
TTTIvrATUATIvlTvrrcAAAĘA^TTŁCTTTCAGGQ©SAAA£ASTCAAAGAAAGAAGCAGTTrTAOęTuAAATAAAGAA
2S0	260	270	280	290	300	110
♦	•	•	«	•	•	•

CTACTTTTACACG7CACAACAAACGACCAACTTTTGOGACACGCACOGAACGACTGTCCTOOCACTACA ATC ACA

«

T>

320

330

340

ISO

160

170

*

«

GTT TTC

CTT TOC TTT GCT TTC CTC CCT

GCC

ATT CTC

ACT

CAC ATA OOG TGC

ACC AAT CAC

V F

L

S

F

A

Γ

L A

A

Z L

T

K

1

c

c·

S H

o>

380

190

400

410

420

430

•

W

•

CGC CGA

ACT CCA CAA AAC

ACT GOC ACA

ACA

TAT AAC

CGG

ATT CAA

CAT GGG

CAA TGT GCC

R R

S

P

ε

H

S

G R

R

Y H

R

Z

G

K

c

G C

A>

440

450

460

470

480

490

•

♦

•

TAC ACT TTC ATT CTT CCA

GAA

CAC CAT CGC

AAC TCT CGT CAC

ACT ACG

ACA GAC CAC

TAC

Y T

F

I

L

F

ε

H O

G

M C

R

ε

S

T

O O

Υ»

500

SIO

S20

SIO

S40

SSO

•

«

*

•

»

•

AAC ACA

AAC OCT CTC CAC

ACA

GAT GCT

CCA

CAC CTC

CAA

CCG

GAT TTC

TCT

TCC CAC

AAA

N T

H

A

L

Q

R

D A

P

Η V

ε

P

0

F

S

s o

X»

S60

570

seo

590

600

610

•

«

•

CTT CAA

CAT CTG GAA CAT GTC

ATC GAA

AAT TAT ACT

CAC

TOG

CTC

CAA

AAA CTT CAC

AAT

b Q

H

L

ε

K

V

η ε

H

Y T

Q

W

Ł

0

X

l ε

N>

620

630

640

6S0

660

670

«

•

«

•

TAC ATT GTC GAA AAC ATC AM3

TOG CAC

ATC OdC CAG

ATA CAC CAC AAT GCA GTT CAC

AAC

Y I

V

ε

H

X

s ε

H

A 0

X

G

<}

K

A

V Q

M>

680

690

700

710

720

730

•

«

CAC ACG GCT ACC ATC CTC CM ATA GGA MOC

ACC CTC CTC TCT CAC ACT OCA CAC CAC ACC

Η T

A

T

K

L

ε

Z G

T

S b

L

s

<1

T

A

e o

T>

740

7SO-

760

no

780

790

«

•

AGA AAC CTC ACA CAT GIT GAC ACC CMS GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT CMS ATA OC

R X

b

T

o

V

E

T o

V

b H

G

τ

s

R

Ł

ε x

Q>

800

810

820

830

840

8S0

•

«

•

CTG CTC

GAC

AAT TCA TTA TCC

ACC TAC

AAC

CTA GAC

AAC

CAA CTT CTT CAA CAC ACA

AAT

L . C

ε

M

s

b

s

T Y

K

ϋ ε

K

Q

C

b

Q

G T

H>

860

870

880

890

900

910

•

«

•

GAA ATC

TTG

AAC

ATC

CAT GAA

AAA AAC

ACT

TTA TTA

GAA

CAT

AAA

KIC

TTA

GAA ATC

GAA

ε Z

c

K

I

H

ε

X N

s

b L

ε

H

X

I

b

Ε K

E>

920

930

940

950

960

970

•

«

•

«

•

GGA AAA CAC

AAC

GAA CAC

TTC

CAC ACC

TTA

AAC GAA GAC

AAA CAC AAC CTT CAA GGC

TTC

C K

K

X

ε

b

D T

L

κ ε

ε

X

E

H

L

G C

u>

980

990

1000

1010

1020

1030

•

«

•

*

•

err act

CCT

CAA

ACA

TAT

ΜΛ

ATC CAC

GAC

CTC GAA

AAG

CAA TTA

AAC

ACA

CCT ACC

ACC

ν T

R

G

T

Y

X

I O

ε

b ε

Κ

o

V

H

ft

A T

T>

1040

10S0

1080

1070

1060

1090

•

AAC AAC

AGT

CTC CTT

CaC

AAC

CAG CAA

ero

GAC CTC

ATS

GAC ACA

CTC CAC

AAC CTT

CTC

K H

S

V

L

Q

X

O O

b

E b

Η

O

T

V

H

N L

v>

138

189 639

Fig.4. (Kont.)

1100

1110

1120

1110

1140

1150

AAT CTT

TCC

ACT

AAA

GAA

CCT

CTT TTA

CTA

AAG GGA

GGA

AAA AGA

GAG

GAA

GAG AAA

CCA

N L

c

T

K

ε

c

V L

L

X G

c

K R

ε

ε k

P>

1160

1170

1180

1190

1200

1210

TTT AGA

GAC

TCT

CCA

CAT

CTA

TAT CAA

CCT

CCT TTT

AAT

AAA AGT

GGA

ATC

TAC ACT

ATT

r r

0

c

A

0

V

Y 0

A

C F

N

X 5

C

I

Y T

x>

1220

1210

1240

1250

1260

1270

TAT ATT

AAT

ATC

CCA

GAA

CCC AAA

AAG

CTC TTT

TCC

AAT ATC

GAT

CTC

AAT OOG

CGA

Y I

H

N

M

P

ε

R X

X

V F

c

Η H

O

V

N C

C>

1280

1290

uoo

1110

1120

1110

4

•

CGT TCC

ACT

CTA

ATA

CAA

CAT

CCT CAA

GAT

GGA AGT

CTA

CAT TTC

CAA

AGA

CCC TOC

AAG

G W

T

V

I

<5

H

a ε

D

c s

L

D F

G

R

c w

X>

1240

1250

1160

1170

1180

1190

GAA TAT

AAA

ATC

OCT

TTT

GGA

AAT CCC

TCC

CCT GAA

TAT

TCC CTC

GCG

AAT

GAG TTT

ATT

ε y

X

M

C

f

c

Μ P

S

C F.

Y

W L

C

M

£ F

1400

14)0

1420

1410

1440

1450

TTT CCC

ATT

ACC

ACT

CAC

AGC

CAG TAG

ATG

CTA AGA

ATT

GAC TTA

ATC

CAC

TCG GAA

αχ

r a

1

T

5

0

R

0 Y

M

L R

:

ε t

H

O

w ε

G>

1460

wio

1480

1490

1500

1510

AAC CCA

ccc

TAT

TCA

CAC

TAT

GAC AGA

TTC

CAC ATA

CGA

AAT GAA

AAC

CAA

ΑΧ TAT

AGC

P R

A

Y

5

0

Y

D R

F

Η I

G

u ε

K

0

Η V

F·.

1520

1510

1540

1550

1560

1570

TTG TAT

TTA

AAA

GCT

CAC

ACT

CCG ACA

GCA

CGA AAA

CAG

ACC ACC

CTC

ATC

TTA CAC

GCT

L Y

L

X

C

K

T

G T

A

G K

0

s s

L

¹

L H

G>

1580

1590

1600

1610

1620

UJO

CCT CAT

TTC

AGC

ACT

AAA

GAT

CCT CAT

AAT

GAC AAC

TCT

ATC TCC

AAA

TCT

GCC CTC

ATC

A D

F

S

T

X

D

A D

W

D N

C

H C

X

C

A L

k>

1640

1650

1660

1670

1680

1690

TTA ACA

GGA

CGA ICC TCC

TTT

CAT CCT TCT

DCC CCC

TCC

AAT CTA

AAT

CGA

ATC TTC

TAT

C. T

G

W

F

0 A

c

C t>

s

N U

N

c

H F

Y>

1700

1710

1720

1730

1740

1750

•

ACT CCG

CCA

CAA

AAC

CAT

GCA

AAA CTC

AAT

COG ATA

AAG

TOC CAC

TAC

TTC

AAA GGG

ccc

τ a

G

0

N

K

G

K L

H

C 1

K

W H

Y

F

X c

P>

1760

1770

1780

1790

IBOO

1810

AGT TAC

TCC

TTA

CCT

TCC

ACA

ACT ATC

ATC

ATT CGA

CCT

TTA CAT

TTT

TCA

AAG CCCAATCT

S Y

s

L

R

s

T

Τ M

H

1 R

P

U O

F

•

1820

1810

1840

1850

1860

1870 1880

1890

•

*

•

CAGAAOTCATTATTLMAOCAACAAAGAAATCCCCAGAAGCTTZ?CAOCTGACAAACTCTTTCAAAACTTCAGAAGCAAACA

1100 1910 1920 1910 1910 1950 1950 1910

ATATTCTCTCCCTICtACGlATAAGTGCTACTTATCTGAACTCACCAAGCTTCTTCACCCTCAATCTCGAGCCGTTTGAC

1980	1990	2000	2010	2020 •	2020	2040	2050
TTCACAACACTCTTTCACTTOGGCTCACACTar7A-AU\.iWX7l\^(7rATAGAAAA6.^^CTUAGTVTCGGGCTrrAAAA
7060	2070	20B0	2090	2100	2110	2120	21)0

4GOCAAGAAACTCCTCAGCTTGCTCTCCTTCAAACTACTACTCGACCTTATTTTCCAACTA'ICCT‘ACCCAGATGATAAAT

2140

AT0CTTAATT7C

189 639

139

Fig.5.

20 30 40 $0 60 10 BO • · ··»· ··

CACCny2TTCAeXAOCCTCCATCCTGAACantXLACA4yOOCAA>CAATAAATCTCACCTACTATCCAATAAATATC

100 110 120 no 160 ISO 160 «····« · «

TCAACTTTTAA2XAACAAAAACATCATTGCACTGAAATAAAAAATTTTAAAAT7TrACAACAAAJGCTAACAAATQ3CTAC

170 ISO 130 200 210 220 210 240 • · 8 · « » ·· rrnxrrATT»TTCTTCTrcAAwxcrTTcrrrc*i3ooraju«Krrouuw2kAAiiAMX>crmAccTCAAATAAACAA

2S0 260 270 280 230 300 310

...... ·

CTAnTTTTAGACGTCACAA£AAAGGA£CAACTTTTGCd£AOGCA£X3GAAGGACTCTQCTOGCACTACA ATC ACA H T>

320

3 30

340

350

360 •

370

GTT TTC

CTT

TCC

TTT

OCT

TTC

CTC CCT CCC

ATT CTC

ACT

CAC

ATA

GOC

TCC

AGC AAT

CAG

v r

L

s

f

A

F

Ł. λ

A

1 U

T

H

I

C

S W

0>

380

330

400

410

4 20

430

COC CCA

ACT

CCA

CAA

AAC

ACT

GCC ACA

AGA

TAT AAC

CGC

ATT

CAA

CAT

GOC

CAA TCT

GCC

P P

5

P

ε

N

e

C B

A

* i!

P

1

O

K

G

0 c

Ki

440

450

460

470

480

490

TAC ACT

TTC

ATT

CTT

CCA

CAA

CAC CAT

GCC

AAC TCT

CCT

GAC

ACT

ACG

ACA

CAC CAC

TAC

Y T

F

I

L

P

ε

H O

G

N C

R

ε

²

T

D 0

Y>

S00

SIO

520

530

540 t

S50

AAC ACA

AAC

GCT

CTC

CAC

AGA

CAT CCT

CCA

CAC CTC

GAA

CGC

GAT

TTC

TCT

TCC CAC

AAA

Η T

W

A

L

0

R

0 A

P

Μ V

ε

P

O

F

S

S 0

k>

56C

570

seo

590

600

610

CTT CAA

CAT

CTC

CAA

CAT

CTC

ATC CAA

AAT

TAT ACT

CAG

TCG

CTC

CAA

AAA

CTT CAC

AAT

v 0

H

ε

H

V

μ ε

N

Y T

<2

W

U

0

X

U Ł

620

630

640

650

660

670

TAC ATT

CTC

GAA

AAC

ATC

AAG

TCC CAG

ATC

OCC CAC

ATA

CAG

C/G

AAT

CCA

CTT CAC

AAC

Y I

V

ε

U

H

X

s ε

H

A 0

I

0

N

A

V o

h>

680

690

700

710

720 •

7)0

CAC ACC

GCT

AOC

ATC

CTC

GAC

ATA CCA

ACC

ACC CTC

CTC

TCT

CAG

ACT

CCA

CAC CAC

ACC

H T

A

T

K

L

ε

1 G

τ

S L

t

s

0

T

A

E 0

T>

740

750

760

770

780

790

ACA AAC

CTC

ACA

CAT

GTT

GAC

ACC CAC

CTA

CTA AAT

CAA

ACT

TCT

CGA

CTT

CAC ATA

OG

R *

L

T

0

V

ε

T 0

V

L N

Q

T

S

R

L

Ε I

Q>

aoo

910

20

8)0

840

850

CTC CTC

CAC

AAT

TCA

TTA

TCC

ACC TAC

AAG

CTA CAC

AAG

CAA

CTT

CAA

CAC ACA

AAT

t L

ε

H

S

L

s

T Y

K

i. ε

R

0

U

L

0

0 T

N>

860

70

880

990

900

910

GAA ATC

TTC

AAC

ATC

CAT

GAA

AAA AAC

AGT

TTA TTA

GAA

CAT

ΑΛΑ

ATC

TTA

CAA ATC

GAA

ε i

U

R

1

H

ε

K N

S

U U

ε

H

K

1

L

ε m

ε>

920

930

940

955

960

970

GGA AAA

CAC

AAC

CAA

GAC

TTC

CAC ACC

TTA

AAC CAA

CAC

AAA

CAG

AAC

CTT

CAA CCC

TTC

C X

H

k

ε

£

L

O T

L

t

ε

X

ε

Ιί

L

0 c

980

990

1000

1010

1020

10)0

GTT ACT

CCT

CAA

ACA

TAT

ATA

ATC CAC

CAC

CTC CAA

AAC

CAA

ΤΓΑ

AAC

CCT ATC

ACC

v T

R

O

T

r

J

i o

ε

L l

ł

0

w

t.

R

A T

T?

10(0

1050

1060

1070

1060

1090

AAC AAC

ACT

ctc

CTT

CAC

AAC

CAC CAA

CTC

CAG CTC

ATC

CAC

ACA

CTC

CAC

AAC CTT

CTC

II H

s

V

u

O

K

0 0

L

e ε

K

O

T

V

M

1· L

v>

140

189 639

Fig.5. (kont.)

1100 AAT CTT TCC

1110 « ACT AAA T K

1120 • CAA GTT TTA CTA AAC

11)0 • CGA CCA C C

1140 AAA ACA CAC

CAA ε

11S0 « GAG AAA CCA TTT

N L

C

ε

V

L L

K

r ε

ε

K P

F>

1160 •

1170 «

1180

1190

1200 •

1210 «

AGA CAC TCT GCA CAT CTA

TAT CAA CCT CCT TTT AAT AAA

ACT CGA ATC

TAC

ACT ATT TAT

R 0

c

A 0

V

Y

0 A

c

F H

K

S G

I

Y

T 1

Y>

1220

1230

1240

12S0

1260

1270

•

*

«

•

ATT AAT AAT ATS CCA CAA <XC

AAA AAC

CTC

TTT TCC AAT

ATG GAT CTC

AAT COG GGA GGT

I M

M

K P

ε

P

K K

V

F C

M

K D

V

H

G C

G>

1280

1290

1300

1310

1320

1)30

•

«

•

TOS ACT CTA ATA CAA

CAT CCT CAA GAT CGA

ACT CTA

CAT

TTC CAA

ACA OOC

TOG AAG CAA

W T

V

I 0

H

R

ε o

c

S L

O

F Q

R

C

W K

E>

1)40

1JS0

1360

1370

1380

1390

•

«

•

«

•

TAT AAA ATO CCT ΠΤ CGA AAT CCC TCC

GGT CAA TAT TOG

CTC OOG

AAT CAG ΤΓΓ ATT TTT

Y K

K

C F

C

H

P s

C

ε y

W

L C

H

ε

F I

F>

1400

1410

1420

1430

1440

1450

«

•

CCC ATT ACC ACT CAC

ACC

CAG

TAC ATG

CTA

ACA ATT CAG

TTA ATG

CAC TOG CAA COG

AAC

λ I

T

s 0

R

0

Y M

Ł

R X

ε

L M

0

W

ε c

Κ»

1460

1470 •

1480

1490

1500

1510 «

CCA CCC TAT TCA CAC

TAT

CAC ACA TTC CAC

ΑΤΑ OGA

AAT CAA ANS

CAA

AAC TAT ACG

TTG

R A

Y

s 0

Y

0

R F

H

I G

H

ε κ

0

H

Y R

L>

1520

1530

1540

ISSO

1560

1570

«

•

*

«

TAT TTA AAA CCT CSC

ACT CGG

ACA CCA CGA

AAA CAC

ACC

ACC CTC

ATC

TTA CAC CCT CCT

Y U

K

C K

τ

C

T A

C

K 0

S

S V

I

L

K c

A>

1580

IS90

1600

1610

1620

1630

«

•

«

•

CAT TTC ACC ACT AAA CAT CCT CAT AAT CAC

AAC TCT ATG TCC AAA TCT OOC CTC ATG

TTA

O F

s

T K

0

A

O H

O

H C

H

C R

c

Λ

V H

1640

1650

1660

1670

1680

1690

•

*

•

ACA CGA CCA TOG TOG TTT CAT CCT TCT OOC CCC TCC

AAT CTA AAT CGA ATG TTC TAT ACT

T C

c

W w

F

0

A C

C

P s

K

V H

c

K

F Y

T>

1700

1710

1720

1730

1740

1750

•

«

•

«

COS OSA CAA AAC CATOGA AAA CTC AAT COO

ATA ANS TOG

CAC TAC TTC AAA COO COC ACT

A C

<ł

N H

C .

K

Ł M

C

X K

W

K Y

F

R

C P

s>

1760

1770

»760

1790

1800

1610

*

•

«

TAC TCC TTA CCT TCC

ACA ACT ATG ATG

ATT CCA CCT

TTA

CAT TTT TGA AACOOCAATGTCACAA

Y s

(.

R S

T

K K

1

R P

C

O F

·>

to

18)0

. 1840

1650

1860

1870

1880 •

1890

CCGATCATGAAAGCAACAAACAAATCOCGAGAACCTGOCACCTGAGAAACTGTtTGAAAACTTCAGAAGCAAACAATATT (900 1910 1920 19)0 1940 1990 1960 1990 ·«·· « ·«· CTCTCCCTrCTAGCAATAAGTCCTAGTTATCTCAACTCACCAACGTTCTTGACOCTOAATCTOOACCCCTTTCACTrCAC

1960 1990 2000 2010 2020 20)0 2040 2050 ·«·· w ··«

AACAGTCTCTACTTGGOCTCACACTGCTCACGTOGCTOGACTATAGAAAACTCCACTGACICTCOGOCTTTAAAAACOCA

2060 2070 2080 2090 2(00 2110 2120 2 00

ACAAACTCCTGACCI IM. IC IU- I ICAAACTACTACTOCACCTTAł' 1 rTCCAACTATOCTACCCAGATGATAAATATGCT

2140

TAATTTC

189 639

141

FIG. 6.

>0	20	30	40	SO	60	70	80
GAATTtVTVA»M4 ίυυινι AiAlVrcCTCCCAGCCTTCAXGAG0GAACAACACTUAAWA-łVlVW3CAiiM»A<A>AAUAAA
90	100	110	120	130	140	ISO	160
*	«	«	•	*	•	«	*

GGACCGTCAAAGCTGCTCroTAAAAGCTGACACAGOOCTCOCAAGTGAOCMGACTGTrCTrOOCACTCCAATCrGACAG

no	180 4	190 •	200 «	210 «	220 •	230 «	240

250	260	270	280	290	300	310	320

AQGGAOOCAGCCA7GGCAGOGTAGCAGCOCTGOClTTCMAOQGCAGCAGCTOGGGACTCTGGACGTCTCTnGCCClCA

330 340 350 360 370 380

AGTTTCCTAMCTGCTGGTTTATTACTCAAGAAAGA ATC TCG CAG ATT CTT TTC TTT ACT CTC AGC TGT

K w

G

1 V

F

T

L

s

C>

390

400

410

420

430

«0

4

•

4

«

•

GAT CTT CTC TTC GOC GCA GOC TAT AAC AAC TTT CGG AAG MC

ATC GAC

AGC

ATA GGA

AM

O

C

V c

A

Y

N

N F

R

X s

K

O

S

I

G

X>

4S0

460

470

480

490

500

•

4

•

AAC

CAA

TAT CAG

CTC

CM

CAT GGG

TOC

TOC AOC TAC ACT TTC

CTC

CCA GAG

ATC

GAC

X

Q

Y <ł

V

0

H

c

s

c s

Y

T F

Ł

L

P

ε

M

O>

510

520

S30

540

SSO

S60

Λ

*

•

4

«

AAC

TCC

CGC TCT

TOC

AGC

CCC

TAC

GTC TCC

AAT

GCT GTC

CAG

AGG

GAC

GCG

CCG

CTC

N

C

R S

s

S

P

Y

V s

N

A V

O

R

O

A

P

L>

570

580

590

600

610

620

*

•

4

•

GAA

TAC

GAT GAC

TOG

CTC

CM

MG

CTC

CAA GTC

CTC

GAG AAC

ATC

GAA

AAC

ACT

ε

Y

D O

s

V

G

R

Ł

O V

L

ε M

I

H

ε

H

N

T>

630

640

6S0

660

€70

680

«

4

•

4

CAG

TOC

CTA ATC

AM

CTT GAG

AAT

TAT

ATC CAG GAC AAC ATC

AAG

AAA

GAA

ATC

GTA GAG

Q

W

Ł M

X

l.

ε

N

Y

I G

O

N M

X

E

M

V

E>

690

700

710

720

730

740

4

•

4

ATA

CAG

CMS AAT GCA GTA CAG

MS

CM

ACG GCT GTC

ATC ATA GAA ATA GGG

ACA

AAC

CTC

X

0

G M

A

V

Q

N

O

T Ą

V

Η X

E

X

G

T

H

L>

750

760

770

780

790

800

«

•

4

TTO AAG CAA ACA GCT GM CAA ACG 093 AM TTA ACT GAT GTG GAA GOC CAA GTA TCA AAT

L

W

Q T

A

E

0

T

R

X L

T

O V

E

A

<ł

V

L

N>

810

820

830

840

850

860

4

•

4

«

CAG

AOC

ACG AGA

CTT GAA CTT CAG

CTC TTG GAA CAC

TOC CTC

TOC

ACA

AAC AAA TTC

GAA

T

T R

ε

L

Q

t

L E

H

S Ł.

s

T

H

K

U

ε>

870

880

890

900

910

920

•

4

•

AAA

CNS

ATT -TTC

GAC

CM

ACC

AGT GAA ATA AAC

AAA

TTC CAA

CAT

AAC

ACT

TTC

CTA

X

0

1 L

O

Q

T

S

ε ·

I M

X

L Q

O

X

H

s

F

L>

930

940

9S0

960

970

980

4

•

4

•

4

CAA

AAC

AAG CTC

CTA

on

ATG

CAA GAC

AAC CAC

ATC

ATC CAA

CIA

CAG

TCA

ATA

AAA

GAA

ε

K

X V

L

A

H

ε

D ·

K W

I

Ϊ Q

L

Q

S

X

K

ε>

990

1000

1010

1020

1030

1040

CAC

AAA

GA+ CAG

CTA

CAG CTC

TTA‘CTA

TOC AAC

CAA

AAT TCC

ATC

ATT CAA

CAA

CTA

CAA

ε

K

O Q

G

C

V

C

V

S K

O

H S

X

I

ε

L

ε>

1O5O

1OGO

1070

1OGO

1090

1100

AAA

ATA GTC

ACT

CCC

ACC

CTC

AAT

AAT TCA

CTT

CTT CAA.

AAS

CNS CAA

CAT

CTC

K

X V

T

A

T

V

H

M S

V

L· Q

K

Q

<3

H

O

L>

142

189 639

Fig.6. (kont.)

1110 1120 1130 1140 11S0 60 ··««*«

ATG GAG ACA CTT AAT AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA CCT AAG CAC CCC

H

ε

T v

N

N L

L

T

Κ H

s

T s

N

S A

K

0

P>

1170

1150

1190

1200

1210 «

1220

ACT

GTT

GCT AAA

GAA

GAA CAA

ATC

ACC

TTC AGA

CAC

TCT GCT

GAA

GTA TTC

AAA

TCA

GCA

T

V

A K

ε

ε Q

I

s

F R

O

C A

ε

V F

K

s

C>

1230

1240

1250

1260

1270

1280

«

•

*

«

•

CAC

AOC

ACA AAT

GOC

ATC TAC

AOG

TTA

ACA TTC CCT AAT TCT

ACA

GAA GAG

ATC

AAG

GCC

H

T

Τ N

G

I Y

T

L

T F

F

W S

T

ε E

1

X

A>

1290

1300

1310

1320

1330

1340

•

«

•

«

TAC

TGT

GAC ATS

GAA GCT GGA

GGA GGC

GGG TOG

ACA

ATT ATT

CAG

CGA CGT

CAG

GAT

GOC

Y

C

0 M

ε

A G

G

G V

T

I I

R R

ε

0

G>

1350

1360

1370

1380

1390

1400

•

«

•

«

•

AGC

CTT GAT TTT

CAG

AGG ACT TGG

AAA GAA TAT

AAA GTG CGA

TTT GGT AAC

CCT

TCA

GCA

S

V

0 F

0

R T

W

X

ε γ

X

V G

F

G H

P

S

G>

1410

1420

1430

1440

1450

1460

•

«

•

GAA

TAT TOG CTG

GGA

AAT CAC

TTT CTT TOG CAA CTG ACT AAT CAG CAA OGC

TAT CTG

CTT

E

Y

W L

G

Ν E

F

V

S 0

L

Τ H

0

0 R

Y

V

L>

1470

1480

1490

1S00

1510

1520

•

«

•

AAA

ATA

CAC CTT

AAA

GAC TGG GAA GGG

AAT GAG

GCT TAC TCA

TTG

TAT GAA

CAT

TTC

TAT

K

I

H L

X

D M

ε

C

η ε

A

Y s

G

Y E

H

F

Y>

1530

1540

1SŚÓ

1560

1S70

1580

«

*

«

CTC

TCA

AGT GAA

GAA CTC AAT TAT AGG

ATT CAC CTT

AAA GGA CTT ACA GGG

ACA

GCC GGC

L

S

s ε

ε

C N

Y

R

Z H

L

X C

L

T G

T

A

c>

1590

1600

1610

1620

1630

1640

•

«

AAA

ATA

AGC ACC

ATC

AGC CAA CCA GGA AAT CAT

TTT

AGC ACA

AAG

GAT GGA CAC

AAC

GAC

K

Z

S S

I

S Q

P

C

H D

F

S T

X

O G

D

N

O>

16S0

1660

1670

1680

1690

1700

•

«

•

«

AAA

TGT ATT TGC

AAA

TGT TCA CAA ATG

CTA ACA

GGA

GGC TGG

TGG

TTT GAT GCA

TGT

GGT

X

C

z c

X

C S

Q

N

L T

G

G W

W

F O

A

C

G>

1710

1720

1730

1740

1750

1760

•

«

•

«

CCT

TOC AAC TTG AAC GGA ATG TAC

TAT CCA CAG AGG

CAG AAC

ACA AAT AAG

TTC

AAC

GGC

P

S

H L

H

O H

Y

P Q

R

Q H

T

Μ X

F

H

G>

1770

1780

1790

1800

1810

1820

•

4

«

*

ATT AAA TOG TAC TAC TGG AAA GOC TCA GOC TAT TOG CTC AAG GCC

ACA ACC ATG

ATG

ATC

X

K

Μ Y

Y

Μ X

o

S

G Y

S

L K

A

T T

M

K

I>

1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 • · ««·«««

CGA CCA GCA CAT TTC TAAACATGOCACTGCACCTCAGGAACTCTCTCGAACTATTTTCAAAGACTTAAGCCCAGT

R P A Q F>

1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ····«···

GCACTCAAAGTCACCGCTOOQCACTCTCTOCTCTTCX>CCAC>CA<XXXCTGTCCTCGGTOCTGACGGGACCCACATGCT

1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2060 «··«·· · ·

CCAGATTAGAGCCnTrAAACTTTATCACTTAAACTTCCATCACTTAACOGACCAAACCAAGACCCTAAACATCCATAATT

2070 2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 • ··*·* * ·

CTGATIAGACAGAACACCTATOCAAAGATGAACCOGACGCTGAGAATCAGACTGACAGTTTACAGAOOCroCTGTCACAA

2150 2160 2170 2180 2190 2200 2210 2220 • « * · * · *

CCAACAATGTTATGTGCAAGTTTATCAGTAAATAACTCCAAAACAGAACACTTATCTTATACAATACAGATCATCTTGGA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 actgcattcttctgaocactctttatacactgtgtaaataoccatatctoctgaattc

143

189 639

TIE2-R >

Fig.7.

Mock L1 L2

Fig.8.

x Mock 20 x 12 + +

0.1 X L1 0.1 X 11

TIE2-R >

144

189 639

Fig.9.

nie prowokowany x mock xTL1 xTL2 t

T

B

B i

B

0.1x TL1 +

0.2x TL.1 +

0.3x TL1 +

CM ci

OJ hQ- .2 — CO

0.9 x mock * x TL2

0.8 x mock xTL2

0.7 x mock x TL2

0.5 x mock x TL2

0.3 x mock ’ x TL2

0.15 x mock ” x TL2

189 639

145

Fig.10.

AKTYWNOŚĆ WIĄZANIA (RU) AKTYWOŚĆ WIĄZANIA (RU)

SHEP

146

189 639

AKTYWNOŚĆ WIĄZANIA (RU) AKTYWNOŚĆ WIĄZANIA (RU)

1600

hTL2 + hTIE2 hTL2+trkB

189 639

147

Fig.12.

Mock + TIE2-Fc o

LL

CM

UJ

H +

Ο

LL

I co

X cc l·I- Ι-

’ „ ·{' ^Λ -i \*^Λ fis# Λ

V'r.M *U , fJ.,

< TIE2-RECEPTOR

148

189 639

Fig.13.

FL d14 5 całość

2	3	4
Ό			1
'C/3 JO			O)
’ω υ		Xi u.	s
m	in	N	in uj
	i?	£	’Τ ł—
w*		CO	+
TJ	TJ	Λ	tj ~
Κ-	_J	00 5	—j “Y
ΙΧ.	u_	LL O

II-ll-li-1 — 04 CO 'ί * Λ O t

I I » » *111

O O O O O o o o

C\l O TJ- r- OJ cn TT 'lil I r i I

O o o o o o o o

TL2

FLiwątroba płodu

189 639

149

Fig.14.

CC co O 04 O <

ir

OJ co i r i o o o 'C o

N

T3 &

¹ + rr ¹⁰CC CD O OJ O <

T- OJ co

I < 4

O O O

TL1

TL2

Grasica płodowa E17.5 aktyna

CDR1 ⁺ : Komórki korowe zrębu A2B5 ⁺ : Komórki rdzenia zrębu

150

189 639

Fig.15. ANGIOGENEZA

PROLIFERA-C-JA/.

MIGRACJA

ROZWÓJ

h H ffl α! ·κ Eh <3 w a W β <3 Of

RÓŻHŁCaWARISZ

STABILIZACJA

189 639

151

Fig.16.

3 4

152

189 639

410 420 430 440 450 460 470 480 •STKDg CNDkClCKCs gMLTOCWWFD AOCPSNtWGM yYpąrCWcnK fUGUCW/YwK GsgYSLkaTT HMIRPaDF

Fig. 17

189 639

153

Fig. 18.

KOWALENTNA MULTIMERYCZNA STRUKTURA TLI I TL2 I ICH WEWNęTRZNA PRZEMIANA PRZEZ MUTACJ? JEDNEJ CYSTEINY

TRIMER

DIMER

h-

CM _l

I-

*4	<4
%	&
H	H
W	W
Eh	Eh
tn	tn
{*	i*
U	υ
1	+
▼—	CM
u	_J
	1—

• «WftjjjjĘjąBii

\' '2*1-

TRIMER

DIMER

154

189 639

Fig.19.

Fig.20.

TL1-f-Fc ίηα/mh

189 639

155 ο *

V <Ν

Ó)

LL

Ο *

Ο β>

ο <

σι b

Ο «

CJ b

ο « r.

Γ»

S* δ^σ

8σ υ

ο^σ δ^σ υ

μ α υ

υ υ w μ

Ο

Ο tj

Ζ υ

υ μ

Η μ

Λ X < υ υ μ

Ζ υ

u n ζ θ . υ¹⁴ §<

π u

2u υ

μ < χ ζ

υ δ ⁵⁵

8χ ζ

g£ = μ ϋ Λ υ gu υ

8*

8ο υ

ο * <Ν

Οι σ * w

Οι

1° ε* g>

ζ

Ο 6» Ο

16 Λ £*

8* h

υ

Ρ 0 μ

μ >

Ο

Ο υ b ο ♦ γ· ο « νβ ο «

ISI u

8ώ ζ

ο

Οι

Ο ο

ΟΧ

Λ o A u v>

g° ο « ιη

Sl·

8^h il·

Sl· μ 8* σ « ο σι

8α ο

ο υ

8α u

ο , υ 4 υ μ >

μ μ μ Ζ « υ

Ζ κ

S* u^q

8*

8α u

il· μ

μ μ μ

Μ ο il·

Ο * r· σι

Ο *

ΙΛ

ΟΙ

Η ί*

8^Ρ μ

δ*

Κ>

ο μ

Ο U

Ο υ

Ο 0 ζ υμ ζ

μ < X ζ

μ

5^>

8ο ο

υ υ Μ μ u X υ

8χ ζ

υ ^Η (4

Ο ϋ

Ρ ϋ

Η υ

«: ι □

8σ α

ο , £“·

8χ ζ

S* υ

Ο 0 ζ

δ ο υ

8ο ο

ο < ω ο

8χ υ

Λχ

Ρ

8α u

Ηα ρ

8*

Ο Ο Ο

Ρ o u υ

ζ ο ο ο ο ο u υ

Ζ

8α u , • n μ μ > ο υ

y ^p «<

υ o « o x μ υ rl

H*

O * 0 P > 0 P

O < 0 μ

οζ ο

ο ο

So o

o

V» <s

Ο*ϋ

O

0

P

Z <

U

0 0

Ζ <

8u υ

μ ί*

8α ρ

8η <

tfl ca o

8*

8x

U

Ο * ΡΙ ο «

C4 §“ g’ μ

z x z

μ o o a

μ μ u μ

μ

8^U2 u

V) ο* w

Ν

8α υ

χ υ

ο ο ο υ

ζ z U

8χ μ

ο μ

δ = δ^Jζ ω ο « ο»

Ν ο * Οι ο

δ μ

υ u

ο ο

8'

Ο μ

υ χ u δζ ο

ο u

u

Ο 0 ζ

u

Ζ X ζ ο ,

Ζ X ζ υ _ υ χ υ υσ ο

Ρ ζ ο

ζ ο 0 μ

0 ζ

ρ ίΓ ο

r ο

= ζ

8>

ο μ

U 0 «>

ν>

χ μ

8, μ

8ο ο

δ ο ο

2χ

8*

8α ρ

u ζ u

μ ο ρ μ ο» m

Ο«

Η

Ι' ζ ο u υ

ζ υ

8χ ο * ο Ν U l·

8“ σ

h·

Μ < < σ υ

8χ υ

tg Ul

156

189 639 ο

45*

W

2$ u

< Ό

U

Sc o

a o

ο «

ΓΊ ον ty ty *ty □ * ο ο , S^M

U A *s^w ty ty ty

CM ό

LL

Ο π

Οι

w >	w r·» H 0 &		2	O		2 ^H	o
O	U		o		«	<	N
	Q	o «	u			0	rt
O Ł		Ol	rt	u		h ^q
0	* 2	o	rt			0
□		rt	rt			0
S a	δ rt		X	*k «W	O *	0 A
		«			rt rt	0

o o*<J	σ	^ł δ⁶*	o * o o	§	X	rt > O	rt 0 ś^x	9
ri «0 O	σ	£k	rt	2	X	0 0*00	* a>	V» N rt
O		<	*	Λ		o <	0

o rt o

o < 0*0 rt r.

* fi _Λ

H gO a

υ k

Ο

S

Ο υ μ

Η

Η < X υ

o 0 α;

O ' Ol rt o « o

rt o « r* r* %

u «

β μ < : X

U < ' O s_: o

δ¹ υ

ί^: rt

8' ο β' υ < ¹

8<

υ ο

u ι <

ο » rt

Οι ο + 01 α>

o « «a o

ty ο

υ μ k

k

Η >

U

Ο υ β< u ty

S ° <Q o

σ\ «Λ

O « O σι s

u o

υ u

u k

k rt σ>

ty ty

2, u*³ g«

U ty ty o « V>

Ol

O

Ol ty s^w ty s k k

a>

f.

o α u

υ y oj ty

S X

X s>

§” o

υ « k x u

Sx ty o

το

O

V o

w o «{ u

0	rt
< w	0 U	O
0	* κ	N
		O
0*0	υ _Λ	w
«λ u rt	< o
03	0

o o u

So <3

O

Λ U U

8«

U <Sz

So u

υ k « <

Kj υ

8« o

i k O o o

-8° !e o (3 > β k <4

Su u

I o k X <

So > υ

O , ' k U k a>

υ o * 0 rt *4 rt

O <

O u

ω ϋ

S z <

u u o 0 0 o * O* o * rt »4 «4

O * rt

S^J ty

S X u

Su o

S“ <t □ o o* k

Z

X k

U O

O k

k U k

k

O U O

Su o

rf < X <

ty < u 0 < ω o

X rt o

rt

So δ

£^u

Su u

S o u

υ k h <

u

U W * rt

U o

rt

N

O * rt

N

N rt

O *

O rt

So

O a x υ

υ o o o

Λ

Λ U O x

k

So

U < X o au β

8x u

il· il· o · <S

FV o

w rt rt

O * rt o *

Ol rt « o k

U 0» u « β X u a j u

o u w

X o

<e z < o < X < o

8‘

8o u

<<

u δ υ» rt rt

O 0 ·· o

S^M u

s*

S o u ty ty k

U M k

ty o * rt o * rt

V o ♦

Ol rt

O* ty ty

5 rt

8x rt

O 0 <

O o o

rt

U 0 rt o

So u

υ <

o δ υ k

ty ty α k $Q

U ty s

u

2x

S^s

So u

o * ff>

H

	u		O	9 *	o
	i	k	« Λ O	9	y	rt
9 *	k		0	m	<
Ol				rt
rt	υ		O		u
rt	u	<	O X		y	0
	o		2	*	<
	o		o«y		o
*	u	k	r- < u		k	u.
	<		M 0		k

189 639

157

CM cp

Ll

ί &

u *

o

«

<

O

4

o

p ,

o

u

o

Q

r*

u

©

2

4

μ U

r4

i

•4

2

μ

<

O

4

8

«

P

< >

o

4

O

o

E

μ

o

μ

P

o

U

<

h

© *

•4

β

•4

< ^x

O

*

o

«

o

Ul

o

«

y

Ol

•e

Ol

H

«4

o

<

Ό

<

r·

(J

o

w

p

*4

p X

«:

3

o

4

μ

o

«

K

υ

O

p

o

«

<

η

(j

O Λ

oi

o

U

V)

p

<

O

w

V·

O

ε

O

4

O

o

0

O *

μ ^w

4

0

»

4

09

rt

o

<

y

©

O

r-

2c

Ul

o

0

•4

t4

*4

<

•4

<e

h

O

o °

3

«

U

«

s

o

W

l··

o

«

•t

<

o

*

I*

o

u

(J

o

i ²

v>

<

μ

H

<

w

υ

O

*

υ

O

♦

O

u

A

f*

o

μ

O

μ ^w

«

U

*

©

p

>

o

O ·

<

β

«•4

0

*4

k-»

Ο»

O z

o

V

O

«

u

«

o

•at

υ

<

υ

(4

<

u

υ

μ

o

<

9 -

o

«

P

H

<

«

F*

o

U

u

Ul

0

o

4

o

O

«

<

»4

14

<

14

o

o ,

o

\3

o

μ

H

X

«4

μ

W

O K

μ

«

*7

4

<c

4

μ

© »

y

<

©

< X

υ

B>

o

V

0

υ

<

h

»4

o

υ

O

< °

O

*

o

m

©

4

o

*

μ

«

o

©

«c

Ul

u

Ul

o

μ

Ul

©

6

μ

o

O

f*

W

P

W

μ

*4

o o

Λ ²

w

o

υ

<

o

u

4

u

«

P

«

O

u

ί-

μ

«

<3

o

ο

s

O <

fc 5*

h

X

p

H

Q

μ

o

<

e

O

o

V

<5 vj

O

o

«

μ

O

«

O

o

*

p

H

X

V

u

V

μ

O

<

10

0

μ

S

<B

o

VI

«4

u

•4

o

•4

o

«

μ

VI

U

<

o

< >

*4

U

Bi

«

o

«

o

«

μ

0

p

P

2

μ

o

<

O

<

O

o

o «

< > ί-

4

%

H

μ

o

Ό

O

4

O

4

o

©

F

o

V

ο

O

n

μ

n

H

n

u

r*

μ w

52

O

10

δ

μ

h

©

α

<

Q

«:

f4

eC

r4

o

u

<

o

O

«

o

«

μ

«

o

4

μ

«

52 °

«r

X

o

X

2

o

Ul

o

O

<

O

H

<

o

O

μ 4 X

K

J

υ

*5

μ

«

o

O

*

o

O

«

μ

O

♦

o

U

Γ*

υ

Γ4

μ

<4

o μ

O *

*£

©

«<

r*

4*

©

v>

μ u

o

W

•4

3

w

W

5

•V

O

μ

p

O

o

W

*

μ

«

μ

«

μ

y -

O

υ

O

o

**

O

«

<

>·

μ

O

«

<

n

P

μ

p

o

Ul

<<

o

«4

o

o <0

υ

VJ

O

4

Q

O

«

o

O

4

o

ί-

<

«4

Q

»4

H

«4

μ

ο

io

O

P·

μ

©

μ

4

o

w

v4

O

»4

μ

O «

fc

o

ft>

u

O

O μ

V

o

4

<

«

4

V

o

μ

o

•4

o

p

k*

<

52 °

o

O

μ

o

O

«

o

U

O

<<

Γ4

VI

158

189 639

		A	A	A	A	A
o	Cd	ω	1			1	o	ri
co		•	o			1	V»	p
	u	t	1	Φ	•	•	«ri	o
		>	>		1	\|		»<
	ri	1	1	>	iSr	X		u
	X				Ό	Φ
	ri	a	a.		•	•		s
	— in <	1 1	i « 1			1 1 1		S X
o	0«	1	1	•	•	•	O	ίΓΪ
r-	U	ri	ri	ri	ri	ri	1Λ	H
	O	•	*	•	•	»	«ri	Cf
	K	«	*	•	•	«
	o							X
	ri	•	•	•	>	>

</} ri ri rt ri «j

5d * * · · ·

IS) AJ AJ AJ · · <4 C R £ « » o ϋ >, X · ♦ · »J t l >. £ >

o* σ σ >, s w «Ο *o · i i uuuu * ·

•	•	•	#-» *	r>
AJ	AJ	AJ	•
•			*
	Ό Ό *0 <0

U	U	M		U
•	*		•	•
4>	Φ	43	•	4>
rt	ri	ri	ri	ri
	•			•

TT U VI VI 3^ Η Η H .

K AJ U << tt M u

A 41 O« U * u

O k3 C tn o 41 VI H V}

o	2	u	μ	μ v»
«r	<	AJ	AJ	AJ AJ	AJ
»ri	O	•	•
	ri	• rl	•ri	• ri >ri	•ri
	2		41	41 4>	41
	u	•		« «ri	•ri
	s
	H	«	•	« >
	W	ri	ri	ri ri	ri
	b

.ΑΛΑΛΑ

4····· - φ φ φ <j φ tr tr tr ό 4» •ri ·Η ‘ri ’ri «ri •ri ·Η ·Η »ri

O >t >,U-» tt tt H · W ♦ V» C o · · · ·

X U U Μ X

O AJ U W tt «4 o p > > > > >

«*1 »4 · · · · · <M w tn « Oi >

x tr tr σ o* t?

»□♦·«·· O C C C 4) · w · · · Ό *U tc X X x Ai

X Φ 0> V o* V (4 · · . · ·

O O X X x x X fi:

I

Jj

U tn tn o W *a Ό

Q I » · · ·

Oj X O-Λ U g W « · · * ·

O«.....

ϊ> «ri W «ri «-( «-4 J> ·Η »ri »ri M r-4 «4 h > H ri Q C σ · σ · < ·Η σ · > > ri ri C U .4 .ri O (¼ ri» H X

U) 4Q X) ri β ^: o · κ r λ /: c jz « tr tr σ tr a* > -ri ·Η -ri · · • · A tt o > « <n u e ri K U

V) · « · X X

PS -M X X 3 X *4 e ε g e e %·««·· > <t il <u Ό Ό x > > > σ' o· έ Ε ε S <u t>

«ri «ri Μ M Vk W Μ M • « · »

XXX X <V ftł fi Ό ’ Λ Λ ♦ * ο σ u ρ m χ c G μ > «Μ Ο μ U cd » * « U ο ·

Ο V» < C (4 U Μ Μ 2 • « » 4

Μ · AJ «Η • α μ μ • · Xł *ο

O VI !fSi u X d s

V σ o· σ e e ο ο. · ν υ w ed ·

X U σ *

C 12 AJ ć 5 g U-S-K • *4 U4

EC c M C < o υ υ χ χ X Cn tn r? n t* < » *£ tt «

O << ·Η >H U . · «4 «4 JZ JZ «ri . .

U rg -ri > *>

»-3 · rt · .

»4 *ri « ri *σ Ό [J - ^υ o 2 o 2 »-i ω “ ε e 6 · u

H > > > · · x λ λ λ e e w « · · . · «4 · · « · ·

O X /3 X ł i νι σ tr ο» i ι o > r* W , ri mm oi _M • · ri M W *4 HJ 44 AJ AJ ri nj VI rri U-J

H iw >

> ·κ o* o· ł 5 e e

C\1 *· 'j η H u rt (Μ N OJ £ P fj F> fi F>

Ó)

LL f-· t-ι JC fε λ υ e

Ol & X J< 2 l’ I* o . * « » .

«< W H-4 VI Η H

PS tt tt 1 « ·

I « M-ί X4 HA tt VI <?Ό Ώ -d Ό Ό «< ft & & < ( m w u «η ci cm U α H «4 U U h (i R H b e x υ e β λ ι Ή »ri »ri »ri r-ł Φ Φ U φ φ

U u V) w

A A A A A

O · · · · · | : : : & &

X · · · · · u X ^4 X ri .ri (b · ♦ · Φ Q>

X α Ό o u <u g p, vi p. · .

_ X . > -MM ° ⁵⁵.....

π g c c o, a

U ·η 'ri <u *M

R · · ’ U AJ

W * · · »ri «ri

E-, · » · · · >««·«·, t> «ri · »ri *ri »ri O·*··· (/> « · . « C

O H X X X · · «η X * ♦ · u u > U4 U4 M W «G

O · · · · «

V) ri · ri · « x tr tr w x x

X >ł >1 >ł Ή *4

W > > > · >

W Ό *O Xł · · g°.....

m O · · · · ·

O U k U Η H k« · · · · · > 0« O, O, AJ V»

O* x x X u .

X <y φ φ σ

CW Ł) Φ OJ φ

F« Φ φ οι Φ Φ

X U · H · ·

Ol i « l U i <λ u x x X w ri C4

v) tn ri tn ri >

» i t O ι i 111X11 > tn C rri »AJ t t X t » i

1 «ri I « 1

0« X rri «ri M · X «ri > > Μ *O

O o «ri σι σιχ x CO Q > φ Ci M ri

N » ω I I 1 1 ot X X X Ć W «< AJ M AJ P« c « 4 « « ł M

I I 1 I VI AJ

I I ł ł Μ V» > U U O G g

K «ri «ri «ri S E

O X c U tt AJ AJ

O · »ri · rri »ri

Γ4 t4 · · · · ·

X β AJ C M G a λ Λ c q >«*··. («4 AJ AJ AJ AJ AJ (4 tj ·σ ·σ · <

h e e e c e ♦4 ♦ ♦ ♦ · · o a οι ν φ *σ ·σ ’ώ OH Η ΗΛ c^ęr·····

8^σχ X X X X • · · · <A > > ‘ri U >

Vł * · · » .

<Λ C c C G C ox*···· un Cl AJ AJ G > >

<M V) AJ AJ AJ AJ AJ «4 ri ri ri ri ri

Λ M X u AJ AJ

X G c tt > >

•4 · · · · ’ri x tr v tr x x ZC X X X X X X Φ Φ Φ 41 0) eąi *·? J «Η CM «Μ u J η *4 u U t* Λ H H υ g g 2 π ri U r n ch 4 4^444 t! t: ^Λ iJ U t: EZ U 6 E i

189 639

159

		A	A	A
o	o	•	•
o	•4	•rA	Ή	•W
	O	X	X	Λ
	Ul	•		«
	2	u	li	ll
	«4	tj	Ό	Ό
		•		•
	O	*	«	•
	W	14	<4	M
	M	>t		>,
o	A	rt	<3	<3
cb	O	h	U	U
cn	rflh	C	u	c

HH X *4 <44 iiifiź x u c u a u o · * · · · o x en en tn x u c~ > « « « er o •o M U ' U p, ft

5rt « · · · · >1 tu M4 U4 · .

3: O X «4 LfeU °

ca X **ł «3 •4 s

(2 to b* o «□ r> os ε ε e μ x • ♦ · · « • * * σ/:

Ή ·Η »K **4 Ή ♦ ' · X Λ ε * ε > >

er er u u σ er er u u u χ: tr σ σ σ • Cn C

C

O c\f

CM .0)

Ll fSl a

rt	C3		tr	er
ha	HA	HA	«0	M
•H	•W	•W	•
i*⁴	HA	HA	HA	HA

o W >,

W · · · · ♦ m ps Cn ta Cn ci *< Vł W Cł rA Cl

-*£. P* p< P* Λ O<

O tn o

δ u

£ £

o

U.

</i

*	• · « · • · · «
ii ftć.0,0,
•	« · « ·
	« * * ·
•	• * * ·
*	• · « *
AJ	AJ X» · AJ
»-4	rł K · *
•	• •(OM
*	• * «W -W
•	♦ «XX
«	• · · ·
rt	X « M Ol
•	* « « «

		cn	4ΓΌ Φ	TJ TJ TJ
•	• · «		H « «	«MU
X	XXX		0 . .	• · ·
♦	• · ·		αχ x	cna
Cn	Ch * ·		£Vr1 H	x tr σ
X	• « «		»r1	•Η Μ M		«		A	A	A	A
			u · ·	• *r< ·Η			HA	H4	H4	HA	HA
*	• · ·		</J · «	« « «		13	•0	•a	•O T)	TJ
Ό	TJ tj TJ		2 M w	Μ Μ M		X	ri	♦H	ri	CS	rt
rA	rA · »	0	ϋ c tr	er-H .ri	0	0*
•	• « ·	<H	XXX	XXX	0	X	•	«	•	•	•
			0 · ·	• «J ·	in	u	H	•H	•H	•H	*H
			< * ·	• * ·		s	•	•	•	*	*

> co

W Ol x o H P

X O <J

TT U c u cn tn fi > > S > «j ŁJ *O ‘ TJ M · *****

Q C C C · ·

W U Ł> u Ł> u

W tn Oi cn Di tn MU · U U U Μ X fi Λ 1-4 «Η Q en Oi tn tn tn 2 χ χ χ u X

O 1* rt X X X X M S >» >«X X -r »4 · · · «.i ·<-ι

M U U U |4 U %4 · · « » «

X c u u c c

O · · - Μ «-Ι χ χ χ X ν V (U * · * * «

M c C C Ol Χ 4J U Łł U U δ· · « · «

M w n «I rt

X Μ M H X X o

Ο- U · tn cn * · * (rt W

X X X X X • ' · > >

3—4

rA U

rA

<1

CH

co

r4

rA <4

rrt

Cł

fO

rA

<H

CA

U

u

θ

U

•4

*4

J

U

*4

a

•J

*2

H

J3

£

ti

H

X

ξί

H

A

χ:

Bm

e*

ε

X

υ

ε

jd

ε

Λ

U

E

e

X

ε

JS

U

ε

160

189 639

2>

u

S & w b

2ε <

υ pi rt o

O O rt m u £>

U

O b > u 'iiυ

2u u

o o W rt

O U n O O

O

O ~ rt O U

2u u

o 2 ε <Ί rt υ υ rt u i u u

So o U r-<

	u 2^M	rt s*·	O f- tu £»
	u ,	O	u
CO	8^J	rt o o O p·	U b <
OJ Ó)	2 ε rt	3 o u	U < > O b O (M

w O rt tn rH f>4 p u

Sx υ

u

8° υ

rt X

O o

rt o υ o

rt b

U §' o

rt Ol u

o

2^υ o o o x rt £ o o

o υ rt o o rt o o

O < I CD (J <<

υ s^z u

2^W

So o o σι ^8x rt

O υ w b > □ o o « rt ω -< o b

U a.

υ o

o o o

o o o o. Γ' O

o.

υ u

2° u

(J O.

o υ 10 u U rt U U

2>

u o

rt o ci o

rt o o o

3* o o m <j o, b υ o

rt

Cl (Λ b ω o rt o x rt

So

Cl

2u υ

b rt

O o r> Cl to rt

O

3“ u

<<

o

O	rt			rt
in
CM	o			O
	O	CU		rt U	O
	U			O		co
						m
	M			rt
	brt	G		b	u
	£4		o	U
			•M
	o		m	O
	3	X		3	X
o	o			o
	o	□		rt	κ
ΓΜ	o			3		O
						r*
	p			o		m
	b	u		b	u
	Cl			u
	CJ		o	n
	rt	X	o	fl	2
	O		n	b
	O			O
O	b	u		rt	O
n	υ			u
CM
	rt			o		o
	Cl	CU		Cl	b	Ό
	Cl			rt		<*1

ci

3^Z

8-:

u

Cl

O rt 2 σι rt cm

O

3°

O b J o υ ca cm rt

O rt o

rt o υ

o rt u o g- g- og o

rt υ

§^S ci

Cl Λ U

8*

8b rt h

!^z o

rt O

Cl u

Cl rt o

g>

o

3° oS« m o ci

2u υ

o o

o2 ot

Cl O O X rt

S o 10 ot O < ω O b

rt Q O

O U m Cl b ot rt

O

3“ « u u b i rt o rt I o u υ , o i

u U I rt rt υ

υ i*

g.

g' u

o to rt

8b rt

Cl

8° u o o σ o rt ω o o

Ol tn

	(J	Cl
	υ b	O
O	rt	rt
IM
Ul		u

g o u . w O b m rt

O rt ω o

rt

Cl Al υ ο2ε o <

V) o

3° < Q o O ’^,2x rt rt o X rt

V)

S 3 b ά rt O

3° &

obu r- Ci ·» o

8^U o

rt O Cl

g.

i o o V OD *n U 8° S o

Cl ci o U r- rt O l/l U

O rt O υ

o o < X v < in σ

< o> υ χ

·<

o rt o o O tn tn rt g' o O ot rt O tn u σ

< ω o

O b J m U ui

LL

189 639

161 o O U x> p « to < U

O P s* e^j w S 8 p < r> o o

tn to

8*

O

3°

S8_t

Ot *C rt s* fr δ

U V) O fr fr < fr <

o

tO	o		o
	K j		u	fr·
	o		<
	e rt ω o	o	g	«4
		o
	o rt u	r-	ii	<
	o		0
o	o _		u
m	< o		o	<
*o	u		p
	P		o
	< o		o	0
	u		rt
	w V	o	o
	< *	cr>	<	Cf
	rt	w	u
	o		o
o	V fr		P	a
et	rt		u
to	p		o
	< w		o	w
	p		rt
	S »4	o	2	u
		<B
		to
	8 rt		8	fr
O	o		rt
fr
Ό	O		o 3
	s°		X
		O	g	«4
		r*
	o o x u	to	g	*4
O	□		Q
o	< u		2	M
to	< o		p
	*c ω		U	<
	O		P

O ^K gU

U l/j rt

U s^a s°

So o O to r* O < O □ o _

Hu

U u

O V) < u g⁰⁵

o

Cd p fr

8o

ΙΛ

BO <

U < 0 ?x rt o

o u m m p «ο

O

O $^z rn <

! Cd

O l

Ot o

rt Cf o §8 « <

	u		□		U
	rt fr	o	o	O	rt
	fr	00	o		fr
		cn
			rf		fr
	& >		p	O	rt
O	P		0		P
W
os			frl		<3

53*

O w «<

8<

O

8 w 0\ <

o O w Ot &

«0 p w rt CJ

U CA

O <

Γ* σ> p _ rt O O %

u rt Q O

U

U.

>

§ ta rt y

o u fr fr t3 fr U r-4

S° y

?5^X

3² o O fr < O o

O ¹to < ot i fr

3^Z w g ^w s⁵ o u ^8° o

tO

O

Vł

σ			0			U			rj		rt
rt	O	o	rt	X		u	fr		0	X	rt
u		tn	rt			rt			grt
		o
p			o			O		o	O
fr	H		P	X		P	P	00	rt	X
			<			P		o	o
								<4
<3			o			fr			o
rt	U		p	fr	o	rt	X		rt	Cd
P			p		rt	3			O
					O
			o		rt	P			0		O
0	rt		rt	X		rt	ω		rt	P	t?
p		o	rt			P			0		H
		t,									rt
fr		Ot	u			fr			fr
0			0	fr		0	X	O	o	rt

O o

g p

o u t* < Q o p p

3° u <

p fr

2* O U g>

o u

08“ o

o O r* rt &

O gr.

O s° ^K 5 eu o

u rt o p o8° tO o o

Fiq.23( kont i).

fr i

α §

o u

<

u

P o

fr

O

O sś y

X

Cd >O <

fr <

Cd

X

O ω

x o

o u

Cd >

X *4 w

fr <

162

189 639

O f. tM O O m (>

5« *

Ci Ή α co co ο < rp

Ci U Ή *ζ >«

Ρ o

o a

> 0

S8>

CM 0

o u

O f.

O\ iz U, Ci P

X a

e» u

U ^w s

U δ

c o

O σί

C\J ri

Ll ο ο α Ci < ci

W 0 ί

oS° rH

Ci O *

o < £4 0 w

z o

s*

O

CO ci

U <

a

Ϊ

I co ez σ

o u <3 s^u ε

O o 8 m □ *8 z

o i

Ci *9 O o

O <

o

Cm >·

X

X ϋ

H <

O <

o o

o a

χ

X >« z

Q

CU <

X o

σ\ rp *S

O co o

r* >

o u

X

X £

£

X co <

X u

co o

g <

>« co g

X

189 639

163

Fig.24.

o · o\	Q O A ooc O V gg» SsB*	o · CD	sil· 3l· Sil·	o · f* IN	gl· Sil·	o · V ΓΛ	&s> Sl· Su*	o · wi -*	gl· SB- &l·	o « «Ί	5l· 3E° El·
O « CO	SE-	O « P	§l·	O «	SB-	o · ω	sil·	o *	SB^C	O ♦ r-i	Bl·
	3 S e. U <5		h-		gl·		Sil·		Sil·		SB°
	§5«		& 3 Λ U O		Sil·		l·-		gil·		śE*
O ·	Sil·	O ·	El·	O ·	S&°	o ·	sil·	o ·	sl·	O «	ifg“
	gil·		ΪΙ*	\|M	El·	n	gl·	*	sl·	WI	jSSu b o
	O u 36°		u o 88°		sil·		O u _ Ρ < X < P		α o , S8^H		5l·
	5 fc “=		sg°		3l·		isg-		Sil·		«ll·
o « IO	gil·	O · «Λ r-f	sl·	O ♦ Ζ» w	gl·	o * n «n	gl·	o ♦ Γ· ΊΓ	\|g«	o · «Μ <n	gl·
	gil·		SB-		gl·		o u 5U-		< p u o < o u		O o 8S^W
	il·		8l·		El·		o u ss^x		gl·		ul·

< P S £ ^M	O· fci U ** bo	P < _ O « X (Z O *n O U	V o 3’ 5U*	3· 3	l· g·
u p 35*	fci. < p	n §l·	r* SB-	W E	Ul < O cn <

Bl· SB- W u σ

C3^J

O <J fc3^J

U5w < P y

b

Ss o

Sfc δ h

O · < h £l·

SB° §l· eg*

Bil·

Sb*

Sil· sil·

Sil·

P <

s£* ϋ< <

o o <

SI

88h

O o

S8^W sil·

BS

SB

SB fc o

5» η <

Sl· ll·

O u H < J U ϋ gl·

3l· < P p < M < P o λ < P OH H < M n < p sil· gil· o ♦ o u CD < P W w o U u o b

sB

Sil·

El·	s· 3B° •H	_e. 2Su o UO M	p u O ♦ P < «4 σ» U O fN	o · 2 5ź X β < p	o. £3»
g§^w	BŚ^h	Bb*	gg*	gg*	Sśl·
ES-	gl·	IB*	sg°	fc p < o u	SB°
BI-	_g>	o. SB¹' «1	fc 3 p o · < P o	_e ⁸^ o · «< p c·	o. l·
ES*	Sl·	ll·	IN P < < P P P <	ri U 0 sil·	tl·
Sl·	Sil·	sl·	Sil·	sl·	Ol·
ll·	ŚE-	sil·	SB-	SUo u o	3l·

164

189 639

O · w>

O · k£>

O ·

O «5

O «

Os m

o · oa m

sL·

o · n rt

rt < A uu < Ił O

σ « »4 <0

BS>

o * o Ok

sL·

o · Ol Ok

SL·

o · «0 o

ΒΒ^Δ

o · r- r4

ΒΒ^ώ

BL·

sS-

SL·

BL·

S t ec u o

SB²

rt < * rt rt rt <

SB-

sB²

SB-

SL·

SB°

Sto u u

EL·

SL·

o · rM fo

BL·

O ♦ o

SB-

o · «

sS^s

o · o

EL·

o · rt

85źu U <ł

O » Ό

SL·

sS-

SL·

£L·

3L·

EL·

«-<

BL·

e4

BL·

sL·

SL·

BL·

3L·

BL·

SL·

SS-

O « o

SL·

o »

BS”

o »

SL·

o ·

BL·

o ·

SB-

O ♦

sB-

SL·

rt

SL·

ł-

iS^a

co

sL·

Ok

BL·

o w

SS^u

Wl •4 M

SB²

SL·

υ u <C rt U υ u

SL·

B§°

SL·

BL·

o o 3t°

ES^J

SB-

SS“

SL·

SB-

SL·

o · Ok 40

USw < rt

o · co rt

ih

o · rt «

SL·

o « 40 Ok

gS°

o · 1Λ O

υ o SE²

O · 4» e4

gL·

SL·

< rt S rt ^M

SL·

W

SL·

H

sS^Q

SB-

SL·

SB-

EL·

SB-

SS-

o · «0

3L·

o · rt

ŚL·

o · 10

SL·

O ♦ wi

o u _ 5ί^χ

O « 4»

sS°

O · *n

BS-

SL·

W>

SL·

rt

§B°

<s

BL·

Ok

gB°

O e-ł

BL·

BB²

SL·

SB^r

SL·

SB-

SL·

o «

SL·

o «

SL·

O 9

SŚ-

O 9

BL·

O *

rt < ss-

O ·

SB-

< rt E5^J

Γ» 40

BS>

rt

SB-

Ol «

EL·

W Ok

BL·

**) O a*4

SE-

·-<

BS-

SS

SL·

BL·

SL·

BL·

SB-

BL·

SB®

sL·

SL·

SB-

EL·

BL·

rt ·< < rt rt rt <

u>

m

Fig.24( kont i).

o ♦ ui

Wl

SB- s‘S£^o L·BS° SB- BS- SSSL· SL· SL· SL· s*SL· s*£L· ll· SB- ” SL· SL· SL· §L· SB^k o.SB^u o.SL· SB- ³ §L· ^? SL· SL· SL· SL·

SL· yg, ygk

2* SL· IL· |‘ £L· L· SL· SL· SL· IL· SL· SL· SL· SL· SL· s· SL· s· SL· 2· BL· o· SS²SL· $Β^β SL· ~ SL· SL· SL· BS> SL·

§s°	s· BL·	Β8™ O · < rt	ίΕα o * v b
SB-	~ SL·	¹ SB-	Ol O O u - £§«
BL·	SL·	rt < Sfc°	BS>
SL·	u o	sS-	ES-

189 639

165

30-	o · V» *»»	b -C A < b o V Łl	o · w	IE-
		El-		go*
< H		EO*		io-
3g^w	o ·	go*	o « m	30-
3E«	*H	88« o u	crt	g\|*
03-		sS~		IE-
IE-	O ·	03-	O ·	03-
EE-	«Μ	bi^u	»* rR	33-
3§*		gg =		IE^x
O^b		30-		El-
08°	O * m	< fc? £§«	O · rł w	IE-
03-		30-		I3^x		3fc.^A1- <
oi-		IE-		OB-		o u , cs-
33-	O » w	o u 8S-	o ♦ o	IE*	o « m	30°
IE-	*4	03-		sE-	RR	33*
03-		EO-		0E“		δ tS a· Łl O
u P SG^X	o ♦	IE-	O ♦	3E-	O *	33“
fcSw < H	♦Ί «•r	IE	«*> rR	<5 fe Β» O O	*	03-
O U		IE*		b < S <		03 =
b < s s *		3g°				8Sx < b
§£*	O · 9i	03-	O · » q	03=	O · f* *r	IE-
El-		b< _ < b o o G		33°		ob-
30^w		3E-		IE*		E§*
30^w	e «	OB-	o · r-	El-	o · <o	IE-
ggo	^w	IE-	•K	IE*	RR	Es-
EO-		El-		El-		El-
El-	o ·	30°	o ·	3§-	O ·	30-
30-	r· ««	!£*	F*>	33°	r ^4	3E-
El-		03°		33°		E0^w
so*		53-		33*		33-

166

189 639

LO

CM

Ó5

Ll

0Ε^ώ	© · O O A » < μ μ — μ X	O » <N	SE*	o · *o en	SE*
< μ μ < w χ μ	BE-		SE*		SE*
o o o u w x μ	SS		i k © O u		SE-
SE°	?♦ ES	O « Ό	SE*	o · IA	OS*
SB*	ES		α o μ x w X μ		SB*
88« x μ	£S		SE*		SE*
SE*	88* o · U O Ό	O « Vł	SE*	O « Ό	SE-

ES ίΕiS>

SE

ΕΕ* te

SE*

SE* μ χ X μ >· μ χ εε* sb* ο ο 88* ο υ _Λ

C5^J

ΕΒ>

es§Ε° te *te giźu

h.

o u ©4 Η X <

”» bo

Ο · < Η Λ

S ρ 5

Β5^>

SB° s· y §* ’ SB !E>

5t^ft ygBSse-⁵

SB

SgSE

22o ite t3~ χ μ o u 56° $te

X μ sr

o o S8	SE-	3fc_uo b	SE*	SE
SE*	o · o u * μ * u o» be	o * X μ s es^>	ΓΒΒ*	r es-
BE	o o U O (C x μ	8iźx x μ	SE-	SB*
£§-	SE-	SB	5 fc o u b	α o Sfc*

BESS

SB8 8 w χ μ u o

ES §Ε°

SO* o u o · μ < > η O U ~ g8«

SE° o. SB° «Ν <J O < μ μ μ <

SE

ESrggSil· *g°

SE* SE* SE* SE⁸¹Si

SEo a A <

O fi Η X »-> H <

SB*

SE

E§* ££SBSE*

ESES3!

I 8 <0 > <

¹ O > X J i o

I 8 « i X o » t? o

S 5fc²

SB

SE ε

sr ES ES-	o · »-4 w	SE- ES>	s-SE* BE-	o ♦ fc 5 j o> bo C4 SE*	x μ 0 4 μ X w oa χ μ <*» SB	o. ifc r- o b ’ BS
ES>		SE-	SS*	SE*	¥3 se-	SE
oo SS^M	O · O	5£μ x	o. BS*	o. BS- co	O «X W r*	o.SE
SE°	*—	SB-	^s SE*	- gy*	n o u μ x > b o	- 8g
ES*		SE*	ES	BE-	£3*	SE
SE*		SE*	ES>	SB-	SE-	SB

189 639

167

Fig.25(kont i).

O · «*» SO

sb* < H l·· < w < 1- 28

o · Γ4 C*

Sc* Bi> §0-

o « W

88° sB* Sb*

o · o

83- 82- ii-

o * Os O*

SC* 3B^w 83*

o » m O

83- B3“ iB“

o · r- *—<

Bs* SB* iB-

o ♦ CC

*B-

O · »x

00*

O · o

28

o · os

8i-

O · CD

82*

O ♦ t*

SB*

O · SO

82-

SO

r-

CO

o

Os

o

•A

28-

£2-

SB*

38“

32-

80“

«-4

iB-

38-

Bi>

28

82

28-

S5u b o

28

o ·

$l~

o *

28-

o ·

22-

o ·

SB*

O *

28»

O ·

88*

O ·

H < < H * Η X

o

es

0»

Ρ»

Ό

tn

so

Bi-

t*

SB*

r

08

eo

SB*

cn

6 3 h < H

O *c

82-

•X

00*

iB*

SB*

Bi*

BS*

00*

38“

28*

O u SC*

38“

li*

82°

82“

82-

sB*

o « o SO

ii-

o « Os SO

28-

o ♦ CD r»

82-

o « t* B

82*

o ♦ so 0S

88-

o · »n o

08

O * «r

OB-

38“

<3 U cs-

32-

IB-

o o U O A<j o

5 p ω ϋ Ο

p u _

< H

b x „

Ł- <

{x <

o u

H < X < t-

38“

£3-

ί «*

SC*

Cf U X H *

o · OS

bo*

o * «0

83-

o ♦ Γ

SB*

O · SO

28»

O · lA

Bi»

o · «»

88°

o · m

o o _ΛgG°

SA

SO

t-

«Β

OS

o

«X

C5^J

p s _M53-

SB*

h < . 4 fc Q O b

82°

BS*

łX

8^x X t-

σ u es»

oo^w

83>

28*

o o 53*

83-

O ·

o u SC*

O ·

8B*

o ·

2B-

O ·

B2-

O ·

SB*

o ·

li*

O ·

u u st^w

α

r*

SO

SA

**

rc

sn

O o SC*

so

38-

r*

ϊμ o b

CD

ie°

cn

01°

o r4

SB*

rX »A

83-

38“

sB*

53*

SB*

BS*

82»

SB*

28 -

08

Bi-

Bi*

Bi»

38“

28-

o · »n

Bi*

o « Ό w>

28»

O · «η

38°

O · W w

80

e> · rs os

SB*

O ♦ rc o

IB*

O · «X •X

?5x X H

is S m < f-

B8-

82*

li-

SB*

00*

i§-

sB*

G5»

32-

38-

BO*

00°

iB-

o · «Ο

SB*

o « m

iB-

o · w

SB-

o · m

32“

O ·

38^w

o · •A

SB*

O * o

80*

sn

Ό

r*

OD

OS

o

«X

82°

28-

SB*

28*

•-C

38-

•X

iB-

38-

iB-

38°

SB*

Bi*

82

o * sn

BS-

o ·

§2°

O · «*»

83-

O * CC

88*

o · nC

sc*

o · o

82-

O · Φχ

88-

m

tt*

SO

SB*

r-

23»

00

83»

os

SB*

o

28-

O rX

83-

SB*

SC« o b

28

82-

83-

82

00*

28-

38

SB*

Bi*

82-

88°

BS*

168

189 639 c

o

LO

CM

Ó)

Ll

33«	o · ΙΛ rt	53«	o · te
58*		33*		§y«
35^j		53°		33*
55-	O · tF	53*	o · Π	gs*
g~	rt	gS*	**	55-
Sg*		gS*		cg*
Sg*	O *	33°	O ·	gy*
§8-	rt rt	33«	rt te *4	sg*
		55-		55-
33°		35^j		§8«
33*	O · d rt	55*	O · *4 te	53*
53-		85^J		Sg^J
§3«		yy<		33*
t 3 fr < fr	O *	35«	o * o	35°	o · o*	< fr A gS·
58*	d	33*	rt	fr < ce*	rt	33*
33°		u o o o o fr <		sg*		fr * ce°
33*	O ♦	sg*	9 ·	as-	9 ·	35^j
35^u	o rt rt	55«	*4 rt	33°	9 te •4	B 3 «· U P
fr < < fr fr fr <		o o se*		§y<		3 C oc O 9
S5^J		58*		53-		55-
β o SH*	O · ot CJ	53*	O · os s	53-	O · e* w	55*
53-		53°		g§*		55*
sg*		Se*		Se*		53-
33°	o * a»	53°	o · f*	35«	9 · WJ	35-
sg*	rt	33*	rt	53*	rt	gy-
3£^w		53-		35^j		53*
13*	o ·	Sg*	O «	53*	9 ·	35^j
33°	c* rt		rt rt	gy-	W	88»
£5-		§3^a		yy-		55-
58*		53<		yg«		eg»

189 639

169

O » ri

SO

Fig.26.

§0« ΓΒΒ* rss* SB«

SB^Z SB SB*

30“ o.§a«, _s«3g«

O- ~ 10“ ~ ll* SS« 03« OB* 30« o. 03- _e. 3000« ~ SB* ^s 03BO- sB^tf §0« SB* 33- §0° §0“ Γ3Β» Γ0Β> 00° 30“ BS^w

88© <5S*

U U u <9 O U < μ μ «< μ <

H < ri o · H 2 U O« 5f*Q < μ w U O ri O U

88« 12“ §8“ 88“ 82« 82« sil· o.SI- o.L“> £2“ 8£- ⁵⁵ §8« 88« 88« S8“

Sś« 22° 8ś«

81“ 5' 38° 2' §2“ 82“ 88° 22« 88« SS« §8« 23“ a·38” g·?!82“ £2 82« E2^J 88“ £8«

22“ _g.2Ś« =.28“ 83> - S8“ * 22« 22- 22« 22“ 8e« 22“ sg<>

O · to ri	OS* SB- SB»	o * tn w	00- 30“ os*	o « <* ri	ΒΟ- SB- B3-
o « ΙΛ	BO-	o · 09	BO-	o ♦	S3*
	BO-		SO*	ri	BO-
	WO		os-		SO-
O 9	bo«	O ·	SB-	o ·	30«
ri	sS*	*r	BO-	ri	B3-
	SB»		SO*		30-
	ί fcw o b		30-		SB»
O · ri ri	30«	O ♦ ri w	10“	O · ri	30*
	SB-		Os*		B S^u
	SB*		00*		0B-
O «	SB»	o · ri	30-	o · ri	BS^w
ri	30-		3Β»		SO-
	BO-		BS-		30“
O ♦ ri	SS	o · o	03-	O * ri	BS-
ri	•bw>	w	SB*	*9	ESu u o
	SO»		00*		BS-
	30“		§0°		03-
O « e ri	03-	o « ri ri	sB*	O · CD «*	30«
	SB-		30«		03-
	SB*		WB^h		30«
o · ri	33-	o *	SB*	e · r*	SB*
	BS*	ri	0S>		SB*
	BO-		Ss-		BO-
o ·	SO*	O 9	SB*	o «	SO»
ri	SB»	m	ΒΟ-	**	os-
	SB»		SB»		33*
	30“		BO-		30-

170

189 639

Ο · ci «Ο β ·

IN

Ο · ♦z ιθ

Ο ·

Ο

L0

Ο ♦ σι «η ο · <a <Λ

Ρ

4Α

Ο

Φ ιη ο *

ΙΛ

4Λ

§Ε-	o « łN P	El·	o · Ή W	al·	o · o 04	U 0 A P < w < P	o · Oł m	as*	o · <o O	aa*
El·		ES*		sE*		tŚ§°		§B-		SE-
SB-		ES*		ag		aa*		Bl·		ES-
ll·	o · hZ P	< P Ρ < M < P	O « O to	ag*	o · Ol co	aa*	o * OD Ol	ES-	o · P Ca	gg*
ES		aa-		Eg		gg*		3 fe p ·< P	•4	aa*
SB*		aa*		IS^x		SE*		gg*		SE-
0 U SU“	o «	SE-	o ♦	El·	β ·	8l·	O *	88_O 0 0	O *	SE-
U 0 sc°	P	cl·	Ol P	EB*	«0	aa-	Oi	BE-	o *4	5 Β « P <
SE-		SE-		ES-		aa-		BE-		El·
IS^x		SB-		< P us-		El·		BE-		U 0 su*
Ol·	o · Ol ιο	El·	Q · co P	O 0 su*	o · P co	as*	O ♦ 40 Oi	El·	O * •Λ O	El·
SS-		U 0 se*		al·		SB-		SB-		aa-
ES*		u o U 0 « P <		ES*		P * U 0 < 0 u		o u Si^x		BE-
sE-	o ♦ GO	ao*	o « P	ag*	o « \0 w	ga-	O * m	SE-	O · W	ES*
sE		SB-	P	IE-		SE-		ga-	ł-z	aa-
SE-		SE*		EE*		ag-		si*		SB*
ES-	o »	gg-	o ·	Bi-	o «	Es*	o ♦	El·	O 9	SB-
El·	40	< P Cf5*	40 P	ll·		tj 0 SU	Ol	sE-	O ^4	aa*
gB		*< P us-		Sl·		ϋ o 5 f ^w		gg		gg*
O 0 su*		cl·		SB-		SB-		SE-		EB*
SE*	o · 40 40	SE-	o · m p	SE-	o · w CD	SE-	O « Cl oi	SB-	O « ΓΜ O	gg*
SE°		SS-		sE*		SUm o u		ai*		SE-
SE°		SS-		SB-		aa*		gl·		aa-
Es-	o · s	Sl·	o * w	BS-	o · Cl o	Es*	O ♦ Γ4	aa*	o · w4	Sl·
aa-		aa*		BS*		BS*		Bl·		BS*
sE*		SE-		£l·		SB*		El·		gg
< P P < n < P	o ·	SB-	o *	P < su*	o ♦ rc	El·	O ♦	ag*	O ·	El·
S U u u u	Φ	aa*	P	aa*	40	SE-	Ol	aa-	O •N	Sl·
c £«		as-		ES*		!E*		gg*		IE-
gg*		al·		gg*		c s < 0 u		gg*		EE

C ο

<£>

C\J ri

LL

189 639

171

50*	o · wa cr	0E-	o » Wt r»	03“	o ·	El’
El-		03-		El’		30-
b <		IE“		88» b <		30-
30-	o * Ul	IE-	o ♦	88« CS u	o · <-»	El’
Ss*	CR	03-	m ^R	sS°	^R	30-
33“		30-		00-		53-
10“	o *	S§«	O *	35-	α ·	§§°
33-	CR rR	SE*	rt	03 =	RC *R	IE =
30“		00-		30°		03“
El’		SE°		05“		30-
3E«	O · m CR	00-	o · CR ΓΊ	00«	O « »R RC	50 =	o ♦ o wt	30-^A
30-		03-		30-		00-		03“
03-		SCo CS Cl		01«		IE =		53«
30*	O · CR	30-	O «	03-	O · α	30°	o * cr*	00*
< b H < w < b		03-		00°	RC «R	3 E *	RC	x b 88“
30-		30*		30-		30°		OS*
SI-	O ·	OB-	O *	30«	O ·	< b 88“	o ·	ο σ b X w X b
EI*	CR «R	IE-	rt *R	IE*	rt rR	50 -	*c	03 =
b < X* b X b <		b < s s *		30«		30-		O CJ fe£ =
33«		IE*		s&°		03 =		B 8 b X b
30°	O * O CR	03-	e · «Λ CR	§0«	O · eo rt	50°	o * C“ RC	00-
30°		30“		3E-		3E =		y§*
50 =		30“		00-		El-		30-
00-	o * O\	Es δ M < b	O · «Ο	IE^w	o ♦ Γ»	3E =	o * w	05-
E3-		05“	W	03“		E0^m		El
ί t o u o		05-		Sfc o b		S0“		50-
El-	o *	30-	o *	50 =	o ·	so°	o *	SE⁰
03>	»—4 eR	03“	CR <-4	0S°	m ^•4	00°	RC	01“
03“		53*		SS“		3fc* o u		yg°
30“		30“		30°		b X §c«		30-

172

189 639

O * < fr A o, ggo	o · u a λ » rt P r r< H < 88- yg-	O 9 r* rs	55- 55* SS«	rss* yg* 58-	rss* ES- 88»	O » *e	SS·⁵ 55* 3£-
	e 5 w < *» 8w
O · «0	2q o O	o.^8»	o · JO	55*	s· ES>	?· yg-	o * rj	58-
	88«	⁵ d-		85>	SS*	' 88		SS-
	yg-	£3”		SS*	55*	ES-		SS-
o · r·	8E-	o.y§* Ό	o · VI	SS*	0.58- te	... 88»	o · (M	SS-
	§8“	•4 CJ 0 fr % ^U	Cł	0 U _w Gg-	58-	⁵ §8-	VI	SS-
	E3‘	SE»		SS*	55-	88»		o u SU
	88*	88»		SS-	58-	SE		88“
o · Ό	sE«	§•§8»	o * M W	63-	Γ 88*	© · < fr 5 Sg*	O · rt in	E8“
	BŚ-	88“		SS*	55*	O-		SE
	gs<	SS»		58-	2 H « 0 u	58-		U 0 < fr fr fr <
O ♦ Ul	§8«	s· 88»	o « s	gy*	s· 88“	o « rt H w r o G	O · o
	88«	88»		£3”	SE	ss*		£1”
	E8“	ES-		gy«	88«	55-		55-
o ·	88-	G O R O « rt F	o *	Sro o G	o.8E«	Sgo o« u 5	o ·	35”
	BS“	w O O g§-	<N	BE-	^s SE	£3”	Ol w	55*
	SE»	yg”		BE	88-	85-		o u 8C^W
	g?	£5°		88“	CSm 5 3	85-		0 u Gś-
o · n	O	5’ £5”	O 9 rt <N	88	© · o o ° !* H >· m fr rt	o · CJ p o* O O w «Π < fr	o · ® te	85-
	88“	§g°		88«	55*	yg-		58-
	se-	SS*		88»	58«	§8»		35^w
o « (M	ES	s· 58°	O · O	§g“	s* 63-	< fr O ♦ fr < fr w X fr	o « r*	58«
	ES-	^w 85>	«	88»	SE*	n 88	tO	SS-
	ES-	58-		88-	ss-	88“		0 fc ec CJ 0
O · w	SB 88»	o. 53^w 38-	o * Ol r4	EŚ« SE*	8 a _Λ © · u 0 o ~ gg*	..SS» ^s yg-	o · to	£3” 55-
	IS’	sg*		E8”	58-	E8«		Sto U 0
	88«	sg*		88-	55-	§g-		fr < se*

Fig.27.

189 639

173

Fiq.27(kont i

O · ©	SE* BS- yg-	o · n μ	SE* yg- yg-	o ♦ «X o	SE* BS- BS-	O « © ©	μ x a es- £S- Sg-	o « «η «1	X μ A 88Bc° SE	o « eo © μ	ES SS- ES
o ♦ 2	BE°	© · r4	C O X υ o	o · o	ES>	o · OT	μ X	o * OT	ES*	© * μ	BE
	BE-		5 C BC χ μ	©	gg-		SE-		Se*	»-Μ	SB*
	BE		SE*		SE		SE-		SE-		88-
© ·	SE«	O «	BS-	o ·	SE*	o ·	IB	© 9	sE-	© ♦	ES-
	SE*	μ	SE-	μ	yg-	©	SE*	OT	Sil·	O •X	συ gy¹
	BE*		SE*		g§-		SB*		ys-		SB-
	SE*		SE*		ES-		ES		o o gy*		SE
O · o Ό	SE°	o ♦ ot w>	BE-	o · o μ	SB*	o « μ to	£g°	O · lo OT	SS°	© ♦ Ul ©	§8“
	SE		BE*		EB>				SE-		gil·
	BE*		BE-		u e		SE-		88-		88
© * v\	SE*	O · © \o	U o Si“	© · μ μ	SE*	© · © w	SS-	© * VI OT	SB*	© 9 ar O	μ X ifc*
	BS-		«. b SS^M		BE*		Bs^>		υ o . GS	«χ	SGo w υ
	EE-		EB-		EB>		Be°		μ x SG°		ES
© 9	SE*	© »	gg-	© *	BE-	a &	§B*	O *	SE*	O ·	£S-
wi	BE*	WJ	SE-	μ	BE-	cc	ES-	OT	SB*	o w	EE*
	SE*		E§*		SE*		SE-		gy-		SE*
	BS-		μ x yg-		BE-		SE*		ES		BB-
© · μ Ul	BS-	© · w> u>	ES>	ο · ΙΛ μ	BE	o · V ©	ES	O « n OT	EB>	O ♦ C4 O	SE
	yg-		ES-		EE-		Sil·		SE*		SE*
	SE*		88°		SE-		SE*		SE*		gy*
o * «3 V*l	SE*	o · Ul Φ	SE-	Ο ·	BE-	o « *n	BE*	© · gł	8§	© 9 »4	88o © υ
	SE“		ES-		SE*		SE		SE	r-ł	BE*
	μ x SS*		SE*		BE-		BE		SGc υ <5		Sfc» υ u
o ·	Es-	© ·	BE	© ♦	ES-	O 9	SE*	o *	SE*	O ·	ES
m	SE*	©	SE*	μ	EB>	eo	SE*	OT	μ x 5fc*	© © W	SSo o u
	ES-		BE		sg„		08-		SB*		SB-
	EE-		SE*		SE*		SE-		ES-		μ X Sg

174

189 639 c

o nT

CM

Ó) ll

O « rt	SL·	o · 9 PM	SL·	O · v> Cl	OL·	o » 4»	SS
	EL·		SL·		ES-		o§
	SL·		BL·		£L·		os
O « W	SL·	O ♦ Wl <M	BL·	O · Cl	SL·	O · Cl TR	SB
	BL·	P*ł	EL·	w	BS-		ES
	sL·		BL·		OL·		BE
O · m	BE-	O ·	SL·	O *	aL·	O ·	SE
w	BE-	CM W	SE-	Cl w	SL·	* rt	BE
	yo<		BL·		sL·		SE
	s0“		SL·		SL·		X rt b < X rt
o · w	BE*	O ♦ ci CM	SS°	o · CM Cl	BL·	O · rt Ό	OS
	88« O o		SL·		EL·		SB
	SB-		SL·		υ e 5 o ^J		O U b 5
o · Cl	o o as²	O · PM	SL·	o · •M	SL·	O · o	SB
rk	C <J		SL·	4M	aS-	*4	sO
	EL·		<J o SB		SB-		Sb

X rt

E3^U

.. §8 ^s SB

BE* sL·

EL·

SL·

BL·

EL· sL· o * o

PM

X rt

E5^J i‘L·

EL·

IBrt X

X rt * rt X O

EL·

SL·

SL· sL·

SB* §S° rt x p o x ~ u

SE is o · rt <

StSk u o E5^Ł o « 2Ϊ E «< k < k A as·

ESS rt O o · o u <D ³ eL·

Ł o ου o 00B’EL·

EiŹx

X rt

8Sx < rt o · B g k

SE

SL·	~ SL· ² BL·	Cl r4 X f88°	SL·
BL·	SE- SB-	SB*	88« rt x
SL·	o. 3L· o.SL· W rt	X rt rt x u g ·	«.OL· VI
SL·	- 5E^{e 2} SL·	ci rt X - SE^X	³ BL·
EL·	§L· ES-	EL·	BE-
OL·	X rt rt X rt X rt X rt O x rt eL	00-	BE-

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz

Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyodrębniona cząsteczka kwasu nukleinowego, kodująca chimeryczny ligand TIE-2 wiążący i/lub aktywujący receptor TEE-2, znamienna tym, że zawiera N-końcową domenę, domenę skłębionej spirali i domenę fibrynogeno-podobną, przy czym, co najmniej dwie wspomniane domeny pochodzą od różnych ligandów TIE-2 wybranych spośród liganda 1 TIE-2, liganda 2 TIE-2, liganda 3 TIE i liganda 4 TIE.
2. Cząsteczka według zasłuz. 1, znamienna tym, ze domenaN-końcowa, dowenasWębionej spirali i domena fibryoagena-podabna pochodzą z liganda 1 TIE-2 lub liganda 2 TIE-2.
3. Cząsteczka według zastrz. 2, wiążąca i aktywująca receptor TIE-2, znamienna tym, ze zawiera sekwencję nukleotydową, kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji oukleotySowęj, która koduje domenę N-końcową liganda 1 TIE-2 zamienie się na sekwencję oukleotydową, która koduje domenę N-końcową liganda 2 TIE-2.
4. Cząsteczka według zastrz. 3, znamienna tym, że część sekwencji nukleatySowęj, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencję nukleatydową, która koduje domenę skłębionej spirali lizńode 2 TIE-2.
5. Cząsteczka według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że jest tak zmodyfikowana, ze koduje inny aminokwas zamiast reszty cysternowej kodowanej przez nukleotydy 784-787 jak przedstawiono w fig. 27.
6. Cząsteczka według zastrz. 5, znamienna tym, ze jest tak modyfikowana, że koduje resztę serynowązamiast reszty cysternowej.
7. Cząsteczka według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że jest dodatkowo zmaSyfikaweoa, tak, że koduje inny aminokwas zamiast reszty arzioinowęj kodowanej przez nukleotydy 199-201 jak przedstawiono w fig. 27.
8. Cząsteczka według zastrz. 7, znamienna tym, że jest tak modyfikowana, że koduje resztę serynową zamiast reszty argininawej.
9. Cząsteczka, według zastrz. 3, znamienna tym, że koduje chimeryczny ligand TIE-2 posiadający sekwencję ammokwasową przedstawioną na fig. 27.
10. Cząsteczka według zastrz. 4, znamienna tym, koduje chimeryczny ligand TIE-2 posiadający sekwencję przedstawioną na fig. 25.
11. Cząsteczka według zastrz. 2, kodująca modyfikowany ligand TIE-2 wiążący się z receptorem TIE-2 lecz nie aktywujący receptora TIE-2, znamienna tym, że zawiera sekwencję ouklęotySową, kodującą ligand 1 TIE-2, przy czym część sekwencji nuklęotydowej, która koduje domenę fibryoogeno-podobną ligaoda 1 TIE-2 zemięoia się na sekwencję nuklęotySawą, która koduje domenę fibryI-ogeoa-podobną liganda 2 TIE-2.
12. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, ze część sekwencji nukleatySawej, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 1 TIE-2 zamienia się na sekwencje oukleatydową, która koduje domenę skłębionej spirali liganda 2 TIE-2.
13. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, ze posiadająca sekwencję przedstawioną w fig. 24.
14. Cząsteczka według zastrz. 12, znamienna tym, że posiada sekwencję przedstawioną w fig. 26.
15. Chimeryczny ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.
16. Chimeryczny ligand TIE-2 według zastrz. 15, znamienny tym, ze posiada sekwencję przedstawioną w fig. 27, lecz zmodyfikowany tak, ze posiada inny aminokwas zamiast reszty cysternowej kodowanej przez nukleotydy 784-787.

189 639
17. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.
18. Wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z kontrolną sekwencją ekspresji zdolną do kierowania jego ekspresją w komórce gospodarza.
19. Wektor według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że jest plazmidem.
20. Układ gospodarza-wektor do wytwarzania chimerycznego liganda jak zdefiniowano w zastrz. 15, który obejmuje komórkę gospodarza i wektor jak zdefiniowano w zastrz. 17.
21. Układ gospodarza-wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia lub ssacza.
22. Sposób wytwarzania chimerycznego liganda jaki zdefiniowano w zastrz. 15, znamienny tym, ze prowadzi się hodowle komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano w zastrz. 20, w warunkach, pozwalających na wytwarzanie liganda i odzyskiwanie tak wytworzonego liganda.
23. Przeciwciało, znamienne tym, że specyficznie wiąże się z chimerycznym ligandem TIE-2 jak zdefiniowano w zastrz. 15, ale które nie wiąże się z natywnym ligandem TIE-2.
24. Przeciwciało według zastrz. 23, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.
25. Koniugat, znamienny tym, że obejmuje ligand jak zdefiniowano w zastrz. 15 i sprzężony z nim środek cytotoksyczny.
26. Koniugat według zastrz. 25, znamienny tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop lub toksyna.
27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera chimeryczny lub modyfikowany ligand jak zdefiniowano w zastrz. 15 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
28. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało jak zdefiniowano w zastrz. 23 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
29. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera koniugat jak zdefiniowano w zastrz. 25 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
30. Ligand jak zdefiniowano w zastrz. 15, albo 16, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.
31. Przeciwciało jak zdefiniowano w zastrz. 23, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.
32. Koniugat jak zdefiniowano w zastrz. 25, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.
33. Chimeryczny ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 11.
34. Chimeryczny ligand TIE-2, według zastrz. 33, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną na fig. 24, 25, 26 i 27.
35. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 11.
36. Wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z kontrolną sekwencją ekspresji zdolną do kierowania jego ekspresją w komórce gospodarza.
37. Wektor według zastrz. 35 lub 36, znamienny tym, że jest plazmidem.
38. Układ gospodarza-wektor do wytwarzania chimerycznego liganda jak zdefiniowano w zastrz. 33, który obejmuje komórkę gospodarza i wektor jak zdefiniowano w zastrz. 35.
39. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 38, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia lub ssacza.
40. Sposób wytwarzania chimerycznego liganda TIE-2 jaki zdefiniowano w zastrz. 33, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano w zastrz. 38, w warunkach, pozwalających na wytwarzanie liganda i odzyskiwanie tak wytworzonego liganda.
41. Przeciwciało, znamienne tym, że specyficznie wiąże ligand jak zdefiniowano w zastrz. 33 i który nie wiąże natywnego TIE-2 liganda.

189 639
42. Przeciwciało według zastrz. 41, znamienne tym, ze jest przeciwciałem monoklonalnym.
43. Koniugat, znamienny tym, że zawiera chimeryczny ligand TIE-2 jak zdefiniowano w zastrz 33 i sprzęzony z nim czynnik cytotoksyczny.
44. Koniugat według zastrz. 43, znamienny tym, że czynnik cytotoksyczny jest radioizotopem lub toksyną.
45. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera chimeryczny ligand TIE-2 jak zdefiniowano w zastrz. 33 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
46. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało według zastrz. 41 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
47. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera koniugat jak zdefiniowano w zastrz. 43 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
48. Ligand jak zdefiniowano w zastrz. 33, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.
49. Przeciwciało jak zdefiniowano w zastrz. 41, do zastosowania w sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.
50. Koniugat jak zdefiniowano w zastrz. 43, do zastosowania sposobie leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego, albo w sposobie diagnozowania.