CN108588191A - 菊芋实时定量pcr分析中内参基因的选择方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，涉及定量PCR领域，该方法以菊芋不同组织(幼根、嫩茎、叶、茎块和花瓣)为材料，使用q PCR技术开展18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、转录延伸因子基因(Ef‑1a)、肌动蛋白基因(Actin、β‑actin)、3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、25S核糖体RNA基因(25S rRNA)、多聚泛素酶基因(UBQ)7内参基因的表达量分析，并利用GeNorm和NormFinder软件对所获得的数据进行统计学上的评估，分析各看家基因的表达变化，以期筛选出相对稳定的基因作为菊芋的内参基因，用于研究菊芋基因量的变化。

Description

菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法
技术领域
本发明涉及定量PCR领域，特别涉及一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法。
背景技术
实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是利用实时荧光定量仪，来检测PCR反应后产物的量，以达到对核酸定量的目的。与传统的RNA定量技术相比，它对于探测低拷贝数的mRNA更加灵敏。实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)从定性到定量的飞跃，具有定量准确性高、重复性好、灵敏度强、速度快等优点。随着基因组学以及高通量测序技术的发展，在分子生物学领域中实时荧光定量PCR已经成为分析基因表达特性的重要工具。利用qPCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、RNA质量、酶促反应效率等偏差，往往需要引入内参基因对其进行校正。
鉴于qPCR的众多优点，在植物科学领域中，越来越多的研究者利用实时荧光定量技术筛选合适的内参基因，以进行基因表达和转录组分析。理想的内参基因应该满足以下条件：首先在不同种类的组织、细胞以及不同的发育时期都能表达稳定；另外，其表达受环境、生物、非生物胁迫等各种因素的影响较小；再者，不存在假性基因的情况，以避免基因组DNA的扩增；最后其稳定表达值与目的基因的表达值相近。但到目前为止，尚未发现一种内参基因能够完全满足上述条件，因此在具体、可复制的实验条件下，挑选表达稳定的内参基因是进行qPCR分析的重要前提。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，对所获得的数据进行统计学上的评估，分析各看家基因的表达变化，以期筛选出相对稳定的基因作为菊芋的内参基因，用于研究菊芋基因量的变化。
为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，其特征在于：所述菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的步骤如下：
(1)总RNA的提取：称取100mg菊芋叶片或块茎组织放入预冷好的研钵中，在液氮中快速研磨成粉状后移至盛有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，将匀浆样品在室温下，放置5min，加200ul氯仿，盖好管盖，在涡旋振荡器上剧烈震荡15sec左右，然后室温静置3min，12000r·min-14℃离心10min，样品会分成三层，将上层透明的水相(500ul)转移到新的无酶离心管中，加入500u1的异丙醇，混匀后在室温下放置20min，12000r·min-14℃离心10min，去上清，沉淀用1mL75％的乙醇洗涤2次，短暂离心后倒出液体，晾干后加入30uL RNase·Free ddH2O，吹打混匀，之后用TGem Plus全波长分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，再用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整度；
(2)反转录c DNA第一链的合成：按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒的操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第一链，反转录体系为20μL，获得的cDNA产物直接用于PCR或-80℃贮藏备用；
(3)PCR引物设计：根据定量PCR引物的设计原则，利用Primer Premier 5.0软件，分别设计18S rRNA、Eef-1a、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ5 7个内参基因的定量PCR引物，引物序列见表1，由华大基因科技有限公司合成，内参基因的荧光定量PCR分析以菊芋不同组织来源的第1链为cDNA模板，进行实时荧光定量分析，在八连管中加入2×SuperPeal PreMix Plus10μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各0.6μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH2O加至20μL，每个样品重复3次，反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性10秒，53℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环；72℃延伸10分钟，采集融解曲线荧光信号，数据由荧光定量PCR仪自动读取，每个样品重复3次；
(4)数据分析：对荧光定量PCR仪读取的各个样品CT值(表达量越高，CT值越小)，用公式Q＝EΔCT进行计算，得出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，一般情况下，2为默认理想扩增效率，ΔCT＝CTmin-CT样品(CTmin为所以样品里最小的CT值，CT样品为各个样品的CT值，软件GeNorm和Norm-Finder分析各基因的稳定性。
采用以上技术方案的有益效果是：该菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法利用菊芋开花期的不同组织(幼根、茎块、叶、嫩茎和花瓣)，选择了18S rRNA、Eef-1a、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ57个内参基因，系统研究它们在不同组织中的表达稳定性，经计算，GeNorm和NormFinder程序均认为，25S rRNA和18S rRNA的表达最为稳定，且7个内参基因的排序略有差异，这可能是由于不同软件的统计学算法造成的，这种现象在柑橘、毛果杨、以及其他植物中也曾出现过。综合可知，25S rRNA和18S rRNA在菊芋不同组织中表达较为稳定，这二者同为核糖体RNA基因，是在生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组织成分或参与生物体的基本生化代谢过程中，在很多的真核细胞和生理状态下均能表达的基因，此外，25S rRNA在不同时间点二化螟处理水稻茎秆时的表达稳定；以上研究均进一步说明25S rRNA和18S rRNA能作为菊芋基因表达中的内参基因。当然，二者在某些特定情况下也缺乏稳定性。Actin和GAPDH在本试验中稳定性排在最后2位，据报道，GAPH在矮牵牛和桉树中、Actin在牡丹不同组织中的表达也极为不稳定，这说明二者在某些情况下容易受到各种因素的影响，在一些条件下不适合选作内参基因。此外，我们发现在所选的7个内参基因中有4个基因在菊芋根部的表达量均高于其他组织，推测它们在菊芋开花时期与根部的发育有关，同样这种情况也出现在毛晓娟等对毛果杨不同组织内参基因的筛选中。同时，越来越多的报道指出，单一传统的内参基因会对结果的精确性产生影响，而新内参基因的发掘将逐渐取代表达稳定性差的传统基因，随之，应用内参基因组合将成为实时荧光定量分析中新的方向，在菊芋的后基因时代，基于基因芯片技术和EST数据库的筛选，将有助于获得菊芋中应用更广泛、更可靠的内参基因。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
图1是菊芋各内参基因PT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；
图2是7个内参基因在5种不同组织样品中的表达量CT值条形码图；
图3是GeNorm软件分析获得的各内参基因在菊芋不同组织中的表达稳定值曲线图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的优选实施方式。
结合图1、图2和图3出示本发明一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的具体实施方式：该菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的步骤如下：
(1)总RNA的提取：称取100mg菊芋叶片或块茎组织放入预冷好的研钵中，在液氮中快速研磨成粉状后移至盛有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，将匀浆样品在室温下，放置5min，加200ul氯仿，盖好管盖，在涡旋振荡器上剧烈震荡15sec左右，然后室温静置3min，12000r·min-14℃离心10min，样品会分成三层，将上层透明的水相(500ul)转移到新的无酶离心管中，加入500ul的异丙醇，混匀后在室温下放置20min，12000r·min-14℃离心10min，去上清，沉淀用1mL75％的乙醇洗涤2次，短暂离心后倒出液体，晾干后加入30uL RNase·Free ddH2O，吹打混匀，之后用TGem Plus全波长分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，再用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整度；
(2)反转录c DNA第一链的合成：按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒的操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第一链，反转录体系为20μL，获得的cDNA产物直接用于PCR或-80℃贮藏备用；
(3)PCR引物设计：根据定量PCR引物的设计原则，利用Primer Premier 5.0软件，分别设计18S rRNA、Eef-1a、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ5 7个内参基因的定量PCR引物，引物序列见表1，由华大基因科技有限公司合成，内参基因的荧光定量PCR分析以菊芋不同组织来源的第1链为cDNA模板，进行实时荧光定量分析，在八连管中加入2×SuperPeal PreMix Plus10μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各0.6μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH2O加至20μL，每个样品重复3次，反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性10秒，53℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环；72℃延伸10分钟，采集融解曲线荧光信号，数据由荧光定量PCR仪自动读取，每个样品重复3次；
(4)数据分析：对荧光定量PCR仪读取的各个样品CT值(表达量越高，CT值越小)，用公式Q＝EΔCT进行计算，得出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，一般情况下，2为默认理想扩增效率，ΔCT＝CTmin-CT样品(CTmin为所以样品里最小的CT值，CT样品为各个样品的CT值，软件GeNorm和Norm-Finder分析各基因的稳定性。
表1 RT-PCR检测中所用的7个内参基因的引物序列
表2 通过NormFinder软件分析获得的各内参基因在菊芋不同组织中的表达稳定值(S)排序
表3 通过Best keeper软件分析各内参基因在菊芋不同组织中的表达稳定性
表4 各内参基因在菊芋不同组织中表达稳定性的综合排名
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，其特征在于：所述菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的步骤如下：
(1)总RNA的提取：称取100mg菊芋叶片或块茎组织放入预冷好的研钵中，在液氮中快速研磨成粉状后移至盛有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，将匀浆样品在室温下，放置5min，加200ul氯仿，盖好管盖，在涡旋振荡器上剧烈震荡15sec左右，然后室温静置3min，12000r·min-14℃离心10min，样品会分成三层，将上层透明的水相(500ul)转移到新的无酶离心管中，加入500ul的异丙醇，混匀后在室温下放置20min，12000r·min-14℃离心10min，去上清，沉淀用1mL75％的乙醇洗涤2次，短暂离心后倒出液体，晾干后加入30uL RNase·Free ddH2O，吹打混匀，之后用TGem Plus全波长分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，再用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整度；
(2)反转录c DNA第一链的合成：按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒的操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第一链，反转录体系为20μL，获得的cDNA产物直接用于PCR或-80℃贮藏备用；
(3)PCR引物设计：根据定量PCR引物的设计原则，利用Primer Premier 5.0软件，分别设计18S rRNA、Eef-1a、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ57个内参基因的定量PCR引物，引物序列见表1，由华大基因科技有限公司合成，内参基因的荧光定量PCR分析以菊芋不同组织来源的第1链为cDNA模板，进行实时荧光定量分析，在八连管中加入2×SuperPealPreMix Plus10μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各0.6μL，cDNA模板1μL，RNase-free ddH2O加至20μL，每个样品重复3次，反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性10秒，53℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环；72℃延伸10分钟，采集融解曲线荧光信号，数据由荧光定量PCR仪自动读取，每个样品重复3次；
(4)数据分析：对荧光定量PCR仪读取的各个样品CT值(表达量越高，CT值越小)，用公式Q＝EΔCT进行计算，得出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，一般情况下，2为默认理想扩增效率，ΔCT＝CTmin-CT样品(CTmin为所以样品里最小的CT值，CT样品为各个样品的CT值，软件GeNorm和Norm- Finder分析各基因的稳定性。
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