CN112980989A - 柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用 - Google Patents

柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用 Download PDF

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薛金玉
杨俊杰
张莹婷
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Abstract

本发明公开了柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用，属于植物分子生物学领域。本申请筛选了13个内参基因的基因序列，通过5种算法(delta‑CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)评估候选基因的稳定性，获得了柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因：novel16、cln‑miR6725、novel1、U6、novel6和pab‑miR159a，并相应的设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，提高检测结果的可信度。

Description

柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用。
背景技术
柳杉(Cryptomeria fortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr)，又名长叶孔雀松。乔木，其天然分布极其狭窄，主要分布在我国及日本等地。柳杉树形优美，材质优良，适应性强，生长快而持久，具有耐寒冷、干旱和瘠薄，抗风抗雪压能力等特性。在茶树不同组织中已有miRNA内参的研究(CN 105132417B)，但仅使用了geNorm和BestKeeper软件进行了内参选择。研究表明不同植物、品种、组织、处理下没有“完美”的内参基因，因此在定量实验前应该进行内参的筛选。现在关于柳杉不同组织的miRNA基因的研究还未曾有过报道。探究柳杉不同组织的基因表达差异的研究过程中，需要稳定可靠的内参基因作为参照来进行实时荧光定量PCR检测和验证基因的表达水平，因此筛选柳杉不同组织的稳定表达的内参基因对其实时荧光定量PCR检测结果的准确性起着关键作用。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因；本发明所要解决的第二技术问题在于提供柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因的专有引物；本发明所要解决的第三技术问题在于提供上述内参基因和/或内参基因的专有引物在柳杉不同组织的miRNA荧光定量中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因，内参基因为novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因，其中，novel16基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；cln-miR6725基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；novel1基因的核酸序列如SEQ IDNO.3所示；novel6基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；pab-miR159a基因的核酸序列如SEQID NO.5所示。
检测所述的柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因的专有引物，
novel16基因的引物序列如下：
novel16正向引物：5’-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3’；
novel16反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
cln-miR6725基因的引物序列如下：
cln-miR6725正向引物：5’-TGGCATCTGTCGAGGTCATCTA-3’；
cln-miR6725反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
novel1基因的引物序列如下：
novel1正向引物：5’-CTTTCCGGATCCTCCCATGC-3’；
novel1反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
U6基因的引物序列如下：
U6正向引物：5’-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3’；
U6反向引物：5’-GACCAATTCTCGATTTGTGCG-3’；
novel6基因的引物序列如下：
novel6正向引物：5’-TTTACCGATCCCTCCAAAGCC-3’；
novel6反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
pab-miR159a基因的引物序列如下：
pab-miR159a正向引物：5’-CGTTGGTTTGAAGGGAGCTCTAC-3’；
pab-miR159a反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供。
所述的novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因在作为柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因中的应用。
进一步的，柳杉组织为根，茎，嫩叶，球果和种子。
检测所述的novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因的专有引物在柳杉不同组织的miRNA荧光定量中的应用。
本发明还提供了柳杉不同组织的实时miRNA荧光定量内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)材料选择：不同的组织样本(根，茎，嫩叶，球果和种子)是从在自然环境中生长的15年的柳杉#3收集的。每种处理均三个生物学重复。在收集样品时，用液氮快速冷冻。
2)基因选择：通过对柳杉miRNA转录组测序，从中选取10个成熟且表达量较为丰富且稳定的miRNAs(cln-miR6725、novel16、novel1、novel14、pab-miR159a、pab-miR395b、ppt-miR894、novel6、cln-miR162和cas-miRl66d)及3个常用miRNA的内参基因(5S rRNA、18S rRNA和novel1)作为候选基因。
3)、qRT-PCR引物设计：参数如下：miRNA上游引物是以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，通过在引物两端增减碱基以达到合适的Tm值在65℃、GC含量在40-60％，下游引物由试剂盒miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)提供。
4)提取总RNA，反转录合成cDRA：使用anmiRNA分离试剂盒(天根生物，中国北京)提取miRNA。通过1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳和分光光度计(Nano Drop2000，ThermoScientific，Wilmington，DE，USA)分别检测其完整性、纯度和浓度。
检测合成的样品采用加尾法进行反转录，即：1ug miRNA参照miRcute miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(KR201，天根生物，中国北京)说明书进行miRNA cDNA第一链的合成。反应在42℃进行60分钟；之后样品95℃进行3分钟用于酶失活反应。合成的cDNA反应液立即储存于-20℃。
5)qPCR定量：qRT-PCR使用ABI 7500系统(Applied Biosystems)进行扩增，程序如下：95℃预变性15min；之后进行40次循环，94℃变性20s，60℃退火延伸34s；然后进行60～95℃熔解曲线分析。
20μL反应体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(SYBR&ROX)10μL、ForwardPrimer(10μM)和Reverse Primer(10μM)各0.4μL、稀释10倍的miRNA第一链cDNA 2μL、50×ROX Reference Dye 1.6μL，RNase-Free ddH2O5.6μL。每个样品进行3个技术重复，每个候选内参基因都设有不加模板的阴性对照，以检验扩增的背景。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
本发明通过文献资料查阅和数据库搜索，筛选了13个内参基因的基因序列，通过5种算法(delta-CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)评估候选基因的稳定性，获得了柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因，该荧光定量内参基因为novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a，并相应的设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，将其应用于柳杉不同组织的miRNA荧光定量中，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，提高检测结果的可信度。
附图说明
图1是筛选的13个miRNA荧光定量内参基因的CQ值；
图2是geNorm软件对13个内参基因表达稳定值(M)排序；
图3是geNorm确定用于准确量分析最优的内参基因数目；
图4是6个稳定基因novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a以及不稳定基因cas-miR166d做内参基因，smo-miR396基因的表达量；
图5是6个稳定基因novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a以及不稳定基因cas-miR166d做内参基因，aof-miR396a基因的表达量；
图6是6个稳定基因novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a以及不稳定基因cas-miR166d做内参基因，pab-miR396h基因的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例所采用的供试材料为：不同的组织样本(根，茎，嫩叶，球果和种子)是从在自然环境中生长的15年的柳杉#3收集的。每种处理均三个生物学重复。在收集样品时，用液氮快速冷冻。
实施例
1、候选参考基因的筛选及其引物的设计
通过对柳杉miRNA转录组测序，从中选取10个成熟且表达量较为丰富且稳定的miRNAs(cln-miR6725、novel16、novel1、novel14、pab-miR159a、pab-miR395b、ppt-miR894、novel6、cln-miR162和cas-miR166d)及3个常用miRNA的内参基因(5SrRNA，18SrRNA和novel1)作为候选基因。
qRT-PCR引物设计：参数如下：miRNA上游引物是以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，通过在引物两端增减碱基以达到合适的Tm值在65℃、GC含量在40-60％，下游引物由试剂盒miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)提供。13个候选参考基因和引物序列如下表1所示。
表1 13个候选参考基因和引物序列
Figure BDA0002991130390000051
备注：E放大效率；R2相关系数
2、柳杉总RNA提取与eDNA制备
使用anmiRNA分离试剂盒(天根生物，中国北京)提取miRNA。通过1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳和分光光度计(Nano Drop2000，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)分别检测其完整性、纯度和浓度。
检测合成的样品采用加尾法进行反转录，即：1ug miRNA参照miRcute miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(KR201，天根生物，中国北京)说明书进行miRNAcDNA第一链的合成。反应在42℃进行60分钟；之后样品95℃进行3分钟用于酶失活反应。合成的cDNA反应液立即储存于-20℃。
3、qPCR定量
qRT-PCR使用ABI 7500系统(Applied Biosystems)进行扩增，程序如下：95℃预变性15min；之后进行40次循环，94℃变性20s，60℃退火延伸34s；然后进行60～95℃熔解曲线分析。
20μL反应体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(SYBR&ROX)10μL、ForwardPrimer(10μM)和Reverse Primer(10μM)各0.4μL、稀释10倍的miRNA第一链cDNA 2μL、50×ROX Reference Dye 1.6μL，RNase-Free ddH2O 5.6μL。每个样品进行3个技术重复，每个候选内参基因都设有不加模板的阴性对照，以检验扩增的背景。
4、稳定性评估
采用delta-Ct，geNorm，NormFinder和BestKeeper 4种不同的算法分别对不同样本中内参基因的表达稳定性进行统计分析；通过RefFinder网址综合分析结果，筛选出稳定的内参基因。
5、结果
delta-CT分析：delta-CT分析得到标准偏差平均值，其中标准偏差平均值越高基因稳定性越差，相反标准偏差平均值越低基因稳定性越高，结果如表2所示，novel1的标准偏差平均值为1.21，为最稳定的基因；pab-miR159a的标准偏差平均值为2.14，为稳定性最差的基因。
表2 delta-CT分析结果
Figure BDA0002991130390000061
Figure BDA0002991130390000071
geNorm软件分析：通过将荧光定量PCR得到的循环阈值(CT)转换为相对定量数据，利用geNorm软件分析出某一基因与其他基因两两比值的对数转换值的平均变异度M值，并绘制出M值折线图(图2)。M值越小，该内参基因越稳定。geNorm软件的计算方法不受基因间极端比值和表达丰度差别的影响，可通过该软件筛选出2个以上稳定表达的内参基因。由于实施例的成对变异值V6/V7＜0.15(图3)，因此在柳杉不同组织下需要6个内参基因(novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a)进行基因的相对表达量分析。
NormFinder软件分析：使用NormFinder时，将原始Ct值转换2-ΔCt(deRa Ct＝原始Ct值-本组中最低Ct值)后被用于内参基因的表达稳定性分析。通过NormFinder软件计算候选内参基因的稳定值，稳定值越高稳定性越差，反之稳定值越低稳定性越好，即最小稳定值的基因为最稳定的基因。结果如表3所示，novell的稳定值为0.279，为最稳定的基因；pab-miR159a稳定值为1.344，为稳定性最差的基因。
表3 NormFinder软件分析结果
Figure BDA0002991130390000072
Figure BDA0002991130390000081
BestKeeper软件分析：BestKeeper是通过标准偏差SD值对候选基因的稳定性进行评价和排序，SD值越小，该基因的稳定性越好；若SD＞1，则认为该基因不稳定结果。柳杉不同组织的，基因的稳定性为novel1＞U6＞18S rRNA＞cln-miR6725＞novel16＞pab-miR395b＞ppt-miR894＞novel6＞novel14＞5S rRNA＞pab-miR159a＞cas-miR166d＞cln-miR162，表达最稳定的是novel1(表4)。
表4 BestKeeper软件分析结果
序号 Genes std dev[+/-CP]
1 novel1 0.864
2 U6 0.932
3 18S rRNA 1.049
4 cln-miR6725 1.074
5 novel16 1.278
6 pab-miR395b 1.377
7 ppt-miR894 1.519
8 novel6 1.552
9 novel14 1.620
10 5S rRNA 1.664
11 pab-miR159a 1.809
12 cas-miR166d 2.153
13 cln-miR162 2.180
RefFinder网址分析：为验证内参基因筛选的准确性，我们对候选内参基因在每个处理下由delta-Ct，geNorm，NormFinder和BestKeeper排序结果的几何平均值进行了综合排名。综合排名越小，基因表达稳定性越好。结果如表5所示，基因的稳定性为novel1＞novel16＞cln-miR6725＞novel6＞18S rRNA＞U6＞novel14＞pab-miR395b＞cln-miR162＞ppt-miR894＞5SrRNA＞cas-miR166d＞pab-miR159a，其中基因novel1的几何平均值为1.32，为最稳定的基因；基因pab-miR159a的几何平均值为12.47，为最不稳定的基因。
表5 RefFinder网址分析结果
序号 Genes Geomean of ranking values
1 novel1 1.32
2 novel16 2.59
3 cln-miR6725 2.83
4 novel6 3.36
5 18S rRNA 4.82
6 U6 5.26
7 novel14 6.3
8 pab-miR395b 6.96
9 cln-miR162 9.87
10 ppt-miR894 10.26
11 5S rRNA 10.49
12 cas-miR166d 10.95
13 pab-miR159a 12.47
6、内参基因稳定性验证
本发明以(smo-miR396、aof-miR396a、pab-miR396h)作为靶基因，并以不同的内参基因(组合)作为标准进行计算，以确认本研究中评估的候选基因的适用性。用2-ΔΔCt方法计算三个靶基因的表达。发现稳定基因novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a做内参时，三者靶基因表达量的变化趋势基本一致，在种子和球果表达量较高。但用不稳定基因cas-miR166d做内参时，与稳定筛选的稳定基因相比，三者靶基因表达情况不同(图4、5和6)表达量均较低。说明筛选出来的内参基因是可靠的。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用
<130> 1
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> novel16
<400> 1
uuuuuccaau accuccuaua cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> cln-miR6725
<400> 2
uggcaucugu cgaggucauc ua 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> novel1
<400> 3
ucuuuccgga uccucccaug cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> novel6
<400> 4
uuuuaccgau cccuccaaag cc 22
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> pab-miR159a
<400> 5
uugguuugaa gggagcucua c 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> novel16 正向引物(artificial)
<400> 6
gcgtttttcc aatacctcct atacc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> cln-miR6725 正向引物(artificial)
<400> 7
tggcatctgt cgaggtcatc ta 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> novel1 正向引物(artificial)
<400> 8
ctttccggat cctcccatgc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> U6 正向引物(artificial)
<400> 9
acagagaaga ttagcatggc c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> U6 反向引物(artificial)
<400> 10
gaccaattct cgatttgtgc g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> novel6 正向引物(artificial)
<400> 11
tttaccgatc cctccaaagc c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> pab-miR159a 正向引物(artificial)
<400> 12
cgttggtttg aagggagctc tac 23

Claims (5)

1.柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因，其特征在于，所述内参基因为novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因，所述novel16基因的核酸序列如SEQID NO.1所示；所述cln-miR6725基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述novel1基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述novel6基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pab-miR159a基因的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.检测权利要求1所述的柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因的专有引物，其特征在于，
novel16基因的引物序列如下：
novel16正向引物：5’-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3’；
novel16反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
cln-miR6725基因的引物序列如下：
cln-miR6725正向引物：5’-TGGCATCTGTCGAGGTCATCTA-3’；
cln-miR6725反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
novel1基因的引物序列如下：
novel1正向引物：5’-CTTTCCGGATCCTCCCATGC-3’；
novel1反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
U6基因的引物序列如下：
U6正向引物：5’-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3’；
U6反向引物：5’-GACCAATTCTCGATTTGTGCG-3’；
novel6基因的引物序列如下：
novel6正向引物：5’-TTTACCGATCCCTCCAAAGCC-3’；
novel6反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
pab-miR159a基因的引物序列如下：
pab-miR159a正向引物：5-CGTTGGTTTGAAGGGAGCTCTAC-3’；
pab-miR159a反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供。
3.权利要求1所述的novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因在作为柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组织为根，茎，嫩叶，球果和种子。
5.检测权利要求3所述的novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因的专有引物在柳杉不同组织的miRNA荧光定量中的应用。
CN202110317280.9A 2021-03-24 2021-03-24 柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用 Withdrawn CN112980989A (zh)

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