CN117210607A - 适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构树(Broussonetia papyrifera)荧光定量的内参基因及其引物和应用。本发明选择构树的6个不同组织为实验材料，包括叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根，依据现有不同物种中公开的内参基因，筛选出表达稳定的候选基因，依次通过荧光定量PCR分析，扩增曲线和熔解曲线分析，LinRegPCR扩增效率分析，geNorm、NormFinder和BestKeeper基因表达稳定性分析，筛选出适用于构树不同组织荧光定量PCR的2个表达稳定的内参基因(ACT和UBQ)，其中，ACT基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，UBQ基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明获得了适用于构树不同组织的表达稳定的荧光定量内参基因，填补了构树没有内参基因的现状，为构树相关功能基因的精确定量提供数据支持，可提高研究的稳定性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用。
背景技术
构树(Broussonetia papyrifera)属于桑科、构树属，在中国黄河、长江流域均有分布，目前，中国种植的构树有30万公顷，被广泛应用于饲料、造纸和植被恢复等领域。构树中粗蛋白质含量可达15％(干物质基础)，高于禾本类粗饲料和普通豆科类粗饲料，与苜蓿干草中粗蛋白质含量基本相等。构树作为一种木本饲料，具有重大的开发价值。随着构树全基因组序列的公布，极大地促进了构树的分子生物学和遗传育种研究，但目前还没有用于构树不同组织基因功能验证相关研究的内参基因，常用的内参基因在不同的植物及实验条件下会表现不稳定的性状，从而影响目的基因检测的准确性，因此筛选在构树不同组织稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供适用于构树不同组织荧光定量内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检测构树不同组织转录表达水平的要求，提高了构树不同组织基因表达分析研究的稳定性和可靠性。本发明的另一目的是提供一种上述内参基因的专用引物。本发明还有一目的是提供一种上述内参基因或专用引物的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了ACT基因和UBQ基因组合在构树不同组织荧光定量中作为内参基因的应用，所述ACT基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述UBQ基因的序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步地，所述ACT基因的引物序列如下：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’。
进一步地，所述UBQ基因的引物序列如下：
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
进一步地，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
第二方面，本发明还提供了检测ACT基因和UBQ基因的引物组合在构树不同组织荧光定量中的应用，所述引物组合由以下引物组成：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
进一步地，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
第三方面，本发明还提供了检测ACT基因和UBQ基因的引物组合在制备用于构树不同组织荧光定量的试剂盒中的应用，所述引物组合由以下引物组成：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
进一步地，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明筛选出在构树不同组织(叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根)稳定表达的内参基因分别为ACT基因和UBQ基因，同时揭示了这两个内参基因的序列。以ACT基因和UBQ基因为模板设计的实时荧光定量引物，不仅解决了构树不同组织中功能基因表达模式分析没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物，用于构树不同组织基因表达分析时引物特异性强，从而能够大大提高采用实时荧光定量检测构树优良基因的检测效率，并提高了检测结果的可信度。
附图说明
图1是构树不同组织的样品图，图1A为叶片、图1B为幼果、图1C为成熟果，图1D为茎，图1E为根，图1F为叶柄；
图2是9个候选内参基因在不同组织的平均Ct值分布图；
图3是9个候选内参基因的Ct值分布箱型图；
图4是geNorm确定用于准确定量分析最优的内参基因数目结果图；
图5是geNorm软件计算9个候选内参基因表达稳定性；
图6是应用CAT验证所筛选出的内参基因稳定性的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法；
下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例所使用的主要供试材料为：供试材料采用种植于浙江省林业科学研究院的构树。随机选择生长良好，并且高度和长势一致的3棵植株做样品采集，在2023年9月份采集构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根(图1)，每个组织每株树分别采集3个重复，采集后放入离心管，迅速用液氮速冻，-80℃保存，直至使用。
实施例1：
1、植物组织总RNA提取及cDNA的合成
使用RNAprep Pure Polysaccharide Polyphenol Plant Total RNA ExtractionKit(TIANGEN，NanJing，China)在构树不同组织中分离总RNA，用分光光度计(METTLERTOLEDO，Switzeriand)检测RNA浓度和质量。通过1.0％琼脂凝胶电泳检测RNA。用于实时荧光相对定量PCR分析的cDNA逆转录反应体系的配制参照One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix(Trans,NanJing,China)说明书，使用1μg总RNA建立20μL cDNA逆转录反应体系。反应完成后存于-20℃备用。
2、内参基因的选择及引物的设计
根据文献查询其他植物中主要的内参基因并最终设计出实验所需的9个内参基因，分别为ACT(SEQ ID NO.1)、UBQ(SEQ ID NO.2)、α-TUB1(SEQ ID NO.3)、α-TUB2(SEQ IDNO.4)、β-TUB(SEQ ID NO.5)、TIP41(SEQ ID NO.6)、CDC2(SEQ ID NO.7)、H2A(SEQ IDNO.8)、DnaJ(SEQ ID NO.9)。
首先在本申请人通过与构树基因组序列进行比对，确定各候选基因的全长序列和全长转录本序列，根据基因的转录全长序列用Primer Premier 5.0设计引物，通过BLAST工具鉴定引物特异性。引物均在生工生物工程股份有限公司合成(表1)，通过普通PCR初步筛选引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，近一步通过qRT-PCR进一步检测引物特异性，选择峰图单一，没有杂峰，阴性对照无峰的引物作为最终的引物。
表1内参基因及其对应的引物
3、内参基因引物标准曲线的建立
对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率。将反转录的cDNA以5为倍数稀释成5个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625)，作为建立标准曲线的模板。同时，以ddH2O作为阴性对照模板，来检测实验过程中的试剂或者人为污染。所有的样品均做3次重复，以确保实验数据的可信度。用QIAquant 96 2plex(QIAGEN,Germany)进行qRT-PCR，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，荧光定量PCR扩增效率要求所选引物的扩增效率在90％-110％之间。
4、荧光实时定量
使用QIAquant 96 2plex(QIAGEN,Germany)进行qRT-PCR，每个反应均包含正向和反向引物各4pM，2μL稀释不同倍数的cDNA模板，10μL PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(Thermo Fisher，USA)，加ddH2O至20μL反应体系。每个反应体系进行三次重复。qRT-PCR反应条件为：95℃持续3分钟，随后进行95℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续30秒的40个循环，在每个实验结束时，使用默认参数在55-95℃以0.3℃的增量持续60s的周期进行熔解曲线分析，所有分析均设置了三个重复。
5、数据处理
(1)geNorm软件采用成对比较法(Pairwise comparison approach)，计算出基因表达稳定性M值。判定标准是当M值低于1.5时，M值越低，稳定性越高，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的平均配对变异V值，并根据Vn/Vn+1值来确定所需最适内参基因的数目。当配对变异值Vn/Vn+1<0.15时，内参基因组合的最适基因是高稳定性排名的前n个。而如果Vn/Vn+1>0.15，则最适内参基因组合数量是n+1个。
(2)NormFinder软件采用基于模型的方法，获得内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小来筛选出最合适的内参基因，判定标准为表达稳定值最小的内参基因为最合适的内参基因。
(3)BestKeeper采用重复配对相关分析、相关分析和回归分析，计算Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)，再通过比较各个值的大小，最终确定稳定性较好的内参基因。
6、结果
(1)RNA提取质量及引物特异性检测
各样品的OD260/OD280、OD260/OD230均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28S及18S条带清晰，无降解现象，满足要求。9对引物在荧光实时定量中熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带图，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。
(2)内参基因Ct值分析
Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高。9个内参基因Ct值的均值在18.00-28.93之间，其中UBQ和ACT表达量较高，DnaJ表达量较低(图2，图3)。
(3)软件分析
geNorm软件分析：geNorm软件是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，软件默认的取舍值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参使用，M值越低表示基因越稳定。此外geNorm软件还根据候选内参基因的配对差异值Vn/Vn+1来确定合适的内参基因个数，当Vn/Vn+1＜0.15时，采用n个内参基因个数。根据软件，计算出V2/V3＝0.102＜0.15，所以进行构树不同组织荧光定量分析，应该选用两个内参基因(图4)，为UBQ和ACT(图5)。
NormFinder软件分析：NormFinder软件是根据计算候选内参基因的稳定值进行评价，稳定值越高稳定性越差，具有最小稳定值的基因为最稳定的基因。ACT的值为0.133，为最稳定的基因，α-TUB2稳定值为0.718，为最不稳定的基因(表2)。
表2 NormFinder软件分析结果
| 排名 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Gene | ACT | UBQ | TIP41 | H2A | DnaJ |
| 稳定值 | 0.133 | 0.229 | 0.287 | 0.291 | 0.304 |
| 排名 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| Gene | α-TUB1 | CDC2 | β-TUB | α-TUB2 | |
| 稳定值 | 0.332 | 0.337 | 0.351 | 0.718 |
BestKeeper软件分析：BesterKeeper软件是基于内参基因Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达Ct值进行分析。SD值越小，表达越稳定，程序默认临界值为1，当SD值大于1时，认为该基因表达不稳定。分析结果显示H2A、CDC2、β-TUB和α-TUB1，SD数值均大于1，其余基因SD数值均小于1，表达最稳定的是UBQ，最不稳定的为α-TUB1(表3)。
表3BestKeeper软件分析结果
| 排名 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Gene | UBQ | ACT | α-TUB1 | DnaJ | TIP41 |
| SD | 0.64 | 0.70 | 0.73 | 0.80 | 0.98 |
| CV | 2.74 | 3.21 | 3.26 | 3.25 | 3.66 |
| 排名 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| Gene | H2A | CDC2 | β-TUB | α-TUB2 | |
| SD | 1.43 | 1.78 | 1.93 | 2.01 | |
| CV | 5.39 | 6.27 | 7.05 | 7.26 |
(4)内参基因稳定性验证
综合考虑BestKeeper、geNorm和Normfinder 3个软件的分析结果得出，ACT和UBQ是在构树不同组织中最适的内参基因(表4)。
表4综合排名
| 排名 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| BestKeeper | UBQ | ACT | α-TUB1 | DnaJ | TIP41 |
| NormFinder | ACT | UBQ | TIP41 | H2A | DnaJ |
| geNorm | ACT/UBQ | α-TUB1 | β-TUB | TIP41 | |
| 综合排名 | ACT | UBQ | α-TUB1 | TIP41 | DnaJ |
| 排名 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| BestKeeper | H2A | CDC2 | β-TUB | α-TUB2 | |
| NormFinder | α-TUB1 | CDC2 | β-TUB | α-TUB2 | |
| geNorm | DnaJ | α-TUB2 | H2A | CDC2 | |
| 综合排名 | H2A | CDC2 | β-TUB | α-TUB2 |
选用CAT(SEQ ID NO.10)来验证所筛选的内参基因ACT和UBQ稳定性，并用表达不稳定的α-TUB2基因来做比较，发现用所筛选出的内参基因来作为内参时CAT有着相似的变化趋势，但用α-TUB2基因来做内参时，CAT基因表达情况不同，说明筛选出的内参基因ACT和UBQ是准确可靠的(图6)。
Claims (8)
1.ACT基因和UBQ基因组合在构树不同组织荧光定量中作为内参基因的应用，其特征在于，所述ACT基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述UBQ基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ACT基因的引物序列如下：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述UBQ基因的引物序列如下：
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
5.检测ACT基因和UBQ基因的引物组合在构树不同组织荧光定量中的应用，其特征在于，所述引物组合由以下引物组成：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
7.检测ACT基因和UBQ基因的引物组合在制备用于构树不同组织荧光定量的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组合由以下引物组成：
ACT正向引物5’-AATGGTGAAGGCTGGGTT-3’
ACT反向引物5’-ACCGTGCTCAATGGGATA-3’
UBQ正向引物5’-CCCTCGCCGACTACAACA-3’
UBQ反向引物5’-TCAGCCTCTGGACCTTGC-3’。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述不同组织为构树叶片、叶柄、幼果、成熟果、茎、根。
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| CN202311342942.3A Pending CN117210607A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 适用于构树不同组织荧光定量内参基因及其引物和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117210607A (zh) |
-
2023
- 2023-10-17 CN CN202311342942.3A patent/CN117210607A/zh active Pending
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