CN114457187A - 梅花实时荧光定量pcr分析中内参基因的筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因及其专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；本发明还公开了一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，可为梅花分子水平研究研究提供理论基础和技术保障。

Description

梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用。

背景技术

梅花(prunus mume)是蔷薇科李属多年生木本植物，原产于中国南方，已有三千多年栽培历史，是著名的观赏树种。随着梅花基因组测序以及分子研究的不断深入，选择出合适的内参基因为进一步研究梅花的重要农艺性状形成以及分子育种提供重要的保障。

实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)因具有准确性高、灵敏度高、特异性强、检测范围广等特点，其对于基因表达、分子水平的研究具有重大的意义，成为现代分子研究的重要手段。但实时定量PCR的结果受到总RNA质量、引物特异性和扩增效率等因素的影响，需要引入内参基因对基因表达进行校正，所以适合的内参基因显得格外的重要。理想的内参基因在任何生理状态下均能稳定地表达，然而现在没有任何一个基因能够满足要求。常用的内参基因包括转录延伸因子编码基因EF1α(elongation factor 1-α)、3-磷酸脱氢酶GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、α微管蛋白TUA(α-tubulin)、β微管蛋白TUB(β-tubulin)、肌动蛋白ACT(Actin)、多聚泛素酶基因UBQ(polyubiquitin)等被广泛应用于植物研究中。同时一些新的内参基因在不同条件下表现出高稳定性，比如蛋白磷酸酶PP2A(protein phosphatase2A)，细胞色素P450同工酶CYP(Cytochrome P450 proteins)和真核细胞翻译起始因子EIF5A(eukaryotic initiation factor 5A)等。然而目前的内参基因在不同品种、组织和开花时期中可能出现表达水平的变化。因此选择内参基因要覆盖广泛的表达水平，具有在某一条件下的代表性。内参基因的选择不是固定的，是会随着实验材料和处理条件变化而变化，不能盲目以一种看家基因(houskeeping gene)作为任何实验条件下的内参。因此利用qRT-PCR筛选不同品种、组织和不同开花时期的最佳内参基因势在必行。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选和应用，筛选梅花适用的qRT-PCR内参基因，可为梅花分子水平研究提供理论基础和技术保障。

GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；

在梅花不同品种的叶片间分析时，采用GAPDH和UBQ基因作为内参基因；

在梅花不同品种的花瓣间分析时，采用GAPDH和Actin1基因作为内参基因；

在‘美人’梅不同组织中分析时，采用Actin7和UBQ基因作为内参基因；

在‘美人’梅不同开花时期中分析时，采用PP2A和Actin1基因作为内参基因。

本发明所述的应用，其中，所述GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述UBQ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述Actin7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述Actin1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

一种用于扩增本发明所述的内参基因的专用引物，其中，所述GAPDH基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述UBQ基因的引物序列如序列表中SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述Actin7基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示；所述PP2A基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述Actin1基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。

本发明所述的专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用。

一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

(1)材料准备：选取生长一致、无病虫害的梅花品种‘长艳宫粉’、‘北京玉蝶’、‘美人’梅、‘骨红朱砂’、‘淡丰后’、‘江梅垂枝’的叶片；选取‘美人’梅一年生枝条、多年生枝条、幼叶、成熟叶、盛花期的花瓣，同时采集‘美人’梅花发育四个不同时期的样品，包括小蕾期、大蕾期、初开期、盛开期，每组样品3个生物学重复，所有样品收集后液氮速冻，放置于－80℃冰箱保存备用；

(2)总RNA提取和cDNA的合成；

(3)候选内参基因的选择和引物设计，其中，候选内参基因为从梅花基因组数据库中筛选出的EF1α、GAPDH、Actin1、Actin2、Actin3、Actin7、UBQ、PP2A、TUA、TUB1、TUB2、TUB3、TUB4、PHK共14个候选内参基因序列；

(4)qRT-PCR分析；

(5)实验数据处理与分析；

(6)内参基因验证：在梅花不同品种的叶片和花瓣中，选择原血红素IX法尼基转移酶基因COX10和花青素还原酶基因ANR作为目的基因，在‘美人’梅不同组织和开花时期分别选用纤维素合成酶基因CESE1和扩展蛋白A20基因Expansin-A20作为目的基因，选择稳定性好的两个内参基因和稳定性最差的一个基因，观察目的基因的表达模式，对内参表达稳定性的排序结果的可靠性进行验证；如稳定性好的内参基因与目的基因表达模式一致，稳定性差的基因与目的基因表达模式不一致，则说明内参表达稳定性的排序结果可靠。

本发明所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其中，步骤(4)中，反应体系如下：cDNA模板1.0μL，上下游引物各0.4μL，TB GREEN Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)(2×)5μL，ddH₂O 3.2μL，共10μL；实时荧光PCR反应程序如下：95℃下预变性3min，95℃变性5s，60℃退火30s，共45个循环；每个反应重复3次；引物扩增效率由cDNA浓度梯度稀释10倍后反应产生的标准曲线决定，扩增效率E＝(10^－1/s-1)×100％，其中s为曲线斜率。

本发明所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其中，步骤(5)中，候选内参基因稳定性采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4个程序软件对14个候选内参基因的表达水平进行测定，最后结合在线程序RefFinder结果综合筛选出最佳内参基因。

本发明与现有技术不同之处在于：本发明中，根据转录组数据选择了14个候选内参基因(EF1α、GAPDH、Actin1、Actin2、Actin3、Actin7、UBQ、PP2A、TUA、TUB1、TUB2、TUB3、TUB4、PHK)分别在不同梅花品种的叶片和花瓣中，‘美人’梅不同组织以及‘美人’梅不同开花时期进行表达水平测定，并结合geNorm、NormFinder与Bestkeeper和ΔCt 4个程序软件对14个候选内参基因的表达水平进行测定，最后结合在线程序RefFinder结果综合筛选出最佳内参基因并进行内参基因验证。

结果表明：梅花不同品种的叶片间的最佳内参基因为GAPDH和UBQ；梅花不同品种的花瓣间的最佳内参基因为GAPDH和Actin1；‘美人’梅不同组织中的最佳内参基因为Actin7和UBQ；‘美人’梅不同开花时期中的最佳内参基因为PP2A和Actin1。为了进一步验证所筛选内参基因的可靠性，本发明在梅花不同品种的叶片和花瓣中对COX10、ANR基因相对表达水平进行分析，‘美人’梅不同组织和不同开花时期中对CESE1、Expansin-A20基因相对表达水平进行分析，结果发现筛选出的最佳内参基因表达模式一致，结果准确。本发明可为今后梅花基因表达的研究提供参考依据。

下面结合附图对本发明的筛选方法和应用作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中梅花6个不同品种，其中：1：‘长艳宫粉’；2：‘北京玉蝶’；3：‘美人’梅；4：‘骨红朱砂’；5：‘淡丰后’；6：‘江梅垂枝’；

图2为本发明中‘美人’梅不同组织及开花时期，其中：A：1：一年生枝条；2：多年生枝条；3：幼叶；4：成熟叶；5：盛开期的花瓣；B：1：小蕾期；2：大蕾期；3：初开期；4：盛开期；

图3为本发明方法中候选内参基因琼脂糖电泳结果图；其中，1：EF1α；2：GAPDH；3:Actin1；4：Actin2；5：Actin3；6：Actin7；7：UBQ；8：PP2A；9：TUA；10：TUB1；11：TUB2：12：TUB3；13：TUB4；14：PHK；

图4为本发明方法中候选内参基因的qRT-PCR熔解曲线；

图5为本发明方法中候选内参基因Ct值分布图，其中：A：不同品种(叶)Ct值分布；A：不同品种(花)Ct值分布；C：‘美人’梅不同组织Ct值分布；D：‘美人’梅不同开花时期Ct值分布；

图6为本发明中梅花不同品种叶(A)和花(B)内参稳定性geNorm分析；

图7为本发明中‘美人’梅不同组织(A)和开花时期(B)内参稳定性geNorm分析图；

图8为本发明中原血红素IX法尼基转移酶基因COX10在叶(A)和花(B)中的表达模式分析图；

图9为本发明中花青素还原酶基因ANR在叶(A)和花(B)中的表达模式分析图；

图10为本发明中纤维素合成酶基因CESE1在‘美人’梅不同组织的表达验证分析图；

图11为本发明中扩展蛋白A20基因Expansin-A20在‘美人’梅不同开花时期的表达验证分析图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1实验材料

实验材料保存于浙江农林大学梅花种质资源圃。选取生长一致、无病虫害的梅花品种‘长艳宫粉’(P.mume‘Changyangongfen’)、‘北京玉蝶’(P.mume‘Beijing Yudie’)、‘美人’梅(P.mume‘Meiren’)、‘骨红朱砂’(P.mume‘Guhongzhusha’)、‘淡丰后’(P.mume‘Danfenghou’)、‘江梅垂枝’(P.mume‘Jiangmeicuizhi’)的叶片和花瓣(图1)；选取‘美人’梅一年生枝条、多年生枝条、幼叶、成熟叶、盛花期的花瓣(图2A)。同时采集‘美人’梅花发育四个不同时期的样品，包括小蕾期、大蕾期、初开期、盛开期(图2B)。每组样品3个生物学重复，所有样品收集后液氮速冻，放置于-80℃冰箱保存备用。

1.2实验方法

1.2.1总RNA提取和cDNA的合成

取样品约0.1g于液氮冷冻下快速研磨成粉末，之后按照RNAprep Pure PlantPlus Kit(天根，北京)试剂盒说明书步骤提取总RNA。利用质量浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的质量。以所提样品RNA为模板，按照ReverseTranscriptase M-MLV(Takara，大连)说明书合成cDNA，所得cDNA用ddH₂O以1：10稀释后于-20℃冰箱储存备用。

1.2.2候选内参基因的选择和引物设计

从梅花基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/13911)筛选出EF1α、GAPDH、Actin1、Actin2、Actin3、Actin7、UBQ、PP2A、TUA、TUB1、TUB2、TUB3、TUB4、PHK共14个候选内参基因序列，同时选取原血红素IX法尼基转移酶基因COX10、花青素还原酶基因ANS(anthocyanidin reductase)、维素合成酶基因CESE1(cellulose synthase-likeprotein E1)、扩展蛋白A20基因Expansin-A20基因来验证梅花不同品种、组织和不同开花时期内参的准确性(表1)。

利用Primer Premier 5软件设计qRT-PCR引物，主要参数设置如下：引物长度为17-30bp，产物长度为100-300bp，GC含量为45-60％，Tm值为58-62℃。引物设计完成之后，利用NCBI-blast(http://www.https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物特异性检测。引物由杭州有康生物技术有限公司合成(表1)。

表1候选内参基因引物信息

1.2.3 qRT-PCR分析

qRT-PCR采用TB GREEN^TMPremix Ex Taq^TMII(Takara，大连)试剂盒，并按照说明书进行操作。反应体系如下：cDNA模板1.0μL，上下游引物各0.4μL，TB GREEN Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)5μL，ddH₂O3.2μL，共10μL。实时荧光PCR反应程序如下：95℃下预变性3min，95℃变性5s，60℃退火30s，共45个循环。每个反应重复3次。引物扩增效率由cDNA浓度梯度稀释10倍后反应产生的标准曲线决定，扩增效率E＝(10^-1/s-1)×100％，其中s为曲线斜率。

1.2.4实验数据处理与分析

候选内参基因稳定性采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4种程序进行分析评价。geNorm程序作为一个可视化的Excel工具，通过计算每个内参基因稳定值M来筛选出稳定性较好的内参基因，默认稳定值M为1.5，小于默认值表示内参可用。geNorm程序根据变异V值与内参基因个数n的关系(即Vn/Vn+1比值)来确定最佳内参基因个数，当Vn/Vn+1<0.15时，最佳内参基因个数为n个，当Vn/Vn+1＞0.15时，则最佳内参基因个数为n+1。NormFinder是一个计算组内和组间变异的程序，将两种结果合并成每个候选内参基因的稳定值M，稳定值越低基因表达越稳定。BestKeeper软件是Michael等编写的针对内参基因和目标因表达量分析的程序，通过比较变异系数(CV)、标准偏差(SD)和相关系数(r)来对候选基因稳定性进行排序。相关系数越大，标准偏差和变异系数越小，内参基因稳定性越好。如果SD＞1，则该基因表达不稳定。ΔCt是根据基因表达的标准偏差评估内参稳定性的程序，标准偏差越小，其表达稳定性越好。RefFinder是一种综合统计程序，是综合分析不同软件得到的结果进行排名，已被广泛用于内参基因筛选的研究中。使用在线程序RefFinder(https://localhost/RefFinder-master/index.php)综合分析候选内参基因的稳定性，选出每组样品的最佳内参基因。

2结果与分析

2.1引物特异性与扩增效率分析

通过琼脂糖电泳和熔解曲线分析了引物的特异性，所有引物扩增片段与预期长度一致且为单一条带(图3)，每个基因的熔解曲线都呈单一峰状(图4)。采用标准曲线对各引物扩增效率进行分析，引物扩增效率介于91％-107％之间，线性相关系数R²＞0.98(表2)。由此可见，所有引物均具有良好的特异性和扩增效率，符合qRT-PCR的基本要求，可用于后续实验。

表2候选内参基因的扩增特性

2.2候选内参基因表达水平分析

将14个候选内参基因在梅花不同品种以及‘美人’梅不同组织和开花时期的Ct值进行汇总，分析它们在转录水平上的表达丰度的稳定性(图5)。在6个不同梅花品种中，叶的Ct值介于21-35之间，其中GAPDH转录水平最高(图5A)；花的Ct值介于16-32之间，大部分基因的Ct值相近(图5B)；在‘美人’梅不同组织中，Ct值介于19-34之间，基因最大Ct值与最小Ct值之间差异较大，其中最小的为EF1α(Ct＝19)，最大的为Actin3(Ct＝34)(图5C)；‘美人’梅不同开花时期的Ct值介于24-36之间，其中Actin7转录表达水平最高(图5D)。

2.3梅花不同品种内参稳定性分析

为了进一步分析梅花不同品种中内参的稳定性，我们使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4个软件对候选内参基因的表达水平进行分析。

在梅花不同品种的叶中，geNorm分析显示候选内参GAPDH与UBQ表达稳定性最高(M＝0.2469)，TUB1稳定性最低(M＝2.0)(图6A)；NormFinder分析显示GAPDH和TUB2表达稳定性最高，M值分别为0.374和0.439(表3)；ΔCt与geNorm分析一致，GAPDH和UBQ排名靠前，M值分别为0.78和0.85。另外，BestKeeper软件与geNorm、NormFinder和ΔCt软件分析出现较大差异，结果显示Actin2和Actin3表达稳定性最高，M值分别为0.121和0.249(表3)。最后使用RefFinder程序综合4种软件分析结果可知，GAPDH和UBQ为梅花不同品种叶中排名最高，表达最为稳定的内参(表3)。

在梅花不同品种的花部组织中，geNorm分析显示候选内参Actin7和PP2A表达稳定性最高(M＝0.2521)，Actin3表达稳定性最低(M＝1.92)(图6B)；NormFinder分析结果显示Actin1和GAPDH表达稳定性最高，M值分别为0.305和0.485；ΔCt分析中GAPDH和Actin1也是表达最为稳定的基因，M值为0.54和0.63(表3)。BestKeeper分析显示TUB2和PHK为表达最为稳定的基因，与geNorm、Normfider和ΔCt的分析结果不一致。使用RefFinder综合评价结果表明：显示GAPDH和Actin1在梅花不同品种花中表达最为稳定的内参(表3)。

表3梅花不同品种候选内参基因稳定性排序

2.4‘美人’梅不同组织和开花时期内参稳定性分析

在‘美人’梅不同组织中，geNorm分析结果显示Actin7与UBQ的稳定性最高(M＝0.412)(图7A)；NormFinder分析得到Actin7(M＝0.135)和Actin3(M＝0.391)在不同组织中的表达最为稳定，BestKeeper与geNorm软件分析结果分析一致，Actin7(M＝0.173)和UBQ(M＝0.192)为最稳定内参；而ΔCt分析与geNorm、BestKeeper和NormFinder分析结果不一致，结果显示EF1α与TUA为最稳定的内参。使用RefFinder软件综合上述软件分析结果，Actin7和UBQ综合排名分别为第1和第2，为最稳定内参。

在‘美人’梅不同开花过程中，geNorm分析得到EF1α与TUA的稳定性最高(M＝0.255)(图7B)，NormFinder分析显示Actin1(M＝0.389)和PP2A(M＝0.588)的表达最为稳定；BestKeeper软件分析显示TUB3和TUB2表达最为稳定的内参，M值分别为0.218和0.251，另外，ΔCt与分析NormFinde分析结果相同，Actin1(M＝1.16)和PP2A(M＝1.03)的表达最为稳定。使用RefFinder软件综合分析可知，PP2A和Actin1为‘美人’梅不同开花时期最稳定的内参(表4)。

表4‘美人’梅不同组织及开花时期候选内参稳定性排序

2.5内参基因稳定性验证

为了进一步验证最佳内参基因的稳定性，在不同品种叶和花中，我们选择叶绿素合成通路中的原血红素IX法尼基转移酶COX10(protoheme IX farnesyltransferase，LOC103319063)和花青素合成通路中的花色素还原酶基因ANR(anthocyanidin reductase，LOC103324591)进行验证，结果如图8和9所示。在叶中，以稳定性最好的GAPDH和UBQ作为内参基因时，目的基因COX10的表达模式一致，均在‘长艳宫粉’中表达量最高，而以稳定性最差的TUB1作为内参时表达模式有别于二者；在花中，以稳定性最好的GAPDH和Actin1作为内参基因时，目的基因COX10在梅花品种叶和花中的表达丰度相近，而以稳定性最差Actin3作为内参时，各品种组织间的表达差异较大(图8)。在叶中，以稳定性最好的GAPDH和UBQ作为内参基因时，花色素还原酶基因ANR的表达模式几乎一致，而以稳定性最差的TUB1作为内参时表达模式差异较大；在花中，以稳定性最好的GAPDH和Actin1作为内参基因时，花色素还原酶基因ANR均在‘骨红朱砂’中表达远高于其他品种，而以稳定性最差Actin3作为内参时却是‘长艳宫粉’最高，表达模式不一致(图9)。

在‘美人’梅不同组织和开花时期分别选用纤维素酶合成基因CSE1(LOC103318715)和扩展蛋白基因expansin-A20(LOC103334717)进行验证。如图10和图11所示，在不同组织中，以稳定性最好的Actin7和UBQ作为内参时，目的基因CSE1表达模式一致，而以稳定性最差的GAPDH作为内参时表达模式不同。在不同开花时期中，以稳定性最好的PP2A和Actin1作为内参时，目的基因Expansin-A20表达模式一致，均在盛开期表达最高，而以稳定性最差的GAPDH作为内参时却是大蕾期表达最高。

上述结果说明：5个软件对内参表达稳定性的排序结果可靠，GAPDH和UBQ、GAPDH和Actin1、Actin7和UBQ、PP2A和Actin1分别为梅花不同品种(叶和花)、‘美人’梅不同组织和开花时期的最佳内参基因。

3、讨论

qRT-PCR是基因表达分析中最常见的方法，可以快速方便地分析植物不同组织、生长发育过程中的遗传表达调控模式。梅花是著名的观赏植物，在园林绿化中应用普遍，随着对梅花生长发育过程以及花香、花色调控研究的不断深入，梅花不同品种、组织和不同开花时期的稳定的内参基因显得至关重要。因此，我们对筛选的14个候选内参基因分别在不同梅花品种、‘美人’梅不同组织和不同开花时期进行稳定性检测和评价。

理想的内参基因在不同组织、不同发育阶段、不同生长条件下均能稳定表达。由于不同的统计软件(或程序)算法不一样，致使相同的数据可能有不同的结果，因此，需要引入第三个甚至多个程序去评判以获得更可靠的结果。本研究采用4个程序(geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt)对不同梅花品种的叶和花，以及‘美人’梅不同组织和开花时期的最佳内参进行筛选和评估。最后通过RefFinder程序综合不同软件结果发现，候选内参基因GAPDH和UBQ在梅花不同品种叶中排名为第1和第2，表达稳定性最高；在梅花不同品种的花中，GAPDH和Actin1排名为第1和第2，表达最为稳定；而其它基因在梅花叶和花中的表达模式不一致。对于不同组织的内参基因的分析中，不同物种中不尽相同，例如，在猕猴桃(Actinidia chinensis)、黄连木(Pistacia chinensis)和西芹(Apium graveolens)中都有报道。另外，‘美人’梅是重要的观赏植物，稳定内参的筛选对‘美人’梅的观赏性状以及生长发育的研究极为重要。在‘美人’梅不同组织中，Actin7和UBQ为最佳内参基因；PP2A和Actin1为‘美人梅’不同开花时期的最佳内参基因。本发明证明了不同实验条件下内参基因的选择是不一致的，要根据具体条件选择最佳的内参基因。

为了验证所选内参的可靠性，在不同品种、组织和开花时期中，我们选用表达最稳定的两个内参和最不稳定的内参分别对COX10、ANS、CESE1、Expansin-A20基因的表达模式进行检测，发现以最稳定两个基因作为内参基因时，目的基因的表达丰度和表达模式一致。然而当使用最不稳定的基因作为内参时，目的基因的表达丰度和表达模式却大相径庭。这表明在实验中选择合适的内参基因十分的重要，适合的内参基因对于研究目的基因表达具有至关重要的作用。

4、结论

通过geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt和RefFinder对梅花14个候选内参基因表达稳定性综合评价表明：梅花不同品种的叶片间的最佳内参基因为GAPDH和UBQ；梅花不同品种的花瓣间的最佳内参基因为GAPDH和Actin1；在‘美人梅’同组织中Actin7和UBQ为最佳内参基因；在‘美人梅’不同开花时期中PP2A和Actin1为最佳内参基因。为了进一步验证所筛选内参基因的可靠性，在梅花不同品种、‘美人’梅不同组织和不同开花时期中对COX10和ANR、CESE1、Expansin-A20基因相对表达水平进行分析，结果发现筛选出的最佳内参基因表达模式一致，结果准确。本发明结果可为后续梅花基因表达研究提供较为全面的参考依据。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法和应用

<130> 2022-1

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1573

<212> DNA

<213> 梅花(Prunus mume)

<400> 1

ccccacccgc gagcaggcgg ttcatagtaa atctgaggct aatacaaagc cctaaacata 60

atcagcggct ccggattgac tttcttttta cacaagaaaa accgcaacca cccattggtt 120

ttacgattct agacattttt ctctatatat aaacacctcc atcactctct ctctcacact 180

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<210> 2

<211> 1810

<212> DNA

<213> 梅花(Prunus mume)

<400> 2

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cctcgctgaa actctgtgcg cgataccgtg agagttgctg gcattcgtca ccggagaaga 120

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aaaacattgt agatttgtat gtcatacttc tccgattttc aagtttggtg tctgaaacta 300

taccgtgtca tcgagactac cagacatttc ctcctaaaga gagaagtatg tataggaaga 360

aactcttaaa tgtactagat gagcttgaat ctttaaagcc agaagcccaa cgcctagtca 420

acaaacttaa cgaggcccaa gcagtttctc aactacctca acttgaatgc ctagaaggca 480

cttcatatgg tttgggaaca ccttctttag aatggcctcc tgtgaacaat aattcattga 540

gcataaacat taggcagcct tctagcttga catctcagtc ttcatggaag tataataatg 600

attattcacg ggtatcaaca aatacttcac aaattgacaa gcagttccaa aagctatctc 660

ttaatatacc tcttccgaat aaagagactt tgtctagaca ctcatttttg ggtccaaatg 720

gtcttcaggg ccagtggcta ggacccactg caaaggttaa ggttcaatat ccaagcagta 780

ccgacctaat ccctactgaa aattcaggcc tgaatcaggt tgtacaaaat gatattgtgg 840

ctgtaaaaga tggtgatcaa ggaggaatta aatctacaat ggagtcggtg ctctccttgg 900

atgatggtgt atggccacgc cctgctcagg aatttggtcc ttcattgatt aatgaaataa 960

gggaagatcc tttcgaattg gtcatcaatc agccttctcc tcctcctgta cttgctcgag 1020

tgcagccaga atatactcca atttctccat caaaagtggc agatccaaga ccaggacctg 1080

ccaaaccttc tgtggatggg atgccaagtt ctaattcata tcaacattta cacgttccag 1140

taaaattgat ggatgatttc ttgagattgg ctaggacgaa tacagaaaaa aatttagaga 1200

cgtgcggtat tcttgctggt tcattgaaaa ataaggtttt ccatatcacc acgctaatag 1260

tcccaaagca agagtcaacc tctgattcgt gtcaaacatt gaatgaggaa gaagtatttg 1320

aggttcaaga cagattatct cttttttctc ttgggtggat tcatacacac ccatcgcaga 1380

cctgtttcat gtcatcagtt gatctgcata ctcattactc atatcagatt atgttaccag 1440

aagcaatagc gatcgttatg gctccaacag atacatccag tcctcacggc atattccatc 1500

tatcggaccc aggtggtgta tcagtaattc gaaattgtga ccagcgtggg tttcatcccc 1560

atgaagagcc tttggatgga accccaattt acgagcattg ttctcatgtc tttataaact 1620

ccaacttaag gatcgatgtt gtcgatctgc ggtaagaatt ttggattttg tccccttaag 1680

tgacgcccag ttgagattaa ctttggtaaa tatgtaaaac acaacagtaa ttatctcttc 1740

atccaacacc gatattgtaa attcaagtgg tctctatctg atggaaatat aggcatactc 1800

attttagtca 1810

<210> 3

<211> 1447

<212> DNA

<213> 梅花(Prunus mume)

<400> 3

aaaaaaaaag aagaaaaaga aaataaaagg agagagcaga tatttgaatt ttctttaatc 60

ttgtgaaatt tgaaaagaca gcccccgctt gtggtttagt gctgtgtgta gaacatattt 120

actcctcaaa tgctcagctg aatcctttgc ccattgaaca ttgcagaaac tgaaatctag 180

ggttagggtt ttgtggtaaa gagcaagatg gaggctgcgg tggtcgaccc cggctcgaag 240

ctcctcaaag caggacctgc tattcccgat caagctcctt ccatgataat tcctaaccaa 300

atgaagcgca ttcttgatga tggatcaatt aatgataatt catcatctga agataccatt 360

gttgatccag ttgtgcgagg tcttattaga gattgggatg ccatggaaga tctgttgcat 420

catgttctat atactggcct tggatgggaa atgggcaacg aagggcagat attatttact 480

gatccactat gtacccccaa ggctgtcaga gagcagttgg tgcaactgat gtttgaaacg 540

tttaacattt cgggcttcta tgcatcagag caagcagtat tgtcacttta cgctgtaggg 600

cgtatctccg gatgcactgt tgatattggc catggaaaga tagatattgc accagtaatt 660

gaaggtgctg ttcagcacat tgcctcaaga aggtttgaaa ttggaggtat ggatttgacg 720

aagttacttg ctgaagagct tgggaaatcc aatcctttgg tgaatatcaa gatgtctgat 780

attgagaaaa taaaagagca atattcatgt tgtgctgaag atgaacttgc ttatgagaag 840

accaaaaatg catgccagac ggagcaacat actcttcctg atggacaggt cattacgatt 900

ggaagagaaa aatatactgt tggtgaggct ttattccaac catctatatt ggggttagag 960

gctcatggga ttgttgagca gcttgttcgt tgtatttcaa cagtgtcgtc tgataatcac 1020

cgtcaattgc tggaaaatac tgtactctgt ggtggcactg cttctatgac tggttttgaa 1080

gaaaggtttc agaaagaagc tggtctatgc tcatctgctg tccgtcctgc tttaattaag 1140

cctccagaat atatgccgga gaatttgtca atgtattcag catgggtggg aggtgccata 1200

ctagccaaag ttgtgttccc acaaaatcag catgtaacca aagctgacta tgatgaaact 1260

ggaccttccg ttgttcatcg gaaatgcttc tgaggattct ttgtcgttat gagtgagtcc 1320

ttggaagcct agtttagttt gactaatata cttgtattat aatgcatgat aatggtagcg 1380

gaaaattatt ggctaggatt ctaatttcag aattatagtg ctttggtggc tccgtcaatt 1440

agtttca 1447

<210> 4

<211> 1704

<212> DNA

<213> 梅花(Prunus mume)

<400> 4

gaaaaagaga acaaaaaaaa actaatcatg taacgaattc cattgaacaa aaacatcgca 60

aaattctaat ctgctttttt catttgcatc tgggtttcat ttcatttcgc tgcctgcctg 120

cctgcctgcc tctccgcatg tcatttccct ccccgcatgt catttccctc gtcttttctt 180

acattcacat aaatacaatt tcaatttaat ttcccttttt tctccttttt acttttaaaa 240

caaataaaag aacacagagc gaggaatgat agaagaaagg tcgaaactcg accgatctcc 300

aaaacgactc gtttcgctcc gagcgtcgcg atccggaacc ccgaccctag cgccgcttca 360

caaattgctc actgcgtcga gatcgctccg ccggcgttga gttcgcgcgc atcggattgg 420

atctgagaaa tcggcgatcg gatctgaggg cggtggtggt ggaacgatgc cggctcacgc 480

ggatctggac cgtcagatcg agcatctgat ggagtgcaag acgttgccgg aggcagaggt 540

gaagacgctg tgcgagcaag ccagggcgat cctcgtggag gagtggaacg tacagccggt 600

gaagtgcccc gttacggtgt gtggagatat tcacggccag ttctacgacc tcattgagct 660

ctttcggata ggaggcaacg cccccgacac taattacctt tttatgggtg attatgtaga 720

tcgtgggtac tattctgtgg agactgtcac acttctggtg gccctgaaag tccgttatag 780

agatagaatt acaattctca gaggaaatca cgagagtcgg caaattaccc aagtgtatgg 840

tttttatgat gagtgcttga gaaaatatgg gaatgccaat gtctggaagt tctttaccga 900

tttatttgat tatcttcccc tcacagccct tattgagagt cagattttct gtttgcatgg 960

gggcctttcc ccatctttgg acacattgga caatatccga gccttggatc gtatacagga 1020

ggttccacac gaaggaccaa tgtgcgatct cttgtggtct gatccagatg accgctgtgg 1080

atggggaata tctccacgtg gtgctggtta tacatttgga caggatatag ctgctcagtt 1140

caaccatacc aatggactca gtctcatttc aagagctcat cagcttgtaa tggaaggata 1200

caattggtgt caggacaaga atgtggtgac tgtttttagc gctccaaact attgttatag 1260

gtgtgggaat atggctgcaa tattggaaat tggggagaac atggaccaga atttcctgca 1320

gtttgaccca gcccctcgtc aaattgagcc cgacaacaca cgcaagactc cagattattt 1380

tttgtaattt cagcatctta cagggggctg tttgtaatcc atgttttctg ccatgttact 1440

gtagatgtgt ctttaagggg agttgagtta cgttgtttaa gttgagggtt atggtcaaca 1500

tgattctttg tttggagttt ttgtccctgc tgctgctgct ttgttgaatt tctgaagaaa 1560

ctcgttagga gaactgacat tagtcgccaa tggcctgtgg ctcttgtctt tgtatatttt 1620

tctgagagga aacgtcaata acatggtata tctcgttctg taatttttcc aacttcaaca 1680

tagaaaaagc tgatttttca aaca 1704

<210> 5

<211> 1793

<212> DNA

<213> 梅花(Prunus mume)

<400> 5

tctcattgca ggctcaccct aattctgctc tgttttcatt tcgaccattt cttgtcagcc 60

ttgaagaaga gagagacaca gccaagcctt cgtctgcaga ggttggcttg gttattcttc 120

atcgtcgtct tcgattgtct tcgtcttcaa ggtttgtaaa agatggctga tgctgaggac 180

attcaacccc ttgtctgtga caatggaact ggaatggtga aggctggatt tgctggtgac 240

gatgcaccca gggctgtgtt tccttctatt gttggtcgac cacgacacac tggtgttatg 300

gttggtatgg gtcagaagga tgcctatgta ggtgatgaag cccaatctaa gagaggtatc 360

cttaccttga aatatcccat tgaacatggt atagtaagca actgggatga catggagaag 420

atctggcatc acactttcta caatgagctt cgtgttgctc ctgaagagca cccagttctt 480

cttactgagg ctcctctcaa ccctaaggct aacagagaaa agatgacgca gatcatgttt 540

gagaccttca atgtgcctgc catgtatgtt gccatccagg ccgttctctc tctgtatgcc 600

agtggtcgta caactggtat tgtgctggac tctggtgatg gtgtgagtca cactgtgcca 660

atctatgaag gttatgccct ccctcatgcc attcttcgtc tggaccttgc tggtcgtgac 720

cttacagatg ccttgatgaa gattctcacc gaaagagggt acatgttcac caccactgct 780

gagcgggaaa ttgtccgtga tatgaaggag aagctcgcat atgttgccct ggactatgag 840

caagaacttg agactgctaa gagcagctct tcggtagaga agaactatga gcttcccgat 900

ggccaagtaa tcacaattgg agctgagaga ttccggtgcc cagaagttct cttccaacca 960

tcactcattg gaatggaagc tgctggaatt catgagacta cctacaactc tatcatgaag 1020

tgtgatgtgg atattaggaa agacctatat ggaaacattg tgctcagtgg tgggtcaact 1080

atgttccccg gtattgcaga caggatgagc aaggagatta ctgctcttgc tcctagcagc 1140

atgaagatta aggttgtggc tccaccagag agaaagtaca gtgtctggat tggagggtcc 1200

atccttgcat ctctcagtac cttccagcag atgtggattt ccaagggtga gtacgatgag 1260

tctggtccat ccattgtcca caggaagtgc ttctgagttc tacaaatgtt ttgatggtga 1320

gttatttttc aatttagttg gattttcgtg tcgtgtcatg tgaagtcagt ttggttggca 1380

acgatatgcg ttgaggtggg gtcagtgaag gacggagtag attctgatgt tgatgtatca 1440

tagcttttca tccatgtgag aggctttgct tgcaatggca atggtgttct gtatatgtgg 1500

tgggcagaaa atcagtcgaa atccatcctc gccttaccta atctttggtt caaccatctc 1560

tttcagtagg atgtttgtag caggagagtg attgggatgc tttttcaatt ttttttttcc 1620

tttttccttt ttccttttta tttccctttt gttctatatt tgacggtctt ttttcctgag 1680

aacattaata ttaatagctt tattgtatct gaaattttat ggtagtgtca gtttgtggtc 1740

ataaactgct atggaaatta tatttaaata ctggcttgaa agcttgagag gaa 1793

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aaaaccgcaa ccacccat 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

accaaacgac cgattcttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cgtgaaaacc ctaacgggta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

agggtcgatt ccttctggat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

tgaggctcct ctcaacccta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

cagttgtacg accactggca 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

agtcggcaaa ttacccaagt g 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gcccccatgc aaacagaaaa t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ctgaacccaa aggctaatcg t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cataagggca tcggtgagg 19

Claims (7)

1.GAPDH、UBQ、Actin7、PP2A和Actin1基因作为内参基因在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用；

在梅花不同品种的叶片间分析时，采用GAPDH和UBQ基因作为内参基因；

在梅花不同品种的花瓣间分析时，采用GAPDH和Actin1基因作为内参基因；

在‘美人’梅不同组织中分析时，采用Actin7和UBQ基因作为内参基因；

在‘美人’梅不同开花时期中分析时，采用PP2A和Actin1基因作为内参基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所示，所述UBQ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述Actin7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述Actin1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述的内参基因的专用引物，其特征在于：所述GAPDH基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述UBQ基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述Actin7基因的引物序列如序列表中SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示；所述PP2A基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；所述Actin1基因的引物序列如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。

4.权利要求3所述的专用引物在梅花实时荧光定量PCR分析中的应用。

5.一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)材料准备：选取生长一致、无病虫害的梅花品种‘长艳宫粉’、‘北京玉蝶’、‘美人’梅、‘骨红朱砂’、‘淡丰后’、‘江梅垂枝’的叶片；选取‘美人’梅一年生枝条、多年生枝条、幼叶、成熟叶、盛花期的花瓣，同时采集‘美人’梅花发育四个不同时期的样品，包括小蕾期、大蕾期、初开期、盛开期，每组样品3个生物学重复，所有样品收集后液氮速冻，放置于－80℃冰箱保存备用；

(2)总RNA提取和cDNA的合成；

(3)候选内参基因的选择和引物设计，其中，候选内参基因为从梅花基因组数据库中筛选出的EF1α、GAPDH、Actin1、Actin2、Actin3、Actin7、UBQ、PP2A、TUA、TUB1、TUB2、TUB3、TUB4、PHK共14个候选内参基因序列；

(4)qRT-PCR分析；

(5)实验数据处理与分析；

(6)内参基因验证：在梅花不同品种的叶片和花瓣中，选择原血红素IX法尼基转移酶基因COX10和花青素还原酶基因ANR作为目的基因，在‘美人’梅不同组织和开花时期分别选用纤维素合成酶基因CESE1和扩展蛋白A20基因Expansin-A20作为目的基因，选择稳定性好的两个内参基因和稳定性最差的一个基因，观察目的基因的表达模式，对内参表达稳定性的排序结果的可靠性进行验证；如稳定性好的内参基因与目的基因表达模式一致，稳定性差的基因与目的基因表达模式不一致，则说明内参表达稳定性的排序结果可靠。

6.根据权利要求5所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中，反应体系如下：cDNA模板1.0μL，上下游引物各0.4μL，TB GREEN Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)5μL，ddH₂O 3.2μL，共10μL；实时荧光PCR反应程序如下：95℃下预变性3min，95℃变性5s，60℃退火30s，共45个循环；每个反应重复3次；引物扩增效率由cDNA浓度梯度稀释10倍后反应产生的标准曲线决定，扩增效率E＝(10^－1/s-1)×100％，其中s为曲线斜率。

7.根据权利要求6所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤(5)中，候选内参基因稳定性采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4个程序软件对14个候选内参基因的表达水平进行测定，最后结合在线程序RefFinder结果综合筛选出最佳内参基因。

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