CN107345247A - 一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了Pm011905基因(SEQ ID NO.1)在监测梅花休眠状态方面的应用以及一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法。所述方法包括如下步骤：(1)分两次采集待测梅花的花芽，分别提取所述花芽的RNA并反转录成cDNA，以所述cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2～3所示的引物对Pm011905基因进行荧光定量PCR；(2)比较两次采集的花芽的Pm011905基因的表达量，判断梅花花芽处于何种休眠阶段。本发明首次发现了可通过梅花花芽中Pm011905基因的表达量的变化，监测或判断梅花花芽的休眠状态。提供了一种简单方便、快速准确，能够在分子层面检测梅花花芽休眠状态的方法。

Description

一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种分子标记检测梅花花芽休眠状态的方法。

背景技术

休眠是一种有益的生物学特性，是高等植物经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性。花芽休眠的诱导、维持、解除是一个复杂的连续的生物学过程，是植物内部调控和外界环境因子相互作用的结果。根据休眠的诱因，Lang(1987)将含有分生组织的植物结构可见生长的暂时停止称为休眠，并将其分为类休眠(para-dormancy)、内休眠(endo-dormancy)和生态休眠(eco-dormancy)三大类，并将休眠的整个过程分为五个阶段：类休眠、类休眠-内休眠、内休眠、内休眠-生态休眠和生态休眠。这种对休眠的定义及分类已被人们广为接受并被广泛应用。类休眠是由植物休眠结构以外的相邻器官所控制的休眠，即使在有利的环境条件下，休眠结构仍然保持休眠，只有除去限制源，休眠结构才能迅速恢复生长。内休眠是由植物休眠结构内部的生理因素所控制的休眠，只有经过一定时期的低温或光周期后才能解除休眠，重新开始生长。生态休眠是由外界不利环境因素所引起的休眠，只要环境条件适宜植物生长发育时，休眠器官即恢复生长。

休眠发展进程的检测不仅具有重大的理论意义还具有重要的实践意义，因为在生产中无论是避免休眠还是在休眠后期的低温替代都是只有芽子处在这些方法能够干预的合适阶段才有效。目前广泛应用的是在人工气候室或光照培养箱清水插枝催芽法判定芽的休眠进程，即从夏季每隔一定时间间隔采取枝条，然后插入盛水(约2cm深)的玻璃杯中(在自然落叶前，将枝条摘除叶片，剪除顶部幼梢)，并放置于人工气候室或光照培养箱中进行培养，用第一颗花芽开放所经历的时间或芽的平均萌芽时间或萌芽级数表示休眠状态。在设施生产中，花芽自然休眠的解除至关重要，成为限制其生产的关键因素。有效解除休眠方式的建立往往受限于对休眠发生发展的认识。近年来，利用分析生物学手段在生理生化、细胞信号转导、分子调控等不同水平的研究，对其休眠机理进行了探索，初步揭示了“芽休眠”的奥秘。

梅花(PrunusmumeSieb.et Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)，是中国的传统名花，在中国已有3000年的栽培历史。梅花早春开放，是李属中开花最早的种。就梅花而言，休眠的生理机制研究的较为深入，但在分子水平上，芽休眠尤其花芽休眠解除过程仍存在许多不明确的机制，如休眠解除过程中起调控作用的基因的确定、低温解除休眠的作用机制、光周期如何调控等。因此，亟需探索一种简单方便、快速准确，能够在分子层面检测梅花花芽休眠状态的方法，为进一步丰富梅花花芽休眠分子机制以及栽培生产提供理论支持。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了Pm011905基因在监测梅花休眠状态方面的应用，所述Pm011905基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地说，通过梅花花芽中Pm011905基因的表达量的变化，判断梅花花芽的休眠状态。

第二方面，本发明提供了一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法，包括如下步骤：

(1)分两次采集待测梅花的花芽，分别提取所述花芽的RNA并反转录成cDNA，以所述cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2～3所示的引物对Pm011905基因进行荧光定量PCR；

(2)比较两次采集的花芽的Pm011905基因的表达量：

当连续两次采样该基因的表达量很低，且后一次表达量比前一次表达量的增长量小于等于10％，则判断花芽处于类休眠阶段；

当连续两次采样该基因的表达量比较高，且后一次表达量比前一次表达量的增长量大于10％、或减少量大于10％，则花芽处于生理休眠阶段；

当连续两次采样该基因的表达量很低，且后一次表达量比前一次表达量的减少量小于等于10％，则花芽处于生态休眠阶段。

其中，两次采集时间相隔7天。

作为优选，所述荧光定量PCR的程序为：94℃3分钟；94℃10秒，60℃20秒，40个循环，在60℃采集信号。进一步地，以PP2A基因作为内参基因，进行荧光定量PCR。其正向引物为ATATAGCTGCTCAGTTCAACC，反向引物为AAAAACAGTCACCACATTCTT。

进一步地，所述类休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率为0，所述生理休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率达到30～50％，所述生态休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率达到100％(同Lang 1987年提出的类休眠、生理休眠和生态休眠)。

所述人工条件培养具体为：将当年生枝条底部插入水中，并将其放入人工气候室中进行培养，人工条件设为白天25℃16小时，夜晚为16℃8小时，湿度为70％。每隔2天将其底部减掉，每日观察花芽萌动情况，培养10天后，分别记录每组花芽萌发个数并计算萌发率。

本发明的有益效果在于：

本发明首次发现了可通过梅花花芽中Pm011905基因的表达量的变化，监测或判断梅花花芽的休眠状态。提供了一种简单方便、快速准确，能够在分子层面检测梅花花芽休眠状态的方法，为进一步丰富梅花花芽休眠分子机制以及栽培生产提供理论支持。

附图说明

图1为β-1,3-葡聚糖苷酶基因MEGA聚类图。

图2为不同休眠时期转录组的表达量。

图3为不同休眠时期Pm011905表达量。

图4为不同萌发率所对应的Pm011905基因表达量图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

材料：自10月15日开始，每隔7天采集鹫峰“绿萼”品种当年生梅花枝条，每次10根枝条，大概100颗花芽，并将其随机分为3组，每组分别统计枝条上花芽个数。

人工条件培养：将当年生纸条底部插入水中，并将其放入人工气候室中进行培养，人工条件设为白天25℃16小时，夜晚为16℃8小时，湿度为70％。每隔2天将其底部减掉，每日观察花芽萌动情况，培养10天后，分别记录每组花芽萌发个数和萌发率。

萌芽率统计：根据萌发率及萌发所需要的时间，确定花芽所处的休眠状态。若萌发率为0，此时花芽处于类休眠阶段；若萌发率达到30-50％时，此时处于生理休眠阶段；若萌发率为100％时，花芽处于生态休眠阶段。

本发明利用9条拟南芥和9条杨树已经验证过的GH17家族成员做目标序列，分别对桃和梅花做本地Blastp,HMM，MEME等进行同源比对，分别获得14和11条同源序列：

1、9条拟南芥GH17家族序列号：

AT2G27500、AT5G42100、AT1G32860、AT3G13560、AT3G07320、AT4G16260、AT3G57270、AT3G57240、AT3G57260。

2、9条杨树GH17家族序列号：

GH17_6、GH17_33、GH17_39、GH17_44、GH17_61、GH17_65、GH17_79、GH17_101、GH17_102。

3、14条桃GH17家族序列号：

Prupe.6G130300.1、Prupe.5G132700.2、Prupe.4G081200.1、Prupe.3G016900.1、Prupe.3G210700.1、Prupe.1G168300.1、Prupe.8G194400.1、Prupe.7G051800.1、Prupe.1G121800.1、Prupe.7G052000.1、Prupe.7G051700.1、Prupe.7G051600.1、Prupe.7G051700.1、Prupe.7G051800.1。

4、11条梅花GH17家族序列号：

Pm011905、Pm012166、Pm001330、Pm025781、Pm027057、Pm025777、Pm009499、Pm027288、Pm025774、Pm025782、Pm020865。

结合MEGA聚类(图1)和在不同组织中的mRNA表达情况(图2)分别对Pm011905，Pm012166，Pm001330，Pm027057，Pm027288，Pm025782做RT-qPCR定量分析，最终Pm011905转录组及RT-qPCR定量均符合正常生理特征(图3)，因此可以为候选基因。利用Primer5软件，设计qPCR定量引物，最终通过筛选，所得正向引物为TCACGTTCCCGTTCTTTCTC，反向引物为CGGCCGTAGTTGATTCCTATT。

样本采集及qPCR定量分析：分别采集每个有代表性时期的花芽，放入-80℃中进行保存。利用艾德莱RNA提取试剂盒，按照提取说明，分别提取RNA，并将2ng RNA其反转录成cDNA，利用Jena荧光定量PCR仪器，对不同时期的花芽进行定量分析。所用内参为PP2A，其正向引物为ATATAGCTGCTCAGTTCAACC，反向引物为AAAAACAGTCACCACATTCTT，所用Pm011905正向引物为TCACGTTCCCGTTCTTTCTC，反向引物为CGGCCGTAGTTGATTCCTATT。其RT-qPCR定量所用的程序为94℃3分钟；94℃10秒，60℃20秒，40个循环，在60℃采集信号。

结果统计：其定量结果是在类休眠阶段，该基因表达量非常低，随着冷积温的逐渐增加，该基因的表达量逐渐增加，当生理休眠完全解除之后，即人工条件下萌芽率达到100％时，其处在生态休眠阶段，此时该基因的表达量迅速下降(图4)。

实施例2

分别在11月1号、8号采集花芽样本，对其进行RNA提取、cDNA反转录、和qPCR定量分析，发现1号和8号的样本中Pm011905基因的表达量都很低，而且8号的表达量比1号的表达量仅仅高2％(小于10％)，就说明1号、8号的花芽处在类休眠阶段。为了验证次结果，分别将1号、8号的枝条进行水培，发现其萌发率仅仅为0％，也符合Lang提出的类休眠的定义。

分别在12月10号、18号采集花芽样本，对其进行RNA提取、cDNA反转录、和qPCR定量分析，发现10号和18号Pm011905基因的表达量都很高，而且18好的表达量比10号的表达量高50％(大于10％)，就说明10号、18号的花芽处在生理休眠阶段。为了验证次结果，分别将10号、18号的枝条进行水培，发现其萌发率为40％和50％，也符合Lang提出的生理休眠的定义。

分别在1月21号、28号采集花芽样本，对其进行RNA提取、cDNA反转录、和qPCR定量分析，发现21号和28号Pm011905基因的表达量都很低，而且28好的表达量比1号的表达量仅仅低2％(小于10％)，就说明21号、28号的花芽处在生态休眠阶段。为了验证次结果，分别将21号、28号的枝条进行水培，发现其萌发率为90％和100％，这也符合Lang提出的生态休眠的定义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法

<130> KHP171113964.3

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> Pm011905

<400> 1

atggccacct tcacgttccc gttctttctc tcactcctcc tcctcccgct cttctcactc 60

ttgacttttg cagctgaaaa cacaacaggt acaataggaa tcaactacgg ccgaatagcc 120

aacaatttac ctacaccgga aaaagtagtg gcgctcctca agtcccaagg tatcaacaaa 180

gtcaagctct acgacactga cgccgccgtc ctcaccgccc ttgccaactc cggcataaac 240

gtcgtcgtcg cgctccccaa cgagctcctc tcctccgccg ccaacgaccc ctccttcgcc 300

gacaaatggg tccaagccaa catctcccaa taccacccgc agacccaaat agaagccatc 360

gccgtcggca acgaagtctt cgccgaccca aacaacacca ccaaattcct cgtccctgcc 420

attaacaacc tccaatcagc gctcgtcaag cacaatctaa gctcctccat caagctctct 480

tccccaattg ccctcagcgc gctccagaat tcgtaccctc cttcgtccgg atccttcaaa 540

ccggatctaa tcgaacccgc aattaaacct ttgttggact ttttaagcaa aacgtcgtcg 600

tatttgatga tcaatgcgta tccctttttc gcgtacgagg ccaacgctga cgagatctct 660

ctagactacg ccttgtttcg gaccaaccag ggtaacgtgg attcgggtaa cgggttgcgt 720

tataatagtt tgatggaggc ccaactcgac gccgttttcg ctgccatgtc agctctcgga 780

tacgatgacg ttaagttggt ggtgacggag accggttggc cttctaacgg cgacgagaac 840

gagattggct cggggaaagc caacgccgcg gcgtataacg gaaacttggt gaaaagagtt 900

ttgacaggga gtgggacccc cttgaagccc aaggacccac tcaacgtgta tttatttgct 960

ctgtttaatg agaaccagaa gcccgggccc acatcggaga ggaattacgg gctgttttat 1020

ccggatgaag ggaaggtgta cgacataccc cttactctcg cgggcctgag tggggcccag 1080

tcaaatccgg tcaacgagag caaggcccag gtaccgacga cggcgccgtc tagtgggaac 1140

acgtggtgcg tggcgaatgc gaatgcaggg gaggagaagc ttcaggctgc actggattac 1200

gcatgcggag agggcggggc tgattgccgt tcgattcagg aaggctccac gtgtttcaat 1260

ccaaatacgc ttgaggcgca cgcttcgtac gcctttaata gttactatca gaagaaggca 1320

cgtggaactg gcacgtgcga ttttggtggc gccgcacacg ttgttgccca acctccaagg 1380

tatgggacgt gcgagtaccc aacaggttac tga 1413

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcacgttccc gttctttctc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggccgtagt tgattcctat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatagctgc tcagttcaac c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaaacagtc accacattct t 21

Claims (6)

1.Pm011905基因在监测梅花休眠状态方面的应用，其特征在于，所述Pm011905基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种梅花花芽休眠状态的分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分两次采集待测梅花的花芽，分别提取所述花芽的RNA并反转录成cDNA，以所述cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2～3所示的引物对Pm011905基因进行荧光定量PCR；

(2)比较两次采集的花芽的Pm011905基因的表达量：

当后一次表达量比前一次表达量的增长量小于10％，则判断花芽处于类休眠阶段；

当后一次表达量比前一次表达量的增长量大于10％、或减少量大于10％，则花芽处于生理休眠阶段；

当后一次表达量比前一次表达量的减少量小于10％，则花芽处于生态休眠阶段。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的程序为：94℃3分钟；94℃10秒，60℃20秒，40个循环，在60℃采集信号。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，以PP2A基因作为内参基因，进行荧光定量PCR。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述类休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率为0，所述生理休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率达到30～50％，所述生态休眠阶段指通过人工条件培养后萌发率达到100％；

所述人工条件培养具体为：将当年生枝条底部插入水中，并将其放入人工气候室中进行培养，人工条件设为白天25℃16小时，夜晚为16℃8小时，湿度为70％。每隔2天将其底部减掉，每日观察花芽萌动情况，培养10天后，分别记录每组花芽萌发个数并计算萌发率。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，两次采集时间相隔7天。