CN108823328B - 野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用。其作为内参基因的是基因PP2A或基因EF1α，基因PP2A或基因EF1α在野生大麻和栽培大麻始果期不同部位中表达稳定性最高，解决了野生大麻和栽培大麻基因表达研究中没有内参基因的现状，为下一步研究不同基因型大麻中基因表达研究提供了有力的支持。

Description

野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体是指用于野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用。

背景技术

大麻(Cannabis sativa L.)，别称火麻、线麻，为大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物，多雌雄异株，是一种传统的经济作物，广泛应用于造纸、纺织、食品和制药等领域。大麻主要起源于中亚地区，现全世界均有分布(栽培种或野生种)。我国大麻资源丰富，其中野生大麻在我国的云南、西藏、新疆、内蒙古和东北地区均有分布，而栽培大麻分布范围更广，涵盖我国大部分省区，目前主要集中在云南、黑龙江、内蒙、甘肃、山西和安徽等地。野生大麻和栽培大麻在株高、分枝数、千粒重和大麻素含量等生物学性状和农艺性状方面具有显著差异。通常野生大麻植株矮小，茎秆质地较硬，种子落粒性强，大麻素含量低，且具有栽培大麻所不具备的部分优良特性如抗寒、抗病和抗盐碱等，是育种工作者开展品种选育和遗传改良的优异资源和材料。因此，明确这两种不同类型大麻在上述生物学性状和农艺性状的基因表达差异就显得尤为关键。

实时荧光定量PCR技术是一项快速准确、灵敏度高和特异性强的定量分析技术，现已广泛应用于植物领域中基因表达分析和研究。该项技术的准确性和可靠性受诸多实验因素如RNA的产量和质量、反转录效率等的影响，因此，为了减少样本间的误差，获得更为精确的数据，需要选择合适的内参基因进行校正和标准化。而理想化的内参基因应该在各种类型的细胞、组织和各种外界因素下都恒定表达。然而，近年来大量研究结果表明，并没有表达绝对稳定的内参基因，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验条件下“有范围”的恒定。到目前为止，在水稻、玉米、土豆、黄瓜、西红柿和苹果等作物上已不乏内参基因的筛选和验证的报道，而在野生大麻和栽培大麻中开展与大麻素合成相关基因的表达分析时尚没有合适的内参基因可供选择。本发明根据7个候选基因在野生大麻和栽培大麻始果期(此时期大麻素含量最高)不同部位的表达情况，筛选出适用于研究这两种不同类型大麻基因表达分析的内参基因。

发明内容

为解决目前还没有适用于野生大麻和栽培大麻基因表达研究的内参基因的技术问题，本发明提供了作为野生大麻和栽培大麻实时荧光定量分析的内参基因及其引物的应用。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

1.用于大麻基因表达研究的内参基因，其特征在于：所述内参基因为内参基因PP2A或内参基因EF1α，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述内参基因为内参基因PP2A或内参基因EF1α，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.根据技术方案2所述的大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述植株不同部位为大麻植株的根、茎、叶、花或假果。

4.技术方案1所述的用于大麻基因表达研究的内参基因或权利要求2或3所述的大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。

5.扩增基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物，其特征在于：

扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为PP2A引物，所述PP2A引物由引物PP2A-F和引物PP2A-R组成：所述引物PP2A-F的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，所述引物PP2A-R的碱基序列如SEQ ID NO.9所示，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

扩增基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为EF1α引物：所述EF1α引物由引物EF1α-F和引物EF1α-R组成：所述引物EF1α-F的碱基序列如SEQ ID NO.10所示，所述引物EF1α-R的碱基序列如SEQ ID NO.11所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述大麻为野生大麻或栽培大麻。

6.基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据技术方案6所述的基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，其特征在于：所述植株不同部位为大麻植株的根、茎、叶、花或假果。

8.根据技术方案6或7所述的基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。

本发明的有益效果：

1、本发明首次筛选出在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因，数据真实可靠。

2、筛选出的内参基因适用于野生和栽培两种不同类型大麻同一时期不同部位中与大麻素合成相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性，其操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高，解决了野生大麻和栽培大麻基因表达研究中没有内参基因的现状，为下一步开展不同基因型大麻中基因表达研究提供了有力的支持。

3、本发明设计的用于作为在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因的引物，特异性强，准确性高。

综上所述，本发明首次筛选出在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因，筛选出的内参基因适用于野生和栽培两种不同类型大麻同一时期植株不同部位中与大麻素合成相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性，其操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。

序列表中SEQ ID NO.1所示的是内参基因PP2A的核苷酸序列，基因PP2A的GeneBank Accession No.:JP470792.1。

序列表中SEQ ID NO.2所示的是内参基因EF1α的核苷酸序列，基因EF1α的GeneBank Accession No.:JP452083.1。

序列表中SEQ ID NO.3所示的是基因ACT2的核苷酸序列，基因ACT2的GeneBankAccession No.:JP451309.1。

序列表中SEQ ID NO.4所示的是基因18S rRNA的核苷酸序列，18S rRNA基因的GeneBank Accession No.:JP477000.1。

序列表中SEQ ID NO.5所示的是基因GAPDH的核苷酸序列，GAPDH基因的GeneBankAccession No.:JP451550.1。

序列表中SEQ ID NO.6所示的是基因UBQ的核苷酸序列，基因UBQ的GeneBankAccession No.:JP465573.1。

序列表中SEQ ID NO.7所示的是基因TUB的核苷酸序列，基因TUB的GeneBankAccession No.:JP475803.1。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是引物PP2A-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：9所示的是引物PP2A-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是引物EF1α-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是引物EF1α-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是引物ACT2-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：13所示的是引物ACT2-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：14所示的是引物18S rRNA-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：15所示的是引物18S rRNA-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：16所示的是引物UBQ-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：17所示的是引物UBQ-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：18所示的是引物TUB-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：19所示的是引物TUB-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：20所示的是引物GAPDH-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：21所示的是引物GAPDH-R的碱基序列。

附图说明

图1是实施例中7个候选内参基因和2个目的基因的琼脂糖凝胶电泳图。图1中，M为Trans DNA Marker，泳道1为EF1α，泳道2为UBQ，泳道3为PP2A，泳道4为ACT2，泳道5为18SrRNA，泳道6为TUB，泳道7为GAPDH，泳道8为OLS，泳道9为MDS。

图2是实施例中通过GeNorm软件比较每个候选内参基因表达稳定度M值排序图。图2中，横坐标表示内参基因，纵坐标表示每个内参基因对应的内参基因表达稳定值M，M值越大稳定性越低，最右侧两个内参基因PP2A和EF1α的M值最小，是GeNorm分析中最稳定的两个基因。

图3是根据GeNorm软件通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数目，图3中，纵坐标为配对变异系数PV值，横坐标为配对基因个数。

图4为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以EF1α内参基因计算的表达情况，图4中，横坐标表示栽培大麻不同部位，纵坐标表示相对表达量。

图5为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以PP2A为内参基因计算的表达情况，图5中，横坐标表示栽培大麻不同部位，纵坐标表示相对表达量。

图6为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以GAPDH为内参基因计算的表达情况，图6中，横坐标表示栽培大麻不同部位，纵坐标表示相对表达量。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。

实施例1

野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因的筛选和稳定性验证，包括如下步骤：

1、实验材料取样：分别用野生大麻CF 1(采集于内蒙古赤峰市)和栽培大麻YM 7(云南主栽品种)的种子播种于温室，分别于始果期取其植株的根、茎、叶、花、假果五个部位共30个样品。所有样品离体后速冻于液氮中，然后置于-80℃保存。-80℃保存的野生大麻CF1、栽培大麻YM 7各样品均按下述步骤进行：

2、总RNA提取：采用RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen，德国)提取样品总RNA。

3、cDNA的第一链的合成：采用cDNA反转试剂盒(Evoscript Universal cDNAMaster，Roche)按照说明书将步骤2获得的总RNA反转录成cDNA，作为荧光定量PCR模板。

4、根据大麻基因组注释结果选取7个候选内参基因，利用Primer Express v3.0软件，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计引物，其扩增片段为100-150bp，实时荧光定量PCR特异引物序列如表1所示，引物特异性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示，所有候选内参基因均只有一个条带(见图1)。所有引物由擎科生物科技(昆明)有限公司合成(PAGE纯化法)。所述候选的7个内参基因如下：

蛋白磷酸酶2基因(PP2A)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，转录延伸因子基因(EF1α)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，肌动蛋白2基因(ACT2)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，18S核糖体RNA基因(18S rRNA)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，泛素蛋白基因(UBQ)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，β微管蛋白基因(TUB)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

对步骤3中获得的cDNA样品用一对跨内含子设计的引物来进行PCR，然后对DNA去除情况进行验证，同时来确定cDNA的合成情况，根据实验需要来调整cDNA的浓度。

5、引物设计：根据上述候选内参基因序列通过Primer Express v3.0设计该基因相应的特异性引物(其特异性根据熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳进行判断)。各内参基因的扩增引物等信息详见表1。

6、荧光定量PCR反应：以反转录的cDNA为模版，用设计的特异性引物在Eco Real-Time PCR(Illumina,USA)仪中进行扩增，获得各个候选内参基因的表达数据Ct值。

7、根据所得Ct值通过GeNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对各候选内参基因的稳定性进行分析，筛选出表达最稳定的内参基因并确定最优内参基因数目。

表1七个候选内参基因的基因名、引物序列、扩增长度、PCR扩增效率和相关系数R²

8、利用两步法来进行实时荧光定量PCR，在Eco Real-Time PCR(Illumina,USA)仪运行。所用反应体系和程序参考Roche公司的Faststart Essential DNA Green Master试剂盒的说明书。PCR反应体系为10μl，其中模板cDNA1μl，上下游定量引物10μM各0.5μl，Faststart Essential DNA Green Master 5μl，PCR-grade water 3μl。荧光定量PCR扩增采用两步法，即在95℃酶激活10min之后，先运行40个循环的95℃10s，60℃30s，再运行熔解曲线阶段的95℃15s，55℃15s，95℃15s。通过观察PCR反应后生成的熔解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得到Ct平均值见表2。

表2野生大麻和栽培大麻始果期不同部位内参基因Ct值

9、采用GeNorm软件分析7个候选的内参基因表达的稳定性：利用步骤8中获得的Ct值(表2)，用GeNorm软件计算选出7个内参基因表达的稳定性M值(图2)，M值越大，表明稳定性越低；反之M值越小，稳定性越高，其中M＝1.5是上限。在野生大麻和栽培大麻始果期不同部位荧光定量稳定表达的内参基因为PP2A和EF1α，而相对最不稳定的是GAPDH。

10、根据PV值确定n的值：配对变异系数PV值以0.15为筛选标准，当Vn/n+1＞0.15，表明需选择n个以上的基因组合作为量化标准；Vn/n+1＜0.15，表明只需选择n个内参基因作为量化标准。由图3可以看出，V₂/₃值小于0.15，表明在这些样品中进行基因表达分析所需的最小内参基因数目n＝2，即PP2A和EF1α。

11、使用NormFinder软件对候选内参基因进行分析：NormFinder软件通过计算Ct值组内方差与组间方差来确定候选内参基因的稳定值(Stability value，SV)，稳定值越小，内参基因表达就越稳定；反之不稳定。根据NormFinder软件分析结果来看，ACT2的稳定值(Stability value，SV)最低，为0.092，其次是PP2A和EF1α，均为0.104，18S rRNA的稳定值为0.287，UBQ的稳定值为0.353，TUB的稳定值为1.262，而GAPDH的SV值最高(3.561)，表明它最不稳定，这和GeNorm软件分析的结果一致。7个候选内参基因的稳定性从高到低排序依次为：ACT2>PP2A/EF1α>18S rRNA>UBQ>TUB>GAPDH。

12、采用BestKeeper软件对候选内参基因进行分析：BestKeeper软件直接根据各候选内参基因原始Ct值的标准差(standard deviation，SD)、变异系数(coefficient ofvariation，CV)和相关系数(coefficient of correlation，r)筛选出最适内参基因。其中，标准差和变异系数越小，相关系数越大，表示稳定性越高，反之则稳定性越低。BestKeeper软件分析结果可知(见表3)，除TUB外，其余候选内参基因Ct值的标准差都小于1，表明所有这些内参基因表达都相对比较稳定，这和GeNorm软件分析的结果一致。其中，PP2A和EF1α的稳定性相对最高，而内参基因TUB对应的标准差最高(1.57)，这表明该内参基因相对不稳定。

表3 BestKeeper软件分析结果

13、利用内参基因对大麻素合成相关基因MDS和OLS进行表达验证

基因MDS(2-C-甲基-D-赤藓醇2:4-环二磷酸合酶)是MEP途径中的一个关键酶，MEP途径最终合成GPP，参与大麻素的合成。基因OLS(聚酮合酶)是大麻素合成途径中的一个关键催化酶，通过催化乙酰辅酶A生成OLA(大麻素合成的关键底物)。

(1)以PP2A为内参基因，以栽培大麻YM 7始果期不同部位(根、茎、叶、花、假果)为材料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情况。荧光定量体系和反应程序参照步骤8，荧光定量内参基因和目的基因均设3个重复孔，每个处理均为3个生物学重复，相对定量数据处理采用2^-△△Ct法，^△△Ct＝^△Ct_处理样本-^△Ct_对照样本。^△Ct＝^△Ct_目的基因-^△Ct_内参基因。各处理间差异采用Excel进行统计分析。

结果如图4所示，两个目的基因均以茎为对照，基因MDS在叶中表达量最大，其次为花和假果，在根中表达量最小；基因OLS在花中表达量最大，为对照的157倍，其次在假果、叶和根中表达量依次降低。

(2)以EF1α为内参基因，以栽培大麻YM7始果期不同部位(根、茎、叶、花、假果)为材料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情况。

结果如图5所示，两个目的基因均以茎为对照，基因MDS在叶中表达量最大，其次为花和假果，在根中表达量最小；基因OLS在花中表达量最大，为对照的114倍，其次在假果、叶和根中表达量依次降低。

(3)以GAPDH为内参基因，以栽培大麻YM7始果期不同部位(根、茎、叶、花、假果)为材料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情况。

结果如图6所示，两个目的基因均以茎为对照，基因MDS在根中表达量最大，其次为花，在假果和叶中表达量最小；基因OLS在根中表达量最大，为对照的170倍，其次在花、假果和叶中表达量依次降低。

本实施例中采用两个稳定的内参基因PP2A和EF1α作为内参时，两个目的基因在栽培大麻植株不同部位的表达量分别呈现一致性，而以最不稳定的GAPDH基因作为内参时，两个目的基因在其植株不同部位的表达趋势出现明显差异，这也再次表明本发明筛选的两个内参基因PP2A和EF1α能满足野生大麻和栽培大麻基因表达分析的要求。

序列表

<110> 云南省农业科学院经济作物研究所

<120> 野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 1

taaaactaca aatcccactc gctctcatcc acgcgctcct ccgttccaaa attggtctct 60

gcctttctcc ccaactccca ttcttcttcg ttccactctt ctgcctagag cagaaccagt 120

tttcgaggac tgatctccca gcttgggtgg tttagggtaa aatccctaat cggaatagcg 180

ttattctggt gcatattcac gaaggagagg gtggtagcga gcgagcgaga tgggcatgaa 240

ttctatatcc acaaagtcca atatcgacct caatgagcag atctcgcagc ttatggagtg 300

caagccactc tccgagcaac aggttagagc cctatgtgac aaggccaagg aagtcttaat 360

ggatgaaagc aacgttcagc ccgttaaaag tcctgtgacc atttgtggtg atattcatgg 420

gcagtttcat gatcttgctg aactttttcg aattggaggg aagtgtctgg atactaatta 480

tttgtttatg ggagactatg tggaccgtgg atattattct gttgaaactg tgacgcttct 540

ggtggcctta aaagtgcgtt atccacagcg catcaccatt cttagaggaa accatgaaag 600

tcgtcagatt actcaagttt atgggtttta tgatgaatgt ctacgaaagt atggaaatgc 660

caatgtctgg aagactttta cagacctctt tgactatttt ccgttgactg cattggttga 720

atcggaaatt ttttgtctgc atggtggttt gtccccttcc attgaaaccc ttgacagcat 780

acgtaatttt gatcgtgttc aagaggttcc tcacgaagga ccaatgtgtg atctgttatg 840

gtctgaccca gatgatcgat gtggttgggg tatttctcct cgaggtgctg gatatacttt 900

tggccaggat atttctgaac aatttaatca tactaacagc ttaaagctga ttgccagagc 960

tcatcagttg gtcatggatg gatacaactg ggcacatgag caaaaggttg ttactatatt 1020

tagtgcaccc aattattgct accgttgtgg caacatggcc tctattttgg aagtcgatga 1080

ctgcaagaac cacactttca ttcagtttga gccagctcct aggagagggg agccagatgt 1140

tactcgtaga acacctgatt acttcttata aatcagttgg aattctctat attctattta 1200

cttactactg gttccactca cgttctggtg gttgtgcaag atgactgtca ggtttagaat 1260

ctacaattct accttctgat gcatttttga tggtttgtgg gataggatct gtcatagaac 1320

ataagctgcc tactgatttg tcttacactt gaacatcgcc tggattttgc gtccgagaga 1380

ttgccaaaag ctgattgttt tagtctgatt gtatcatata tccatcactt ctcttgtttt 1440

gtttctaata tcttctcacc cttaccattc ttatgggttt aaatttgggt gaatgaattt 1500

cattagtgga tatttgccct cttttttctt tcttcccttt tttcaaaatg tctcattaaa 1560

cagtaattta catgatcagc agcgttctgg ttgttatttt tgactcttcc atagttatct 1620

catatcatga tagacagaca gtacagttac aaacggtttc ttatagactg aaatatttta 1680

tcttcttcta ctgttcttgg tggaaaaccc tgctgtgttc ttgtattcac t 1731

<210> 2

<211> 2465

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 2

acaacaaatt tcgaaacttt ccaaaagcca caattcttct tcttcttctt cttcttcctc 60

tgctccgatt tctcattctt tgatttcttc tgcgaattgg ggctgaatcc tttcgctgct 120

catgccagag ctggacgaac tggttcaacg agcttctgtg ttagagagga gtagaggttg 180

aattatttga gctcatacat aaggatcact ataagaaggc tttttcttgc tttgaaatca 240

tgcctcggaa aattaatacc ggagttgatt attacgacga ctatgaagat tatgattatg 300

atgaatatga ctatgatgga gaagaagaga atgttgaagt tgtgcagtat acgccagaaa 360

gtagaaggcc cgagacatgg agttgctcaa tatgcacgta tgataatgaa gagaggatga 420

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ttattagtat actaatcttg gttttatttt ctttccaaaa aaaaaaaagg ccgcctcgac 2460

cactc 2465

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 3

gaagatggca gatgcagagg atattcagcc acttgtctgc gataatggaa ctggaatggt 60

caaggctggg tttgctggag atgatgctcc acgagctgtg ttccccagta tcgtgggtcg 120

tcctcgtcac actggtgtaa tggttggaat gggccagaaa gacgcatatg tgggtgatga 180

ggcacaatcc aagcgaggta tcttaactct gaagtaccca attgagcatg gtattgtcag 240

caactgggat gacatggaaa agatctggca tcacactttt tacaatgagc ttcgtgttgc 300

ccctgaggaa caccccgttc ttctaactga agctccactt aacccaaagg ccaatcgtga 360

gaaaatgacc cagatcatgt ttgagacctt taacactcct gctatgtatg ttgccattca 420

agccgttctt tctctgtatg ccagtggtcg tactaccggt attgtgctgg attctggtga 480

tggtgtaagc catactgtcc ccatatacga gggatatgct cttcctcatg ccattctacg 540

tcttgatctt gctggtcgtg atcttactga tcacctaatg aagattctca ccgagcgtgg 600

atactccttc accaccactg ctgaacggga aattgtgagg gacatgaagg agaagcttgc 660

ctacatagct cttgactttg agcaggagat ggagacagcc aagactagtt ctgctgttga 720

gaagagttat gagttgccag acgggcaagt catcaccatt ggtgccgagc gattccgatg 780

tcctgaagtt cttttccaac cttcattggt tggaatggaa gcagcaggca ttcacgaaac 840

tacttacaac tccatcatga agtgcgatgt tgatatcaga aaggatcttt acggtaacat 900

tgtcctgtct ggtggttcaa ccatgttccc aggcattgct gataggatga gcaaggaaat 960

ctctgctctt gcaccaagct ctatgaagat taaggtggtc gcaccaccag agaggaaata 1020

cagtgtctgg attggaggct ccatcttggc ctctctcagc accttccagc agatgtggat 1080

tgcaaaagca gagtacgatg agtctgggcc atcaattgtt cataggaaat gcttctaagc 1140

atgtgagaat tagaactact gcagagagaa aagcaagtac tgttgttttt attatcttgg 1200

agaaaagtgt tgtttgcaga aggttcattc tagctcgtta cctttttttt attctcaact 1260

tgaagtgact tcggaaggcc aggagttaat ttatccaatt tgtttctttt aaattttatt 1320

ttatttttgt tattacaact tctttgatta tcattattat tattttttgg tcattccatc 1380

ccaaaattcc gtacttacaa aagctcatat tgaatgctta aatttcttat gaacccaatt 1440

catgagataa aacctttatt ttatgaatca 1470

<210> 4

<211> 1495

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 4

caacgcagag gcctagttac gggggagaac gaaaccaaac ctccgaaaac gaacgaacgc 60

agtctctctc tgctctttgg atcatcaatg gcgggaggta aggccaggaa ggacaaaccg 120

aagccaaacg ctgcggctca cgctccttac caaggaggca tatcattcca caagtccaaa 180

ggacaacata ttcttaaaaa ccccatgctt gtcgactcca ttgttcaaaa atcagggatt 240

aagaccactg ataccattct tgagatcggt cctggtactg gaaacttaac caagaagctt 300

ttagaagccg gaaagatggt tatcgcagtt gagcttgatc ctcgtatggt tctcgagttg 360

cacagacgat ttcagggtac tcctctttcc aatcgtttga aggttattca aggagatgtg 420

ctgaaaactg agctacctta ttttgatata tgtgtggcca acattcccta ccaaatttca 480

tctccactta ctttcaagtt actaaaccac caaccttcat tcaggtgtgc aatcatcatg 540

tttcagaggg aatttgcaat gagactggtt gctcagcctg gggacaagct atattgtcgt 600

ctcactgtca acacccaact cttatcacga gtttcacatc ttctcaaagt tgggaggaac 660

aactttcgtc ctcccccaaa agtggattcc tccgtggttc gaatcgagcc aaggaagcca 720

cggattgaag tgaagcaaaa ggaatgggat ggattcctgc gaatttgttt caatcgaaag 780

aacaaaacgc tcggttcgat ctttaggcag aagagtgtca tcaatttgct ggagaagaac 840

tacaagactg ttcaagcact aaagctccca ggacagagta gtaccatgga agaaacgggt 900

gatcatatag acttttcgaa actcggggag gccaatgaag atttaagtat ggatttagat 960

gatgatgttg atgacgatga ggattttgat ggagctgatg aagaaatgga agtggaagat 1020

ggtaatgtag gaggggagac atctgagttc aaagccaaag tcttggcagt gttaaaggaa 1080

ggtgactttg aggagaagag atcatctaag ttgacactac aagaattctt atacttgctc 1140

tctttgttta acaaagctgg catacacttc tcctgatttt gagttttgag tgtaatttat 1200

aaccaaaatt tcaagatttt aagattttga tttctcttat cttataattt tgtaaaagct 1260

tttcccacac aaggtattac tagttaaatt attcttgttg ctcagtgagt tgaatgagca 1320

cgagaaaaaa aaaacttgag accaagagga ttattggttg tttcggctct gttatatgaa 1380

cttagatctt tagtaactag ggaactatac ttaattgctc gtgctttatt agatttttgt 1440

ttaaagatgt tgttagggtt gtttttcttt tgattgttaa cgattttagt tgcct 1495

<210> 5

<211> 1593

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 5

gtggacttgg agatgagtaa ccacagccat acaaatatat gagaagctat ccataatcta 60

atcccttctt cctttcattt cagtcacacc ccttcttctc tttctctctt ttctcttcta 120

aatattattc aatatatata tcaaaaaccc aaccttacaa attttctgag ctcaaaaaat 180

acccatatca acacaaccaa ccatggcttc ggctattctt tctgtggcca aaccatctct 240

tcaggccagt ggaaagggat tgtcagaatt ttctggactt agaagctcaa atggttccat 300

tccattttct aggaagacta cctctgatga ctttgtttct ttcatctctt tccagacctc 360

tgctgttgga agcagtggag gatatagaaa aggtgtggtg gaggctaagc taaaggtggc 420

cataaatgga tttggacgaa ttggaaggaa cttcttgagg tgttggcatg gccgaaagga 480

ctcgccttta gatgtcatcg ccatcaatga caccggtggt gtcaagcaag cttctcacct 540

tcttaagtac gactcgacac taggcatctt cgatgcagat gtcaagcctg ttggtgatga 600

tggaatctct gttgatggca aggtcatcaa ggttgtctcc aacagaaacc cctcccttct 660

tccatggaag gagttgggga ttgaccttgt catagaaggc acaggtgtgt ttgtggacag 720

agatggtgca ggcaagcaca ttgaggcagg agccaagaag gtgctcatta ctgccccggg 780

aaagggtgac attcccacct acgtggtggg agtgaatgct gatggctaca gccacgacga 840

gccaatcatc agcaatgcct cttgcaccac caactgcctt gccccctttg tgaaggttat 900

tgatgagaaa ttcggcatca tcaaaggcac catgaccaca actcactcct acaccggtga 960

ccaaaggttg ctcgatgcca gccaccgtga tcttcgtcgt gctcgtgctg ctgcactcaa 1020

cattgttcca acttcaactg gtgcagccaa ggctgtttcc cttgtcctcc cttcactcaa 1080

aggcaaactc aatggaattg ctcttcgagt ccccacacct aatgtctcag tcgtcgacct 1140

tgttgttcaa gtctctaaaa agacttttgc tgaggaggtt aatgctgctt tcagagaaag 1200

tgctgataag gaactcaatg gcattctctc tgtctgtgat gagcctcttg tctccgtcga 1260

tttcagatgc accgatgtat catccaccgt cgattcttcg ttgacaatgg ttatgggaga 1320

tgacatggtt aaggtcattg cttggtatga taatgagtgg ggttactcac agagggttgt 1380

ggatctggct gacattgtag ccaatcagtg gaaatgagat tcccaatcca atcattttaa 1440

taagattttt tccctgcctt aaatattatt caccaactgt ttttttcctt cttttttcct 1500

ttttctatta ttcctgtcta aaaatttgta atgagaactt tgaaccgatt tccctggctt 1560

gtcattattc aataacagct ttcctttcaa tca 1593

<210> 6

<211> 942

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 6

ctggggaagc aaggacacct aatgttgctg gtctgggagg gcttggtctc cccaatatgg 60

agcagatgct ctctggcggc atgccagaca ctactcaaat gaatcagctt ttgcaaaacc 120

cagctatatc tcagatgatg caaagcttgc tttccaatcc tcaatatatg aatcagatgc 180

tgaaccttaa tccacaactg cgtggcatgg ttgatgtgaa ccctcaactt agagagatga 240

tgcagaatcc agaaatactg cgccagctaa caaaccctga gacaatgcag caaatgctca 300

ctctacagca gtcacttctt tctcagctca atcgacaaca atcaacccag gattcaggtc 360

agacgggtgc aactacagga acacctaata acaatggact ggaactactg atgaacatgt 420

ttggtggtct tggagctggc agctttgcag caccaaccaa tccagatgtt ccacctgaag 480

agctttatgc aactcaacta tcacagcttc aagaaatggg tttctttgac actcaagaga 540

acatcagggc attgcgtgcc acgtctggga atgtccatgc agctgtggag cggcttttag 600

gaaatcccgg gcagtagaca taacccgatt tgatttgtgt ctctttcttt agttggacat 660

ttcttgtgga catgtaaaac acagacacga tttggacttt aggttcttgc aaattatgcg 720

agagaaattt acgaggagca gctgtagatt tcattttggg cgtgtgaata agcaagtaca 780

caccatgata gagctgtgaa cttgtggata tataagcata tatgcgtcaa cattacagga 840

cttctctctt ctcccaccct cactctatat atcgctctcg catatgtaca ttttaattac 900

atctttttta attttttttt tcttttttaa gtattgtttt gg 942

<210> 7

<211> 1849

<212> DNA

<213> 大麻(Cannabis sativa L.)

<400> 7

tcttaacctc ggcatctccc tcccaccatc aaactctcac acttcttata tttctcttct 60

ctcttcttca tttctccgcc tctcttcaca gattttctct ctgaacccta aacctttgaa 120

tcgttatctt cgacaatgag ggaaatcttg catattcaag gaggtcaatg tggtaaccaa 180

atcggttcca agttctggga agtaatctgt aacgagcatg gtgtagaccc taccgggagg 240

taccagagcg atggtgctgc tgatcttcag ttggagagga ttaatgtcta ctacaatgag 300

gcttctggag gaaggtacgt tcctcgggct gttcttatgg atctcgaacc tggaactatg 360

gatagcatca gatcgggtcc ttatggacag atctttcgcc ctgataactt cgttttcggc 420

cagtccggtg ctggaaacaa ttgggccaaa ggtcactaca ccgaaggcgc tgagttgatc 480

gattcggtac ttgatgttgt tcgtaaagag gctgaaaact gtgactgtct tcaaggtttt 540

caggtatgtc actcacttgg aggagggact ggttctggta tgggaacact tctcatatca 600

aagatcagag aggaatatcc agacagaatg atgctcacat tctcagtttt cccttctcca 660

aaggtctctg acacagttgt ggaaccatac aatgccaccc tctcggtgca tcaactggtt 720

gaaaacgctg atgagtgcat ggttcttgat aatgaagcac tttatgatat ttgcttcagg 780

actctaaaac tcagcacacc aagttttggc gacttgaacc atttgatatc tgcaactatg 840

agtggtgtaa cttgctgcct gaggttccct gggcaactca actcggacct tcgtaagctg 900

gctgttaatt tgattccatt cccgcgactt cacttcttca tggtggggtt tgcacctctg 960

acttctcgtg gatcccaaca gtacatctcc ctcactgtgc cagagcttac tcagcaaatg 1020

tgggatgcca agaacatgat gtgcgcagct gaccctcgcc atggccgata cctgactgcc 1080

tcggctatgt tcaggggtaa gatgagtact aaagaggtgg atgaacagat gatcaatgtg 1140

caaaataaga actcatctta ctttgttgag tggatcccaa acaacgtgaa atcaagtgtt 1200

tgtgatattc caccattggg gcttaaaatg gcgtctacct ttgttggtaa ctcaacatcg 1260

atccaggaga tgttcaggag ggtgagcgag cagttcacag ctatgttccg tcgcaaggcc 1320

tttttgcatt ggtacacagg agaaggaatg gacgagatgg agttcacaga ggcagagagt 1380

aacatgaatg atttggtcgc tgagtatcaa cagtaccagg acgccactgc tgatgaggaa 1440

ggtgaatatg aagaagaaga agaaggtgat gagatctatg agaactaaaa tctcggattt 1500

taactgaagt gtctaagctt tggaggattg tggatcatgt gccaatattt tctttctcaa 1560

ccacctgctt atatgttttg cttagataaa tatcagcctg tttttgtttg ctctctactc 1620

agttgttgtt tgttaccttt catttttaaa agacaaccat ctgttgctgt ttttgctttc 1680

ctccaattgt ttgaataaat attatatcat tattcgagga aatgacgtgt taggttcccg 1740

tgcattttgc tattaagatg ttttctctct tttggggttt attaattctt gattaaattt 1800

actttccttc atattattag aattgtaata tgcagggtag tgctattgg 1849

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcaacgttc agcccgttaa 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacacttccc tccaattcga aa 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgttttgcac ggatcagttt g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatgccgacc gctacagttc 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atattcagcc acttgtctgc ga 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tatgcgtctt tctggcccat 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttcgtcctcc cccaaaagt 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgagcgttt tgttctttcg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tactgcgcca gctaacaaac c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcacccgtct gacctgaatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cattcccgcg acttcacttc 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agggtcagct gagcacat 18

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctctttcca gacctctgct gtt 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcaagaagt tccttccaat tcg 23

Claims (3)

1.扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物的方法，其特征在于：

扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为PP2A引物，所述PP2A引物由引物PP2A-F和引物PP2A-R组成：所述引物PP2A-F的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，所述引物PP2A-R的碱基序列如SEQ ID NO.9所示，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述大麻为野生大麻或栽培大麻。

2.基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的应用，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植株不同部位为大麻植株的根、茎、叶、花或假果。

3.根据权利要求2所述的基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的应用，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。

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