CN104357454A - 香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法，基于对NCBI已经登录的其他物种EF1a基因cDNA全长进行分析的基础上，根据其基因序列的保守区域设计简并引物，以香樟叶片中总RNA反转录的cDNA第一链为模板，用常规PCR进行体外扩增，获得香樟CcEF1a基因片段的cDNA序列。设计相应的qRT-PCR引物，测序检测其扩增产物的特异性，建立了基于SYBR GreenI染料技术的qRT-PCR方法，从而为香樟CcEF1a基因作为内参基因，为利用qRT-PCR技术研究香樟其它功能基因或逆境相关基因提供有效的方法。

Description

香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法。

背景技术

香樟(Cinnamomum camphora)，樟科(Lauraceae)，常绿乔木，是贵重家具、高级建筑、造船和雕刻等理想的用材。近年来，香樟在园林绿化中的应用越来越多，成为城市中重要的园林绿化树种，但是耐寒性差这一不良性状限制了香樟的地理分布及其在园林绿化中的应用。研究香樟抗寒相关基因从而通过基因工程技术获得抗寒性增强的香樟新品种是一个有效途径，基因工程育种与传统育种相比具有较强的目的性、育种周期短并且克服远缘杂交不亲和的优点，因而具有重大的实际价值。

近年来，CBF/DREB1(CRT/DREbinding factor)转录因子被认为是对植物冷驯化机制具有重要调节作用的一类基因；该基因能够能感受上游传递的低温信号，在低温诱导下迅速合成，并在转录水平上调控多个抗逆基因，从而提高植物的耐寒性，因而成为近年来研究的重点。因而对该家族基因的克隆和分子重组为实现育种目标提供了新思路。CBF/DREB1途径广泛存在于各个物种中，近年来科学家们相继从平榛、巨桉等木本植物中分离CBF/DREB1家族基因，本实验室也已经从香樟中克隆到两个CBF/DREB1家族基因(数据未公布)，要深入研究这些基因的抗寒相关性及表达模式，一般通过实时定量PCR手段进行基因的表达量进行定量分析。

抗寒相关基因的表达模式的研究需要一个在低温胁迫处理条件下表达量相对恒定的持家基因作为内参，从而实现该基因的定量和标准化。传统持家基因像甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(ACT)和延伸因子(EF1a)因为其组成型表达而被广泛认为是比较可靠的内参基因。EF1a(elongat ion factor 1 alpha)是真核生物延伸因子的一个亚基，延伸因子是一类在蛋白质合成中发挥作用的蛋白，帮助肽链的延伸。EF1a基因被认为在黄瓜、矮牵牛和大白菜中最为稳定的内参基因，很多研究者在研究抗寒相关基因DREB基因的表达模式中应用了EF1a基因作为内参基因。然而，目前位止，国内外还没有见到香樟延伸因子EF1a相关文献的报道，GenBank中也没有与香樟延伸因子EF1a相关的基因序列登录，其作为内参基因应用于其他基因表达变化的研究也尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法，本发明的有益效果是为香樟CcEF1a基因作为内参基因，在利用qRT-PCR技术研究香樟其它功能基因或逆境相关基因的表达分析提供有效的方法。

本发明所采用的技术方案是提供香樟延伸因子CcEF1a基因片段，所述基因的GenBank登录号为KM086740，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

香樟延伸因子CcEF1a基因片段所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的一种香樟CcEF1a基因的克隆方法：提取香樟叶片总RNA，反转录成第一链cDNA作为模板，采用简并引物EF1aF和EF1aR进行RT-PCR扩增，PCR扩增产物经A-T克隆，并将阳性克隆测序，获得目的基因的cDNA序列。其中引物序列为：

EF1aF:5’-ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3’(SEQ ID NO.3)；

EF1aR:5’-GAAATCCACATCTGYTGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。

所获得目的片段大小为1297bp。

进一步，所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共30个循环；72℃总延伸10min。

本发明的另一目的是提供香樟CcEF1a的qRT-PCR引物，建立了基于SYBR GreenI染料技术的qRT-PCR方法，从而为香樟CcEF1a基因作为内参基因，在利用qRT-PCR技术研究香樟其它功能基因或逆境相关基因提供有效的方法。

qRT-PCR扩增香樟延伸因子CcEF1a基因部分序列的方法为：提取香樟叶片总RNA，利用试剂盒进行cDNA第一链的合成，然后以反转录产物作为模板，以CcEF1a-RTF和CcEF1a-RTR为引物，采用SYBR Green I法进行定量PCR扩增，其定量PCR引物CcEF1a-RTF和CcEF1a-RTR序列为：

CcEF1a-RTF：5’-TCCAAGGCACGGTATGAT-3’(SEQ ID NO.5)；

CcEF1a-RTR：5’-CCTGAAGAGGGAGACGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

所获得目的片段大小为232bp。

进一步，所述定量PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环；溶解曲线在65～95℃之间，每0.05s升高0.5℃。

本发明香樟延伸因子CcEF1a基因片段作为内参基因应用于香樟其它功能基因或逆境相关基因的定量PCR检测。

本发明是基于对NCBI已经登录的其他物种EF1a基因cDNA全长进行分析的基础上，根据其基因序列的保守区域设计简并引物，以香樟叶片中总RNA反转录的cDNA第一链为模板，用常规PCR进行体外扩增，获得香樟CcEF1a基因片段的cDNA序列。设计相应的qRT-PCR引物，测序检测其扩增产物的特异性，建立了基于SYBR Green I染料技术的qRT-PCR方法，从而为香樟CcEF1a基因作为内参基因，在利用RT-qPCR技术研究香樟其它功能基因或逆境相关基因的表达分析提供有效的方法。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1.本发明首次从香樟中克隆到了延伸因子CcEF1a基因片段。

2.本发明首次设计了CcEF1a基因的qRT-PCR引物，并检测了特异性，可以直接应用于基因的表达分析，优化了qRT-PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度。

3.本发明首次对香樟CcEF1a基因进行了表达分析，结果表明，其在低温胁迫下的叶片中表达量相对稳定，可以在相应基因表达分析中作为内参基因。

附图说明

图1香樟延伸因子CcEF1a基因的PCR产物电泳图；

图2香樟延伸因子CcEF1a基因的熔解曲线；

图3香樟延伸因子CcEF1a基因低温处理下各个样品cDNA进行qRT-PCR的平均C_T值(C_T值与表达量负相关)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明以园林植物香樟为研究材料，提供1个香樟延伸因子CcEF1a基因片段，可作为香樟功能基因表达分析的内参基因，同时提供香樟CcEF1a的qRT-PCR引物，建立了基于SYBR GreenI染料技术的qRT-PCR方法，从而为香樟CcEF1a基因作为内参基因，在利用qRT-PCR技术研究香樟其它功能基因或逆境相关基因的表达分析提供有效的方法。

实施例1：香樟延伸因子CcEF1a基因的克隆

1.1香樟叶片总RNA的提取

香樟总RNA的提取根据EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱公司)说明书进行操作，涉及RNA的实验所用枪头和离心管等耗材均为无RNA酶污染(Axygen公司)。所提RNA加入30μL RNase Free水(试剂盒中自带)，充分溶解后于-80℃保存。

1.2RT-PCR(反转录PCR)

cDNA第一条链的合成根据TaKaRa公司的PrimeScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit操作说明，反转录2μg总RNA，合成cDNA第一链，反转录产物用于香樟延伸因子基因EF1a基因的克隆。用于qRT-PCR定量分析的各个cDNA样品稀释10倍作为反应模板。

1.3PCR扩增引物序列

EF1a的上游引物：5’-ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3’(EF1aF：SEQID NO.3)；

EF1a的下游引物：5’-GAAATCCACATCTGYTGGAA-3’(EF1aR：SEQ ID NO.4)。

1.4常规PCR扩增

PCR反应

a.反应体系为20μL：

b.反应条件：

94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共30个循环；72℃总延伸10min。

1.5用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图1)，DL2000为TaKaRa公司生产。图1中：M代表DL2000DNA Marker，1-3泳道为CcEF1a基因的PCR产物。

1.6PCR产物的胶回收

琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用Axygen(吴江康宁生命科学有限公司)琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。

1.7PCR产物的克隆，A-T克隆

(1)连接反应

回收的目的产物与TaKaRa公司生产的pMD19-T Vector16℃连接过夜，反应体系如下：

(2)大肠杆菌感受态细胞的转化

将上述连接产物加于50μL Trans5α大肠杆菌感受态细胞(北京全式金公司)中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，缓慢加入400μL新鲜液体LB，37℃，180rpm 50min，吸取100μL菌液涂于添加有Amp 100mg/L的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养12-16h。

(3)阳性重组子的筛选及鉴定

随机挑取上述转化平板中的阳性菌以pMD19-T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确的阳性菌接种于1ml添加有Amp 100mg/L的液体LB中摇菌培养，送往上海生工测序，得到香樟延伸因子EF1a的cDNA序列(具体序列间SEQ ID NO.1)，推导获得相应氨基酸序列(具体序列间SEQ ID NO.2)。

1.8.测序结果及序列分析

测序结果经分析并去除两端引物序列，获得了1个大小为1297bp的cDNA序列片段，编码432个氨基酸。将获得片段的核苷酸序列和推导氨基酸序列在NCBI中进行BLAST分析，结果显示该基因片段的核苷酸序列与BLAST结果的其它物种EF1a的核苷酸序列的相似性均在80％以上，其中与梅花EF1a相似性最高，相似度为87％；氨基酸序列的相似性均在96％以上，其中与大戟科木薯、蓖麻、小油桐以及棕榈科的油棕的EF1a氨基酸序列的相似度均达到98％。推测本实验所获得的基因片段是香樟EF1a基因片段，命名为CcEF1a，提交Genbank，登录号为KM086740。

将得到的香樟EF1a基因片段的氨基酸序列NCBI中已经登录的其它物种EF1a氨基酸序列进行多序列比对，结果显示，EF1a基因的氨基酸序列相当保守，本实验结果也进一步证明延伸因子EF1a是高度保守的蛋白质。

此外，利用MEGA5.03软件对香樟EF1a推导的氨基酸序列与橡胶树、毛果杨、油棕、烟草等14个物种的EF1a蛋白进行系统进化树分析表明，香樟与大戟科木薯、橡胶以及棕榈科油棕聚为一支，表明它们在氨基酸水平上亲缘关系较近，也充分说明EF1a基因在不同物种行使相近的功能，通过生物信息学分析本实验所获得基因片段应为香樟延伸因子基因(CcEF1a)。

实施例2：香樟CcEF1a基因在低温胁迫下叶片中的稳定性分析

2.1样品制备

所有实验材料香樟叶片均选用1年生香樟无性系EL6生根组培苗，确保其遗传背景一致。该材料在含有30g/L蔗糖和8.0g/L琼脂的MS基本培养基中生根，培养温度(25±1)℃，光照强度2500lx，光照时间16h/d。组培苗生根处理2mon左右，其不定根状况生长良好，并有5-7片叶片形成，选取约200株健壮的香樟组培苗进行4℃低温处理，分别于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72h随机取其叶片用于RNA的提取，材料收获后立即用液氮速冻，-80℃保存直至RNA提取，RNA的提取方法见实施例1中1.1所述。

2.2qRT-PCR扩增引物合成

qRT-PCR扩增上游引物：5’-TCCAAGGCACGGTATGAT-3’(CcEF1a-RTF：SEQ IDNO.5)；

qRT-PCR扩增下游引物：5’-CCTGAAGAGGGAGACGAA-3’(CcEF1a-RTR：SEQ IDNO.6)。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.3qRT-PCR

cDNA第一条链的合成根据TaKaRa公司的PrimeScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit操作说明，利用Oligo dT Primer为引物进行反转录反应，起始RNA模板为2μg，将获得的反转cDNA产物稀释10倍作为qRT-PCR的反应模板。反应采用SYBR Green I法，利用罗氏公司的FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)试剂盒，在伯乐CFX96实时定量检测系统(BIO RAD)上进行。基因表达分析软件为Bio-Rad CFXmanager2.0，每一样品重复三次。实验得到溶解曲线(melting curve)，如图2所示，横坐标代表在溶解曲线扩增阶段，从65℃到95℃之间的温度范围；纵坐标代表荧光信号(RFU)改变的负的一次导数，即扩增反应完成后，SYBR Green I荧光染料结合到CcEF1a目的片段的双链DNA，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号，随着反应中DNA的熔解，荧光信号降低，峰值指对应温度下荧光信号急剧降低的拐点处的导数值。

依据各样品对应的平均C_T值，利用Excel2007进行数据分析，获得CcEF1a基因在不同样品中的表达差异。图3中：横坐标代表4℃低温处理的时间；纵坐标代表C_T值是指反应体系累计足够的扩增产物，至可以产生可检测的荧光信号时的循环数，主要由扩增反应体系中的模板的初始浓度决定，柱状图和误差线代表每个取样时间点3个重复样品的平均C_T值和标准偏差。表1为CcEF1a基因在低温处理0-72h的各个样品cDNA进行qRT-PCR的C_T值。

a.qRT-PCR反应体系为10μL：

b.反应条件：

94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环；溶解曲线在65～95℃之间，每0.05s升高0.5℃。

2.4香樟CcEF1a基因低温胁迫下叶片中的表达分析实验结果

本发明按照qRT-PCR反应程序将2μg香樟叶片总RNA进行定量PCR扩增，并结合熔解曲线及测序判断扩增产物的特异性。一般理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体或者非特异扩增产生，从引物的熔解曲线来看，其呈单峰型曲线，熔解峰在80℃，高于引物二聚体的峰值(75℃左右)，无杂峰，说明本发明涉及的qRT-PCR引物(SEQ ID NO5和6)，扩增条带单一，没有非特异扩增出现，进一步将扩增产物进行测序，结果表明该对引物的扩增产物特异性强。

表1 CcEF1a基因在低温处理0-72h的各个样品cDNA进行qRT-PCR的C_T值

根据表中各个样品的C_T值，利用Excel2007进行数据分析(图3)。C_T值是指反应体系累计足够的扩增产物，至可以产生可检测的荧光信号时的循环数，主要由扩增反应体系中的模板的初始浓度决定，基因的表达量与C_T值成反比例关系。如果初始模板浓度低，需要较多的扩增循环才能产生足够的荧光信号；反之，只需要较少的扩增循环就可以累计足够的产物，从而产生高过背景的荧光信号。

根据Excel2007软件基CcEF1a基因在经低温处理各个样品的C_T值所得柱形图(图3)可以看出，香樟延伸因子CcEF1a基因在低温处理下，表达量基本恒定，可以作为低温胁迫相关基因表达研究的内参基因。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.香樟延伸因子CcEF1a基因片段，基因的GenBank登录号为KM086740，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.香樟延伸因子CcEF1a基因片段所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种香樟延伸因子CcEF1a基因部分序列的克隆方法，其特征在于：提取香樟叶片总RNA，反转录成第一链cDNA作为模板，采用简并引物EF1aF和EF1aR进行RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)扩增，PCR扩增产物经A-T克隆，并将阳性克隆测序，获得目的基因的cDNA序列；其中引物序列为：

EF1aF：5’-ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3’(SEQ ID NO.3)；

EF1aR：5’-GAAATCCACATCTGYTGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共30个循环；72℃总延伸10min。

5.一种qRT-PCR扩增香樟延伸因子CcEF1a基因部分序列的方法，其特征在于：提取香樟叶片总RNA，利用试剂盒进行cDNA第一链的合成，然后以反转录产物作为模板，以CcEF1a-RTF和CcEF1a-RTR为引物，采用SYBRGreenI法进行定量PCR扩增，其定量PCR引物CcEF1a-RTF和CcEF1a-RTR序列为：

CcEF1a-RTF：5’-TCCAAGGCACGGTATGAT-3’(SEQ ID NO.5)；

CcEF1a-RTR：5’-CCTGAAGAGGGAGACGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所用RT-qPCR反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环；溶解曲线在65～95℃之间，每0.05s升高0.5℃。

7.根据权利要求1所述的香樟延伸因子CcEF1a基因片段，其特征在于：香樟延伸因子CcEF1a基因片段作为内参基因应用于香樟其它功能基因或逆境相关基因的定量PCR检测。