CN108611434B

CN108611434B - 剑麻内参基因act/gapdh及其应用

Info

Publication number: CN108611434B
Application number: CN201810479757.1A
Authority: CN
Inventors: 张燕梅; 周文剑; 王瑞芳; 杨子平; 鹿志伟; 李俊峰; 陆军迎
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108611434A

Abstract

本发明提供剑麻ACT和GAPDH基因序列，可作为剑麻内参基因的应用，并同时提供剑麻ACT和GAPDH作为内参基因的特异性引物，建立基于SYBR Green荧光染料技术的qRT‑PCR方法，为后续利用实时荧光定量PCR对剑麻烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理等逆境条件下基因表达分析提供稳定可靠的内参基因和技术方法。

Description

剑麻内参基因ACT/GAPDH及其应用

技术领域

本发明根据现有一种的核酸序列，筛选出剑麻在烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理等逆境条件下稳定表达的内参基因，属于植物分子生物学技术领域。

背景技术

剑麻是我国热带地区特有的经济作物之一，剑麻不仅是主要的热带纤维原料，剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料，剑麻麻渣含有较高皂素，可用来制药，剑麻也是一种重要的生物质能源，并且近年来，剑麻作为景天庚代谢的模式植物，有非常重要的理论和经济价值。

随着测序技术和生物信息学的飞速发展，利用组学研究某一逆境胁迫下基因表达谱已成为分子生物学研究的常规方法，但是组学只是初步的分析基因在某一逆境胁迫下的表达情况，其结果还需要用荧光定量RT-PCR进行验证；另外，基因的时空表达研究也已成为基因功能研究的主要内容之一，以上研究均需要相对稳定表达的基因作为内参基因；随着剑麻分子生物学的深入开展，一些功能基因被成功分离，目前在NCBI公共数据上也有许多龙舌兰麻的核酸序列，但内参基因序列较少，仅有actin1（232bp）和18S rRNA(186bp)的部分序列,由于内参基因在不同的条件下、不同组织、不同时期以及不同品种间表达水平可能会发生改变，这样会导致研究结果的不稳定和降低结果的可靠性，因此，筛选剑麻不同逆境条件下稳定表达的内参基因，是剑麻基因功能研究的前提；这不仅改善了剑麻内参基因少的现状，而且对剑麻基因表达水平研究结果可靠性提供了保障。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供剑麻ACT和GAPDH基因序列，可作为剑麻内参基因的应用；并同时提供剑麻ACT和GAPDH作为内参基因的特异性引物，建立基于SYBR Green荧光染料技术的qRT-PCR方法，为后续利用实时荧光定量PCR对剑麻烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理等逆境条件下基因表达分析提供稳定可靠的内参基因和技术方法。

为实现上述目的，本方法采用的技术方案是：

剑麻内参基因ACT/GAPDH及其应用，包括如下内容：

1、植物材料：用于伤处理和烟草疫霉接种的为2年生的H.11648盆栽苗，用于低温和盐（NaCl）胁迫的为8-10cm的H.11648组培苗；

2、处理条件：低温处理温度为4℃，盐胁迫的NaCl浓度为200mM；烟草疫霉接种后的取样时间分别0h，24h, 36h, 48h和72h；低温，伤和盐处理后的取样时间分别为0h, 3h,6h, 12h和24h；

3、基因种类：选取的8个内参基因分别为肌动蛋白（ACT）, 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH), 亲环蛋白(CYP)，泛素蛋白(UBC)，β微管蛋白(TUB)，18S核糖体RNA ( 18SrRNA )、多聚泛素酶(UBQ)和苹果酸酶(MADH)；

4、操作方法：内参基因稳定性分析软件为geNorm、Normfinder和Bestkeeper，用geNorm, Normfinder和Bestkeeper等软件分别计算出烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理下内参基因的M值、SV值和CV/SD值，然后分别根据M值（geNorm）、SV值（Normfinder）和CV/SD值（Bestkeeper）按从小到大对每个内参基因的稳定性进行排序，值最小的序次为1，第二小的序次为2，依次类推；最后根据geNorm, Normfinder和Bestkeeper软件的排序结果，计算出每个内参基因的综合排序（序次的几何平均值），几何平均值越小的内参基因越稳定；

5、所述内参基因ACT和GAPDH的序列均来自H.11648，核酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，进一步地，以ACT和GAPDH序列为基础，利用Primer Premier3.0软件，并遵循实时荧光定量RT-PCR的原则设计的荧光定量RT-PCR特异性引物序列分别为SEQ IDNo.3- SEQ ID No.6；剑麻PGIP基因引物序列分别为SEQ ID No.7和 SEQ ID No.8。

本发明的有益效果：

本发明提供了2个剑麻内参基因ACT和GAPDH及其序列，并提供了ACT和GAPDH作为内参基因的实时荧光定量RT-PCR特异性引物，既充实了剑麻内参基因及其数量，又为研究剑麻在烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理等逆境条件下基因表达水平提供了稳定表达的内参基因，使研究结果更加稳定可靠。

附图说明

图1内参基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2 内参基因熔解曲线；

图3用geNorm软件计算出的内参基因不同逆境胁迫下的M值；

图4用Normfinder软件计算出的内参基因不同逆境胁迫下的SV值；

图5用Bestkeeper软件计算出的内参基因不同逆境胁迫下的CV/SD值；

图6 剑麻PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫、低温和伤处理后不同时间的基因表达情况分析图。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围；未加特殊说明，所有试剂盒操作均按试剂盒说明书进行，所有的试剂均为生物试剂；实验材料和研究方法前后一致。

本发明所提供的ACT和GAPDH核酸序列均来自H.11648，核酸序列分别SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，ACT和GAPDH引物核酸序列分别为SEQ ID No.3-SEQ ID No.6；剑麻PGIP基因引物序列分别为SEQ ID No.7和 SEQ ID No.8；所用的植物材料为H.11648，病原菌为烟草疫霉。

（1）材料处理

烟草疫霉侵染：取保存于本实验室的烟草疫霉接种于马铃薯培养基（PDA）上，28℃培养1周后，接种H.11648叶片，用灭菌的大头针将叶片正面刺伤，取直径为5mm的菌饼，将菌饼的菌丝生长面贴在伤口的位置，用无菌湿棉花保湿，然后用保鲜膜包裹叶片，置于25-30℃条件下培养，并分别在接种前（0h）、接种24小时、36小时、48小时和72小时取叶片，液氮速冻后保存于-80℃备用；

盐胁迫（NaCl）处理：取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLNaCl溶液，盖上盖子，静置放于桌面上；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

伤处理：取2年生的剑麻盆栽苗，选取健康的叶片擦净消毒后，用消毒的大头针将叶片表面划伤但不能穿破背面；每株当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取伤处理叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

低温处理：取8-10cm的剑麻组培苗，连瓶和培养基一起放于4℃冰箱中；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

（2）引物设计

从转录组数据中选取8个内参基因，肌动蛋白（ACT）, 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH), 亲环蛋白(CYP)，泛素蛋白(UBC)，β微管蛋白(TUB)，18S核糖体RNA ( 18SrRNA )、多聚泛素酶(UBQ)和苹果酸酶(MADH)，根据转录组测序获得的核酸序列，采用引物设计软件Primer Premier3.0设计内参基因和剑麻PGIP基因荧光定量PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

（3）RNA提取和cDNA合成

采用华越洋生物有限公司的超快型植物RNA提取试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行；采用琼脂糖凝胶电泳和酶联免疫分析仪对RNA质量和浓度进行检测；OD260/230大于2.0、OD260/280大于1.8的RNA样品将用于cDNA第一链的合成；cDNA第一链的合成采用北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒进行；取0.5μg总RNA，采用六核苷随机引物合成第一链cDNA；使用前除酶以外的试剂均置于4℃冰箱中解冻；具体操作按说明书进行；合成的cDNA按1:5比例稀释后-20℃保存备用。

（4）内参基因目的片段PCR扩增

①PCR反应体系的建立

20µLPCR反应体系中各组份的浓度及使用量：2×NOVA Taq-Plus PCR Forest Mix(江苏愚公生命科技有限公司):10µL；引物(10μmol/L) F:0.2 µL，R:0.2µL；cDNA: 2µL；灭菌ddH2O :7.6µL；

PCR扩增程序：先95℃(5min), 然后进入35个循环（95℃（30s）,58℃（1min）, 72℃（30s）），最后72℃（10min），扩增产物4℃保存备用；

②PCR产物的检测

将PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Goldview染色后用凝胶成像系统拍照保存，检测结果显示所有引物PCR产物均为单一条带，进行下一步的荧光定量PCR扩增（图1）。

（5）内参基因荧光定量PCR扩增

荧光定量PCR扩增采用北京全式金生物技术有限公司的TransStart® Top GreenqPCR SuperMix试剂盒，具体操作按说明书进行，定量PCR仪为Light Cycler 480IISystem；所有操作均在冰上进行；

荧光定量PCR扩增反应体系中各组份的浓度及使用量：2×TransStart® TopGreen qPCR SuperMix：10µL; cDNA: 2µL; 引物(10μmol/L) F:0.4 µL，R:0.4µL；灭菌ddH2O :7.2µL；

荧光定量PCR扩增程序：先预变性95℃(1min), 然后进入45个循环（95℃（10s）,62℃（30s）, 72℃（30s））；每个样品设置三次重复，反应结束后进行溶解曲线分析；溶解曲线显示重复性好，特异性强，数据可以用于下一步的稳定性分析。

（6）内参基因稳定性评价

荧光定量PCR扩增后，仪器会自动得出各样品Ct值，首先用geNorm, Normfinder和Bestkeeper等软件分别计算出烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫和伤处理下内参基因的M值、SV值和CV/SD值，并根据M值、SV值和CV/SD值从小到大对内参基因表达稳定性进行排序，值越小对应的内参基因越稳定。根据M值排序结果为，在烟草疫霉侵染过程中内参基因稳定性排名依次为：ACT/GAPDH＞TUB＞UBC＞UBQ＞MADH＞18SrRNA＞CYP；盐胁迫下内参基因稳定性排名依次为：ACT/GAPDH＞CYP ＞UBC＞MADH＞TUB＞18SrRNA＞UBQ；低温胁迫下内参基因稳定性排名依次为：ACT /GAPDH＞18SrRNA＞TUB＞UBC＞CYP＞UBQ＞MADH；伤处理内参基因稳定性排名依次为：ACT /GAPDH＞18SrRNA＞CYP＞UBC＞TUB＞UBQ＞MADH（图3）；根据SV值排序，在烟草疫霉侵染过程中内参基因稳定性排名依次为：ACT＞GAPDH＞TUB＞UBC＞UBQ＞MADH＞18SrRNA＞CYP；盐胁迫下内参基因稳定性排名依次为：ACT＞GAPDH＞MADH＞UBC＞CYP＞TUB＞18SrRNA＞UBQ；低温胁迫下内参基因稳定性排名依次为：GAPDH＞ACT＞TUB＞18SrRNA＞UBC＞UBQ＞CYP＞MADH；伤处理内参基因稳定性排名依次为：GAPDH＞ACT＞UBC＞CYP＞18SrRNA＞UBQ＞TUB＞MADH（图4）；根据CV/SD值排序，在烟草疫霉侵染过程中内参基因稳定性排名依次为：ACT＞GAPDH＞UBQ＞MADH＞TUB＞UBC＞18SrRNA＞CYP；盐胁迫下内参基因稳定性排名依次为：18SrRNA＞GAPDH＞ACT＞UBQ＞TUB＞MADH＞UBC＞CYP；低温胁迫下内参基因稳定性排名依次为：GAPDH＞18SrRNA＞TUB＞ACT＞CYP＞UBC＞UBQ＞MADH；伤处理内参基因稳定性排名依次为：CYP＞GAPDH＞ACT＞18SrRNA＞UBC＞TUB＞UBQ＞MADH（图5）；然后分别根据M值（geNorm）、SV值（Normfinder）和CV/SD值（Bestkeeper）的排序结果，对序次进行赋值，值最小的序次为1，第二小的序次为2，依此类推；最后根据geNorm,Normfinder和Bestkeeper软件的排序结果，计算出每个内参基因的综合排序（序次的几何平均值），几何平均值越小的内参基因越稳定；geNorm, Normfinder和Bestkeeper综合分析结果显示，在烟草疫霉侵染过程中内参基因稳定性排名依次为： ACT＞GAPDH＞TUB＞UBC＞UBQ＞MADH＞18SrRNA＞CYP；盐胁迫下内参基因稳定性排名依次为：ACT＞GAPDH＞18SrRNA＞MADH＞UBC＞CYP＞TUB＞UBQ；低温处理后内参基因稳定性排名依次为：GAPDH＞ACT＞18SrRNA＞TUB＞UBC＞CYP＞UBQ＞MADH；伤处理后内参基因稳定性排名依次为：GAPDH＞ACT＞CYP＞18SrRNA＞UBC＞TUB＞UBQ＞MADH。即分析结果表明，在烟草疫霉侵染，盐胁迫过程中，ACT表达最稳定，GAPDH次之；在低温和伤处理过程中GAPDH表达最稳定，ACT次之。

注：GN，NF，BK分别为geNorm, Normfinder和Bestkeeper.

表1 内参基因稳定性排序

（7）剑麻PGIP基因表达分析

分别以ACT和GAPDH为内参基因，对剑麻PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫、伤和低温处理后不同时间基因表达情况进行分析，相对表达量参照Livak, K.J. 和Schmittgen等的2^–ΔΔCT方法进行，分析结果显示：以ACT为内参基因，PGIP基因在烟草疫霉侵染过程中诱导表达上调，且侵染48h时表达水平达到最高；在盐胁迫过程中诱导表达上调，在胁迫3h时表达水平最高；在低温胁迫过程中表达水平没发生显著变化；在伤处理过程中PGIP诱导表达上调，处理12h时表达水平达到最高。以GAPDH为内参基因，PGIP基因在烟草疫霉侵染过程中诱导表达上调，且侵染48h时表达水平达到最高；在盐胁迫过程中诱导表达上调，在胁迫3h时表达水平最高；在低温胁迫过程中表达水平没发生显著变化；在伤处理过程中PGIP诱导表达上调，处理12h时表达水平达到最高。即以ACT为内参基因和以GAPDH为内参基因，PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫、伤和低温处理过程中的表达趋势一致，即2个内参基因分析结果基本一致，即表明ACT和GAPDH均可作为剑麻烟草疫霉侵染，盐胁迫，低温胁迫和伤处理后基因表达分析的内参基因（图6）。

序列表

<110> 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所

<120> 剑麻内参基因ACT/GAPDH及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<220>

<221> CDS

<222> (54)..(1184)

<400> 1

ttctctctcc tctccacgct ccgtggccag ctccgaaggt ttgttaagag aga atg gca 59

Met Ala

1

gat gct gag gat att cag ccc ctt gtc tgt gac aat gga act ggt atg 107

Asp Ala Glu Asp Ile Gln Pro Leu Val Cys Asp Asn Gly Thr Gly Met

5 10 15

gtg aag gct gga ttt gct gga gac gat gcc cca agg gct gtc ttc cca 155

Val Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro

20 25 30

agt atc gtc ggt cgg ccc cgg cac act ggt gta atg gtt ggg atg gga 203

Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Thr Gly Val Met Val Gly Met Gly

35 40 45 50

cag aaa gat gca tat gtt ggc gat gaa gcc cag tcc aag agg ggt att 251

Gln Lys Asp Ala Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile

55 60 65

ctt act ttg aaa tac ccc atc gaa cat gga att gtt agt aat tgg gat 299

Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Ser Asn Trp Asp

70 75 80

gac atg gag aag att tgg cat cac act ttc tac aat gaa ctc cgt gtt 347

Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val

85 90 95

gca cct gaa gaa cat cct gtt ctt ctc act gaa gcc cct ctt aac ccc 395

Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro

100 105 110

aag gct aac agg gag aaa atg aca caa atc atg ttt gag acc ttc aat 443

Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn

115 120 125 130

gtt cct gca atg tat gtt gcc att cag gcc gtc ctt tct ctt tat gcc 491

Val Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala

135 140 145

agt gga cgt acc acc ggt atc gtg ttg gat tcg ggt gat ggt gtc agc 539

Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Ser

150 155 160

cat act gtc cca atc tat gag ggc tat gca ctt cca cat gct att ctc 587

His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu

165 170 175

cgt ctt gac ctt gct ggg aga gat cta acc gat gcc ctc atg aag atc 635

Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Ala Leu Met Lys Ile

180 185 190

ctc act gag agg ggt tac tct ttc acc aca aca gct gag cgg gaa att 683

Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile

195 200 205 210

gtc cgt gac atc aag gag aag ctc gcc tat gtt gct ctt gac tat gag 731

Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Ala Tyr Val Ala Leu Asp Tyr Glu

215 220 225

cag gag ctt gag acc gcc aag agc agc tcc tcg gtc gag aag agc tat 779

Gln Glu Leu Glu Thr Ala Lys Ser Ser Ser Ser Val Glu Lys Ser Tyr

230 235 240

gag ctg cct gat ggg cag gtt atc acc att ggt gct gag cgg ttc agg 827

Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg Phe Arg

245 250 255

tgc cca gaa gtg ctt ttc cag cct tct ctc att gga atg gag gct cct 875

Cys Pro Glu Val Leu Phe Gln Pro Ser Leu Ile Gly Met Glu Ala Pro

260 265 270

gga atc cat gag acc acc tac aat tca atc atg aag tgc gat gtt gat 923

Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp

275 280 285 290

atc agg aag gac ttg tat ggt aac att gtg ctc agt ggt ggt tcc acc 971

Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly Ser Thr

295 300 305

atg ttc ccg ggc att gct gat aga atg agc aag gag atc acc gca ttg 1019

Met Phe Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Ser Lys Glu Ile Thr Ala Leu

310 315 320

gca cca agc agc atg aag att aag gtg gtt gca cct cct gag agg aag 1067

Ala Pro Ser Ser Met Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu Arg Lys

325 330 335

tac agt gtc tgg att gga ggg tcc att ttg gct tct ctg agc aca ttc 1115

Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe

340 345 350

caa cag atg tgg atc tct aaa gcg gaa tac gat gaa tct gga cca gca 1163

Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Ala Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ala

355 360 365 370

att gtt cac aga aag tgc ttc taagtgcttg gtaggtttgt ggtttgaagt 1214

Ile Val His Arg Lys Cys Phe

375

ttatatttct gatggtagtg ataggtggtt tatgggtgat ggtttgctat tccctttctt 1274

tcccctcttt ttcgttgaat ttgagtttat tgtggttggc cttttctttt ttctccttct 1334

aaaagccatt tgtttttttg aatcagatac cattagatga acatattaga tatgtgtatt 1394

ggtagtttgg ttttgtggtg tcgcactgtt ttgtaaagac tagtgacact ccttcgtatg 1454

tttctctcgc att 1467

<210> 2

<211> 1504

<212> DNA

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<220>

<221> CDS

<222> (499)..(1509)

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgttgcac ctgaagaaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatcacccg aatccaacac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacaccggta gactccacaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagacccttc tctttggcga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctctggaca tcagccacaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctcagca ccgaactctc 20

Claims

1.一种核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的ACT基因作为剑麻内参基因在剑麻烟草疫霉侵染、盐胁迫、低温胁迫或伤处理后基因定量表达分析中的应用。

2.权利要求1所述的ACT基因的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

3.权利要求2所述的扩增引物在剑麻烟草疫霉侵染、盐胁迫、低温胁迫或伤处理后基因定量表达分析中的应用。