CN110724757B - 一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物及其应用，所述的引物的序列为：上游引物如SEQ:ID:NO:1所示，下游引物如SEQ:ID:NO:2所示。本发明首次利用RPB2引物序列扩增C.shiraiana，上述引物组能够扩增出一条大小为559bp的特异性条带，用于C.shiraiana特异性的检测，普通PCR检测灵敏度为10ng/μL，qPCR检测灵敏度为1pg/μL。qPCR检测适用于桑椹肥大型菌核病早期无症状芽(果)检测，受外源基因组DNA干扰小，精准度高。本发明还有耗时短、操作简单的特点，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约3个小时。

Description

一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物及其应用
技术领域
本发明属于林果病害检测、鉴定及防治技术领域，涉及一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物及其应用，具体地说，涉及一种用于桑椹肥大型菌核病菌实时荧光定量检测的引物及其应用。
背景技术
桑树是一种多年生的经济型植物，过去的上千年里被用于丝绸产业，其果实桑椹花青素含量极高，抗氧化功效明显，具有促进造血细胞生长、降血糖、降血脂等药理作用，被卫生部列为“既是食品又是药品”名单。桑椹除直接食用外，目前已开发出果汁饮品、桑果酒、桑果酱、桑椹膏及花青素等产品，市场前景广阔。据不完全统计全国果桑种植面积约5.36万公顷，桑果产量近80万吨。果桑种植可促进传统蚕桑产业向多元化发展，又可显著提升种植农户收入，带动乡村采摘游产业发展。然而在产业发展过程中，桑椹菌核病来势猛、发病快，发病率高达30％～90％，有些甚至绝产，桑椹菌核病已成为限制果桑产业发展的瓶颈问题。
桑椹菌核病又称白果病，目前公认且常见的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹缩小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3种，病原菌分别为桑实杯盘菌Ciboria shiraiana、桑椹核地杖菌Scleromitrula shiraiana和肉阜状杯盘菌Ciboria carunculoides。除上述病原菌外，王国良等(2009)在宁波地区还发现了Scleromitrula sp.、Scleromitrula rubicola和Synciboria ningpoensis等桑椹菌核病菌；贺磊等(2010)报道了桑茎点霉Phomamoricola同样可以引发桑椹菌核病，且其病果形态与桑椹肥大型菌核病颇为相似；胡军欢等(2011)在宁波天宫庄园桑果基地发现核盘菌Sclerotinia sclerotiorum也能导致桑椹菌核病。所有病原种类中由C.shiraiana引起的桑椹肥大型菌核病被报道在亚洲分布最广泛。
2017-2019年调查发现，桑椹肥大型菌核病在湖北、江西、重庆、浙江、广东等果桑种植区普遍发生，早期发病症状不明显，等可以观察到发病症状时，几乎很难防治。目前肥大型菌核病的检测主要依靠采用从发病组织中分离和纯化病原菌，对其进行形态学和分子生物学鉴定及柯赫氏法则验证，整个过程大约周期长，易耽误防治时机。徐立等发明了一种基于巢式PCR的桑椹肥大型菌核病病原菌早期快速检测方法，但该检测方法需要经过两轮PCR；除扩增出特异性条带254bp外，在500bp左右有微弱条带(可能是第一轮扩增产物浓度过高引起)和在700bp附近有微弱杂带(可能是桑树ITS序列)；引物可以检测未显症的桑椹，但是具体检测下限不明确。因此，开发出更加快速、灵敏、精准的检测方法对病原菌早期检测和病害预测预报具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种用于桑椹肥大型菌核病菌实时荧光定量PCR检测的引物及其应用。所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种用于桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
优选的，所述试剂盒还包括
Figure BDA0002288399510000021
SYBR qPCR SuperMix plus。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
优选的，所述阳性对照品包括桑椹肥大型菌核病菌基因组DNA；所述阴性对照品包括去离子水。
本发明还提供了上述方案所述的引物组或上述方案所述的试剂盒在桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行qPCR扩增反应，收集荧光数据；
3)根据所述荧光数据的Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在桑椹肥大型菌核病菌。当Ct值>35或为N/A，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含病菌。当28＜Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有、无来判断是否存在病菌。当Ct值≤28，且有明显的扩增曲线,则表示待测样品中含有病菌。
4)当Ct值≤28，按照如下公式计算待测样品中桑椹肥大型菌核病菌基因组DNA的浓度X；所述浓度X的单位为pg/μg，X＝10(30.87-Ct值)/3.205。
优选的，步骤2)中所述qPCR扩增反应使用的反应体系以20μL计包括：待测样品基因组DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、
Figure BDA0002288399510000031
SYBR qPCR SuperMix plus10μL和ddH2O 7μL。
优选的，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立为10μM。
优选的，步骤2)中所述qPCR扩增反应的程序为：95℃3min，[95℃10s、60℃20s，72℃20s，40个循环]，72℃20s，反应结束。
其具体技术方案为：
一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物，所述的引物的序列为：上游引物CPS-F如SEQ:ID:NO:1所示，下游引物CPS-R如SEQ:ID:NO:2所示。
一种桑椹肥大型菌核病菌的检测方法。步骤如下：
(1)DNA提取
(2)RPB2基因片段的PCR扩增
以提取的样品DNA为模板，利用真菌RNA聚合酶Ⅱ的第二大亚基的引进行PCR扩增，上游引物如SEQ:ID:NO:3所示，下游引物如SEQ:ID:NO:4所示。
(3)引物特异性检测
本发明所述的引物序列首先在GenBank NR数据库用Blast进行同源性比对，然后对16个菌株进行PCR扩增，验证其特异性。结果表明，只有C.shiraiana能扩增出559bp特异性条带，而其它真菌都未出现该条带。
(4)常规PCR引物灵敏度检测
将制备的Whzn基因组DNA用Nanodrop one超微量分光光度计测定其纯度和浓度后，将DNA进行10倍梯度稀释制成一系列100ng/μL～100fg/μL作为模板进行PCR扩增反应，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR反应灵敏度，结果表明引物CSP-F/CSP-R检测C.shiraiana要求最低DNA模板浓度为10ng/μL。
(5)SYBR Green I Real-time PCR标准曲线的绘制及灵敏度检测
用10倍梯度稀释的Whzn基因组DNA作为模板来进行qPCR扩增和标准曲线的绘制。然后根据Ct和琼脂糖凝胶电泳来确认检测灵敏度。用GraphPad Prism 6.0(GraphPadSoftware,CA)软件建立10倍梯度稀释的C.shiraiana基因组DNA浓度的对数(X)和对应的qPCR反应的Ct值(Y)之间的线性关系。
对qPCR扩增的熔解曲线分析表明，产物在82.5℃有单一峰，另外，琼脂糖电泳结果也表明产物为特异性扩增。根据所述荧光数据的Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在桑椹肥大型菌核病菌。当Ct值>35或为N/A，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含病菌。当28＜Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有、无来判断是否存在病菌。当Ct值≤28，且有明显的扩增曲线,则表示待测样品中含有病菌。
根据qPCR扩增Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果，确定qPCR检测下限为1pg/μL，比常规PCR检测灵敏度高四个数量级。根据qPCR扩增结果绘制标准曲线，结果表明稀释DNA浓度的对数(X)和对应的qPCR中的Ct值(Y)之间的线性关系为：Y＝–3.205X+30.87(R2＝0.95)。
进一步，步骤(1)具体为：①菌株基因组DNA提取：将菌株在铺有玻璃纸的PDA平板上25℃下培养20d，用无菌的钝刀片收集菌丝。取约100mg菌丝在液氮中研磨成粉末状，将研磨的粉末收集到离心管，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)操作说明进行基因组DNA提取。
②病样基因组DNA提取：将采集的病样用液氮速冻后，放置-80℃超低温冰箱。选取不同类型菌核或子囊盘在液氮中研磨成粉末状，将研磨的粉末收集到离心管，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)操作说明进行基因组DNA提取。
进一步，步骤(2)PCR反应体系总体积为50μL，反应组分为：2×Es Taq Master Mix25μL(康为世纪，CW0690H)，10μM的上、下游引物各1μL，DNA 1μL，双蒸水22μL。扩增反应程序为：94℃40s，60℃40s，72℃2min，共10个循环；94℃45s，55℃1.5min，72℃2min，共37个循环，72℃10min，16℃保存。取适量5μL扩增产物，加入2μL Goldview I型核酸染色剂，采用1％琼脂糖凝胶，在电压120V下电泳35min，在Bio-Rad凝胶成像下检查扩增结果，并委托擎科生物科技有限公司进行DNA纯化和测序。
进一步，步骤(3)、步骤(4)中，PCR反应体系总体积为50μL，反应组分为：2×Es TaqMaster Mix 25μL(康为世纪，CW0690H)，10μM的上下游引物各1μL，DNA 1μL，双蒸水22μL；扩增反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃30s，72℃45s，共35个循环，72℃延伸10min，16℃保存。
进一步，步骤(5)中，qPCR扩增采用20μL体系：10μL
Figure BDA0002288399510000061
SYBR qPCRSuperMix plus，10μM引物各1μL，1μL的DNA模板、ddH2O 7μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃20s，72℃20s，40个循环；72℃20s这一阶段收集荧光进行数据分析。qPCR反应在Bio-Rad CFX384(Bio-Rad Laboratories,CA)上运行，采集的数据用Bio-Rad CFX ManagerTM software,version3.1进行分析。
本发明所述的引物在桑椹肥大型菌核病菌的检测过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明专利根据桑椹肥大型菌核病病原菌C.shiraiana的RPB2序列设计了一对引物(CSP-F/CSP-R)可以扩增出一条大小为559bp的特异性条带，特异性条带的序列如SEQ:ID:NO:5所示，用于C.shiraiana特异性的检测，普通PCR检测灵敏度为10ng/μL，qPCR检测灵敏度为1pg/μL。用10倍梯度稀释的C.shiraiana基因组DNA，根据扩增结果绘制qPCR标准曲线为：Y＝–3.205X+30.87(R2＝0.95)。本发明中C.shiraiana实时荧光定量PCR检测检测方法适用于适用于桑椹肥大型菌核病早期无症状芽(果)检测，具高灵敏度，检测时间较短，操作过程简单，对待测样品要求较低等优势。
本发明具有以下突出的实质性特点和优点：(1)本发明首次利用RPB2引物序列扩增C.shiraiana。(2)本发明可以检测到1pg/μL的桑椹肥大型菌核病菌基因组DNA，即使在潜伏期或者感染极其轻微的情况下也能准确检测出该菌，适用于桑椹肥大型菌核病早期无症状芽(果)检测。(3)本发明针对桑实杯盘菌基因组DNA可以扩增出559bp的单一条带，特异性强，不会检测出桑椹缩小型菌核病菌，桑椹小粒型菌核病菌，核盘菌，细极链格孢菌，链格孢菌，尖孢枝孢菌，拟茎点霉、节孢霉、炭疽菌，受外源基因组DNA干扰小，精准度高。(4)本发明还有耗时短、操作简单的特点，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约3个小时，常规方法至少需要10～15天。
附图说明
图1：为CSP-F/CSP-R引物设计区域；
图2：为引物CSP-F/CSP-R的特异性验证，其中，A.M：
Figure BDA0002288399510000071
Plus DNA Marker；泳道1-3：桑椹缩小型菌核病菌；泳道4-6：桑椹肥大型菌核病菌；泳道7-9：桑椹小粒型菌核病菌；泳道10：核盘菌；泳道11：细极链格孢菌；泳道12：链格孢菌；泳道13：尖孢枝孢菌；泳道14：拟茎点霉；泳道15：节孢霉；泳道16：炭疽菌；泳道17：空白对照；
图3：为PCR扩增10倍梯度稀释的C.shiraiana基因组DNA，检测引物CSP-F/CSP-R的灵敏度。泳道M：DL 2,000marker；泳道1-7：100ng/μL；10ng/μL；1ng/μL；100pg/μL；10pg/μL；1pg/μL；100fg/μL；泳道8：H2O；
图4：为qPCR扩增熔解曲线；
图5：为琼脂糖凝胶电泳验证qPCR扩增特异性和灵敏度。泳道M：
Figure BDA0002288399510000081
PlusDNA Marker；泳道1-3：10ng/μL，泳道4-6：1ng/μL，泳道7-9：100pg/μL，泳道10-12：10pg/μL，泳道13-15：1pg/μL，泳道16-18：100fg/μL：泳道19-21：10fg/μL，泳道22-24：清水对照；
图6：为qPCR扩增基因组DNA标准曲线；
图7：为琼脂糖凝胶电泳验证未表现症状的单个芽(果)实时荧光PCR检测结果。泳道M：
Figure BDA0002288399510000082
Plus DNA Marker；泳道1-6：云果1号(3月2号、3月19号、3月23号、3月30号、4月4号、4月11号)；泳道7-12：青果1号(3月9号、3月19号、3月23号、3月30号、4月4号、4月11号)；泳道13：清水对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
(1)供试材料
2017-2018年从湖北、广东省果桑基地收集发病病果、子囊盘、菌核。进行常规组织分离法，将分离获得S.shiraiana和C.carunculoides菌株或直接将菌核、子囊盘用于DNA提取(表1)。筛选引物灵敏度所用其他真菌细极链格孢(Alternaria tenuissima)、链铬孢菌(A.alternata)、尖孢枝孢菌(Cladosporium oxysporum)、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、节孢霉(Althrinium sp.)、炭疽菌(Colletotrichum fructicola)分离自发病果桑，核盘菌(S.sclerotiorum)分离自油菜，所有菌株均用滤纸片保存于-20℃冰箱中备用，病果、子囊盘、菌核等保存于-80℃超低温冰箱。
表1分离获得的菌株和直接用于DNA提取的病样信息
名称 采集分离部位 地理来源 种类
Hh1x 小粒菌核组织 湖北省洪湖市 Ciboria carunculoides
Hh2f 肥大菌核组织 湖北省洪湖市 Ciboria shiraiana
Hh3f 肥大菌核组织 湖北省洪湖市 Ciboria shiraiana
Cb1xl 小粒菌核组织 湖北省赤壁市 Ciboria carunculoides
Cb2fd 肥大菌核组织 湖北省赤壁市 Ciboria shiraiana
Cb1-6-24 小粒菌核分离 湖北省赤壁市 Scleromitrula shiraiana
Xtfb 肥大菌核组织 湖北省仙桃市 Ciboria shiraiana
Xtfh 肥大菌核组织 湖北省仙桃市 Ciboria shiraiana
Fdbg 肥大菌核组织 湖北省武汉市 Ciboria shiraiana
Xlbg 肥大菌核组织 湖北省武汉市 Ciboria carunculoides
Whzn 子囊盘 湖北省武汉市 Ciboria shiraiana
Wh 小粒菌核分离 湖北省武汉市 Ciboria carunculoides
Wh1fj 肥大菌核组织 湖北省武汉市 Ciboria shiraiana
Hnxl 小粒菌核组织 湖北省武汉市 Ciboria carunculoides
Lf3 小粒菌核分离 湖北省恩施市 Ciboria carunculoides
Yszn 子囊盘 湖北省英山市 Ciboria carunculoides
Tfdj 肥大菌核组织 湖北省团风县 Ciboria shiraiana
Tfxl 小粒菌核组织 湖北省团风县 Ciboria carunculoides
Sd1-2 小菌核分离 湖北省宜昌市 Scleromitrula shiraiana
Zhf1 缩小菌核分离 广东省珠海市 Scleromitrula shiraiana
Zhf2 缩小菌核分离 广东省珠海市 Scleromitrula shiraiana
(2)DNA提取
①菌株基因组DNA提取：将菌株在铺有玻璃纸的PDA平板上25℃下培养20d，用无菌的钝刀片收集菌丝(表1)。取约100mg菌丝在液氮中研磨成粉末状，将研磨的粉末收集到离心管，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)操作说明进行基因组DNA提取。
②病样基因组DNA提取：将采集的病样用液氮速冻后，放置-80℃超低温冰箱。选取不同类型菌核或子囊盘(表1)在液氮中研磨成粉末状，将研磨的粉末收集到离心管，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)操作说明进行基因组DNA提取。
(3)RPB2基因片段的PCR扩增
以提取的样品DNA为模板，利用真菌RNA聚合酶Ⅱ的第二大亚基(The secondlargest subunit of RNA polymerase,RPB2)的引物fRPB2-F5f/bRPB2-7.1R(5'-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3'/5'-CCCATRGCYTGYTTMCCCATDGC-3')进行PCR扩增，PCR反应体系总体积为50μL，反应组分为：2×Es Taq Master Mix 25μL(康为世纪，CW0690H)，10μM的上下游引物各1μL，DNA 1μL，双蒸水22μL。扩增反应程序为：94℃40s，60℃40s，72℃2min，共10个循环；94℃45s，55℃1.5min，72℃2min，共37个循环，72℃10min，16℃保存。取适量5μL扩增产物，加入2μL Goldview I型核酸染色剂，采用1％琼脂糖凝胶，在电压120V下电泳35min，在Bio-Rad凝胶成像(美国Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+)下检查扩增结果，并委托擎科生物科技有限公司进行DNA纯化和测序。
(4)引物设计与筛选
用DNAMAN软件(version 6.0,Canada)将测序的21个样品(表1)和从GenBank下载的C.shiraiana(JN086873)进行多序列比对(图1)，根据3种类型菌核病菌RPB2序列，分析C.shiraiana特异性区域，以Whzn的RPB2基因序列为代表，用Primer Premier 5.0、Oligo6.0软件手动选择进行引物设计，并检查引物二聚体(primer-dimer)，发夹结构(hairpin)等干扰PCR的因素。筛选了一对引物CSP-F(5'-GCCGAACCAATACACCCATT-3')/CSP-R
(5'-TATCCTTGATTGATTCGCTCTG-3')，以上引物均由擎科生物科技有限公司合成。
序列表SEQ ID NO：5是桑椹肥大型菌核病菌核Whzn的RPB2基因序列。
AGCTGACTCTACTTGCAAGCTCTTTCGAACCTGTTCCGCAGATTGACGACGGATGTCTACAGATACTTGCAACGTTGCGTGGAAAACAACAGAGAGTTCAATCTGACGTTAGGTGTGAAATCCACTACAATCACAAACGGTCTGAAATATTCCTTGGCTACAGGCAATTGGGGTGATCAGAAGAAGGCAGCAAGCTCTACTGCTGGTGTGTCTCAAGTATTAAACAGATATACATTCGCATCGACACTTTCTCATTTGCGCCGAACCAATACACCCATTGGGCGTGATGGAAAAATTGCGAAGCCTAGGCAACTGCATAATACTCATTGGGGTTTGGTTTGCCCGGCCGAGACGCCTGAAGGTCAAGCTTGTGGTTTGGTCAAGAATCTGGCTTTGATGTGTTACGTTACAGTTGGTACGCCAAGTGACCCCATCGTTGAGTTCATGATTCAGCGCAATATGGAAGTGCTGGAGGAATATGAACCGCTCCGAGCACCTAATGCGACAAAGGTTTTCGTCAATGGTGTTTGGGTTGGTATTCATCGAGATCCTGCTCATTTGGTTAAATGTGTGCAAGACCTTCGTAGATCACACTTGATCTCTCATGAAGTCTCACTTATTCGAGAGATTCGAGACAGAGAGTTCAAGGTTTTCACCGATGCAGGACGAGTTTGCAGACCTCTATTGGTCATCGATAATGATCCCGAAAGCGCCAACAAAGGTAACTTGGTACTGAATAAAGATCATATTCACCGTTTGGAGGATGACCAAACGCTACCATCAAGCATGGATCCGACAGAGCGAATCAATCAAGGATACTATGGATTCCAAGGTTTGATTAATGATGGTGTTGTTGAATATCTAGACGCCGAAGAAGAAGAGACCGTCATGATTACCATGACACCTGAAGATCTTGACATCTCTCGACAGCTTCAGGCTGGTTATCAAATTCGCCCCGACGAGAGTGGTGATTTGAACAAGCGTGTCAAGGCACCTATCAATCCTACTGCACACATCTGGACTCATTGTGAAATTCATCCAAGTATGATCCTTGGTATCTGTGCAAGCATCATTCCCTTCCCGGATCATAACCAGGTAAGCTTTCAGTCCAAGAATGAACGATTGACACTAGGCTAATCATGTACTACAAAGTCTCATCGTA
(5)引物特异性检测
引物序列首先在GenBank NR数据库用Blast进行同源性比对，然后对16个菌株进行PCR扩增，验证其特异性(图2)。PCR反应体系总体积为50μL，反应组分为：2×Es TaqMaster Mix 25μL(康为世纪，CW0690H)，10μM的上下游引物各1μL，DNA 1μL，双蒸水22μL；扩增反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃30s，72℃45s，共35个循环，72℃延伸10min，16℃保存。结果表明，只有C.shiraiana能扩增出559bp特异性条带，而其它真菌都未出现该条带。
(6)常规PCR引物灵敏度检测
将制备的Whzn基因组DNA用Nanodrop one超微量分光光度计(ThermoFisher，美国)测定其纯度和浓度后，将DNA进行10倍梯度稀释制成一系列(100ng/μL～100fg/μL)作为模板采用(5)进行PCR扩增反应，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR反应灵敏度，并将样品于-20℃冰箱保存备用。结果表明引物(CSP-F/CSP-R)检测C.shiraiana要求最低DNA模板浓度为10ng/μL。
(7)SYBR Green I Real-time PCR标准曲线的绘制及灵敏度检测
用10倍梯度稀释的Whzn基因组DNA作为模板来进行qPCR扩增和标准曲线的绘制。qPCR扩增采用20μL体系：10μL
Figure BDA0002288399510000131
SYBR qPCR SuperMix plus(上海近岸科技有限公司)，10μM引物各1μL，1μL的DNA模板，ddH2O 7μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃20s，72℃20s，40个循环；72℃20s这一阶段收集荧光进行数据分析。qPCR反应在Bio-Rad CFX384(Bio-Rad Laboratories,CA)上运行，采集的数据用Bio-Rad CFXManagerTM software,version3.1进行分析。然后根据Ct和琼脂糖凝胶电泳来确认检测灵敏度。用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software,CA)软件建立10倍梯度稀释的C.shiraiana基因组DNA浓度的对数(X)和对应的qPCR反应的Ct值(Y)之间的线性关系。
对qPCR扩增的熔解曲线分析表明，产物在82.5℃有单一峰(图4)，另外，琼脂糖电泳结果也表明产物为特异性扩增(图5)。根据所述荧光数据的Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在桑椹肥大型菌核病菌。当Ct值>35或为N/A，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含病菌。当28＜Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有、无来判断是否存在病菌。当Ct值≤28，且有明显的扩增曲线,则表示待测样品中含有病菌。
根据qPCR扩增Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果(图5)，确定qPCR检测下限为1pg/μL，比常规PCR检测灵敏度高四个数量级。根据qPCR扩增结果绘制标准曲线，结果表明稀释DNA浓度的对数(X)和对应的qPCR中的Ct值(Y)之间的线性关系为：Y＝–3.205X+30.87(R2＝0.95)(图6)。
(8)实时荧光定量PCR检测体系的应用
2019年春季不同时间点在武汉市桑园采集未显症果桑单个芽(果)，提取其DNA，采用方法(7)进行实时荧光定量PCR扩增。根据qPCR扩增基因组DNA标准曲线，计算其病菌DNA含量(表2)。结果表明，不同时间点云果1号qPCR检测的Ct值均大于31，且琼脂糖凝胶电泳无条带，由此，判断云果1号无病菌侵染。可能是由于云果1号是抗品种，这也与后期对该品种进行调查未发现病果结果一致。青果1号在3月23号初花期检测到C.shiraiana，这为桑椹肥大型菌核病早期预测预报提供了技术支撑。(图7)。
表2不同时间点采集未显症果桑单个芽(果)的实时荧光定量PCR检测
Figure BDA0002288399510000141
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgaaccaa tacacccatt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatccttgat tgattcgctc tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaygaymgwg atcayttygg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccatrgcyt gyttmcccat dgc 23
<210> 5
<211> 559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgaaccaa tacacccatt gggcgtgatg gaaaaattgc gaagcctagg caactgcata 60
atactcattg gggtttggtt tgcccggccg agacgcctga aggtcaagct tgtggtttgg 120
tcaagaatct ggctttgatg tgttacgtta cagttggtac gccaagtgac cccatcgttg 180
agttcatgat tcagcgcaat atggaagtgc tggaggaata tgaaccgctc cgagcaccta 240
atgcgacaaa ggttttcgtc aatggtgttt gggttggtat tcatcgagat cctgctcatt 300
tggttaaatg tgtgcaagac cttcgtagat cacacttgat ctctcatgaa gtctcactta 360
ttcgagagat tcgagacaga gagttcaagg ttttcaccga tgcaggacga gtttgcagac 420
ctctattggt catcgataat gatcccgaaa gcgccaacaa aggtaacttg gtactgaata 480
aagatcatat tcaccgtttg gaggatgacc aaacgctacc atcaagcatg gatccgacag 540
agcgaatcaa tcaaggata 559
<210> 6
<211> 1162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctgactct acttgcaagc tctttcgaac ctgttccgca gattgacgac ggatgtctac 60
agatacttgc aacgttgcgt ggaaaacaac agagagttca atctgacgtt aggtgtgaaa 120
tccactacaa tcacaaacgg tctgaaatat tccttggcta caggcaattg gggtgatcag 180
aagaaggcag caagctctac tgctggtgtg tctcaagtat taaacagata tacattcgca 240
tcgacacttt ctcatttgcg ccgaaccaat acacccattg ggcgtgatgg aaaaattgcg 300
aagcctaggc aactgcataa tactcattgg ggtttggttt gcccggccga gacgcctgaa 360
ggtcaagctt gtggtttggt caagaatctg gctttgatgt gttacgttac agttggtacg 420
ccaagtgacc ccatcgttga gttcatgatt cagcgcaata tggaagtgct ggaggaatat 480
gaaccgctcc gagcacctaa tgcgacaaag gttttcgtca atggtgtttg ggttggtatt 540
catcgagatc ctgctcattt ggttaaatgt gtgcaagacc ttcgtagatc acacttgatc 600
tctcatgaag tctcacttat tcgagagatt cgagacagag agttcaaggt tttcaccgat 660
gcaggacgag tttgcagacc tctattggtc atcgataatg atcccgaaag cgccaacaaa 720
ggtaacttgg tactgaataa agatcatatt caccgtttgg aggatgacca aacgctacca 780
tcaagcatgg atccgacaga gcgaatcaat caaggatact atggattcca aggtttgatt 840
aatgatggtg ttgttgaata tctagacgcc gaagaagaag agaccgtcat gattaccatg 900
acacctgaag atcttgacat ctctcgacag cttcaggctg gttatcaaat tcgccccgac 960
gagagtggtg atttgaacaa gcgtgtcaag gcacctatca atcctactgc acacatctgg 1020
actcattgtg aaattcatcc aagtatgatc cttggtatct gtgcaagcat cattcccttc 1080
ccggatcata accaggtaag ctttcagtcc aagaatgaac gattgacact aggctaatca 1140
tgtactacaa agtctcatcg ta 1162

Claims (9)

1.一种用于桑椹肥大型菌核病菌检测的引物，其特征在于，所述的引物的序列为：上游引物如SEQ:ID:NO:1所示，下游引物如SEQ:ID:NO:2所示，所述桑椹肥大型菌核病菌为Ciboria shiraiana。
2.一种用于桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组，所述桑椹肥大型菌核病菌为Ciboria shiraiana。
3.根据权利要求2所述用于桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括NovoStart®SYBR qPCR SuperMix plus。
4.根据权利要求2所述用于桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求4所述用于桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括桑椹肥大型菌核病菌基因组DNA；所述阴性对照品包括去离子水。
6.权利要求2所述的试剂盒在桑椹肥大型菌核病菌qPCR检测中的应用，所述桑椹肥大型菌核病菌为Ciboria shiraiana。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1）提取待测样品基因组DNA；
2）以待测样品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行qPCR扩增反应，收集荧光数据；
3）根据所述荧光数据的Ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在桑椹肥大型菌核病菌；当Ct值>35或为N/A，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含病菌；当28＜Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有、无来判断是否存在病菌；当Ct值≤28，且有明显的扩增曲线, 则表示待测样品中含有病菌；
4）当Ct值≤28，按照如下公式计算待测样品中桑椹肥大型菌核病菌基因组DNA的浓度X；所述浓度X的单位为pg/µg，X=10(30.87-Ct值)/3.205。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2）中所述qPCR扩增反应使用的反应体系以20µL计包括：待测样品基因组DNA 1µL、上游引物1 µL、下游引物1 µL、NovoStart®SYBR qPCR SuperMix plus10µL和ddH2O 7 µL；
所述上游引物和下游引物的使用浓度独立为10 µM；
步骤2）中所述qPCR扩增反应的程序为：95℃ 3min，[95℃10s、60℃ 20s，72℃ 20s，40个循环]，72℃ 20s，反应结束。
9.权利要求1所述的引物在桑椹肥大型菌核病菌的检测过程中的应用，所述桑椹肥大型菌核病菌为Ciboria shiraiana。
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