CN118256521A - 一种用于栎树早烘病检测的线粒体cytb基因片段及其应用和栎树早烘病检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种线粒体cytb基因片段及其应用和栎树早烘病检测方法。本发明从栎树早烘病病样中分离得到一种新病原菌，鉴定为Tubakia japonica，并研究获得其线粒体CYTB基因特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可用于该病原菌的特异性检测，实现栎树早烘病的特异检测诊断。本研究还提供针对上述基因片段的特异性引物及试剂盒，该引物特异性强，灵敏度高。本发明首次利用分子生物学手段对栎树早烘病进行检测，检测方法特异灵敏、快速简便、结果可靠，有助于及早发现病害，并及时采取相应的防治措施，降低病害对栎树产量和品质的影响。

Description

一种用于栎树早烘病检测的线粒体cytb基因片段及其应用和 栎树早烘病检测方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域。更具体地，涉及一种用于栎树早烘病检测的线粒体cytb基因片段及其应用和栎树早烘病检测方法。

背景技术

栎树是一种重要林木，木材材质坚硬，可供制造车船、农具、地板、室内装饰等用材；树皮为制造软木的原料；树叶可饲柞蚕；种子富含淀粉，可供酿酒或作家畜饲料，加工后也可供工业用或食用；壳斗、树皮富含鞣质，可提取栲胶；朽木亦可培养香菇、木耳等食用菌。栎树可谓全身都是宝。

栎树早烘病，是一种多发的栎树严重真菌性病害，该病害主要影响栎树的叶片，主要症状为栎树叶上早期出现点状红褐色斑点，后期斑点相连，叶片枯死，严重时整个栎树的栎叶出现红褐色干枯状，危及整株健康，且病菌分生孢子经过气流传播。近年来，栎树早烘病在我国柞蚕区逐渐蔓延，对栎叶的生长和发育造成严重的损害，不仅严重影响栎叶的产量和质量，还影响柞蚕取食。

目前，栎树早烘病的防治方法主要是用波尔多液、石灰硫磺合剂和防霉灵等农约进行防治。但是待症状明显时往往已难防控，因此建立一种能早期准确识别和检测栎树早烘病的方法，是制定有效防治策略的前提。

传统的栎树早烘病检测方法主要是采用分离病原菌，进而针对检测病原菌，如菌丝培养和镜检法，但该类方法耗时长、操作繁琐，且检测灵敏度较低。

相比传统的病原菌检测方法，分子检测技术具有特异性和灵敏性更高的优势。线粒体基因具有高度保守性，利用病原菌的线粒体基因特异片段作为靶基因，可以提高分子检测的特异性和灵敏性，能够更加准确可靠地检测栎树早烘病。然而目前尚未见专门针对栎树早烘病的病原菌线粒体特异基因的相关报道。

发明内容

本发明旨在解决现有缺乏针对栎树早烘病分子检测技术的问题，首先从栎树早烘病病样中分离得到一种新病原菌，鉴定为Tubakia japonica，并研究获得其线粒体CYTB基因特异性片段，并提供针对上述基因片段的检测引物与栎树早烘病检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测栎树早烘病的病原Tubakia japonica线粒体cytb基因片段及其应用。

本发明的第二个目的是提供一种栎树早烘病检测引物组。

本发明的第三个目的是提供一种栎树早烘病检测试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种检测栎树早烘病的方法及其应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从栎树早烘病病样中分离得到一种新病原菌，经鉴定为Tubakiajaponica，并研究获得其线粒体CYTB基因特异性片段，该片段可用于病原菌Tubakiajaponica的特异性检测，实现栎树早烘病的特异检测诊断。因此，本发明提供如下应用方案：

本发明提供一种用于检测栎树早烘病的线粒体cytb基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述cytb基因片段作为检测靶点在检测栎树早烘病中的应用。

检测上述cytb基因片段的试剂在制备检测栎树早烘病的产品中的应用。

作为一种可选择的优选方案，本发明提供一种栎树早烘病检测引物组，具体是能够特异性检测上述cytb基因片段的引物组。

作为方案之一，所述引物组包括上游引物TCYTB4F和下游引物TCYTB4R；上游引物TCYTB4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物TCYTB4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

并基于此，本发明还提供一种栎树早烘病检测试剂盒，含有检测所述cytb基因片段的试剂，或含有上述引物组。

作为可选择的实施方案，试剂盒还含有2×GS Taq PCR Mix和ddH₂O。

本发明还提供一种检测栎树早烘病的方法，以上述cytb基因片段为靶点对待测栎树样本进行检测，根据结果判断待测栎树样本是否感染早烘病；如检测结果为阳性，则待测栎树样本感染早烘病；如检测结果为阴性，则待测栎树样本未感染早烘病。

具体地，作为一种优选方案，所述检测栎树早烘病的方法，以待测栎树样本的DNA为模板，利用上文所述引物组或试剂盒进行检测；根据结果判断待测栎树样本是否感染早烘病；如检测结果为阳性，则待测栎树样本感染早烘病；如检测结果为阴性，则待测栎树样本未感染早烘病。

作为可选择的实施方案，所述检测为PCR检测，根据PCR扩增产物是否阳性，来判断待检测样本是否感染早烘病。

优选地，所述PCR扩增的退火温度为49～53℃，循环次数为32～35次。

具体地，所述PCR扩增产物的条带大小为250～500bp。

优选地，所述的PCR反应体系为：2×GS Taq PCR Mix 10～15μL，10pmol/μL的引物TCYTB4F 0.5～1.5μL，10pmol/μL的引物TCYTB4R 0.5～1.5μL，DNA模板1～5μL，水补足至25μL。

该检测方法特异性、灵敏性高，可在少量病原菌存在时即可敏感地检测，可用于栎树早烘病病株的早期检测诊断，且方法快速简便、结果可靠，有助于及早发现病害，并及时采取相应的防治措施，在栎树检疫、栎树早烘病早期鉴定从而降低病害对栎树产量和品质的影响方面，具有重要价值。

因此，上述方法在栎树检疫、栎树早烘病鉴定中的应用，也应在本发明保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明从栎树早烘病病样中分离得到一种新病原菌，鉴定为Tubakia japonica，并研究获得其线粒体CYTB基因特异性片段，可用于该病原菌的特异性检测，线粒体基因的高度保守性增加了检测的准确性和可靠性。本发明还针对该基因片段设计出特异性引物，该引物灵敏度高，可以在少量病原菌存在时仍能敏感地检测，可用于栎树早烘病病株的早期检测诊断。

本发明首次利用分子生物学手段对栎树早烘病进行检测，与传统的病原菌生化鉴定检测方法相比，本发明的分子生物学检测方法特异灵敏、快速简便、结果可靠，有助于及早发现病害，并及时采取相应的防治措施，在栎树检疫、栎树早烘病早期鉴定从而降低病害对栎树产量和品质的影响方面，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为栎树早烘病叶片病斑图。

图2为栎树早烘病叶片所检测到的真菌微生物占比结果(饼状图中的数值表示物种所占比例)。

图3为分离的病原菌回接栎树叶片后发生早烘病害结果及病斑放大图的照片(A图为叶片出现早烘病病斑图；B图为病灶在显微镜下放大10倍图)。

图4为栎树早烘病病原菌Tubakia japonica在PDA培养基的形态图(A图为Tubakiajaponica在PDA培养基上的生长形态；B图为Tubakia japonica在PDA培养基上生长的菌丝在显微镜下放大400倍图)。

图5为栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的ITS基因系统进化树。

图6为四组引物对栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的DNA PCR扩增检测结果(M：Takara DL 2000Marker；泳道1：TCYTB1F/R引物扩增结果；泳道2：TCYTB2F/R引物扩增结果；泳道3：TCYTB3F/R引物扩增结果；泳道4：TCYTB4F/R引物扩增结果)。

图7为引物组TCYTB4F/R的特异性检测结果(M：Takara DL 2000Marker；泳道1：栎树早烘病病叶总DNA扩增结果；泳道2：栎树早烘病病原菌Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道3：桑膝节霉(Gonatophragmium mori)DNA扩增结果；泳道4：桑新褐斑壳丰孢(Neophloeospora maculans)DNA扩增结果；泳道5：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)DNA扩增结果；泳道6：木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)DNA扩增结果；泳道7：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)DNA扩增结果；泳道8：桑锈孢锈菌(Aecidium mori Barclay)DNA扩增结果；泳道9：链格孢菌(Alternaria alternata)DNA扩增结果；泳道10：球形黑孢菌(Nigrospora Sphaerica)DNA扩增结果；泳道11：暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)DNA扩增结果；泳道12：DNA空白对照扩增结果)。

图8为TCYTB4F/R引物组的灵敏度检测结果(M：Takara DL2000 Marker；泳道1为18.6ng/μL Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道2为18.6×10^-1ng/μL Tubakia japonicaDNA扩增结果；泳道3为18.6×10^-2ng/μL Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道4为18.6×10^-3ng/μL Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道5为18.6×10^-4ng/μL Tubakia japonicaDNA扩增结果；泳道6为18.6×10^-5ng/μL Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道7为18.6×10^-6ng/μL Tubakia japonica DNA扩增结果；泳道8为18.6×10^-7ng/μL Tubakia japonicaDNA扩增结果)。

图9为TCYTB4F/R引物组对栎树早烘病田间样本的PCR检测结果(M：Takara DL2000Marker；泳道1～3为辽宁省丹东市宽甸满族自治县蒙古栎早烘病病样扩增结果；泳道4～6为辽宁省丹东市宽甸满族自治县辽东栎早烘病病样扩增结果；泳道7～8为栎树早烘病病原菌Tubakia japonica接种健康栎树10天的病部DNA扩增结果；泳道9为栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的DNA扩增结果；泳道10为DNA空白对照扩增结果)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中，用到的微生物信息：

桑新褐斑壳丰孢(Neophloeospora maculans)，保存在本实验室；在文章《刘吉平.桑树真菌性病害褐斑病和轮纹病的病原菌检测技术获得新进展[J].蚕学通讯[2024-01-18].》中披露。

桑膝节霉(Gonatophragmium mori)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)，保存在本实验室；在专利《刘吉平.202310254957.8一株枯草芽孢杆菌和生防菌剂及其应用[2023.08.25].》中披露。

平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、桑锈孢锈菌(Aecidium moriBarclay)、链格孢菌(Alternaria alternata)、球形黑孢菌(Nigrospora Sphaerica)，由本实验室分离、鉴定并保存。

实施例1栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的分离鉴定

1、样本

采集自辽宁省丹东市栎树早烘病叶片样本，栎树早烘病叶片病斑如图1所示。

利用宏基因组高通量测序(Metagenomics Sequencing，mNGS)辅助鉴定病原，占比值可表示该微生物在样本中的检测量，所检测到的真菌微生物占比结果如图2所示，根据结果显示，Tubakia属占比为1.3692％。

2、分离与致病性验证

从上述栎树早烘病叶片样本上经组织分离得到一株纯培养的病原菌，经科赫氏法则实验证实为栎树早烘病病原菌。将分离的病原菌回接栎树叶片进行致病性验证，结果如图3所示，结果显示栎树叶片发生早烘病害。

3、鉴定

上述得到的纯培养病原菌，在PDA培养基上的生长形态如图4所示，在PDA培养基上菌株呈白色，触感坚硬且可以产生“水珠”，盾片是由密集排列的菌丝组成，菌丝自中心细胞辐射状生长出，有隔，具1～3个分叉，菌丝束尖端呈圆形或刺状，芽殖。

另外该纯培养病原菌(目标菌株)经ITS(内源转录间隔区)测序进行分子生物学鉴定，鉴定系统进化树如图5所示，鉴定该纯培养病原菌属于Tubakia japonica。

综合形态特征和分子鉴定，上述得到的纯培养病原菌属于Tubakia japonica。实施例2栎树早烘病病原菌Tubakia japonica线粒体cytb基因的获得

本研究首先完成了对栎树早烘病病原菌Tubakia japonica线粒体测序，对测序结果进行组装及基因的注释。

经数据库比对之后，筛选得到栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的线粒体特异cytb基因，其核苷酸序列(5’-3’)如下：

AACCTTTTTTTATTAAAGAAATGTTATATAAATTGGGACTATAAAGCTTTTGGCCTTTCCATCCTGATATACATTATGGATTGATTTAATAAAATCCTGATTTTAATTTATCGATCTTTTACCTTTCTACGCCATTTTAAGATCTATTCCTAATAAATTATTAGGTGTTATTGCTATGTTAAGTGCTATTTTAATAATCTTAGCATTACCTTTTGTTGACTTAGGAAGATCAAGAGGTTTACAATTTAGACCCTTAAGTAAAATAGCCTTTTTCGTATTTGTAGCCAATTTCTTAATCTTAATGCAAATAGGTGCAAAACACGTAGAAGATCCATTTATCTTATTAGGACAAATTAGTACCGTTTTATATTTTGGTCATTTCTTATTTATAGTACCTTTTTTAAGTGTATTAGAAAATACTTTAATCGACTTAAATTCTACTAAGTTGGCGAGGAAATAAAGAGTCTTTTGGTTCTATATCTAAAGGAGGTTTAACTCTGTAAACAATGCAACTTTAAACAGATTCTTTGCTCTTCATTTTGTACTACCTTTTATATTAGCGGCTTTAGTGTTAATGCACATGATTGCTTTACATGATACATCGGGATCTGGAAATCCTTTAGGACTTTCAGGTAATTATGATAGAGTACCTATGGCTCCTTATTTCTTATTTAAAGATTTAATTACT ATATTTATCTTTTTATTTGTATTAAGTATATTTGTATTCTTCATGCCTAATGTTTTAGGAGATAGTGATAATTATATCATGGCTAACCCCATGCAGACTCCTCCTGCTATAGTTCCAGAGTGATAGAAAGACAAAGATGTCACTTAATCTCGCTATATGCTGGAA。

实施例3栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的特异检测引物设计

(一)引物设计

1、针对实施例1的栎树早烘病病原菌Tubakia japonica线粒体CYTB基因片段设计了4对检测引物，引物的核苷酸序列如表1所示。以栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的DNA作为模板，使用4对检测引物进行扩增。

表1栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的特异检测引物序列

2、PCR方法：PCR扩增体系和程序

PCR扩增的反应体系为：2×GS Taq PCR Mix 12.5μL，10pmol/μL的上下游引物(上游引物为TCYTB4F，下游引物为TCYTB4R)各1μL，DNA模板2μL，ddH₂O 8.5μL；

PCR的反应条件为：98℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃1min，34个循环；72℃5min。

3、扩增结果

四组引物对栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的PCR扩增检测结果如图6所示，结果表明，引物组TCYTB1F/R扩增出多条带，引物不特异。引物组TCYTB2F/R和引物组TCYTB3F/R均不能扩增出目的片段条带。而引物组TCYTB4F/R能扩增出明亮且单一的条带，符合要求，因此选择引物组TCYTB4F/TCYTB4R进行后续实验。

引物组TCYTB4F/TCYTB4R扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

AACTTTAAACAGATTCTTTGCTCTTCATTTTGTACTACCTTTTATATTAGCGGCTTTAGTGTTAATGCACATGATTGCTTTACATGATACATCGGGATCTGGAAATCCTTTAGGACTTTCAGGTAATTATGATAGAGTACCTATGGCTCCTTATTTCTTATTTAAAGATTTAATTACTATATTTATCTTTTTATTTGTATTAAGTATATTTGTATTCTTCATGCCTAATGTTTTAGGAGATAGTGATAATTATATCATGGCTAACCCCATGCAGACTCCTC

(二)引物特异性测试

PCR特异扩增：以栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的总DNA为模板，以其它9种真菌(9种阴性对照真菌如表2所示)的总DNA为阴性对照，以ddH₂O为空白对照，使用表1中的所示的TCYTB4F/R引物组进行PCR扩增，PCR方法同上。

对上述各样本的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测TCYTB4F/R引物组对Tubakiajaponica的特异性。

引物组TCYTB4F/R的特异性检测结果如图7所示，可以看出，只有泳道1、泳道2扩增出单一明亮条带，且目的片段大小约为284bp，介于250～500bp之间，而其它9种真菌和空白对照均没有扩增出相似大小的片段。可见，引物组TCYTB4F/TCYTB4R能够对特异性地对栎树早烘病病样DNA和栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的DNA(泳道1和泳道2)进行扩增，而无法对桑膝节霉DNA(泳道3)、桑新褐斑壳丰孢DNA(泳道4)、尖孢镰刀菌DNA(泳道5)、木贼镰刀菌DNA(泳道6)、平头炭疽菌(泳道7)、桑锈孢锈菌DNA(泳道8)、链格孢菌DNA(泳道9)、球形黑孢菌DNA(泳道10)和暹罗炭疽菌DNA(泳道11)进行扩增，说明引物组TCYTB4F/TCYTB4R能够特异检测栎树早烘病病原菌Tubakia japonica。

表2九种阴性对照真菌名称

实施例4TCYTB4F/R引物组检测灵敏度

提取栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的总DNA并测定DNA浓度，然后对总DNA模板进行十倍梯度稀释，稀释后Tubakia japonica的总DNA模板的浓度分别为18.6ng/μL、18.6×10^-1ng/μL、18.6×10^-2ng/μL、18.6×10^-3ng/μL、18.6×10^-4ng/μL、18.6×10^-5ng/μL、18.6×10^-6ng/μL、18.6×10^-7ng/μL，以上述各浓度的总DNA为模板，用TCYTB4F/R引物组按照实施例3的PCR方法进行检测。

TCYTB4F/R引物组的灵敏度检测结果如图8所示，结果表明，以18.6ng/μL、18.6×10^-1ng/μL、18.6×10^-2ng/μL、18.6×10^-3ng/μL、18.6×10^-4ng/μL、18.6×10^-5ng/μL浓度的栎树早烘病病原菌Tubakia japonica的DNA为模板，按实施例3的PCR方法扩增后均能扩增出清晰的条带，条带大小为284bp左右，检出限为18.6×10^-5ng/μL，说明该引物具有很好的灵敏度。

实施例5TCYTB4F/R引物组对栎树早烘病田间样本的测定

为快速检测栎树早烘病，收集栎树早烘病叶片(辽宁省丹东市宽甸满族自治县的栎树早烘病叶片)，提取总DNA，作为栎树早烘病株样本模板，以ddH₂O为空白对照，以栎树早烘病病原菌Tubakia japonica为阳性对照，按照实施例3的PCR方法进行PCR扩增。

TCYTB4F/R引物组对栎树早烘病田间样本的PCR检测结果如图9所示，结果表明，TCYTB4F/R引物组对辽宁省丹东市宽甸满族自治县蒙古栎早烘病病样、辽宁省丹东市宽甸满族自治县辽东栎早烘病病样、栎树早烘病病原菌Tubakia japonica接种健康栎树10天的病部DNA病样均能扩增出条带，表明TCYTB4F/R引物组适用性强，能检测出不同地区的栎树早烘病病原菌Tubakia japonica。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测栎树早烘病的线粒体cytb基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.权利要求1所述cytb基因片段作为检测靶点在检测栎树早烘病中的应用。

3.检测权利要求1所述cytb基因片段的试剂在制备检测栎树早烘病的检测产品中的应用。

4.一种栎树早烘病检测引物组，其特征在于，包括检测权利要求1所述cytb基因片段的引物组。

5.根据权利要求4所述检测引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物TCYTB4F和下游引物TCYTB4R；上游引物TCYTB4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物TCYTB4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种栎树早烘病检测试剂盒，其特征在于，含有检测权利要求1所述cytb基因片段的试剂，或含有权利要求4或5所述引物组。

7.一种检测栎树早烘病的方法，其特征在于，以权利要求1所述cytb基因片段为靶点，对待测栎树样本进行检测，根据结果判断待测栎树样本是否感染早烘病；如检测结果为阳性，则待测栎树样本感染早烘病；如检测结果为阴性，则待测栎树样本未感染早烘病。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以待测栎树样本的DNA为模板，利用权利要求4或5所述引物组或权利要求6所述试剂盒进行PCR检测；根据结果判断待测栎树样本是否感染早烘病；如检测结果为阳性，则待测栎树样本感染早烘病；如检测结果为阴性，则待测栎树样本未感染早烘病。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的退火温度为49～53℃，循环次数为32～35次。

10.权利要求7～9任一所述方法在栎树检疫或栎树早烘病鉴定中的应用。