CN112322773A - 珊瑚菜的内参基因exp2及其筛选方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用，属于植物基因工程技术领域。具体涉及珊瑚菜的内参基因及其引物，所述内参基因为EXP2并提供了一种珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，填补了珊瑚菜研究领域中缺少合适的、通用的内参基因的空白。

Description

珊瑚菜的内参基因EXP2及其筛选方法与应用

本申请为分案申请；

原申请申请日：2019-07-22；

申请号：CN201910659220.8；

发明创造名称：珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用；

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及珊瑚菜的内参基因、及其筛选方法与应用。

背景技术

珊瑚菜，为伞形科草本植物，以根入药，名北沙参，是我国传统中药材，在《神农本草经》中被列为上品，其性味甘淡，微寒，有养阴清肺，益胃生津功效，主治肺热阴虚燥咳，胃燥咽干口渴等症，临床和保健中常用，在国内外市场年需求量可达8000吨以上。

珊瑚菜野生资源主要有两个分布区域：其一为东亚珊瑚菜分布区，其二为北美珊瑚菜分布区，中国是东亚珊瑚菜分布区的主要生长地域之一。在我国，辽宁、江苏、山东、浙江、福建、广东以及海南的沿海海岸，在历史上均为珊瑚菜的道地药材产区，是北沙参商品药材的重要来源地。珊瑚菜生长于原始海滩的沙地中，其根系发达，在生长过程中自然膨大形成根状茎，因此，也是海岸固沙的良好经济品种。目前珊瑚菜的产业研究中面临两个主要问题，问题之一是亟需进行珊瑚菜耐盐机制研究，前期由于沿海开发等原因，上述珊瑚菜的沿海道地产区范围逐渐缩小，甚至消失；所以珊瑚菜的主要产区逐渐向内陆转移，比如内蒙、河北等内陆地区，逐渐成为了珊瑚菜的主要人工种植栽产区，但是，在内陆人工种植栽产区内，珊瑚菜长势受限，且质量参差不齐。虽然近年来，随着我国沿海新围垦土地的开发利用，为珊瑚菜的沿海道地产区规模的恢复提供了空间和机遇，然而现有的珊瑚菜主栽种由于长期由内陆栽培及人工选种，导致耐盐性不足，在沿海盐碱地恢复种植难度极大。问题之二是珊瑚菜药材道地性形成的机制尚未清晰，而其特定的沿海高盐生存环境，或许是影响其药效成分积累和药材道地性形成的重要原因，具体的影响机制有极大研究意义。要解决上述两个问题，不可避免地要对珊瑚菜的耐盐机制、育种、活性成分的合成代谢机理等各个方面进行研究，均需对珊瑚菜进行植物分子生物学领域的研究。

基因表达分析是植物分子生物学领域研究中重要手段之一，其在深入对探寻植物相关基因和调控机理、揭示植物奥妙等方面至关重要。在研究基因表达水平时，需要用到内参基因作为参照，如实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qRT-PCR)技术，为获得更加准确可信的结果，都需要内参基因对目标基因的表达水平进行标准化衡量。

在通过qRT-PCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同样品初始模板差异、反转录效率差异的影响，需要引入稳定的内参基因对表达结果进行校正。内参基因通常是各种持家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1)不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA非特异性扩增；2)高度或中度表达，排除低表达；3)稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；4)表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5)其稳定的表达水平与目标基因相似；6)不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。在植物中经常用的如18S rRNA、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(Actin)等作为内参基因。然而完美的内参基因几乎不存在，大多内参基因在不同的环境条件、不同的发育阶段和组织器官中表达并不是恒定不变的，只能在一定的试验范围内相对稳定，同时，不同植物有最合适的内参对照基因而同一种植物不同组织之间内参基因的稳定性也存在差异。所以，如果盲目以一种基因作为任何试验条件下的内参基因则直接影响研究结果的可靠程度，甚至产生错误的结果，因此针对特定的试验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因表达结果至关重要。

同时越来越多的研究者在分析基因表达时，也逐渐倾向选择应用多个内参基因共同校正的研究方法，如设置两个或两个以上稳定的内参基因，将得到的结果进行均一化，去校正目标基因，这样也更能够降低实验误差，增加研究结果的可靠程度。比如，在水稻BAHD酰基转移酶表达研究中，研究者评估了五个内参基因，最终确定用稳定性最高的两个内参基因Ubq5和Cc55共同进行荧光定量PCR结果校正(Bartley LE et al.Overexpression ofa BAHD acyltransferase,OsAt10,alters rice cell wall hydroxycinnamic acid contentandsaccharification.Plant Physiol.2013,161:1615-1633)。同样的，在钾离子通道HKTs家族基因的表达分析中，研究者则应用了两个内参基因UBQ5和18sRNA同时进行校正，以增加结果稳定性(Wang R,Jing W,Xiao L,Jin Y,Shen L,Zhang W.The rice high-affinity potassium transporter1；1is involved in salt tolerance and regulatedby an MYB-type transcription factor.Plant Physiol.2015,168(3):1076-90)。因此，在根据特定的实验条件和样品筛选内参基因并进行稳定性评估后，评估稳定性居于前列的内参基因，在多内参校正中具有重要的使用价值。

而目前，没有关于珊瑚菜内参基因的开发、筛选和稳定性验证方面的研究报道，加之上述原因，对珊瑚菜的稳定内参基因及其引物的开发，在珊瑚菜分子生物学研究、以及伞形科植物的研究中皆具有重要实际应用价值。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有技术中缺少对珊瑚菜进行相关基因表达分析的有效手段，本发明提供珊瑚菜的内参基因、及其筛选方法与应用；通过珊瑚菜转录组测序数据库，进行内参基因开发、选取四种不同实验处理条件进行稳定性筛选和验证，适用于珊瑚菜盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)处理研究下的稳定内参基因及其引物。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

珊瑚菜的内参基因，所述内参基因为EXP2；所述EXP2的核苷酸序列为SEQ IDNO.10。

用于扩增上述内参基因的PCR引物。

优选地，所述引物的扩增片段大小为100～250bp。

优选地，所述用于扩增EXP2的引物对序列为SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34。

上述珊瑚菜的内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，包括以下步骤：

(1)选取分别经盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理过的4种模板珊瑚菜的根部组织样品；

(2)利用珊瑚菜转录组测序数据，筛选出珊瑚菜的内参基因；

(3)以挑选出的内参基因序列为模板，设计实时荧光定量PCR的内参基因引物；

(4)进行实时荧光定量PCR；通过ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计软件，对得到的实时荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出最优内参基因和内参基因组合，然后综合分析软件RankAggreg R进行综合排名分析。需要说明的是，上述步骤(1)可以位于步骤(2)之后，也可以位于步骤(3)之后；但步骤(1)必须位于步骤(4)之前。

优选地，进行所述步骤(4)中的实时荧光定量PCR前，先通过普通PCR鉴定内参基因引物的特异性(使用由南京诺唯赞生物科技有限公司提供的DNA聚合酶：Green Taq Mix；鉴定条件：95℃3min，95℃15s，56℃15s，72℃60s/kb，30个循环；72℃5min)。

优选地，所述步骤(4)中，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环。

优选地，所述步骤(4)中，通过ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计软件，对得到的实时荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出最优内参基因和内参基因组合，然后综合分析软件RankAggreg R进行综合排名分析。

优选地，所述珊瑚菜的内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，具体步骤如下：

1)材料及处理方法：选取长势一致的沙培珊瑚菜，分别利用浓度为200mM的NaCl溶液、质量浓度为20％的PEG(聚乙二醇)6000溶液、100μM ABA(脱落酸)溶液以及100μMMeJA(茉莉酸甲酯)溶液分别对不同的珊瑚菜进行盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理得到模板珊瑚菜；在处理时间为0h、6h、24h时的三个时间点对每株模板珊瑚菜的根部进行取样，每个时间点对珊瑚菜均进行三次生物学重复的采样；

2)RNA提取与检测：将采取的所有珊瑚菜的根部组织样品，利用去离子水冲洗，吸水纸吸干，液氮速冻；利用Trizol Reagent(TakaRa)试剂盒提取珊瑚菜根部组织样品的RNA(提取方式与试剂盒说明书中的内容一致)；利用电泳检测提取出的RNA的完整性，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，170V电压下电泳10min，利用凝胶成像系统观察并分析；用NanoDropND-2000对提取的RNA进行纯度检测(纯净RNA的OD260/280在1.8～2.2之间)以及浓度的定量；

3)RNA反转录合成cDNA：取0.5-1μg珊瑚菜的RNA样品使用反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)对RNA进行反转录反应；

4)候选内参基因筛选：利用珊瑚菜转录组测序数据，参考模式植物拟南芥的基因同源筛选出进行稳定性分析的珊瑚菜的候选内参基因；

5)特异性引物的设计及检测：以筛选出的候选内参基因序列为模板，利用站点Primer 3web(http://primer3.ut.ee/)进行实时荧光定量PCR的内参基因引物的设计；

以模板珊瑚菜反转录得到的cDNA为模板，先通过普通PCR初步鉴定引物特异性。

6)内参基因引物标准曲线的建立：建立每一个内参基因引物的标准曲线：将反转录得到的cDNA稀释成6个浓度梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125)，作为建立标准曲线的模板；以引物为引导进行实时荧光定量PCR；

7)荧光定量PCR扩增：以反转录得到的cDNA为模板，对内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Ct值；扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环；利用得到的荧光定量PCR结果，绘制标准曲线，求得各候选基因的扩增效率及斜率，候选内参基因的引物扩增效率在88％-108％之间；

8)利用ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计分析方法，分析内参基因的稳定性；

9)利用RankAggreg R程序包对四种统计分析方法得到的候选内参基因稳定性排名进行综合统计排名，得到综合结果；

10)利用2^-ΔΔCt法对应用内参基因进行目标基因表达量分析验证，ΔCt＝Ct(目标基因)-Ct(内参基因)，ΔΔCt＝ΔCt(处理)-ΔCt(对照)，2^-ΔΔCt＝相对表达量。

上述的珊瑚菜的内参基因在研究珊瑚菜目标基因表达水平中的应用。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)面对现有珊瑚菜行业中急需对珊瑚菜的耐盐机制、育种、活性成分的合成代谢机理等各个方面进行研究，利用PCR对珊瑚菜不同部位、不同组织、在面对不同情况时的基因表达进行分析的现状，发明人在珊瑚菜物种中筛选出多个候选内参基因，并揭露了内参基因序列；填补了珊瑚菜研究领域中缺少合适的、通用的内参基因的空白；

(2)本发明在珊瑚菜物种中筛选出多个内参基因，并以此设计了实时荧光定量PCR引物，经验证引物扩增效率高，特异性强(详见表1及图1)，不仅填补了珊瑚菜研究领域中缺少合适的、通用的内参基因的空白，也填补了珊瑚菜研究领域中缺少合适的荧光定量PCR引物的空白，为今后珊瑚菜基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。

(3)本发明针对珊瑚菜物种稳定内参基因的研究空白，以转录组数据为基础，对上述内参基因进行了筛选，利用多种统计方法分析并综合比较内参基因稳定性；设置了不同的处理条件，比如盐胁迫，干旱胁迫，激素胁迫，能够满足大多数生理研究的需要；取材是药用活性部位，研究更有针对性；其中，在盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸和茉莉酸甲酯四种处理下，EXP2稳定性综合排名均居于前30％，属于稳定性好的内参基因(详见附图4)，不仅满足实时荧光定量检测珊瑚菜基因表达水平的要求，且具有较好的校正能力，研究人员在进行在上述胁迫处理研究中，可单独使用其作为内参基因，也可与其它稳定性较好的内参基因进行组合，共同校正目标基因表达量，使研究人员根据实际需求有选择的使用内参基因，以得到稳定可靠的结果，在提高科研工作效率、减少成本的同时，进一步保证研究结果的稳定性、可靠性和重复性。

(4)本发明所提供的内参基因还可以为伞形科其它植物的研究提供参考价值。

附图说明

图1本发明提供的13个引物以珊瑚菜cDNA为模板扩得到的序列电泳图；M：DNAMarker，条带大小顺序从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；编号从1-13所代表基因分别为PP2A、UBQ10、ACT、EF1-α、GAPDH、α-TUB、β-TUB、PTBP1、EXP1、EXP2、TIP41-like、SAND family、CYP2；

图2为13个内参基因的荧光定量PCR的Ct值分布图；

图3是应用GeNorm软件对13个候选内参基因表达稳定值(M)排序图，M值越低，基因越稳定；其中图3A为NaCl处理条件；图3B为PEG处理条件；图3C为ABA处理条件；图3D为MeJA处理条件；

图4应用RankAggreg R程序包对四种统计分析方法得到的排名进行综合分析，得到综合的排名；图4A为NaCl处理条件；图4B为PEG处理条件；图4C为ABA处理条件；图4D为MeJA处理条件；

图5是应用本发明的候选内参基因，对四种胁迫处理下珊瑚菜目标PYL基因表达量变化进行分析，验证本发明提供的候选内参基因应用的效果；图5A为NaCl处理条件；图5B为PEG处理条件；图5C为ABA处理条件；图5D为MeJA处理条件。

具体实施方式

本文中：所述的珊瑚菜转录组测序数据：参考Li L,Li M,Qi X,Tang X,Zhou Y.Denovotranscriptome sequencing and analysis of genes related to salt stressresponse in Glehnialittoralis.PeerJ.2018,6:e5681；

本文中所述的ΔCt参考：Silver N,Best S,Jiang J,Thein SL.Selection ofhousekeeping genes for gene expression studies inhuman reticulocytes usingreal-time PCR.BMC Mol Biol.2006；7:33；

GeNorm参考：Vandesompele J,De Preter K,Pattyn F,Poppe B,Van Roy N,Paepe A,et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes.Genome Biol.2002；3:7；

NormFinder参考：Andersen CL,Jensen JL,

TF.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data:a model-based varianceestimation approach to identify genes suited for normalization,applied tobladder and colon cancer data sets.Cancer Res.2004；64:5245–5250；

BestKeeper参考：Pfaffl MW,Tichopad A,Prgomet C,NeuviansTP.Determination of stable housekeeping genes,differentially regulated targetgenes and sample integrity:BestKeeper-Excel-based tool using pair-wisecorrelations.Biotechnol Lett.2004；26:509–515；

RankAggreg R程序包参见：Pihur V,DattaS,Datta S.RankAggreg,an R packagefor weighted rank aggregation,BMC Bioinformatics 2009,10:6；

本文所述的生物学重复：每单株珊瑚菜为一个重复；

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例为本发明所述的珊瑚菜的内参基因。提供了以下13个珊瑚菜的内参基因：PP2A(蛋白磷酸酶2)、UBQ10(泛素10)、ACT(肌动蛋白)、EF1-α(延伸因子)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、α-TUB(α-微管蛋白)、β-TUB(β-微管蛋白)、PTBP1(多聚嘧啶序列结合蛋白)、EXP1(扩展蛋白1)、EXP2(扩展蛋白2)、TIP41-like(类TIP41蛋白)、SAND family(沙家族蛋白)、CYP2(亲环蛋白)；所述PP2A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述UBQ10的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；所述ACT的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；所述EF1-α的核苷酸序列为SEQID NO.4；所述GAPDH的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；所述α-TUB的核苷酸序列为SEQ IDNO.6；所述β-TUB的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；所述PTBP1的核苷酸序列为SEQ ID NO.8；所述EXP1的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；所述EXP2的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；所述TIP41-like的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；所述SAND family的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；所述CYP2的核苷酸序列为SEQ ID NO.13。

实施例2

本实施例中，提供了用于扩增实施例1中内参基因的荧光定量PCR引物，

引物的扩增片段大小为100～250bp。

用于扩增PP2A的引物对序列为SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16；用于扩增UBQ10的引物对序列为SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18；用于扩增ACT的引物对序列为SEQ ID NO.19/SEQID NO.20；用于扩增EF1-α的引物对序列为SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22；用于扩增GAPDH的引物对序列为SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24；用于扩增α-TUB的引物对序列为SEQ IDNO.25/SEQ ID NO.26；用于扩增β-TUB的引物对序列为SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28；用于扩增PTBP1的引物对序列为SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30；用于扩增EXP1的引物对序列为SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32；用于扩增EXP2的引物对序列为SEQ ID NO.33/SEQ IDNO.34；用于扩增TIP41-like的引物对序列为SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36；用于扩增SANDfamily的引物对序列为SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38；用于扩增CYP2的引物对序列为SEQID NO.39/SEQ ID NO.40。

实施例3

本实施例提供了筛选上述珊瑚菜的内参基因的实时荧光定量PCR方法，其包括以下步骤：(1)选取分别经盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理的珊瑚菜的根部组织样品；

(2)利用珊瑚菜转录组测序数据，筛选出珊瑚菜候选内参基因；

(3)以挑选出的候选内参基因为模板(即PP2A、UBQ10、ACT、EF1-α、GAPDH、α-TUB、β-TUB、PTBP1、EXP1、EXP2、TIP41-like、SAND family、CYP2；具体序列可以参见序列表SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.13)，设计并得到了每个内参基因的实时荧光定量PCR的引物(详见实施例2)；

(4)进行实时荧光定量PCR，对得到的实时荧光定量PCR数据(Ct值)进行统计分析，筛选出最优内参基因。

实施例4

本实施例与实施例3的区别仅在于：步骤(1)位于步骤(2)之后。

实施例5

本实施例与实施例3的区别仅在于：步骤(1)位于步骤(3)之后。

实施例6

本实施例与实施例3的区别仅在于：步骤(1)为材料及处理方法：选取长势一致的沙培珊瑚菜，分别利用浓度为200mM的NaCl溶液、质量浓度为20％的PEG 6000溶液、100μMABA溶液以及100μMMeJA溶液分别对不同的珊瑚菜进行盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理得到模板珊瑚菜；在处理时间为0h、6h、24h时的三个时间点对每株模板珊瑚菜的根部进行取样，每个时间点对珊瑚菜均进行三次生物学重复的采样。

实施例7

本实施例中提供的述珊瑚菜的内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其包括以下步骤：(1)选取分别经盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理过的珊瑚菜的根部组织样品；

(2)利用珊瑚菜转录组测序数据，筛选出珊瑚菜的内参基因；

(3)以挑选出的内参基因为模板(即PP2A、UBQ10、ACT、EF1-α、GAPDH、α-TUB、β-TUB、PTBP1、EXP1、EXP2、TIP41-like、SAND family、CYP2；具体序列可以参见序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13)，设计并得到了每个内参基因的实时荧光定量PCR的引物(详见实施例2)；

(4)通过普通PCR初步鉴定内参基因引物的特异性；

使用由南京诺唯赞生物科技有限公司提供的DNA聚合酶：Green Taq Mix；鉴定条件：95℃3min，95℃15s，56℃15s，72℃60s/kb，30个循环；72℃5min；

(5)进行实时荧光定量PCR，对得到的实时荧光定量PCR数据(Ct值)进行统计分析，筛选出最优内参基因。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(4)为：进行实时荧光定量PCR；通过标准曲线对得到的实时荧光定量PCR数据进行定量分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合；

其中，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环。

实施例9

本实施例中提供了珊瑚菜的内参基因的稳定性筛选方法，具体步骤如下：

1)材料及处理方法：选取长势一致的沙培珊瑚菜，分别利用浓度为200mM的NaCl溶液、质量浓度为20％的PEG 6000溶液、100μM ABA溶液以及100μMMeJA溶液分别对不同的珊瑚菜进行盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理得到模板珊瑚菜；

在处理时间为0h、6h、24h时的三个时间点对每株模板珊瑚菜的根部进行取样，每个时间点对珊瑚菜均进行三次生物学重复的采样(每单株为一个重复)。

2)RNA提取与检测：将提取的珊瑚菜的根部(药用部位)组织样品，利用去离子水冲洗，吸水纸吸干，液氮速冻；利用Trizol Reagent(TakaRa)试剂盒提取珊瑚菜根部组织样品的RNA(提取方式与试剂盒说明书中的内容一致)；

利用电泳检测提取出的RNA的完整性，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，170V电压下电泳10min，利用凝胶成像系统观察，并分析；利用NanoDrop ND-2000对提取的RNA进行纯度检测(纯净RNA的OD260/280在1.8～2.2之间)以及浓度的定量；

3)RNA反转录合成cDNA：取0.5-1μg RNA样品使用反转录试剂盒PrimeScript^TMRTreagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)对RNA进行反转录，得到cDNA。

4)候选内参基因筛选：利用珊瑚菜转录组测序数据，参考模式植物拟南芥的基因同源，筛选出进行稳定性分析的珊瑚菜的候选内参基因；

5)特异性引物的设计及检测：以筛选出的内参基因为模板，利用站点Primer 3(http://primer3.ut.ee/)进行实时荧光定量PCR的内参基因引物的设计；

以反转录得到的cDNA为模板，通过普通PCR鉴定引物特异性，使用由南京诺唯赞生物科技有限公司提供的DNA聚合酶：Green Taq Mix；鉴定条件：95℃3min，95℃15s，56℃15s，72℃60s/kb，30个循环；72℃5min。

6)内参基因引物标准曲线的建立：建立每一个内参基因引物的标准曲线：将反转录得到的cDNA稀释成6个浓度梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125)，作为建立标准曲线的模板；以引物为引导进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线；

7)PCR扩增：以反转录得到的cDNA为模板，对内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Ct值；

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环；利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，引物扩增效率在88％-108％之间。

8)利用ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计分析方法分析内参基因的稳定性；

9)利用RankAggreg R程序包对四种统计分析方法得到的候选内参基因稳定性排名进行综合统计排名，得到综合结果；

10)利用2^-ΔΔCt法对应用内参基因进行目标基因表达量分析验证，ΔCt＝Ct(目标基因)-Ct(内参基因)，ΔΔCt＝ΔCt(处理)-ΔCt(对照)，2^-ΔΔCt＝相对表达量。

实施例10

本实施例为本发明所述的珊瑚菜候选内参基因的开发、筛选过程，以及候选内参基因在不同胁迫处理下的稳定性评估。本实施例中的模板珊瑚菜的种质资源来源于福建平潭沿海，在江苏省中国科学院植物研究所暨南京中山植物园种质资源圃栽培；

(1)材料及处理方法：

前期处理：采集苗圃中珊瑚菜幼苗(地下部长度约3-6cm)移栽于洗净河沙的花盆中，浇灌霍格兰营养液培养于光照培养箱中，昼夜温度分别为26℃和22℃，14h/10h昼夜循环，相对湿度75％，培养三个月；

取样：选取长势一致的沙培珊瑚菜，分别利用浓度为200mM的NaCl溶液、质量浓度为20％的PEG6000溶液、100μM ABA溶液以及100μMMeJA溶液分别对不同的珊瑚菜进行盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理得到模板珊瑚菜；

在处理时间为0h、6h、24h时的三个时间点对每株模板珊瑚菜的根部进行取样，每个时间点对珊瑚菜均进行三次生物学重复的采样(每单株为一个重复)，利用去离子水将采集的模板珊瑚菜的根部组织样品冲洗干净，吸水纸吸干，液氮速冻，放-80℃冰箱用于RNA的提取；

(2)RNA提取与cDNA合成：利用Trizol Reagent(TakaRa)试剂盒提取4种不同的模板珊瑚菜的根部组织样品的RNA(提取方式与试剂盒说明书中的内容一致)；

利用电泳检测提取出的RNA的完整性，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，170V电压下电泳10min，利用凝胶成像系统观察，并分析；利用NanoDrop ND-2000对提取的RNA进行纯度检测(纯净RNA的OD260/280在1.8～2.2之间)以及浓度的定量；

(3)取1μg RNA样品使用反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)进行反转录得到cDNA(反转录方式与试剂盒说明书中的内容一致)。

(4)内参基因筛选及特异性引物设计：依据本研究团队已经获得的珊瑚菜转录组测序数据库信息，参考模式植物拟南芥的基因同源，筛选出珊瑚菜中同源的基因作为候选内参基因(见序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13)；以筛选出的候选内参基因为模板，根据基因序列用Primer 3web(http://primer3.ut.ee/)设计引物，扩增片段大小在100-250bp之间(详见表1)；

以模板珊瑚菜的反转录得到的cDNA为模板，通过普通PCR鉴定引物特异性，电泳后在凝胶成像系统下观察PCR产物的条带，如图1所示选择条带大小正确，条带单一，没有引物二聚体的引物，并将其PCR产物回收测序，以进一步确定目标候选基因扩增产物是否正确。

(6)内参基因引物标准曲线的建立：对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率。将模板珊瑚菜反转录的cDNA以5为倍数稀释成6个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125)，作为建立标准曲线的模板；用qTOWER2.2 Real-Time PCRSystem仪器进行qRT-PCR，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，引物扩增效率在88％-108％之间(详见表1)；

表1珊瑚菜候选内参基因及其对应引物

(7)qRT-PCR：以反转录得到的cDNA为模板，对内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Ct值；采用SYBR Premix ExTaqTM II(TliRNaseH Plus)(Takara)荧光定量试剂盒，扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环；采集熔解曲线信号，生成的熔解曲线为单一峰，说明引物特异性良好，Ct值数据由实时荧光定量PCR仪自动读取，Ct值的分布范围如图2所示。Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高；

(8)内参基因稳定性分析：利用ΔCt，GeNorm，NormFinder，BestKeeper四种统计分析方法，分析内参基因的稳定性；

(9)用RankAggreg R程序包进行内参基因稳定性综合分析。ΔCt是根据Ct值数据分散程度进行排名，mSD(Mean StdDev)越小，基因稳定性越高。表2是应用ΔCt方法对13个候选内参基因在四种不同胁迫处理下的稳定性排名情况。图3是GeNorm是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，M值越小，稳定性越好。表3是NormFinder是基于方差分析，对内参基因稳定性进行直接评价。表4是BestKeeper以标准变异系数(SD)判断内参基因稳定性，SD越小，表明该基因越稳定。如图4所示，最后根据四种方法所得的稳定性排名，应用RankAggreg R程序包做综合排名，在珊瑚菜盐胁迫、干旱胁迫、ABA和MeJA四种处理条件下，CYP2基因综合稳定性排名第一，稳定性最好；

(10)基因相对表达量的计算方法应用2^-ΔΔCt法，具体步骤如下：ΔCt＝Ct(目标基因)-Ct(内参基因)，ΔΔCt＝ΔCt(处理)-ΔCt(对照)，2^-ΔΔCt＝相对表达量。

表2ΔCt方法对13个候选内参基因的稳定性分析

表3 NormFinder法对13个候选内参基因在四种胁迫下的稳定性分析

表3 BestKeeper法对13个候选内参基因在四种胁迫下的稳定性分析

实施例11

本实施例为验证本发明提供的候选内参基因应用的效果。选用PYL(脱落酸受体类似蛋白)为目标基因，PYL是ABA信号转导途径中关键的组分，通常在受到胁迫后其表达量会有所增加。根据珊瑚菜NaCl差异转录组测序研究表明，珊瑚菜PYL基因在盐处理下，表达量明确有上调。因此，本实施例分别选取本发明提供的稳定性较好的和较差的内参基因(附图4)，利用qRT-PCR方法对珊瑚菜PYL基因在盐处理、干旱处理、ABA、MeJA处理下的表达量进行验证、比较应用效果。具体步骤如下：

(1)实验材料与处理方法：模板珊瑚菜的种质资源来源于福建平潭沿海，在江苏省中国科学院植物研究所暨南京中山植物园种质资源圃栽培；

胁迫处理方法如下：采集苗圃中珊瑚菜幼苗(地下部长度约3-6cm)移栽于洗净河沙的花盆中，浇灌霍格兰营养液培养于光照培养箱中，昼夜温度分别为26℃和22℃，14h/10h昼夜循环，相对湿度75％，培养三个月，选取长势相近且健康的植株进行胁迫处理，处理时将沙培的模板珊瑚菜的花盆分别浸泡在200mM NaCl(盐胁迫)、20％PEG 6000(干旱胁迫)、100μM ABA、100μMMeJA溶液中，分别在0、6、24小时取珊瑚菜的根部(药用部位)组织样品，去离子水冲洗干净，吸水纸吸干样品，液氮速冻，放-80℃冰箱用于RNA的提取，每次采样均有三个生物学重复(每单株为一个重复)；

(2)RNA提取与cDNA合成：利用Trizol Reagent(TakaRa)试剂盒提取4种不同的模板珊瑚菜的根部组织样品的RNA(提取方式与试剂盒说明书中的内容一致)；

利用电泳检测提取出的RNA的完整性，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，170电压下电泳10min，利用凝胶成像系统观察，并分析；利用NanoDrop ND-2000对提取的RNA进行纯度检测(纯净RNA的OD260/280在1.8～2.2之间)以及浓度的定量；

(3)取1μg RNA样品使用反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)进行反转录得到cDNA(反转录方式与试剂盒说明书中的内容一致)；

(4)验证内参基因应用效果的目标基因PYL序列及特异性引物设计：依据本研究团队已经获得的珊瑚菜转录组测序数据库信息，参考模式植物拟南芥的PYL基因AT5G05440，得到PYL核酸序列(见序列表SEQ ID NO.14)，根据基因序列用Primer 3web(http://primer3.ut.ee/)设计引物，PYL荧光定量上游引物序列见序列表SEQ ID NO.41，下游引物序列见序列表SEQ ID NO.42，目标片段137bp；

(5)目标基因PYL引物标准曲线的建立：将模板珊瑚菜反转录的cDNA以5为倍数稀释成6个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125)，作为建立标准曲线的模板；

用qTOWER2.2 Real-Time PCR System仪器进行qRT-PCR，利用得到的数据结果计算基因的扩增效率及斜率，PYL引物扩增效率为92.22％，斜率为0.9974；

(6)qRT-PCR：以反转录得到的cDNA为模板，对选用验证的内参基因和目标基因同时进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Ct值；

采用SYBR Premix ExTaqTM II(TliRNaseH Plus)(Takara)荧光定量试剂盒，扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环；采集熔解曲线信号，生成的熔解曲线为单一峰，说明引物特异性良好，Ct值数据由实时荧光定量PCR仪自动读取。Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高；基因相对表达量的计算方法应用2^-ΔΔCt法，具体步骤如下：ΔCt＝Ct(目标基因)-Ct(内参基因)，ΔΔCt＝ΔCt(处理)-ΔCt(对照)，2^-ΔΔCt＝相对表达量。

(7)选取不同内参基因进行qRT-PCR验证本发明提供的内参基因应用的效果：

如图4所示，对内参基因的综合稳定性评估结果，在NaCl处理条件下，分别应用四个内参基因，其中CYP2和EXP1为经验证相对稳定性好的内参基因，而GAPDH和UBQ10为稳定性较差的内参基因；qRT-PCR结果可见，使用GAPDH和UBQ10校正，NaCl处理24h时PYL的表达量较对照比变化幅度较大，而使用稳定性好的CYP2和EXP1做校正，结果相对稳定，因此使用稳定性好的内参基因，能够一定程度上减少假阳性结果的可能(见图5A)。

在PEG处理条件下，分别应用四个内参基因，其中CYP2和ACT为相对稳定性较好的内参基因，而β-TUB和UBQ10稳定性较差；qRT-PCR结果可见，使用相对不稳定的β-TUB和UBQ10基因，在PEG处理24h时PYL的表达量变化差异较大，使用UBQ10甚至出现了与使用其它内参基因相反的趋势，而使用稳定性较好的CYP2和ACT，趋势是一致且重复性好(见图5B)。

在ABA处理条件下，分别应用四个内参基因，其中CYP2和ACT为相对稳定性较好的内参基因，而β-TUB和UBQ10稳定性较差；qRT-PCR结果可见，使用不稳定的β-TUB和UBQ10基因，在ABA处理后PYL的表达量变化不一致，在24h出现了相反的趋势，而使用稳定性较好的CYP2和ACT，PYL表达趋势是一致的，结果更可靠(见图5C)。

在MeJA处理条件下，分别应用四个内参基因，其中CYP2和EXP2为评估相对稳定性较好的内参基因，β-TUB和EF1-α相对稳定性较差；而qRT-PCR结果可见，应用这四个基因得到的PYL表达趋势几乎一致，说明在MeJA处理下，各个内参基因的重复性都比较好，结果可靠(见图5D)。

根据本实施例，本发明开发的稳定性好的内参基因对目标基因表达分析有较好的效果，清楚表现出目标基因PYL在各种胁迫处理6h，24h后基因的表达变化趋势，如果单独使用CYP2，使试验操作简便、减少成本，同时具有可靠性，也可与其他内参基因组合用于校正。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1764

<212> DNA

<213> PP2A

<400> 1

atgtcgaatg ttgaagagcc attgtaccca atagctgtgt tgattgatga gctgaagaat 60

gacgatattc agttgcgact taattctatt agaaggcttt cgactattgc tcgtgctctc 120

ggggaggaac ggacaagaag ggaattgatt ccgtttttga gcgagaacaa tgatgatgac 180

gatgaggttc ttcttgcaat ggccgaagag ttgggagtat ttattcctta tgttggaggt 240

gtggaacacg ctcatgtttt gctccccact cttgaaaatc tttgcactgt tgaagaaact 300

tgtgtcaggg acaaagccgt ggagtcgctt tgtagaattg gatctcagat gagggagagt 360

gatttaaatg actattttgt tcctctagtg aagaggttgg cagcaggtga atggtttact 420

gctcgagttt ctgcttgtgg attgtttcac atcgcatatc ccagtgcacc agagacgttg 480

aaaaccgaat tgcgatcgat atacagtcag ttgtgtcagg atgacatgcc tatggttagg 540

agatctgctg ctacaaattt ggggaagttt gctgcaacca ttgaacctgc tcatctcaag 600

actgatatta tgtcaatatt tgaggatctt acccaggatg atcaagattc tgttcggttg 660

ctagctgttg aaggatgtgc tgctcttgga aagttgttgg aacctcaaga ttgtgtagca 720

catatacttc ccgttattgt caacttttcc caggataagt cgtggcgtgt tcgttacatg 780

gttgccaatc agctctatga attatgtgaa gctgtgggac ctgaacctac caggacggaa 840

ttagttcctg catatgtgcg acttcttcga gataatgaag ccgaagtacg tatagctgct 900

gctggcaaag tcaccaagtt ctgcagaatt cttaatcctg agctagcaat tcagcacatc 960

cttccatgtg tgaaggagtt atcatctgat tcttctcagc atgttagatc tgctctggcc 1020

tcggttataa tgggcatggc tcctgtatta ggaaaggaag caacaatcga gcagcttctt 1080

ccaatatttc tttcccttct gaaggatgaa tttcctgatg tgcgactcaa cattattagc 1140

aagctagatc aagttaatca ggttattgga atagatcttt tgtcccagtc tctgctacca 1200

gccattgttg agcttgcagg ggataggcat tggagagttc gactagcaat tattgagtat 1260

attccgctat tagctagcca attaggagta ggcttcttcg atgataagct tggtactctc 1320

tgtatggagt ggctaaagga taaggtttgc tcgattcgag atgctgctgc tgataacttg 1380

aagcgccttg cagaagaatt tggcccagag tgggcgatgc agcatatcat tccacaggtg 1440

ttggacatga ttaataaccc tcattacctg tatcggatga caatcctgcg tgctatatct 1500

ctacttgctc ctgtcatggg cccagaaatc acatgttcta aactgctacc tgttctagtt 1560

actgcatcaa aggacagagt ggcgaacatc aaattcaatg tggcaaaggt gctgcaatcc 1620

cttattactg tagtcgatca gtctgtggtg gagtcaacaa ttcgcccttg tctggtggaa 1680

cttagcgagg acccggatgt cgatgttcgt ttctttgcca atgaagcact tcatgctatt 1740

gatcatgaca tgatgtcaag ctag 1764

<210> 2

<211> 612

<212> DNA

<213> UBQ10

<400> 2

atgcaaattt ttgtcaagac cctcactggg aagacgatta ccttggaagt agagagctcg 60

gatacaattg acaatgtgaa ggcgaaaatt caagacaagg aaggaatccc tcctgatcag 120

caaaggttga tatttgctgg caagcagtta gaggatggaa ggactttggc cgattacaat 180

attcagaagg aatcaaccct tcatttggtg ctgaggctga ggggtggaat gcagattttt 240

gtgaagactt tgacggggaa aaccatcacc ctggaggtgg agagctcgga caccattgat 300

aatgtcaaag caaaaataca ggacaaagaa ggtatcccac cagaccagca gaggctgatt 360

tttgctggca agcagcttga ggatggtcgt acacttgcag actacaacat ccaaaaggaa 420

tctacccttc acttggtgct acgtctcaga ggagggatgc agatctttgt caagactttg 480

actggtaaga ccattactct ggaggttgaa agctcggata ccattgataa tgtgaaggca 540

aagatccaag acaaggaggg aatcccacca gatcagcaga ggttgatttt tgctggaaag 600

cagttggaag at 612

<210> 3

<211> 1134

<212> DNA

<213> ACT

<400> 3

atggccgatg ctgaggatat ccagccccta gtttgtgaca atggaactgg aatggtgaag 60

gctggttttg ctggtgatga tgctcccaga gcagtattcc ccagtattgt tggtaggccc 120

agacatactg gtgttatggt cgggatgggg cagaaggatg cctatgttgg tgatgaagcc 180

caatcgaaga gaggtattct taccttgaaa tatccgattg agcacggtat tgtgagtaat 240

tgggatgaca tggagaaaat ttggcatcat accttttaca atgagcttcg agttgctcct 300

gaggagcacc cagttctttt gactgaagcg cctctcaatc ccaaggccaa cagggagaaa 360

atgactcaga ttatgtttga gacgtttaat gttcctgcta tgtatgttgc catccaggct 420

gttctttctc tgtatgcaag tggtcgtact actggtattg tgctggattc tggtgatggt 480

gtgagccata ctgtaccaat ttacgaagga tatgcccttc cccatgccat tctccgtctc 540

gaccttgctg gtcgtgatct cactgattct ctcatgaaga tcttaacgga gagaggttac 600

atgttcacca ccactgctga gcgggaaatt gttcgtgaca tgaaggagaa acttgcctat 660

gttgctcttg actacgagca agagcttgaa acctcaaaga gtagctcttc tgtggaaaag 720

aactatgaat tgcctgacgg acaagttatt acaattggag ctgagagatt ccgttgccca 780

gaagtcctgt tccagccgtc tctgatcggg atggaagctg ctggaatcca tgaaaccact 840

tacaactcca tcatgaagtg tgatgtcgat atcagaaagg atctctatgg aaacatagtg 900

ctcagtggtg gttcaacaat gttccccggt attgcagatc gtatgagcaa ggaaattact 960

gcccttgcac ccagcagcat gaagatcaaa gttgttgcac cacccgagag aaaatacagt 1020

gtctggattg gaggatccat tcttgcatct ctcagcacct tccaacagat gtggatatcc 1080

aagggcgaat atgacgagtc tggcccatca atcgtgcaca ggaagtgttt ttaa 1134

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> EF1α

<400> 4

atgggtaagg aaaagattca tatcagtatt gtggtcattg gccatgtcga ctctggaaag 60

tctaccacaa ctggtcatct tatctacaag ctaggtggta tcgacaagcg tgtgattgaa 120

aggttcgaga aggaagctgc tgagatgaac aaacgttcat tcaagtacgc atgggttctt 180

gacaagctta aggctgagcg tgaacgtggt attaccattg atattgctct ttggaagttt 240

gagactacca agtactactg cacagttatt gatgctccag ggcatcgtga tttcattaag 300

aacatgatta ctggaacttc tcaggctgat tgtgctgtcc tgatcattga ctccaccact 360

ggaggttttg aagctggtat ctctaaggat gggcaaactc gtgagcatgc tttgcttgca 420

tttacacttg gtgtcaagca gatgatctgt tgctgcaaca agatggatgc tacaaccccc 480

aagtactcca agtctagatt cgaagaaatt gtgaaggagg tttcttctta tttgaagaag 540

gttgggtaca accccgacaa aattgctttc attcccatct ctggatttga gggtgacaac 600

atgattgata ggtctaccaa ccttgactgg tacaagggac caactcttct tgaagctctt 660

gaccagatct ctgagcccaa gagaccctca gacaagcccc ttcgtctccc acttcaggat 720

gtttacaaga ttggaggtat tggaactgtg ccagtgggac gtgttgaaac tggtgtgatc 780

aagcctggta tggttgtgac ttttggtcct tcagggttga ccactgaagt caagtctgtt 840

gagatgcatc atgaggctct ccaggaggct cttcctggtg acaatgttgg attcaatgtt 900

aagaatgttg ctgttaagga tctcaagcgt ggatatgttg cctccaactc caaggatgat 960

cccgccaaag aggctgccaa tttcactgct caagttatca tcatgaacca ccctggtcag 1020

atctcaaatg gttatgctcc agtgcttgat tgccatacct gtcacattgc tgttaagttt 1080

gctgaaatcc aaaccaagat tgatcgtcga tctggtaagg agatcgagaa ggagcccaag 1140

tttttgaaga atggtgatgc tggatttgtt aagatgattc caaccaagcc catggtggtc 1200

gagaccttta tgacctaccc tcctcttgga aggtttgctg taagggacat gaggcagact 1260

gttgctgtgg gagtcatcaa gagtgtggag aagaaggaac ctaccggagc caaggtcaca 1320

aaggcggcaa tcaagaagaa a 1341

<210> 5

<211> 1010

<212> DNA

<213> GAPDH

<400> 5

atggcaccaa tcaagatcgg aatcaacggt ttcggaagaa ttggacgatt ggttgctaga 60

gttgttctgc aaagagatga tgttgagctt gttgctgtta acgatccatt tatctcaact 120

gattacatga catacatgtt caagtatgac agtgttcacg gtgcatggaa gcatcatgaa 180

ctcaaggtta aggatgagaa gactcttctc ttcggtgcga agcctgttgc tgtctttggt 240

tgcaggaacc cagaggagat cccatgggct agcactggtg cagagtatat tgttgaatcc 300

actggtgtct tcactgacaa ggaaaaggct gctgcacatt tgaagggagg tgcaaagaag 360

gtcatcatat ctgccccaag caaagatgct ccaatgtttg tcgttggtgt caatgagaag 420

gaatacaagt ctgacctcca cattgtttcc aatgctagtt gcacaacaaa ttgccttgct 480

cccctagcta aggtgatcaa tgataggttt ggcattgttg aggggcttat gacaactgtt 540

cattcaatca ctgccacaca aaaaactgtt gacggacctt ctgcgaagga ctggagaggt 600

ggaagagctg cttcattcaa catcattcct agcagcactg gagctgccaa ggctgttgga 660

aaagtgctac cttctctgaa tgggaagttg accggaatgt cattccgagt tcctactgtg 720

gatgtctcag ttgttgatct cactgtcagg ctggaaaaga aggctactta tgaacaaatt 780

aaagctgcca ttaaggagga gtctgaggga aagcttaagg gaatcttggg ttacactgaa 840

gatgatgtgg tttccacaga ctttgtgggt gacagcaggt caagcatctt tgatgccaaa 900

gctggaattg ctctaaatga caactttgtc aagcttgttt cgtggtatga caacgaatgg 960

ggatacagca cccgagtggt tgacttgatc gttcatatgg catctgttca 1010

<210> 6

<211> 1356

<212> DNA

<213> α-TUB

<400> 6

atgagggagt gcatttcagt tcacatcggt caggccggta ttcagatcgg taacgcttgc 60

tgggaacttt actgcctcga gcacggcatt cagcctgatg gccaaatgcc aagtgacaaa 120

actgtcggtg gaggtgatga tgctttcaac actttcttta gtgaaactgg tgctggaaag 180

catgtgcctc gagcaatctt tgtggatctt gagcccactg tcattgatga agtgaggact 240

ggaacatatc gtcagctctt tcatcctgaa cagctgatta gcggaaaaga agatgcagct 300

aacaactttg ctcgtggaca ctataccatt ggaaaggaga ttgttgatct ttgcctggat 360

cgtatcagga agcttgctga caattgcact ggtctccagg gtttccttgt ttttaatgct 420

gttggaggag gcactggttc tggtttgggt tcccttcttc tggaacgtct ctccgtggac 480

tatggcaaaa agtcaaaact tggattcact gtttatcctt caccacagat ctctacctct 540

gttgttgagc cttacaacag tgtgctttcg acccactcac ttttggagca caccgatgtt 600

tctgtgctgc tggataatga ggctatatat gatatttgca agcgttccct tgacattgag 660

cgacccacct ataccaacct taatcgattg gtttctcagg tcatttcctc tttgaccgct 720

tccttgaggt ttgatggagc cttgaatgtt gatgtgactg agttccagac taatctggtg 780

ccatacccaa ggatccactt catgctttct tcttatgccc ctgttatctc cgctgagaag 840

gcctaccatg aacagctatc tgttgcagag atcaccaaca gtgcatttga gccctcttct 900

atgatggcca agtgtgatcc tcgccatgga aagtacatgg cttgctgtct gatgtaccga 960

ggtgatgtgg tgcccaaaga tgtgaatgca gctgttggta ccattaagac caagcgcacc 1020

atccagtttg ttgattggtg cccaactggt tttaagtgcg gtatcaacta tcaggcccca 1080

actgttgttc caggtggtga tcttgccaaa gtgcagagag ctgtatgcat gatctcaaat 1140

tcgaccagtg ttgcagaggt tttctcacgc atagacacta aatttgacct aatgtactca 1200

aagagggctt tcgttcactg gtatgttggc gagggtatgg aagaaggtga attctctgaa 1260

gcacgtgagg atcttgctgc ccttgagaag gactatgagg aggttggtgc agagtctgct 1320

gagggggatg atgaggacga gggagaagat tactga 1356

<210> 7

<211> 1344

<212> DNA

<213> β-TUB

<400> 7

atgagagaaa ttcttcacat tcagggcggt caatgtggaa accagatcgg agcaaagttc 60

tgggaagtga tctgcgccga gcacgggatc gattcgacag ggcgttacca gggagacact 120

gaaattcaat tggagcgaat caatgtgtat tacaatgaag ccagttctca gaggtatgtt 180

cccagggctg tgcttatgga tctggagcct ggtactatgg atagtctccg atctggaccc 240

tacggtcaga tcttcaggcc tgataacttt gtgtttggtc aatctggtgc tggtaataat 300

tgggccaaag gtcactatac tgaaggtgct gagttaatcg actcggtgct tgatgttgtg 360

aggaaggaag ctgagaattg tgactgtctt caagggtttc aggtgtgtca ttcactcggt 420

ggtggaaccg gatctggaat gggtacactt ctgatttcaa aaatcagaga ggagtatcct 480

gaccgtatga tgcttacttt ctcagttttc ccatcaccca aggtgtctga tactgtggtt 540

gagccttata atgccactct ttctgttcat caacttgttg aaaatgctga tgagtgcatg 600

gttttggaca atgaggctct ttatgacatt tgcttccgca ccttgaagct taccacacct 660

agctttggtg atctaaacca cttgatttcg gccactatgt ctggtgttac atgctgcttg 720

cgtttccctg gtcagttgaa ctccgatctc aggaagttgg ctgtaaatct cattcccttc 780

cccaggttgc acttctttat ggttggattt gcacctctta cctcccgtgg ttcccagcaa 840

taccgtgcat tgagtgtacc tgagcttacc cagcagatgt gggattcaaa gaacatgatg 900

tgcgcagctg atccccgcca tggtagatac ttgacagctt ctgctgtgtt cagaggaaag 960

atgagcacta aagaggttga tgagcagatg atcaacgtcc agaacaagaa ctcttcctac 1020

tttgttgaat ggatcccaaa caatgtgaag tcaactgttt gtgacatccc accaactggt 1080

ctgaagatgg cttcaacctt cattgggaat tcaacttcaa ttcaagagat gtttaggcgt 1140

gtgagtgagc agttcacagc tatgttcagg aggaaagctt tcttgcattg gtataccggt 1200

gagggcatgg acgagatgga gttcactgag gctgagagca acatgaatga tcttgtttcg 1260

gagtaccagc agtaccagga tgccactgct gacgaggagg gtgactattt cgaagaagaa 1320

gaagaggatg gccaagacat gtaa 1344

<210> 8

<211> 1163

<212> DNA

<213> PTBP1

<400> 8

atgtcgaatt caaatcagcc tcaatttcga tacacacaga ctccttctaa agtgcttcac 60

ttgcgtaact tgccttggga gtgtattgaa gaagagctcg tcgagctttg caggcctttt 120

ggtaagatcg ttaacaccaa gtgcaatgtc ggcgctaatc gcaatcaagc cttcgttgaa 180

tttgtggatc ttaatcaggc cattaatatg gtttcatatt atgcttcatc atcagaacct 240

gcatctgttc ggggtaaaca tgtttatata cagtattcaa acagacatga aattgtcaac 300

aacaagggtc caggtgatgt tccgggaaat gtcttgctgg taaccattga gggtgtagaa 360

gccggtgatg taagcattga tgtgattcac ttggtcttct cggcttttgg atttgtgcac 420

aagattgcta cttttgagaa ggcagcaggt tttcaggcac taatccagtt tactgatgct 480

gagactgctc tttcagcaag ggaagcttta gatggcagaa gtattccaag gtacttgctt 540

ccagaacatg ttggttcttg caatctgcgc atctcatatt cagctcacac agatctaaac 600

atcaagttcc aatcacaccg tagccgggac tatacaaatc catatcttcc tgttaatgca 660

actgcaattg agggatttgt ccagcctgtt gtaggtcctg acggaaagaa aaaagaaccg 720

gagagtaatg tacttcttgc ctcaattgaa aataggatct atgatgtcac tgtagatgtt 780

cttaacacgg tattctctgc atttggcacg gttcagaaaa ttgctatatt cgagaagaac 840

gcgacaactc aggctctaat tcagtatcct gatgtcaaca ctgccgccgt agctaaagat 900

gctctagagg gacactgcat atatgatggt ggctactgta agcttcatat atcatactct 960

cgtcatactg atctcaatgt aaaggccttc agcgataaaa gtagggatta tacagtacca 1020

gagtccggtt ttgctgctgg tctgcctgct ggagcaacag tctggcagaa tcctcatgct 1080

gctgctccgg tctttattgg gagcgaattt gctagtatca attatgggca gcctcaaggc 1140

tctcccggtc aaggacctcc tgg 1163

<210> 9

<211> 1179

<212> DNA

<213> EXP1

<400> 9

atgtcgaaaa ctgaagacga agaggagcgc cggagaaagt acgaggaagc tctcgaagtc 60

aaatctctcc gccgtatcat cagcgcctat ctcaattacc cagaggctgc agaggaggac 120

ttgaaaagat atgaaagatc ttatagaagg cttccaccaa cccataaggg tctcctgtct 180

caccttcctg taaaatatcg aagactgcga aggtgtatat ctaagaattc atattttata 240

tttgaaatgc taaaggcatt tgaacctccc cttgatctga gccaagacct tgacatatgt 300

gaacaagatc cgcagaatat cttagacgat accaaagaaa ccaattattt ttcttgtggg 360

tctgcatcaa ccagtaaaac aggatgtcat ccagggtgca atgaagctgt cagtggagag 420

gaggggagcg tgttattagg atctcccaag gaggagaaac ttgggctttt tattgattcg 480

gacaccggga gccgtcatat tttggaatgt gatgccacag cagataaagc tggtaacaac 540

ggtgttaaga ttaaaaaaac ttcacactct aatgcagact ccaataataa tgagaaactt 600

gggcttttca ttgagtctga cactgggaac cgtcatgttt tggaatgtga taccaaagca 660

gatgaggctg gtaacaacgg tgttaggata caggaaactt cgtactctaa tgcagactcc 720

aattataatg tgtcttcatc tcctgattgg ttggatccat cactgcagtc gcatgttcct 780

ctagttgatg tagataaggt tcgatgtatt ataagaaata ttgtaagaga ttgggctgca 840

gagggacaac aagaacgtga tcagtgctat acgcctattc ttgaagagct taaatcacaa 900

tttcctaatc gaagtaaagg gagccctcct gcatgtttag ttccgggtgc tggacttggt 960

agactggctt tggaaatttc atgtcttggt tttgcaagcc aaggaaatga attttcatac 1020

tatatgatga tctgctcgag ttttattctt aaccaagcgg aaagggctaa tgaatggact 1080

atccatcctt ggattcatag caattgcaat tcactttctg acagtgacca gcttcgtcct 1140

atttcaatac cagatattca tcctgccagg aataactga 1179

<210> 10

<211> 981

<212> DNA

<213> EXP2

<400> 10

atggcaagag gagagtgggg gtactataat ggaagaacga aatggtgttc ttatagaaga 60

accactttga ttatttgttc aattaacatt ggtgttgctc tttatgttct tcacactctt 120

tataactctc tttacaccta cccttttaat gatcctcaaa aagctgctag gtacactcct 180

gatcagatta ggaaaatgga agaatcaaat gatattagaa aagcctcaca acccactgaa 240

cttattaaat tggtgaatga aataaggaag gattttttac aagaagagaa gagggttgat 300

ttgccatcaa atttgaaaca ccaggtaatt gatgagattg tggaattatt gaggagcttg 360

aagtcctcca atgcgactgt tcaaaatgaa gcagttgaaa gatggcgcaa gcaaaaaata 420

agagaagcta gaggggtggc tcggggagat attctgaatc caaacattct gccaaaggaa 480

gcaaaaattc ttgcaagaac gttgaagtct cgctgggatg agtttagaga agaaatcggt 540

ctctggatac ctgttgcaat cgttaacaag gaacatgatg acaagcctga gggtgaagaa 600

gagtttgaca gcgaaatatt agccggcaga cagcttcctc ccgagtgcca tactgaactt 660

catacagatt atggtggggc agctgttcgc tggggcctta cccaccataa agagagcgct 720

tatgattgtt gtcaagcttg tctggatcaa gccaaaaatg caagagaagg cgaaaagcgc 780

tgcaatatat gggtgtactg cccttcagag ggtggatgtt actcaccaga tatatatgaa 840

cacaaacagc aagaatgctg gctgaaatat gacgagaaac cccaagtaag ctttaaggac 900

aaatactccg aatcattcag aaactcgcat ccaaatgttc cactggttgt tccatgggta 960

gctgggattg taagtgtata a 981

<210> 11

<211> 684

<212> DNA

<213> TIP41-like

<400> 11

atggtttttg gggaaagttc attggttctc aagcacttga agagcgatgt aaagattcat 60

ttcaacgcat ttgattctct agttggttgg aagcaggaaa aattaccacc agttgaggtc 120

cctgcagcag caaaatggaa atttagaagc aaacctttcc agcaggtgat attagattat 180

gactacacat ttacaacacc atattgtgga agtgaaactg ttgagaaaaa ctcagagagg 240

gatacaatct ctgatgaagg cagttgcaag cttcgttggg aggactgcga ggaacgaatt 300

aatttgactg cacttgcatc aaaagagcct attctcttct atgatgaggt gatcttctat 360

gaagatgaat tggctgatag tggagtgtcg cttttaacag taaaagtgag agtgatgcca 420

agctgttggt ttcttctctt gcgtttttgg cttagagttg atggtgtgct tatgcgttta 480

agggacacac gcatccattg catttttggt gagggtaaaa caccagttat tctgagagaa 540

tgttgctgga gagaggccac atttcaagca ctagcttcta aaggatatcc ttctgattgt 600

gctgcgtata ttgatccaag cagcatcggc caaagacttc ctatcatttt gcataagacc 660

caaaagctta taattcctga ttaa 684

<210> 12

<211> 2007

<212> DNA

<213> SAND family

<400> 12

atgttaccag aagatgatgc caactcctca tcagaaaccg actcaattga ccaaaaccct 60

aaccctacca cttcaattga ccaatctctc gacgctattg aaggtcaatt aacctctatt 120

tcactcaatc accaccactc aaaaccccca tttcaccctc ctcttcccca aaatatcgat 180

acattgcctt cccattcgca ttcgcaactc caacaaccac cagcaccagc tgaaaatctc 240

caaaatatcg atacattacc ttcccattca cattcgaaac tccaacaagt agcagtagct 300

gaaaatatcg gttcattacc ttcggattca cattcgcggg ccggacaagt agttgaaaat 360

tctggacaag tggatatatt aggttcggat tcctatacga aagtagagaa ggaagtagtt 420

ggaaattcga gaggcgaagg agtgttgtgg aggaataatt cggatgtgga agttgaggtg 480

gaagggcaag ggagtccgag tagtagtgga tatgctggag gaaaggggac tagtagtagt 540

ggtagtagtg gtataagtgg ttcaggtatc gaggagatta gtggcggcga tgacgaggtg 600

gttaacagga gtggttcttt tggtggtagt gtggattccg agtgggtccc tgggaaacgg 660

catgttaatg aagatgatgc ttctgtttca tggaggaaaa ggaagaagca tttttttatc 720

ttaagccatt ccggaaaacc aatatattca agatatggag atgaacacag actagcagga 780

ttttcagcaa ctttgcaagc catcatttcc ttcgtggaga atgggggaga tcgcgtgaag 840

ttggttaggg cgggaaaaca ccaggtggtt tttcttgtta aaggaccaat atatctagtt 900

tgcataagct gtacagaaga gcctcatgaa tccctcagtg aacaactgga acttctttat 960

ggccagatga tacttattct gacaaagtct ataaatagat gctttgagaa gaatccgaaa 1020

tttgatatga cacctttgct tgggggaaca gatgctgtgt tctcttctct catccactcg 1080

tttagttgga accctgccac ttttcttcat gcctactctt gtcttcccct tgcttatcca 1140

acaaggcaag ccgccggtgc catattgcag gatgttgctg agtcaggtgt cctcttcgcg 1200

atattaatgt gtaaacacaa ggtcatcagt ctggttggtg cacaaaaagc gtctcttcat 1260

cccgatgata tgctcttgct tgccaacttt gtgatgtcat ctgaatcatt caggacatct 1320

gaatctttct ctccaatctg tcttccgaga tacaatccaa tggcattttt atatacttat 1380

gtgtattatc ttgatgctga tacttatttg atgttgctta ctgctaatcc tgatgcattt 1440

catcgtctaa aagattggag gatccgtatc gaaatggtcc ttctgaagtc aaatgttctt 1500

aatgaagctc aaaggtcgat gttggatggt ggcatgcgtg tcgaagatgt gcctgttaat 1560

ccatctcctc gctcgggatc tttgtcatct catttaggtc agcctagacc tccaccggac 1620

tctgcagatg ggtgtaaggc actgttaggt ggtcctgctg ggctttggca cttcgtttac 1680

cgcagtatat atctagatca atatgtatct tctgagttct catcaccgat caacacccct 1740

aaacaacaga aaagattata tagagcatat cagaagctgt atacttctat gcatgatata 1800

gaacttggtc ctcacaaaac ccagtttaga agggacgaga actatgttct actctgctgg 1860

gttactcagg attttgaact ttatgcagca tttgatcctc tagcagacaa ggcactggct 1920

ataaagacat gcaaccgagt atgccaatgg gttaaagatg tggaaaatga agtttttttg 1980

ttgggagcaa gccccttttc atggtga 2007

<210> 13

<211> 1491

<212> DNA

<213> CYP2

<400> 13

atgtcatcta tctacgtatc ggagcctccg accaaaggca aagtttcgct caagacaaca 60

tacggtccat tggacataga gctatggccg aaagaggctc ctaaagctgt gcgcaacttc 120

gttcagctct gtctcgaagg ttattatgat gacacaattt ttcatcgtat aattaagtca 180

tttatggtcc aaggtggtga tcctactggc actggcaaag gtggtgaaag tatatatgga 240

ggtacatttt ctgatgagtt ccattcccgc cttaggttca accacagggg cttggttgca 300

tgtgcgaatg ctggatcacc aaattcaaat gggagtcagt tttttataac cttggatcgt 360

tgtgattggc ttgatcgtaa acataccatt ttcggaaagg taactggaga ttcactatac 420

aatctcttaa acttttccga ggttgaaact gataaggatg atcgaccagt agaatctccc 480

cctaaattga tttcagttga ggtgatatgg aacccttttg atgatattgt tccaagggca 540

gcccctgcta aagctttggt ctcctcaaat gatagtggca acagagatac aaaaaggaaa 600

gcgtcaaaaa agctaaactt gctttcattt ggagaagaag ctgaagaaga ggaaaaagaa 660

ttggcagctg tgaagatgaa aattagaagt agtcacgatg tattagatga tcctcgtttg 720

ctgaaggaag acggttcaac cagcaaaccg agtgaatcag aagccaaagc tatgaaagat 780

atgcagttaa gtgttagaga agctctaagt tcaaagaagg atgaatcatg gaaagagacg 840

cacagtaaat tttcagagac ccttcctgat agcgatgacg atgaggccaa ctttgataac 900

aggatgcgat tacaaatact taagaaaaga aaggagcttg gagatcattc aactaagcaa 960

aagtcacaca atgcgagttc aagtccaaga aaccgtgaac gctcctattc tcctcccagg 1020

tcaaatgcca aaaattccga tgatcaacca aaagtggaga agttggcttt gaagaaggga 1080

ataggatcag aagccagggc cgagcgtttg gccaatgcgg atgtggactt gcaactgttg 1140

ggagaagctg aacgagaaag gcagttacaa aagcagaaga agcgccgatg tcatgggcac 1200

gaagaggatg tgctagcaaa gcttgagaag ttcaaggcca ccatgtcctc caaatctgtt 1260

ggagctgatg gtgaatctgg aggacacaag gaagaggact tgtctgactg gacaaaagtt 1320

aagctgaagt ttgaacctca atccgggaag gataatatga ctcgcaccga gaatgtgaat 1380

gactatgtat ttcatgatcc tcttctggag aagggaaaag agaagttcaa caaaatgcaa 1440

gcaaagcaaa agcgacgaga acgagaatgg gctggaaagt cacttacata a 1491

<210> 14

<211> 603

<212> DNA

<213> PYL

<400> 14

atgccttcat ctcttcgacg tcaaagaatc tacaacaccg attacaacta ccaaaaaaaa 60

tcacataata atgtgcatac aattattcca ccacctctag ggcttccgga aaatatcaaa 120

caccaccaca cacacatgat tagctataac caaagcagct ccgccgtggt ccaaaccatc 180

tccgcaccta tatccaccgt gtggtccatt attcgaaact tcgaaaagcc acaaatttac 240

aagcacttta tcaaaagctg ccatgtcatc cacggggatg gatccgtagg tagtctccgg 300

gaagtccacg tcatctctgg cctgcccgcg gtgtcgagca tcgagaggct agatattctt 360

gatgaagagt gtcacattat tagttttagt gtagtaggag gtgatcatcg gttgaacaat 420

tatcggtcag tgacgacgct acacaagacg gagaccggaa atggtacggt ggtggtggag 480

tcatatgtcg tggatgtgcc ggaggggaat actaaagagg agacttgtgg atttgcaaat 540

acaattgtga catgtaattt acattctttg gcaaagattg ctgaaaactt gagtaataag 600

taa 603

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcaaccattg aacctgctca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaacacgcca cgacttatcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgaggggtgg aatgcagatt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgcaagtgta cgaccatcct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

accatcacca gaatccagca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cttcgagttg ctcctgagga 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aaggatgggc aaactcgtga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agcaattttg tcggggttgt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

accttctttg cacctccctt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctgtctttg gttgcaggaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acaactttgc tcgtggacac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgcctcctcc aacagcatta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

caggtacact caatgcacgg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgcaccttga agcttaccac 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggctacggtg tgattggaac 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcggcttttg gatttgtgca 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agccctcctg catgtttagt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acgaagctgg tcactgtcag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

acacccatat attgcagcgc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

catgatgaca agcctgaggg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agagtgatgc caagctgttg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gcctctctcc agcaacattc 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggaccatttc gatacggatc c 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aagcgtctct tcatcccgat 20

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gccactatca tttgaggaga cc 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cgttgtgatt ggcttgatcg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tgccttcatc tcttcgacgt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

catgtgtgtg tggtggtgtt 20

Claims (10)

1.珊瑚菜的内参基因，其特征在于：所述内参基因为EXP2；所述EXP2的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。

2.用于扩增权利要求1所述内参基因的PCR引物。

3.根据权利要求2所述的用于扩增内参基因的PCR引物，其特征在于：所述引物的扩增片段大小为100～250bp。

4.根据权利要求3所述的用于扩增内参基因的PCR引物，其特征在于：所述用于扩增EXP2的引物对序列为SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34。

5.珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)选取分别经盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理过的4种模板珊瑚菜的根部组织样品；

(2)利用珊瑚菜转录组测序数据，筛选出珊瑚菜的候选内参基因；

(3)以挑选出的候选内参基因序列为模板，设计实时荧光定量PCR的内参基因引物；

(4)进行实时荧光定量PCR；对得到的实时荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出最优内参基因和内参基因组合。

6.根据权利要求5所述的珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其特征在于：进行所述步骤(4)中的实时荧光定量PCR前，先通过普通PCR鉴定内参基因引物的特异性。

7.根据权利要求5所述的珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环。

8.根据权利要求5所述的珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中，通过ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计软件，对得到的实时荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出最优内参基因和内参基因组合，然后综合分析软件RankAggreg R进行综合排名分析。

9.根据权利要求5所述的珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)材料及处理方法：选取长势一致的沙培珊瑚菜，分别利用浓度为200mM的NaCl溶液、质量浓度为20％的PEG 6000溶液、100μM ABA溶液以及100μMMeJA溶液分别对不同的珊瑚菜进行盐胁迫、干旱胁迫、脱落酸以及茉莉酸甲酯处理得到模板珊瑚菜；

在处理时间为0h、6h、24h时的三个时间点对每株模板珊瑚菜的根部进行取样，每个时间点对珊瑚菜均进行三次生物学重复的采样；

2)RNA提取与检测：将采取的所有模板珊瑚菜的根部组织样品，利用去离子水冲洗，吸水纸吸干，液氮速冻；提取珊瑚菜根部组织样品的RNA；

利用电泳检测提取出的RNA的完整性；

利用NanoDrop ND-2000对提取的RNA进行纯度检测以及浓度的定量；

3)RNA反转录合成cDNA：对模板珊瑚菜的RNA进行反转录反应，得到cDNA；

4)候选内参基因筛选：利用珊瑚菜转录组测序数据，参考模式植物拟南芥的基因同源筛选出进行稳定性分析的珊瑚菜的候选内参基因；

5)特异性引物的设计及检测：以筛选出的候选内参基因序列为模板，进行实时荧光定量PCR的内参基因引物的设计；

以反转录得到的cDNA为模板，通过普通PCR初步鉴定引物的特异性；

6)内参基因引物标准曲线的建立：建立每一个内参基因引物的标准曲线：将反转录得到的cDNA稀释成6个浓度梯度，作为建立标准曲线的模板；以引物为引导进行实时荧光定量PCR；

7)荧光定量PCR扩增：以反转录得到的cDNA为模板，对内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Ct值；

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸25s，运行40个循环；利用得到的荧光定量PCR结果，绘制标准曲线，求得各候选基因的扩增效率及斜率；

8)利用ΔCt、GeNorm、NormFinder以及BestKeeper四种统计分析方法，分析内参基因的稳定性；

9)利用RankAggreg R程序包对四种统计分析方法得到的候选内参基因稳定性排名进行综合统计排名，得到综合结果；

10)利用2^-ΔΔCt法对应用内参基因进行目标基因表达量分析验证。

10.权利要求1所述的珊瑚菜的内参基因在研究珊瑚菜目标基因表达水平中的应用。

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