CN110512019A - 一种与棉花纤维长度主效qtl连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子育种技术领域，具体公开了一种来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记及其应用。所述分子标记为SSRM155190和SWU17439220。本发明有助于克服现有育种技术对纤维长度鉴定存在的不足，能提高纤维长度的选择效率，加快优质新品种的培育进程。

Description

一种与棉花纤维长度主效QTL连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及到一种来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。目前纤维品质育种是我国棉花育种的重要目标之一。纤维长度是纤维品质性状的一项重要指标。
在2个四倍体栽培种中，海岛棉具有优异的纤维品质，但产量低，种植面积小，而陆地棉产量高，适应性广，种植面积大，但品质偏差(Percy et al.,2006)。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质的改良有着重要的意义。
采用传统的育种方法改良或提高陆地棉的纤维长度，首先要通过陆地棉和海岛棉等杂交，通过多代的回交，获得具有高强纤维基因渐渗的种质材料，与现有的陆地棉栽培品种杂交，通过多代的回交及自交选择，以打破纤维品质性状与产量性状间的负相关。每个世代需要足够大的选择群体，都要对纤维品质进行测定，而每一世代的选择都需等到棉花吐絮后收取棉花进行纤维品质检测后才能决定，这就导致了育种的群体要大，选择工作量大，成本较高且周期长。而且纤维品质性状受环境影响较大，使得育种进展缓慢。
由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，这对质量性状而言一般是有效的，但对纤维品质等这样的数量性状来说，则存在准确性差、效率低等许多缺点。要提高选择的效率，理想的方法应该是能够直接对基因型进行选择。
分子标记辅助选择是借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。分子标记辅助选择对同步改良纤维品质和产量、多性状基因聚合、快速培育棉花新品种等具有无比优越性。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL筛选，取得了很大研究进展。这些研究结果为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，有些QTL或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中。但是，前人的研究中多数是利用RILs、BC1F1等分离群体，遗传背景复杂，或只在单个环境下检测得到的结果，缺乏可靠性和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。染色体片段代换系能够准确的鉴定QTL。而染色体片段代换系与轮回亲本之间只有渐渗片段的不同，其他遗传背景相同，因而染色体片段代换系，特别是单片段代换系在准确鉴定QTL方面具有优越性。
发明内容
为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维长度育种进展缓慢的问题。本发明以陆地棉品种中棉所45(中45)为遗传背景渐渗有海岛棉海1染色体片段的优质代换系MBI7747(BC4F3:5世代)为母本，与其轮回亲本中棉所45杂交，构建次级分离大群体(BC5F2及BC5F2：3)，初步分析12号染色体上的2个渐渗片段能够提高纤维的长度。在在此基础上对含有这2个渐渗片段的代换系(MBI7747-12)与其轮回亲本中棉所45杂交，构建分离群体(BC6F2及BC6F2：3)，进行确认纤维长度的QTL qFL-C12-1，并从分离群体(BC6F2及BC6F2：3)中筛选只含有目标QTL qFL-C12-1的单片段代换系(MBI7747-12-1)，而后用MBI7747-12-1作母本与其轮回亲本杂交自交构建近等基因分离大群体BC7F2，增加新标记，结合BC6F2及BC6F2：3群体进行海岛棉纤维长度QTL的精细定位，把目标QTL定位在一个很小的区间内(最终把QTL定位在SSRM155190和SWU17439220之间，两标记遗传距离为0.8cM，物理距离为18.4kb。)。
本发明的目的是提供来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记。
本发明的再一目的是提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法。
本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记的应用。
本发明提供的技术方案是：一种与海岛棉海1纤维长度紧密连锁的分子标记，所述分子标记为SSRM155190和SWU17439220。
其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①SSRM155190
正向引物序列为5’-GGCATGCACACATACATGCAA-3’，
反向引物序列为5’-GTCGGATAGCAAACGGTGAT-3’，可扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
②SWU17439220
正向引物序列为5’-ATGACCTCGAAAAAGGATGG-3’，
反向引物序列为5’-GTAAATGGGTTCCGGTCTTG-3’，可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
本发明还提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：
(1)DNA提取，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记SSRM155190和SWU17439220对群体单株的基因型进行分子检测；
(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的陆地棉品种；
其中，所述与自海岛棉海1与纤维长度性状紧密连锁的分子标记SSRM155190和SWU17439220的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①SSRM155190
正向引物序列为：5’-GGCATGCACACATACATGCAA-3’，
反向引物序列为：5’-GTCGGATAGCAAACGGTGAT-3’，
可扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
②SWU17439220
正向引物序列为：5’-ATGACCTCGAAAAAGGATGG-3’，
反向引物序列为：5’-GTAAATGGGTTCCGGTCTTG-3’，
可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
根据本发明所述与陆地棉纤维长度辅助育种方法，使用SSR标记SSRM155190和SWU17439220在与海岛棉海1、MBI7747或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中对纤维长度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维长度。该方法所用的分子标记SSRM155190和SWU17439220与纤维长度性状的QTL：qFL-12-1(FL是纤维长度的英文单词fiber length的缩写。QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体缩写及序号+QTL的序号。如：qFL-C12-1表示在第12条染色体上控制纤维长度的第1个QTL。)紧密连锁。这个纤维长度性状的QTL：qFL-C12-1位于染色体C12上，来源于海岛棉海1的一个渐渗片段上，对提高纤维长度的贡献率为10.88-18.95％，加性效应为0.49-0.86mm。
本发明不仅有助于筛选纤维长的材料，为今后海岛棉海1或MBI7747或含有目标片段的代换系等杂交、回交后代的纤维长度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为基因克隆奠定了基础。
使用本发明可以在苗期预测纤维长度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选纤维长的株系用于棉花纤维品质育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过这些与纤维长度性状的QTL紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1、MBI7747或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，以克服现有技术存在的不足。
根据本发明的与海岛棉海1相关的陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的SSR标记SSRM155190和SWU17439220在与海岛棉海1、MBI7747或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉纤维长度0.49-0.86mm。该方法包括以下步骤：苗期单株提取DNA；使用分子标记SSRM155190和SWU17439220对群体单株的基因型进行分子检测；对检测结果进行分析；选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度得到不同程度的提高。
通过这些分子标记选择可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。
上述一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，具体地，所涉及的分子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的：
(1)渐渗片段对纤维长度遗传效应分析
以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45(中45)为轮回亲本，杂交回交并自交获得中棉所45×海1BC4F3：5染色体片段代换系，进行了多个环境的评价(马留军等，2013)和分子基因型检测[标记来自分子遗传连锁图谱(Shi et al.2015)]，从中挑选一个优质含有少数渐渗片段的代换系MIBI7749(在12号染色体上含有2个渐渗片段)作为母本，与轮回亲本中棉所45为父本杂交，构建次级分离大群体BC5F2。
2013年在安阳种植BC5F2分离大群体900株，其中能够测定纤维长度的单株604个，用CTAB法(Paterson et al.1993)提取单株DNA并进行分子检测。从BC5F2中挑选部分单株，2014年在安阳和新疆种植成株系，对这2个世代群体及其轮回亲本进行了纤维品质的检测。初步分析12号染色体上的2个渐渗片段能够提高纤维的长度(卢全伟，2017)。在此基础上对纤维长度QTL进行确认。
(2)纤维长度QTL的确认
2014年，从种植成的株系中选择优质株系为母本，与其轮回亲本中棉所45回交，通过安阳和海南两个地点的连续3次自交并分子标记辅助选择和背景选择，选择只含有12号染色体渐渗片段的杂合状态的单株(该杂合状态的单株命名为MBI7747-12)，于2016年种植成群体获得BC6F2群体单株172个。这些单株于2017年进行了安阳和新疆2个环境的评价，对这些单株和株行进行农艺性状和纤维品质性状的测定(表型数据见表1)。用CTAB法(Paterson et al.1993)提取单株DNA，用初步定位的12号染色体渐渗片段上QTL的标记及对应棉花参考基因组上的区段开发新的SSR标记，对BC6F2群体单株进行DNA基因型检测，利用两个世代三个环境的纤维长度性状的表型数据和基因型数据，采用王健康的QTLIciMapping V4.1软件(http：//www.isbreeding.net/software/？type＝detail&id＝18)构建目标区域的连锁图谱和进一步进行纤维长度性状的QTL定位，得到在两个世代三个环境都能稳定检测的纤维长度性状的QTL：qFL-C12-1，位于12号染色体上SWU17440--SWU17439之间(表2)。
(3)目标QTL qFL-C12-1的精细定位
用SWU17440和SWU17439标记在BC6F2群体中选择含有目标QTL qFL-C12-1的单片段代换系单株(该目标单片段代换系单株命名为MBI7747-12-1)，并其轮回亲本中棉所45继续回交，自交，构建BC7F2分离大群体(2852株)，对纤维品质进行测到。把qFL-C12-1的SWU17440--SWU17439区间对应到TM-1参考基因组上继续开发了新的SSR标记485对，对MBI7747-12-1和中棉所45进行多态性筛选，筛选出多态性的标记有51对，对BC6F2群体和BC7F2群体进行基因型检测，通过连锁分析，对目标QTL进行精细定位，进一步缩小区间，最终把QTL定位在SSRM155190和SWU17439220之间，两标记遗传距离为0.8cM，物理距离为18.4kb。该QTL在三个世代四个环境都能稳定检测到，加性效应都为正，增效基因来源于海岛棉海1，对提高纤维长度的贡献率为10.88-18.95％，能提高纤维长度0.49-0.86mm(表1)。
与qFL-C12-1紧密连锁的SSR标记为标记SSRM155190和SWU17439220。
其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①SSRM155190
正向引物序列为GGCATGCACACATACATGCAA，
反向引物序列为GTCGGATAGCAAACGGTGAT，可扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
②SWU17439220正向引物序列为ATGACCTCGAAAAAGGATGG，
反向引物序列为GTAAATGGGTTCCGGTCTTG，可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，使用分子标记SSRM155190和SWU17439220在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维长度0.49-0.86mm。
使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维长度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育与种子产业化进程。
具体实施方式
下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1：筛选分子标记
(1)渐渗片段对纤维长度遗传效应分析
以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45(中45)为轮回亲本，杂交回交并自交获得中棉所45×海1BC4F3：5染色体片段代换系，进行了多个环境的评价(马留军等，2013)和分子基因型检测[标记来自分子遗传连锁图谱(Shi et al.2015)]，从中挑选一个优质含有少数渐渗片段的代换系MIBI7749(在12号染色体上含有2个渐渗片段)作为母本，在与轮回亲本中棉所45为父本杂交，构建次级分离大群体BC5F2。
2013年在安阳种植BC5F2分离大群体900株，其中能够测定纤维长度的单株604个，用CTAB法(Paterson et al.1993)提取单株DNA并进行分子检测。从BC5F2中挑选部分单株，2014年在安阳和新疆种植成株系，对这2个世代群体及其轮回亲本进行了纤维品质的检测，初步分析12号染色体上的2个渐渗片段上能够提高纤维的长度(卢全伟，2017)。在此基础上对纤维长度QTL进行确认。
(2)纤维长度QTL的确认
2014年，从种植成的株系中选择优质株系为母本，与其轮回亲本中棉所45回交，通过安阳和海南两个地点的连续3次自交并分子标记辅助选择和背景选择，选择只含有12号染色体渐渗片段的杂合状态的单株(该杂合状态的单株命名为MBI7747-12，2015年其纤维长度为31.62mm，而轮回亲本中棉所45的纤维长度为27.50mm)，于2016年种植获得BC6F2群体，单株172个。用CTAB法(Paterson et al.1993)提取单株DNA，用初步定位的12号染色体渐渗片段上QTL的标记及对应棉花参考基因组上的区段开发新的SSR标记进行BC6F2群体单株DNA基因型检测，并对这些单株于2017年进行了安阳和新疆2个环境的评价，对这些单株和株行进行农艺性状和纤维品质性状的测定。2016年和2017年安阳种植行长5m，行宽80cm，株距25cm。2017年新疆地膜覆盖种植，每个膜种植4行，每个膜种植2个材料，每个材料双行区，行长3m，宽行宽60cm和窄行宽20cm，株距10cm。获得的表型数据见表1。
表1 两个世代在三个环境中纤维长度性状描述性统计分析
上表中，AY-安阳，XJ-新疆。
引物由上海生工和北京三博公司合成。SSR扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD公司PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。
利用两个世代三个环境的纤维长度性状的表型数据和基因型数据，采用王健康的QTL IciMapping V4.1软件(http://www.isbreeding.net/software/?type＝detail&id＝18)构建目标区域的连锁图谱和进一步进行纤维长度性状的QTL定位，得到在两个世代三个环境都能稳定检测的纤维长度性状的QTL：qFL-C12-1，位于12号染色体上SWU17440--SWU17439之间(表2)。
表2 两个世代三个环境都能检测到的纤维长度的一个QTL
(3)目标QTL qFL-C12-1的精细定位
用SWU17440和SWU17439标记在BC6F2群体中选择含有qFL-C12-1的目标单片段代换系单株(该目标单片段代换系单株命名为MBI7747-12-1，其2016年纤维长度为33.70mm，而轮回亲本中棉所45的纤维长度为29.13mm)，并其轮回亲本中棉所45继续回交，自交，构建近等基因分离大群体BC7F2(2852株)，对纤维品质进行检测(表3)，用CTAB法(Paterson etal.1993)提取单株DNA。引物合成及SSR扩增反应及其产品电泳同上边(2)中描述。用qFL-C12-1的SWU17440--SWU17439标记区间对应到TM-1参考基因组上继续开发了新的SSR标记485对，对MBI7747-12-1和中棉所45进行多态性筛选，筛选出多态性的标记有51对。用这51对标记对BC6F2和BC7F2分离大群体进行基因型检测，联合原来标记的基因型，结合各个群体的表型数据进行连锁分析，对目标QTL进行精细定位，进一步缩小区间，最终把QTL定位在SSRM155190和SWU17439220之间，两标记遗传距离为0.8cM，物理距离为18.4kb。该QTL在三个世代四个环境都能稳定检测到，加性效应都为正，增效基因来源于海岛棉海1，对提高纤维长度的贡献率为10.88-18.95％，能提高纤维长度0.49-0.86mm。该区间的纤维长度的QTL是前人没有发现的。具体结果见表4。
表3 群体BC7F2纤维长度性状描述性统计分析
表4 三个世代四个环境都能检测到的纤维长度的一个QTL
与qFL-C12-1紧密连锁的SSR标记为标记SSRM155190和SWU17439220。
其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①SSRM155190
正向引物序列为GGCATGCACACATACATGCAA，
反向引物序列为GTCGGATAGCAAACGGTGAT，可扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
②SWU17439220正向引物序列为ATGACCTCGAAAAAGGATGG，
反向引物序列为GTAAATGGGTTCCGGTCTTG，可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
实施例2：陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法
使用实施例1获得的分子标记SSRM155190和SWU17439220在与海岛棉海1、MBI7747或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：
(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本杂交高代回交获得的代换系及其衍生品系，或者代换系MBI7747或含有目标片段的代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法(Paterson et al.1993)提取分离群体单株DNA；
(2)使用分子标SSRM155190和SWU17439220对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度可能得到不同程度的提高。
通过本发明可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种(系)，可加速棉花纤维品质的育种进程。

Claims (3)

1.一种来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SSRM155190和SWU17439220，
其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
SSRM155190
正向引物序列为：5’-GGCATGCACACATACATGCAA -3’，
反向引物序列为：5’-GTCGGATAGCAAACGGTGAT -3’，
扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
SWU17439220
正向引物序列为：5’-ATGACCTCGAAAAAGGATGG -3’，
反向引物序列为：5’-GTAAATGGGTTCCGGTCTTG -3’，
扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
2.一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）DNA提取，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记SSRM155190和SWU17439220对群体单株的基因型进行分子检测；
（2）对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的陆地棉品种；
其中，所述与自海岛棉海1与纤维长度性状紧密连锁的分子标记SSRM155190和SWU17439220的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
SSRM155190
正向引物序列为：5’-GGCATGCACACATACATGCAA -3’，
反向引物序列为：5’-GTCGGATAGCAAACGGTGAT -3’，
可扩增长度为190bp的海1的DNA片段；
SWU17439220
正向引物序列为：5’-ATGACCTCGAAAAAGGATGG -3’，
反向引物序列为：5’-GTAAATGGGTTCCGGTCTTG -3’，
可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
3.权利要求1所述与来自海岛棉海1与纤维长度紧密连锁的分子标记在棉花育种中的应用。
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