CN111004858A - 大豆单荚粒数主效qtl位点的分子标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物及其应用，通过对C025和JD18的F2和F2:3家系分离群体进行田间实验和性状调查获得大豆单荚粒数性状的表型数据；结合F2分离群体的基因型和遗传图谱，进行QTL检测，在M连锁群上获得了控制大豆单荚粒数的主效基因位点，其对大豆单荚粒数的贡献率为15.7%，加性效应为1.2，显性效应为1.8。通过该标记对两亲本衍生的F3代进行基因型分析，挑选出来的携带有利基因单株单荚粒数均值超过携带不利基因单株均值，因此利用该标记进行辅助选择可以快速选择高产育种。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体是指大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物及其应用。
背景技术
大豆是我国七大农作物之一，是人类植物脂肪和蛋白主要来源。现在我国大豆的消费量每年差不多有1亿吨以上，其中自己自产1400万吨，可见我国国产大豆供不应求，对外依存度较高，进口量占世界大豆总进口量的 60%以上。在我国城镇化规模持续扩大，耕地面积进一步缩小的形势下，因此提高大豆单产是目前最为迫切的任务之一，也是我国大豆产业持续发展的根本问题。随着分子生物学和分子遗传学的不断发展，分子标记辅助育种将分子遗传学与传统的表型选择有效结合，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的，因此育种家们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡。目前基因组学和测序技术的高速发展，大豆分子标记研究日渐受到关注，研究的领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因标记和定位、材料纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。SSR标记，也叫微卫星DNA标记（microsatellite DNA），已经被广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、DNA指纹图谱、材料纯度鉴定、种质资源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中（管俊娇等，2019；蔡一鸣等，2019）。SSR标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，长期以来被广泛引用于分子标记辅助选择。
大多数重要的农艺性状（如产量、品质、抗性等）均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点（quantitative traitloci, QTL），然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物及其应用，通过QTL定位旨在筛选到大豆单荚粒数相关QTL位点，用于大豆产量性状的标记辅助选择，本发明的另一个目的在于提供了大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物的应用，所述的QTL位点的效应值和贡献率都较高，对大豆单荚粒数的调控起着关键作用，该引物可用作图位克隆、大豆高产育种、分子标记辅助选择。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物，所述引物为：TATCTTGCCGGCTGCTAAAC和CATGCTACCGTTTTTATTTCCTTC。
进一步的，所述的引物在大豆图位克隆中的应用。
进一步的，所述的引物在大豆育种中的应用。
进一步的，所述的引物在大豆分子标记辅助选择中的应用。
进一步的，大豆单荚粒数的QTL位点的获得包括如下步骤：
（1）利用在大豆单荚粒数有极显著差异的大豆材料C025和JD18杂交，杂种F1代自交产生F2群体及其F2:3家系；
（2）采用CTAB法提取亲本C025和JD18及F2分离群体的叶片总DNA；
（3）合成大豆公开和自主开发的SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；
（4）利用多态性引物对F2分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据；
（5）把F2分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；
（6）F2群体的基因型数据，仅限于定位到遗传图谱上的标记，以及F2群体及其F2:3家系的单荚粒数性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位；其中，位于M连锁群上的QTL在二个群体中能重复检测到，而且效应值和贡献率较大。
本发明的有益效果为：本发明定位了大豆材料C025和JD18控制单荚粒数的重要QTL位点，该标记离主效基因位点的遗传距离很近且是基于基因组序列信息的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便。在常规育种方法中，单荚粒数性状表型鉴定要等到成熟考种，费时费力且选择效率低下（单荚粒数表型受环境影响较大）。通过检测单荚粒数性状主效基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中主效基因位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。利用该标记对两亲本衍生的后代群体进行检测，证明其效应，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与单荚粒数性状相关的分子标记，即可预测单荚粒数的多少，进而准确快速筛选多粒材料。
附图说明
图1是F2:3家系在不同环境种植时单荚粒数的频率分布图；
如图所示：1、，2、，3、，4、，5、，6、，7、，8、，9、，10、，11、，12、，13、，14、，15、，16、。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物，所述引物为：TATCTTGCCGGCTGCTAAAC和CATGCTACCGTTTTTATTTCCTTC。
F2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：
（1）采用CTAB法（Doyle et al. 1987）提取F2群体182个单株的DNA；
（2）挑选出多态性引物对F2群体182个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。本发明涉及到的分子标记为共显性标记，即差异条带表现为位置上（既扩增产物大小）的变异，分离群体的带型依情况分别读作A、B和H，分别表示来源于C025、JD18和杂合带型。
（3）通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。
（4）利用Joinmap4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得20个连锁群。
（5）基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据，以及F2群体及其F2:3家系的单荚粒数性状数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，在M染色体SSR标记SSR07-3935附近（见表1）检测到了一个重复性很好的主效QTL位点，其LOD值和贡献率都较大（见表2），对大豆单荚粒数的贡献率为15.7%，加性效应为1.2，显性效应为1.8。
利用上述技术措施，最终获得了一个控制大豆单荚粒数主效QTL位点，与申请人自主开发的SSR标记SSR07-3935紧密连锁，针对SSR07-3935F设计其引物序列为5’-TATCTTGCCGGCTGCTAAAC -3’；SSR07-3935R: 5’- CATGCTACCGTTTTTATTTCCTTC’。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对大豆单荚粒数的贡献率为15.7%，加性效应为1.2，显性效应为1.8。
大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记SSR07-3935引物的应用，包括利用本发明提供的引物，利用该引物可用于大豆单荚粒数的育种，用于大豆的图位克隆或是用于大豆分子标记辅助选择。
针对SSR07-3935分子标记设计的引物为表1所示，利用该引物，在C025中扩增得到一个条带，大小为193bp，在本发明中记为A；在JD18中扩增得到的一个条带，大小为189bp，在本发明中记为B；在杂合子中扩增得到的两个条带，大小为193bp和189bp。
表1 M连锁群单荚粒数主效QTL连锁标记SSR07-3935的引物序列
| 标记 | 正向引物 | 反向引物 |
| SSR07-3935 | TATCTTGCCGGCTGCTAAAC | CATGCTACCGTTTTTATTTCCTTC |
表2 M连锁群单荚粒数主效QTL的基本信息
大豆单荚粒数分离群体的构建及性状测定：本实施例中使用大豆材料C025和JD18杂交，杂种F1代自交产生F2群体及其F2:3。于2017年在山西省农业科学院东阳基地种植F2群体，2018年种植F2:3家系群体。两亲本和分离群体的单荚粒数表型在成熟期收获后经考种鉴定。考种数据表明：单荚粒数在2个环境下的均值均呈正态分布，表明单荚粒数性状的数量遗传特征，见图1，结果表明单荚粒数表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明单荚粒数属于数量性状。
引物的开发和合成：申请人利用的SSR引物包括两类：一类是已发表文章和大豆数据库中公开引物序列（https://soybase.org/）；另一类是申请人根据大豆基因组测序信息开发的SSR引物；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
引物多态性的筛选，其流程如下：
(1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。
(2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，
PCR扩增反应体系（20μl）：
模板（稀释至25ng/μl） 2μl
Buffer (10×) 2μl
dNTPs（10mM） 0.4μl
Primer-F（10μM） 1μl
Primer-R（10μM） 1μl
Taq酶（5U/μl） 0.2μl
ddH2O 13.4μl
PCR扩增程序：1) 94℃变性3min；2) 94℃30s，58℃45s，72℃45s；34个循环；3) 72℃5min延伸；
(3)凝胶电泳带型判读。
单荚粒数主效QTL连锁标记SSR07-3935的有效性验证，其步骤是：
(1)田间种植中选F2单株的F3代种子，在多年多点进行种植。
(2)在定苗后对F3单株挂牌取样，并提取叶片总DNA，利用分子标记SSR07-3935对其进行单荚粒数主效QTL基因型的分析。
(3)对F3单株单荚粒数进行记录。结果表明，拥有与亲本C025一样大小为193bp条带的单株，其单荚粒数较多（均值为3.8-3.9），而拥有与亲本JD18一样大小为189bp条带的单株，其单荚粒数较少（均值为1.8-2.2）（表3）。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出多荚株系用于大豆育种。
表3 利用SSR标记SSR07-3935辅助选择得到的F3单株的单荚粒数考种数据
| 单株 | 基因型 | TY2017F2 | TY2018F23 |
| No.1 | A | 3.4 | 4.1 |
| No.2 | A | 4.6 | 3.8 |
| No.3 | A | 3.7 | 3.8 |
| No.4 | A | 2.9 | 3.5 |
| No.5 | A | 3.9 | 2.8 |
| No.6 | A | 4.6 | 4.5 |
| No.7 | A | 4.1 | 4.2 |
| No.8 | A | 4.2 | 3.8 |
| No.9 | A | 4.3 | 4.5 |
| No.10 | A | 4.5 | 3.2 |
| No.11 | A | 2.1 | 4.6 |
| 均值 | 3.8 | 3.9 | |
| No.1 | B | 3.2 | 2.1 |
| No.2 | B | 2.5 | 2.1 |
| No.3 | B | 1.6 | 1.2 |
| No.4 | B | 2.3 | 2.1 |
| No.5 | B | 2.1 | 1.3 |
| No.6 | B | 2.7 | 3.4 |
| No.7 | B | 1.0 | 2.5 |
| 均值 | 2.2 | 1.8 | |
| <i>P</i>值 | 3.89E-04 | 2.72E-05 |
注：A、B分别代表来源于亲本C025和JD18的分子标记带型。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，只是本发明的实施方式之一，实际的实施方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西省农业科学院农作物品种资源研究所
<120> 大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“")
<400> 1
tatcttgccg gctgctaaac 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(“")
<400> 2
catgctaccg tttttatttc cttc 24
Claims (5)
1.大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物，其特征在于：所述引物为：TATCTTGCCGGCTGCTAAAC和CATGCTACCGTTTTTATTTCCTTC。
2.大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物的应用，其特征在于：所述的引物在大豆图位克隆中的应用。
3.根据权利要求2所述的大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物的应用，其特征在于：所述的引物在大豆育种中的应用。
4.根据权利要求2所述的大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物的应用，其特征在于：所述的引物在大豆分子标记辅助选择中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的大豆单荚粒数主效QTL位点的分子标记引物及其应用，其特征在于：大豆单荚粒数的QTL位点的获得包括如下步骤：
（1）利用在大豆单荚粒数有极显著差异的大豆材料C025和JD18杂交，杂种F1代自交产生F2群体及其F2:3家系；
（2）采用CTAB法提取亲本C025和JD18及F2分离群体的叶片总DNA；
（3）合成大豆公开和自主开发的SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；
（4）利用多态性引物对F2分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据；
（5）把F2分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；
（6）F2群体的基因型数据，仅限于定位到遗传图谱上的标记，以及F2群体及其F2:3家系的单荚粒数性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位；其中，位于M连锁群上的QTL在二个群体中能重复检测到，而且效应值和贡献率较大。
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