CN105483248B - 来自海岛棉与纤维强度有关的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子育种技术领域，具体涉及来自海岛棉海1与纤维强度有关的分子标记及其应用。所述分子标记为HAU0883125和TMB1125220。其中，HAU0883125与棉花纤维强度QTL位点qFS‑C14‑1紧密连锁，TMB1125220与棉花纤维强度QTL位点qFS‑C20‑1紧密连锁。qFS‑C14‑1位于染色体C14上，qFS‑C20‑1位于染色体C20上。本发明能提高纤维强度的选择效率，可克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的不足，加快优质新品种的培育进程。

Description

来自海岛棉与纤维强度有关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及到来自海岛棉海1与纤维强度有关的分子标记及其应用。
背景技术
棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。目前我国棉花品种存在的主要问题是纤维品质差，遗传基础狭窄。纤维品质和产量的同步改良，是当前棉花育种的主攻目标。纤维强度是纤维品质性状的一项重要指标。培育纤维强度高的棉花新品种是纺织工业纺高档纱和出高档棉织品的重要要求，也是实现棉花机械化采收的重要要求之一。
海岛棉具有纤维长、强、细等优异的纤维品质，但适应性差、产量低，而陆地棉适应性广，产量高，但纤维品质一般，因此，因此，挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质的提高有着重要的意义。但实践证明，利用常规的育种手段和方法把二者的优良性状结合在一起很难(Percy et al.,2006)。
棉花的纤维品质性状和产量性状都属于多基因控制的数量性状。品质性状及产量性状之间存在复杂的相关关系，尤其是主要纤维品质性状与产量性状之间存在显著或不显著负相关，给棉花纤维品质与产量的同步改良带来了难度。采用传统的育种方法，每一世代的品质选择都需等到棉花吐絮后收取棉花进行纤维品质检测后才能决定，而且纤维品质性状受环境影响较大，使得表型选择准确性差、周期长、效率低，育种进展缓慢。分子生物学以及数量性状基因位点作图方法的发展为棉纤维品质改良提供了有效手段。利用与目标QTL紧密连锁的分子标记，对目标性状跟踪选择，可以减少育种过程中选择的盲目性，有利于打破连锁累赘。
借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。
利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL筛选(例如Said et al.2015；Yu et al.2013；Lacape et al.2005,2010；He et al.2007；Linet al.2005；Mei et al.2004；Paterson et al.2003；吴献清等，2003；Kohel et al.2001；Jiang et al.1998；Yu et al.1998)取得了很大研究进展，为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，但仅有少量QTLs或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中。而且前人研究中多数是利用分离群体(如F2，BC1)，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏稳定性和可靠性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。渐渗系(又叫染色体片段代换系CSSLs，或导入系)，基因组中只含有少数供体亲本的染色体片段，大部分遗传背景与受体亲本一致，减少了遗传背景的干扰，提高了QTL检测的准确性。同时，培育渐渗有海岛棉基因的陆地棉背景的渐渗系，拓宽了陆地棉遗传基础，对培育陆地棉纤维品质的改良具有重要意义。
本发明利用纤维优质的陆海渐渗系(BC5F3:5)通过多环境QTL筛选鉴定，筛选出稳定的纤维强度QTLs及其紧密连锁的分子标记，并利用与这些QTL紧密连锁的分子标记筛选出纤维强度得到提高的株系。
发明内容
为了克服传统育种中表型选择准确性差、周期长、效率低等许多缺点，解决纤维品质育种进展缓慢的问题，本发明提供一种来自纤维高优质材料海岛棉海1与棉花纤维强度QTL/主效基因连锁的分子标记，即：通过筛选来自纤维高优质材料海岛棉海1中与纤维强度QTL/主效基因连锁的分子标记，进行DNA水平上的早期标记辅助选择，提高育种效率。本发明以陆地棉品种中棉所36为遗传背景的优质陆海渐渗系作为亲本，两两杂交组配F1，并对这些渐渗系及其F1进行了多环境产量和纤维品质性状的评价和分子检测，为挖掘海岛棉纤维品质性状的QTL、直接培育用于育种的新品系奠定了基础。
本发明提供的技术方案是：提供来自海岛棉海1与纤维强度有关的分子标记，所述分子标记为HAU0883125和TMB1125220，其中，HAU0883125与棉花纤维强度QTL位点qFS-C14-1紧密连锁，TMB1125220与棉花纤维强度QTL位点qFS-C20-1紧密连锁，qFS-C14-1位于染色体C14上，qFS-C20-1位于染色体C20上，其中，分子标记HAU0883125的特异性引物HAU0883其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为125bp；分子标记TMB1125220的特异性引物TMB1125其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为220bp。
各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①HAU0883125
正向引物序列为 TAGAGCTGCTGCTATCAAGG，
反向引物序列为 AAATGATCCCAAGGAACAAA，扩增长度为125bp的海1的DNA片段；
②TMB1125220
正向引物序列为 CAAAACTGACCCAGAACCAAG，
反向引物序列为 CCAAAACTCCCTCTCTCCTTC，扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
本发明还提供提供一种陆地棉纤维强度辅助育种方法及利用上述与棉花纤维强度QTL/主效基因位点连锁的分子标记在棉花辅助育种以提高棉花纤维强度中的应用。
一种陆地棉纤维强度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：
(1)苗期单株提取DNA；
(2)使用与棉花纤维强度QTL/主效基因位点qFS-C14-1和qFS-C20-1连锁的分子标记，分别为HAU0883125和TMB1125220，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所36和海岛棉海1为对照；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维强度得到提高的单株；
其中，所述与棉花纤维强度QTL/主效基因位点qFS-C14-1和qFS-C20-1连锁的分子标记的特异性引物分别为HAU0883125和TMB1125220，引物HAU0883其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为125bp；引物TMB1125其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为220bp。
根据本发明的与陆地棉纤维强度辅助育种方法，使用SSR标记HAU0883125和TMB1125220在与海岛棉海1等有关的育种群体中对纤维强度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维强度。该方法所用的分子标记HAU0883125和TMB1125220分别与棉花纤维强度性状的2个QTLs：qFS-C14-1和qFS-C20-1(FS是纤维强度的英文单词fiber Strength的缩写。QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qFS-C14-1表示在第14条染色体上控制纤维强度的第1个QTL。)紧密连锁。这2个QTLs中：qFS-C14-1位于染色体C14上，qFS-C20-1位于染色体C20上，增效基因都来源于海岛棉海1，qFS-C14-1和qFS-C20-1对棉花纤维强度的贡献率分别为8.71-13.13％和16.09-21.28％，加性效应分别为0.49-0.62cN/tex和0.76-0.99cN/tex。
本发明不仅有助于筛选纤维强度高的材料，而且为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品系的纤维强度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为QTL的精细定位及基因克隆奠定基础。
使用本发明可以在苗期预测纤维强度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选纤维强度高的株系用于棉花纤维品质育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过与纤维强度高的QTLs紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，以克服现有技术存在的上述不足。通过这些分子标记选择可获得纤维强度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。
本发明所述与棉花纤维强度QTL/主效基因位点qFS-C14-1和qFS-C20-1连锁的分子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的：
(1)采用早熟陆地棉中棉所36为受体亲本，海岛棉海1为供体亲本，构建了中棉所36遗传背景的陆海渐渗系材料；2009年获得2660个BC5F3单株，2010年随机筛选表现稳定的纤维优质的株行(BC5F3:4)，2011年种植成株系(BC5F3:5)，两两杂交配制杂交组合F1。
(2)2012年118个纤维优质的株系(作为亲本)及其两两成对杂交的59个F1设置3个环境的试验(黄河流域棉区的河南安阳、长江流域棉区的湖南常德和辽河特早熟棉区的辽宁辽阳)，2013年126个纤维优质的株系(作为亲本)及其两两成对杂交的63个F1继续设置3个环境的试验(黄河流域棉区的河南安阳、长江流域棉区的湖南常德和辽河特早熟棉区的辽宁辽阳)。其中，两年种植的材料中有82个株系(亲本)及41个F1相同。进行田间农艺性状的调查和纤维品质测定，并用CTAB法(Paterson et al.,1993)提取每个渐渗系DNA。
(3)从以中棉所36×海1BC1F1群体构建的高密度分子遗传连锁图谱(Shi et al.,Journal of Integrative Plant Biology,2015,57(5):450-467)上，每隔大约10cM选择一个SSR标记，挑选出459个标记位点，并用其对上述(2)渐渗系材料DNA及其亲本DNA进行基因型检测。
(4)利用两年六个环境(2012年安阳、常德和辽阳，2013年安阳、常德和辽阳)的纤维强度性状的表型数据和基因型数据，进行纤维强度性状的多环境QTL定位分析，获得多环境稳定的纤维强度性状的QTLs，其中有2个QTL是新发现的。这2个新发现的QTLs：qFS-C14-1位于染色体C14上，qFS-C20-1位于染色体C20上，都来源于海岛棉海1；qFS-C14-1和qFS-C20-1对棉花纤维强度的贡献率分别为8.71-13.13％和16.09-21.28％，加性效应分别为0.49-0.62cN/tex和0.76-0.99cN/tex。
各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①HAU0883125
正向引物序列为 TAGAGCTGCTGCTATCAAGG，
反向引物序列为 AAATGATCCCAAGGAACAAA，扩增长度为125bp的海1的DNA片段；
②TMB1125220
正向引物序列为 CAAAACTGACCCAGAACCAAG，
反向引物序列为 CCAAAACTCCCTCTCTCCTTC，扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种提高陆地棉纤维强度性状的分子标记选择方法，在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，使用SSR标记HAU0883125和TMB1125220可分别提高陆地棉棉纤维强度0.49-0.62cN/tex和0.76-0.99cN/tex。
使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维强度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维强度育种进展缓慢的问题，而且有助于克服传统育种技术对纤维强度鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维强度，大大加快我国纤维高优质新品种的培育进程。
附图说明
图1为本发明与纤维强度有关的2个QTLs在BC1F1分子标记连锁图谱的位置。
其中，qFS-C14-1和qFS-C20-1分别位于染色体C14上和染色体C20上；
FS是纤维强度的英文单词fiber strength的缩写；
QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号，如：qFS-C14-1表示在第14条染色体上控制纤维强度的第1个QTL。
具体实施方式
下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1筛选分子标记
(1)渐渗系及其表型数据的获得
以早熟陆地棉中棉所36为受体亲本，海岛棉海1为供体亲本，组配陆海杂交组合，利用中棉所36为轮回亲本进行多代回交，自交，结合SSR分子标记鉴定，构建1套陆海染色体片段渐渗系材料。本发明人于2009年在河南安阳中棉所试验农场种植2660个单株，2010年从中挑选658个BC5F3纤维优质的单株在河南安阳中棉所试验农场种植，获得658个BC5F3:4株行。从658个株行中，随机筛选表现稳定的纤维优质的株行，2011年种植成株系(BC5F3:5)，两两杂交配制杂交组合F1。2012年118个株系(作为亲本)及其两两成对杂交的59个F1设置3个环境的试验(黄河流域棉区的河南安阳、长江流域棉区的湖南常德和辽河特早熟棉区的辽宁辽阳)，2013年126个株系(作为亲本)及其成对杂交的63个F1继续设置3个环境的试验(黄河流域棉区的河南安阳、长江流域棉区的湖南常德和辽河特早熟棉区的辽宁辽阳)。其中，两年种植的材料中有82个株系(亲本)及41个F1相同。
河南安阳试验点的行长为5.0m，单行区，行距0.8m，株距0.25m；辽宁辽阳试验点行长为3.0m，2行区，行距0.55m，株距0.2m；湖南常德试验点的行长为4.0m，单行区，行距1.0m，株距0.40m。田间试验均采用完全随机区组设计，在区组内再嵌套裂区，每个裂区内顺序种植1行母本、2行F1与1行父本，每隔9个裂区种植4行对照，2次重复，其他田间管理同当地大田。按小区收取单株中部自然铃30个，测定纤维品质，纤维样送中国农业部纤维品质检验监督检测中心以HVI1000测定纤维的上半部平均长度(简称长度)、整齐度、马克隆值、伸长率和断裂比强度(简称强度)。获得了两年六个环境的纤维品质性状的数据，纤维强度的数据见表1。
表1 六个环境中渐渗系纤维强度性状描述性统计及中棉所36纤维强度的平均值表现
备注：AY：安阳；CD：常德；LY：辽阳
(2)对2012年118个株系和2013年126个株系，采用CTAB法(Paterson et al.,1993)提取其DNA及海1和中棉所36的DNA。
(3)多态性引物的筛选
以中棉所36×海1BC1F1为作图群体，构建了含有2292个SSR标记位点的分子连锁图谱，覆盖棉花的26条染色体，总图距5115.16cM，标记间平均距离2.23cM，覆盖整个棉花基因组，是目前覆盖遗传距离最广的一张SSR分子遗传连锁图谱(Shi et al.,Journal ofIntegrative Plant Biology,2015,57(5):450-467)，从上述分子连锁图上每大约10cM选择一个标记，共选择459个标记位点(表2)，对(2)渐渗系及海1和中棉所36的DNA进行基因型分子检测。
表2 从SSR分子遗传连锁图谱上选择的SSR标记染色体
引物由上海生工和北京三博公司合成。
SSR扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs0.50μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，TaqDNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD公司PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。
(4)纤维强度的QTL定位
利用QTL IciMapping V4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)，检测六个环境(2012年安阳、常德和辽阳，2013年安阳、常德和辽阳)纤维强度QTL，检测到多环境表现稳定的QTLs，其中有2个QTLs是新发现的，这2个QTLs为qFS-C14-1和qFS-C20-1。qFS-C14-1能在2012年安阳、2012年常德、2013年安阳和2013年辽阳四个环境中被检测到；qFS-C20-1能在2012年安阳、2012年辽阳、2013年安阳、2013年常德和2013年辽阳五个环境中被检测到(具体结果见表3)。
表3 四个以上环境都能检测到的2个纤维强度的QTLs
AY:安阳；CD：常德；LY：辽阳
这2个QTLs为：qFS-C14-1和qFS-C20-1。qFS-C14-1位于染色体C14上，qFS-C20-1位于染色体C20上(图1)，增效基因都来源于海岛棉海1。qFS-C14-1和qFS-C20-1对棉花纤维强度的贡献率分别为8.71-13.13％和16.09-21.28％，加性效应分别为0.49-0.62cN/tex和0.76-0.99cN/tex。
与qFS-C14-1紧密连锁的SSR标记为HAU0883125，可提高陆地棉棉纤维强度0.49-0.62cN/tex；与qFS-C20-1紧密连锁的SSR标记为TMB1125220，可提高陆地棉棉纤维强度0.76-0.99cN/tex。
各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①HAU0883125
正向引物序列为 TAGAGCTGCTGCTATCAAGG，
反向引物序列为 AAATGATCCCAAGGAACAAA，扩增长度为125bp的海1的DNA片段；
②TMB1125220
正向引物序列为 CAAAACTGACCCAGAACCAAG，
反向引物序列为 CCAAAACTCCCTCTCTCCTTC，扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
实施例2陆地棉纤维强度性状提高的分子标记选择方法
使用实施例1获得的分子标记HAU0883125和TMB1125220在与海岛棉海1等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：
(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如鲁棉研28和中棉所60)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如鲁棉研28和中棉所60)为受体亲本杂交高代回交获得的渐渗系及其衍生品系，或者其渐渗系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体等，在苗期采用CTAB法(Paterson et al.,1993)提取分离群体单株DNA；
(2)使用分子标记HAU0883125和TMB1125220对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维强度可能得到不同程度的提高(表4)
表4分子标记选择的陆地棉中棉所45与海1回交4代自交5代的株系纤维强度的表现
材料编号 TMB1125<sub>220</sub> HAU0883<sub>125</sub> 纤维强度(cN/tex)
WZK043 A 31.1
WZK045 A 31.9
WZK066 A 33.3
WZK067 A 31.7
WZK086 A 30.9
WZK142 A 30.9
WZK145 A 34.8
WZK178 A 31.6
WZK181 A 31.6
WZK182 A 31.0
WZK233 A 31.5
对照(中棉所45) 29.3
“A”表示能检测到标记的特征带
通过本发明可获得纤维强度得到提高的陆地棉品种(系)，可加速棉花纤维品质的育种进程。
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120>来自海岛棉与纤维强度有关的分子标记及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 1
TAGAGCTGCTGCTATCAAGG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 2
AAATGATCCCAAGGAACAAA 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 3
CAAAACTGACCCAGAACCAAG 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 4
CCAAAACTCCCTCTCTCCTTC 21

Claims (3)

1.来自海岛棉海1与纤维强度有关的分子标记在棉花育种中的应用，其特征在于，所述分子标记为HAU0883125和TMB1125220，其中，HAU0883125 与棉花纤维强度QTL位点qFS-C14-1紧密连锁，TMB1125220与棉花纤维强度QTL位点qFS-C20-1紧密连锁，qFS-C14-1位于染色体C14上，qFS-C20-1 位于染色体C20上，其中，分子标记HAU0883125的特异性引物HAU0883其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为125bp；分子标记TMB1125220的特异性引物TMB1125其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为220bp；
其中，所述育种是指改良陆地棉纤维强度。
2.一种陆地棉纤维强度辅助育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）提取苗期单株DNA；
（2）使用与棉花纤维强度QTL/主效基因位点qFS-C14-1和qFS-C20-1连锁的分子标记，分别为HAU0883125和TMB1125220，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所36和海岛棉海1基因型为对照；
（3）对检测结果进行分析；
（4）选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维强度得到提高的单株；
其中，所述与棉花纤维强度QTL/主效基因位点qFS-C14-1和qFS-C20-1连锁的分子标记的特异性引物分别为HAU0883125和TMB1125220，引物HAU0883其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为125bp；引物TMB1125其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，扩增条带长度为220bp。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中提取DNA：以陆地棉品种或品系为受体亲本，海岛棉海1为供体亲本，组配陆海杂交组合，陆地棉为轮回亲本进行多代回交，自交，获得分离群体，在苗期提取分离群体单株DNA。
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