CN103436533B - 与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记，采用标记引物Xcfd80.2和Xbarc146.1对小麦品种京411的DNA进行PCR扩增，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为160bp和142bp，即为小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A的分子标记。本发明所提供的小麦穗粒重主效基因位点的分子标记可用于检测小麦品种或品系中是否含有增加穗粒重的主效基因位点QKws.cas-6A，以便快速筛选出具有该基因位点的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与增加小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用。
背景技术
小麦是世界上最主要的粮食作物之一，也是我国第二大粮食作物，其高产、稳产直接影响到我国人们生活水平和国家粮食安全。提高小麦单产、培育高产新品种是确保我国小麦总产水平、保障粮食安全的根本出路。小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点（Quantitative trait locus，QTL）控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育高产小麦品种时，传统的育种方法常存在时间长、耗费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的各个组织和生育时期均可检测、选择效率高的优势。
穗数、穗粒数和千粒重是小麦产量构成的三要素。数十年来，在提高小麦产量方面，通过增加穗数和千粒重来提高小麦产量已经取得较大进展，目前较难取得进一步突破。穗粒重由穗粒数和粒重组成，选育小穗数、穗粒数多，且穗粒数和粒重协调发展的新品种类型，即穗粒重高的高产品种类型是提高小麦产量潜力、培育高产新品种的重要研究方向（何中虎等，作物学报，2011，37：202-215）。因此，研究穗粒重基因，通过分子标记技术，提高小麦穗粒重获得高产小麦新品种，在育种工作中具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用，通过发明获得的与穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有增加穗粒重的基因位点，以加快小麦高产品种的选育进程。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明所提供的一种与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记，该分子标记为Xcfd80.2和Xbarc146.1，其所述分子标记Xcfd80.2的左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO:2所述；所述分子标记Xbarc146.1的左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID NO:4所述。
一种与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记的获取方法，它包括以下步骤：采用分子标记Xcfd80.2的引物，
左端引物序列 ATAGGGGTTTTGAATCACTCC（如SEQ ID NO:1所述）、
右端引物序列 TTGGATTTGCAGAGCCTTCT（如SEQ ID NO:2所述）
和分子标记Xbarc146.1的引物，
左端引物序列 AAGGCGATGCTGCAGCTAAT（如SEQ ID NO:3所述）、
右端引物序列 GGCAATATGGAAACTGGAGAGAAAT（如SEQ ID NO:4所述）
对小麦品种京411的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：左、右端引物（10 μmol/L）各1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，Mg2+（25 mmol/L） 1.2 μl，Taq酶（5 U/μl）0.2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.6 μl，DNA（30 ng/μl）2.0 μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为160 bp和142 bp，即得到与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记。
本发明所述的与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记在选育高产小麦中的应用，即为将与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记用于检测小麦品种或品系的方法，该方法它包括以下步骤：
a．用Xcfd80.2和Xbarc146.1的标记引物对小麦品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：左、右端引物（10 μmol/L）各1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，Mg2+（25 mmol/L） 1.2 μl，Taq酶（5 U/μl）0.2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.6 μl，DNA（30 ng/μl）2.0 μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；
b．将上述扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如Xcfd80.2的扩增产物分子量大小为160 bp的分子标记和Xbarc146.1的扩增产物分子量大小为142 bp的分子标记同时出现，则该小麦品种或品系为具有增加穗粒重的基因位点QKws.cas-6A的品种或品系，否则，该小麦品种或品系属于不具有该基因位点的品种或品系。
本发明提供的与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记的筛选方法，它包括以下步骤：
（i）以小麦品种小偃54为母本、京411为父本进行杂交得到F1，F1自交产生F2，采用单粒传法获得含有182个株系的F7代RIL群体；
（ii）用SDS法（Sharp et al.，1989）提取所述RIL群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记（SSR标记）、基于表达序列标签的SSR标记（EST-SSR）和Glu标记对所述株系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型资料；
（iii）利用MAPMAKER 3.0作图软件将获得的所述RIL群体的基因型资料构建小麦的分子遗传图谱，其LOD ≥ 3.0；
（iv）将所述RIL群体进行田间种植，并对RIL群体的各株系分别进行表型调查，获得各株系的穗粒重的特征数据；
（v）利用基于混合线性模型的QTLNetwork 2.1作图软件对每个分子标记的群体基因型资料与对应每个株系的穗粒重进行连锁分析，在P ≤ 0.001时，染色体6A上的穗粒重QTL均在Xcfd80.2-Xbarc146.1区间，且峰值均在Xcfd80.2这一位点上；
（vi）其Xcfd80.2和Xbarc146.1标记引物在小麦品种京411的DNA中获得的扩增产物的分子量分别为160 bp和142 bp，即为与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记。
本发明所述小麦品种京411的DNA是指对小麦品种京411植株的叶片分离提取后获得的DNA。
本发明所述小麦品种京411和小偃54均为审定品种。其中京411于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。小偃54于2000年通过陕西省品种审定，该品种可以从江苏省农业种质资源保护与利用研究中心索取，编号为苏4394。
本发明所述8%聚丙烯酰胺凝胶是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
本发明公开的小麦穗粒重紧密连锁的分子标记Xcfd80.2和Xbarc146.1充分体现了小麦品种或品系的穗粒重的主效基因位点，通过该分子标记对小麦衍生品种或品系PCR扩增，可以很快捷地对小麦品种或品系是否具有穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A进行判断，从而快速筛选出具有该基因位点的小麦品种或品系，加快高产小麦品种的选育进程。
将本发明提供的与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。
附图说明
图1为小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A在染色体6A上的作图区间。
图1中：空心长方形代表染色体，右侧是分子标记的名称，左侧数字是标记之间的遗传距离，单位是cM；标有黑色下划线的标记为Xcfd80.2和Xbarc146.1；染色体左下方的灰色填充的长方形表示QTL作图区间，KWS代表小麦穗粒重。
图2为小麦品种京411为亲本的F7代RIL群体的10个衍生品系用Xcfd80.2标记引物进行PCR扩增的电泳条带图。
图3为小麦品种京411为亲本的F7代RIL群体的10个衍生品系用Xbarc146.1标记引物进行PCR扩增的电泳条带图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
一种与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记，
采用标记引物Xcfd80.2，
左端引物序列 ATAGGGGTTTTGAATCACTCC（如SEQ ID NO:1所述）、
右端引物序列 TTGGATTTGCAGAGCCTTCT（如SEQ ID NO:2所述）
和分子标记Xbarc146.1的引物，
左端引物序列 AAGGCGATGCTGCAGCTAAT（如SEQ ID NO:3所述）、
右端引物序列 GGCAATATGGAAACTGGAGAGAAAT（如SEQ ID NO:4所述）
对小麦品种京411的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：左、右端引物（10 μmol/L）各1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，Mg2+（25 mmol/L） 1.2 μl，Taq酶（5 U/μl）0.2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.6 μl，DNA（30 ng/μl）2.0 μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；所使用的PCR仪型号为：Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（本发明中所有PCR扩增均采用该型号PCR仪）；扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为160 bp和142 bp，即为小麦穗粒重主效QTL的分子标记。
本发明提供的与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记的筛选方法，它包括以下步骤：
（i）以小麦品种小偃54为母本、京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2，采用单粒传法获得含有182个株系的F7代RIL群体；
（ii）用SDS法（Sharp et al.，1989）提取上述RIL群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记（SSR标记）和基于表达序列标签的简单重复序列标记（EST-SSR标记）对所述株系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型资料；
其中SSR和EST-SSR标记分析是将筛选株系的DNA进行PCR扩增，扩增产物在所述8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在所选RIL群体的株系中进行分析，获得所述RIL群体的基因型资料
（iii）利用MAPMAKER 3.0作图软件，将获得的RIL群体的基因型资料构建具有555个标记的小麦的分子遗传图谱，以LOD ≥ 3.0为标准；其中555个标记是由523个SSR、18个EST-SSR和14个Glu位点组成；
（iv）将RIL群体进行了两年共六个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考查不同年份和不同环境条件下的各个株系的穗粒重，其中两年六个试验环境即2006年对照处理、2006年低氮处理、2006年低磷处理、2007年对照处理、2007年低氮处理和2007年低磷处理。
其中小麦种植方法：RIL群体中每个株系种植4行，行长1.5 m、行间距0.25 m、每行种植30粒种子，正常生长及收获；穗粒重测定方法：将收获后各株系的小麦穗子取10穗调查穗粒重，重复3次，取平均值计算穗粒重。
（v）利用基于混合线性模型的QTLNetwork 2.1作图软件，以P ≤ 0.001为标准对每个分子标记的群体基因型资料与对应每个株系的穗粒重进行连锁分析并作图；
（vi）由QTL分析可得：在染色体6A上分别发现4个环境条件下重复出现穗粒重QTL峰值的位点为Xcfd80.2，如图1、表1所示。
表1 穗粒重基因位点QKws.cas-6A的定位结果
| 环境 | QTL峰值的标记区间 | 峰值位置(cM) | 区间位置(cM) | 加性效应 | P值 | 贡献率(%) |
| 2006年对照处理 | Xcfd80.2-Xbarc146.1 | 7.5 | 4.8-11.3 | -0.056 | 0.0000 | 9.25 |
| 2006年低氮处理 | Xcfd80.2-Xbarc146.1 | 7.5 | 4.8-13.3 | -0.081 | 0.0000 | 18.24 |
| 2006年低磷处理 | Xcfd80.2-Xbarc146.1 | 7.5 | 4.8-12.3 | -0.067 | 0.0000 | 12.23 |
| 2007年对照处理 | Xcfd80.2-Xbarc146.1 | 7.5 | 4.8-18.8 | -0.064 | 0.0001 | 8.00 |
由表1所示，这4个QTL的峰值所在的位点均为Xcfd80.2。这4个QTL的贡献率范围为8.00-18.24%，平均贡献率为11.93%，其中2006年低氮处理的贡献率最高，为18.24%，且所有QTL的加性效应均为负值。说明在Xcfd80.2-Xbarc146.1区间内检测的是与小麦穗粒重相连锁的稳定、主效的QTL，其标记引物Xcfd80.2和Xbarc146.1在小麦品种京411的DNA中获得的扩增产物的分子量分别为160 bp和142 bp，即为与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A连锁的分子标记。
实施例2
本发明提供的与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记在小麦品种京411的10个衍生品系和小麦品种小偃54中的应用。
以小偃54作母本，京411作父本配制组合，通过单粒传法（SSD法）构建了F7重组自交系群体（RIL群体）。用标记引物Xcfd80.2和Xbarc146.1对京411、小偃54及10个衍生品系进行了分析。其具体步骤如下：
（1）将小麦品种京411、小偃54及10个衍生品系进行田间种植，取各株系的植株叶片采用所述SDS法进行分离提取DNA；
所述的小麦品种京411的衍生品系是指：以小偃54作母本，京411作父本，通过单粒传法获得的株系；
（2）采用标记引物Xcfd80.2和Xbarc146.1将获得的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：左、右端引物（10 μmol/L）各1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，Mg2+（25 mmol/L） 1.2 μl，Taq酶（5 U/μl）0.2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.6 μl，DNA（30 ng/μl）2.0 μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；PCR扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测；
（3）对检测结果进行分析，Xcfd80.2的扩增产物中分子量大小为160 bp的条带和Xbarc146.1的扩增产物中分子量大小为142 bp的条带同时出现，即扩增产物均与京411的扩增产物一致的品系为具有穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A的品系。
具体结果分析如下：利用Xcfd80.2和Xbarc146.1的标记引物对小麦品种京411、小偃54及10个衍生品系的DNA进行PCR扩增，其结果分别如图2和图3所示：
在图2和图3中，泳道J4和XY分别代表小麦品种京411和小偃54扩增产物的电泳分离带，泳道1-10分别代表10个衍生品系扩增产物的电泳分离带。其中，带型与京411带型相同的为携带增加穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A的衍生品系，即衍生品系3和7，这些衍生品系是可用于下一步高产育种的品系；而小偃54的扩增产物的电泳分离带型与京411带型不同，即小偃54是不具有基因位点QKws.cas-6A的品种或品系。
由此证明：利用Xcfd80.2和Xbarc146.1进行分子标记辅助选择，可有效筛选具有增加穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A的品种或品系，该标记用于小麦辅助育种可大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 与小麦穗粒重主效基因位点紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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1.一种与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记用于检测小麦品种或品系的方法，其特征在于该分子标记为Xcfd80.2和Xbarc146.1，其所述分子标记Xcfd80.2的上游引物序列如SEQ ID NO:1所述、下游引物序列如SEQ ID NO:2所述 ；所述分子标记Xbarc146.1的上游引物序列如SEQ ID NO:3所述、下游引物序列如SEQ ID NO:4所述；用Xcfd80.2和Xbarc146.1的标记引物对待测小麦品种或品系的DNA分别进行 PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：10 μmol/L的上、下游引物各 1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，25 mmol/L的Mg2+ 1.2 μl，5 U/μl的Taq酶0.2 μl，2.5 mmol/ L 的dNTP 0.6μl，30 ng/μl的DNA 2.0 μl，其余用ddH2O 补足；PCR 扩增程序为 ：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；将上述扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如Xcfd80.2的扩增产物中分子量大小为160 bp的扩增片段和Xbarc146.1的扩增产物中分子量大小为142 bp的扩增片段同时出现，则该待测小麦品种或品系为具有增加穗粒重的主效基因位点QKws.cas-6A的品种或品系，否则，该待测小麦品种或品系属于不具有该位点的品种或品系。
2.一种与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A 紧密连锁的分子标记的获取方法，其特征在于它包括以下步骤：以Xcfd80.2和Xbarc146.1标记引物对小麦品种京411的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：10 μmol/L的上、下游引物各 1.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，25 mmol/L的Mg2+ 1.2 μl，5 U/μl的Taq酶0.2 μl，2.5 mmol/ L 的dNTP 0.6μl，30 ng/μl的DNA 2.0 μl，其余用ddH2O 补足；PCR扩增程序为 ：94℃预变性 7 min ；94℃变性 30s，60/51℃退火45 s，72℃延伸60 s，34个循环 ；72℃后延伸7 min；最后10℃终止反应；扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得对应的扩增产物的分子量分别为160bp和142 bp，即为小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A的分子标记；其中Xcfd80.2标记上游引物序列如SEQ ID NO:1所述、下游引物序列如SEQ ID NO:2所述；Xbarc146.1标记上游引物序列如SEQ ID NO:3所述、下游引物序列如SEQ ID NO:4所述。
3.根据权利要求2所述的与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记的获取方法，其特征在于所述小麦品种京411的DNA是指对小麦品种京411植株的叶片分离提取后获得的 DNA。
4.根据权利要求2所述的与小麦穗粒重主效基因位点QKws.cas-6A紧密连锁的分子标记的获取方法，其特征在于所述8%聚丙烯酰胺凝胶是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
5.根据权利要求1所述检测小麦品种或品系的方法，其特征在于所述的小麦的品种或品系为以小麦品种京411为亲本，通过采用常规杂交并繁衍至F2代以上获得的小麦品种或品系。
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