CN104087580B - 小麦4b染色体粒重qgw4b‑caps分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小麦4B染色体粒重QGW4B‑CAPS分子标记及其应用，粒重控制基因位点QGW4B‑17位于小麦4B染色体短臂31.3～36.3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_c101685_705和分子标记RAC875_c27536_611之间；本发明还公开了根据根据粒重控制基因位点QGW4B‑17开发的粒重QGW4B‑CAPS分子标记。本发明所述分子标记QGW4B‑CAPS可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的大粒资源，并将这些大粒资源用于高产小麦育种或分子设计聚合杂交育种，以及应用该标记进行分子标记辅助选择育种，以更快速、准确进行高产小麦品种的选育。

Description

小麦4B染色体粒重QGW4B-CAPS分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种小麦4B染色体粒重QGW4B-CAPS分子标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

小麦是世界三大粮食作物之一，是我国北方人口的主要口粮。随着我国人均耕地土地和淡水资源的减少，粮食供应安全问题日益凸显。千粒重是小麦产量构成三要素之一，提高小麦粒重是培育高产小麦的重要途径。

粒重由主基因和微效基因共同控制的数量性状，基因数目多且效应较低，易受环境影响。在传统育种中需要大规模的田间选择，工作量大，效率低。小麦是异源六倍体，与粒重有关的基因鉴定较少，缺乏分子标记辅助选择的有效标记。

目前小麦粒重分子标记辅助选择存在的主要问题是：绝大多数QTLs不是功能性标记，多数发表的QTLs位点都没有经过育种过程或品种进行有效性验证；QTLs实用性差，单一遗传群体定位的基因位点，准确度差，而且由于置信区间大，QTLs过多或存在假阳性QTLs，降低了分子辅助选择的实际效率，甚至没法有效应用到小麦育种中。

实效性分子标记能够避免由于高比率的重组交换而产生的选择错误，在群体的目标基因检测时更加有效；直接反映目标性状的表现，可以准确的检测、跟踪目标基因，且其遗传效应值具有普适性，且可靠性高，对人工育种群体和自然群体均有效。在利用回交转育高千粒重性状时，实效性标记的开发有助于推动分子标记辅助选择的应用，而且有利于在种质资源中发掘有利基因。

作为第三代分子标记的SNP(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，标记是一种基于多态性SNP和PCR为基础的分子标记技术。本发明是以RIL群体为材料，在SNPs全基因组扫瞄的基础上，利用连锁分析方法，提高了QTL检测的效应和定位精度，开发了实效性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记，研制粒重分子辅助育种体系，可以程序化应用于育种实践。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种小麦4B染色体粒重基因分子标记QGW4B-CAPS及其应用。

小麦4B染色体控制粒重基因位点QGW4B-17，粒重控制基因位点QGW4B-17位于小麦4B染色体短臂31.3～36.3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_c101685_705和分子标记RAC875_c27536_611之间。

根据上述小麦4B染色体控制粒重基因位点QGW4B-17左侧SNP开发的QGW4B-CAPS1分子标记，该分子标记上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记在分子辅助育种中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子标记作为特异引物对基因组DNA中进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

(3)用限制性内切酶AluI酶切步骤(2)制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

(4)对步骤(3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在439bp和177bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制位点QGW4B-17的品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在722bp有条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的品种。

根据本发明优选的，所述的步骤(2)中PCR扩增体系为20μL，具体如下：

2×Es Taq MasterMix10μL(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，QGW4B-CAPS1分子标记的上游引物0.8μL，QGW4B-CAPS1分子标记的下游引物0.8μL，模板3μL，无菌H₂O5.4μL。

根据本发明优选的，所述的步骤(2)中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性40s，59℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述的步骤(3)中酶切体系为10μL，具体如下：

限制性内切酶AluI0.3μL，PCR扩增产物3μL，10×NE buffer0.7μL，ddH₂O6μL；

酶切条件为：37℃水浴1h，然后65℃灭活5min。

根据上述小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17右侧SNP开发的QGW4B-CAPS2分子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述应用，步骤如下：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子标记作为特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

(3)用限制性内切酶ApalI酶切步骤(2)制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

(4)对步骤(3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有415bp和323bp条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在738bp有条带时，则该被检测样品含有粒重控制位点QGW4B-17的品种。

根据本发明优选的，所述的步骤(2)中PCR扩增体系为20μL如下：

2×Es Taq MasterMix10μL(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，QGW4B-CAPS2分子标记的上游引物0.8μL，QGW4B-CAPS2分子标记的下游引物0.8μL，模板DNA3μL，无菌H₂O5.4μL。

根据本发明优选的，所述的步骤(2)中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性40s，59℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述的步骤(3)中酶切体系为10μL，具体如下：

限制性内切酶Apal I0.3μL，PCR扩增产物3μL，10×NE buffer0.7μL，ddH₂O6μL；

酶切条件为：37℃水浴1h，然后65℃灭活5min。

上述提取待鉴定样品的基因组DNA的方法也采用本领域常规的改良的CTAB法提取叶片中的DNA。

有益效果

本发明根据小麦4B染色体粒重主效QTLs位点SNP开发的特异CAPS分子标记QGW4B-CAPS，该标记可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的大粒资源，并将这些大粒资源用于高产小麦育种或分子设计聚合杂交育种，以及应用该标记进行分子标记辅助选择育种，以更快速、准确进行高产小麦品种的选育。

附图说明

图1为小麦千粒重基因在染色体4B染色体上的作图区间；

图中：右侧是分子标记的名称，左侧数字是标记之间的遗传距离，单位是cM。

图2为大小粒亲本及衍生品系利用QGW4B-CAPS1分子标记进行PCR扩增，扩增产物酶切前后的电泳条带图；

图中：1、Marker；2、大粒亲本01-35酶切前；3、大粒亲本01-35酶切后；4、小粒株系C60酶切前；5、大粒株系C98酶切前；6大粒株系C98酶切后；7小粒株系C60酶切后；8小粒亲本藁城9411酶切前；9小粒亲本藁城9411酶切后。

图3为大小粒品种及育种高代品系用QGW4B-CAPS1分子标记进行PCR扩增，扩增产物酶切前后的电泳条带图；

图中：1-5为大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949酶切前；6-10为大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949酶切后；11-15为小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901酶切前；16-20为小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901酶切后。

图4为大小粒亲本及衍生品系用QGW4B-CAPS2分子标记进行PCR扩增，扩增产物酶切前后的电泳条带图；

图中：01-35×藁城9411F9:10RIL群体大小粒株系酶切前后电泳图；1-5RIL群体大粒C25，C47，C53，C76，C98酶切前，6-10大粒株系C25，C47，C53，C76，C98酶切后；11-15RIL群体小粒株系C27，C36，C44，C60，C114酶切前，16-20小粒株系C27，C36，C44，C60，C114酶切后；

图5为大小粒品种及育种高代品系用QGW4B-CAPS2分子标记进行PCR扩增，扩增产物酶切前、后的电泳条带图；

图中：1-5大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949酶切前；6-10大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949酶切后；11-15小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901酶切前；16-20小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901酶切后；21-25为5个淄麦12×师滦02育种后代F5大粒品系酶切前；26-30为5个淄麦12×师滦02育种后代F5大粒品系酶切后；31-35为5个淄麦12×师滦02育种后代F5小粒品系酶切前；36-40为5个淄麦12×师滦02育种后代F5小粒品系酶切后。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17，粒重控制位点QGW4B-17位于小麦4B染色体短臂31.3～36.3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_c101685_705和分子标记RAC875_c27536_611之间。

遗传图谱构建和QTL定位实验室构建的RIL群体为材料：该RIL群体以普通小麦品系山农01-35为母本，藁城9411为父本进行杂交，获得F1代，经一粒传法自交9代，得到含173个家系的RIL(F_9：10)群体。

母本山农01-35是山东农业大学育成的大粒、中筋、成穗率较低的小麦品系，普通市售产品；

父本藁城9411是河北省藁城农科所育成的小粒、分蘖成穗率较高的强筋小麦品系，普通市售产品。

分子标记的检测

提取亲本及后代群体的DNA，取待鉴定样品的基因组DNA的方法采用本领域常规的改良的CTAB法提取叶片中的DNA。

DArT标记的检测及序列信息由澳大利亚Triticarte Pty.Ltd(http:// www.triticarte.com.au)完成。

SNP标记由美国加利弗尼亚大学戴维斯分校植物科学系生物技术检测中心利用Illumina SNP Genotyping技术测试平台，使用微珠芯片技术(BeadArray)进行检测。其多态性分析使用genomestudio软件进行分析。

SSR标记利用两亲本进行多态性筛选，将多态性引物用于RIL群体的检测，SSR引物的序列等信息通过参考文献和GrainGene2.0(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/ index.shtml)获得。

图谱构建及QTL数据分析

用MAPMAKER/EXP3.0b软件]和Mapchart2.1构建分子标记的连锁图。用基于混合线性模型的QTL network2.0软件对2008年-2010年泰安点和2010宿州4个环境下粒重的表型值和其平均值分别单独进行QTL定位，并利用4个环境的粒重的表型值共同进行多环境的QTL分析。获得了多个环境下稳定表达的主效QTL位点，该位点定名为QGW4B-17。在染色体上的具体位置如图1所示。

根据上述结果，设计分子标记如下：

根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

实施例1所述的根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的分子标记在分子辅助育种中的应用，即为将与小麦千粒重主效QTL紧密连锁的分子标记用于检测小麦品种或品系的方法，该方法它包括以下步骤：

1.分子标记在华大基因等生物技术公司合成，序列如下：

QGW4B-CAPS1：上游引物：5′-TAATAGGCTTGAAAAGTTCTTAC-3′，SEQ ID NO.1

下游引物：5′-CGAATAGACTTCAGGGGCA-3′；SEQ ID NO.2

QGW4B-CAPS2：上游引物：5′-CCCGGTTTTATGAACGATGAGTGG-3′；SEQ ID NO.3

下游引物：5′-GCGTGACAATTGCCACAGATCTA-3。SEQ ID NO.4

2.提取检测材料DNA：参照Triticarte Pty.Ltd(http://www.triticarte.com.au)中提供的植物DNA提取方法，用0.8wt％琼脂糖电泳检测DNA质量和浓度，其详细方法如下：

(1)取0.3-0.5g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末。

(2)加入1600μL已预热至65℃的缓冲液，多次倒置混匀，水浴0.5-1h，(其间轻摇几次以充分混匀)。

(3)降温等待10分钟，加10-15μL RNase(10mg/mL)37℃水浴30钟(其间轻摇几次以充分混匀，约1次/10min)。

(4)取出离心管，加入等体积1600μL，4℃苯酚(Tris-平衡酚)：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，轻轻混匀10min(可水平放置在摇床上)，4℃冰箱静置5min，然后8000rpm离心10min。

(5)取上清液于另一管，约1300μL，加入等体积冷氯仿(4℃冰箱放置)，轻摇10min混匀(可水平放置在摇床上)，8000rpm离心10min。

(6)取上清液于另一管(约1000μL)加100μL3M NaAC(醋酸钠)，加入1000μL的冷异丙醇(或2倍体积的冷乙醇)，充分混匀后于-20℃冰箱静置20min。

(7)用枪头挑出絮状的DNA，用70％乙醇清洗2–3次，稍离心5分钟，去掉乙醇，气干后(无乙醇气味即可)，溶于200μL1×TE溶液中，轻轻混匀，-20℃储存。

(8)用微量可见/紫外分光光度计NanoDrop2000，测定DNA浓度，稀释DNA浓度为200ng/μL做为工作液。

附录：溶液配制：

(a)3M NaAc(pH5.2)

600mL H₂O中加408.24g NaAc-3H₂O，(或者246.24g无水醋酸钠)溶解后用冰醋酸(冰乙酸)调pH值至5.2，定容至1L，灭菌，备用。

(b)1×TE溶液

800mL H₂O中加1.211g Tris、0.3723g Na₂EDTA-2H₂O，用HCl调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用。

(c)RNA酶(RNase)：(若商业化配置好的1mL处理好的分装RNA酶，可以直接使用)。

将固体RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶浓度为10mg/mL，加热至100℃处理15–20min，慢慢冷却至室温，然后加入0.1倍体积1M Tris-HCl(pH7.4)，分装后于–20℃冰箱保存。

(d)缓冲液：按照如下配方配制后，定容至1L。

(e)10wt％SDS配制：

900ml水中100g溶解电泳级SDS，加热至68度助溶，加几滴浓HCl调节溶液PH到7.2，加水定容到1L，分装备用。SDS微细晶，易扩散，需戴面罩。10％SDS无需灭菌。

3.PCR扩增：其PCR扩增体系为20μL

备注：可用北京康为世纪生物科技有限公司生产的试剂或用Taq酶0.25μL，dNTP0.3μL，Mg²⁺0.4μL,Buffer2.0μL，混合配制代替2×Es Taq MasterMix。

扩增条件：

4.PAGE凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶：

本发明所述8wt％聚丙烯酰胺凝胶是指100mL聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺。

4.1药品的配制

(i)39:1原胶的配制:39g Arc和1g Tris溶于100mL水中

(ii)5×TBE缓冲液的配制

TRIS碱 54g

硼酸 27.5g

pH＝8的EDTA溶液 20mL

加水至1L

(iii)8wt％聚丙烯酰胺凝胶配制(30块胶的配方)

39:1的原胶 216mL

5×TBE 216mL

H₂O 639mL

(iv)银染液的配制:2g AgNO₃溶于1L水中

(v)显影液的配制:15g NaNO₃和0.188g硼酸溶于1L水中。

4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤

4.2.1胶板的制备及电泳

(I)带凹口的面板在上，背板在下，两侧用塑料板密封，并用夹子夹好，底部调节使之水平

(II)灌胶每块胶板30mL的凝胶和300μL10％的过硫酸铵溶液、15μL TEMED混合均匀后立即沿口倒入固定好的玻璃板中，插入梳子。

(III)聚合大约20min后，小心拔出凹口处的梳子。

(IV)用1×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压120V，电流200mA，电泳功率为200W,时间为2个小时30分钟。

(V)点样之前需切断电源，用移液枪将点样孔的气泡及胶吹出，用移液枪吸加样到点样孔，点样完毕，电泳开始。

(VI)电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，清洗干净并放回原处。

4.2.2银染

将剥下的胶板用0.2％AgNO₃溶液银染10～15min,并放置于摇床上震荡，然后用去离子水将银染后的胶板冲洗干净。

4.2.3显影液显

将冲洗过的胶板再放入已加入显影液的显影盆里(显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行)显影过程大约5～10分钟，以DNA条带清晰可见为准。将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。

5.PCR产物专一性酶切：

QGW4B-CAPS1：酶切体系10μL：

专一酶AluI：0.3μL

PCR产物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

ddH₂O:6μL

酶切体系37℃水浴1h，然后将酶切体系65℃灭活5min。

QGW4B-CAPS2：酶切体系10μL：

专一酶ApaLI：0.25μL

PCR产物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

ddH₂O:6.05μL

酶切体系37℃水浴1h，然后将酶切体系65℃灭活5min。

用QGW4B-CAPS1分子标记作为特异引物进行PCR扩增，在小麦中的理论扩增片段为：722bp。PCR扩增产物经专一酶AluI酶切，大粒品种酶切出439bp和177bp片段，小粒品种则不能切开，即仍为722bp。可以此来判断是否含有粒重控制位点QGW4B-17。

根据开发的QGW4B-CAPS1分子标记，在RIL群体中利用引物1进行PCR扩增，大小粒株系和亲本都扩增出722bp的片段(图2泳道2、4、5、8)；经特异性酶切AluI(酶切位点AGCT)酶切后，大粒亲本01-35和C98大粒株系PCR扩增后的722bp片段被切开，电泳后产生439bp(序列如SEQ ID NO.6所示)和177bp(序列如SEQ ID NO.5所示)的酶切片段(图2泳道3、6)；而小粒亲本藁城9411和小粒株系C60扩增后的片段不能被酶切，电泳后仍然为722bp的片段(如图2泳道7，9)。

根据开发的QGW4B-CAPS1分子标记对审定大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949和小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901进行了有效验证，结果分析如下：大小粒品种都扩增出722bp片段(图3泳道1-5，11-15)，大粒品种PCR扩增产物经特异性酶切AluI(酶切位点AGCT)酶切后，722bp的片段被切开，电泳后产生439bp和177bp的酶切片段(图3泳道6-10)；而小粒品种扩增后的片段不能被酶切，电泳后仍然为722bp的片段(如图3泳道16-20)。

利用开发的QGW4B-CAPS1分子标记对育种淄麦12×师滦02后代F5株系进行检测，结果分析如下：大小粒株系都扩增出722bp片段(图3泳道21-25，31-35)，大粒品种PCR扩增产物经特异性酶切AluI(酶切位点AGCT)酶切后，722bp的片段被切开，电泳后产生439bp和177bp的酶切片段(图3泳道26-30)；而小粒株系扩增后的片段不能被酶切，电泳后仍然为722bp的片段(如图3泳道36-40)。

用QGW4B-CAPS2分子标记作为特异引物进行PCR扩增，在小麦中的理论扩增片段为：738bp，PCR扩增产物经专一酶ApaLI酶切，大粒品种的PCR扩增产物不能切开，仍为738bp(序列如SEQ ID NO.7所示)片段不变，而小粒品种(系)的PCR产物被酶切出415bp和323bp片段，可以此来判断是否存在该位点大粒增效基因。

根据开发的QGW4B-CAPS2分子标记，在RIL群体中利用引物1进行PCR扩增，大小粒株系都扩增出738bp的片段(图4泳道1-5，10-15)；经特异性酶切ApalI(酶切位点GTGCAC)酶切后，大粒C25，C47，C53，C76，C98株系738bp的片段不能被切开，仍未738bp片段，(图2泳道6-10)；而小粒株系C27，C36，C44，C60，C114扩增后的片段(如图2泳道16-20)被切开形成415bp(序列如SEQ ID NO.8所示)和323bp(序列如SEQ ID NO.9所示)片段。

对开发的QGW4B-CAPS2分子标记对审定大粒品种鲁原205，临麦2，淄麦12，潍麦8号，豫农949和小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979，师滦02，藁城8901进行了验证，结果表明，大小粒品种都扩增出738bp片段(图5泳道1-5，11-15)，大粒品种PCR扩增产物经特异性ApalI酶酶切后，738bp的片段不能被切开，电泳后仍为738bp的泳带(图5泳道6-10)；而小粒品种PCR产物经酶切后形成415bp和323bp的酶切片段(如图5泳道16-20)。

利用开发的QGW4B-CAPS2分子标记对育种淄麦12×师滦02后代F5株系进行检测，结果分析如下：大小粒株系都扩增出722bp片段(图5泳道21-25，31-35)，大粒品种PCR扩增产物722bp的片段不能被ApalI酶切(图3泳道26-30)；而小粒株系PCR扩增后产物经特异性酶ApalI酶切后，电泳产生415bp和323bp的条带(如图5泳道36-40)。

Claims (8)

1.一种小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记在分子辅助育种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子标记作为特异引物对基因组DNA中进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶AluI酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在439bp和177bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制位点QGW4B-17的品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在722bp有条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的品种。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2）中PCR扩增体系为20μL，具体如下：

2× Es Taq MasterMix 10μL，QGW4B-CAPS1分子标记的上游引物0.8μL，QGW4B-CAPS1分子标记的下游引物0.8μL，模板3μL，无菌H₂O 5.4μL；

所述的步骤（2）中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性40 s，59℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10min；

所述的步骤（3）中酶切体系为10μL，具体如下：

限制性内切酶AluI 0.3μL，PCR扩增产物3μL，10×NE buffer 0.7μL，ddH₂O 6μL；

酶切条件为： 37℃水浴1h，然后65℃ 灭活5 min。

5.一种小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求5所述根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分子标记在分子辅助育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子标记作为特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶ApalI酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有415bp和323bp条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在738bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制位点QGW4B-17的品种。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2）中PCR扩增体系为20μL如下：

2× Es Taq MasterMix 10μL，QGW4B-CAPS2分子标记的上游引物0.8μL，QGW4B-CAPS2分子标记的下游引物0.8μL，模板3μL，无菌H₂O 5.4μL；

所述的步骤（2）中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性40 s，59℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10min；

所述的步骤（3）中酶切体系为10μL，具体如下：

限制性内切酶Apal I 0.3μL，PCR扩增产物3μL，10×NE buffer 0.7μL，ddH₂O 6μL；

酶切条件为： 37℃水浴1h，然后65℃ 灭活5 min。