CN106119391A - 小麦沉淀值分子标记QSed1B‑26及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域可应用于小麦育种领域，具体提供了一种小麦沉淀值分子标记，该标记位于小麦1B染色体WPT‑8682和TDURUM_CONTIG98378_452之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增大沉淀值的QSed1B‑26基因位点，以加快优质小麦品种的选育进程，由于采用了专用的小麦沉淀值分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了优质小麦品种或品系的选择效率和质量。

Description

小麦沉淀值分子标记QSed1B-26及其应用
技术领域
本发明涉及涉及基因工程技术领域，可应用于小麦品质育种领域，具体提供了一种小麦沉淀值分子标记。
背景技术
小麦是世界上种植最为广泛的三大粮食作物之一，其种植面积、总产及在国际贸易中所占的比例均居粮食作物之首。我国作为世界上小麦生产和消费的第一大国，小麦生产与国家粮食安全密切相关。随着人们生活水平的提高，品质、营养、健康成为现代社会人们生活的主要追求。由于小麦面粉含有其它作物所欠缺的面筋，适于制作面包、馒头、面条、饼干、糕点等多种食品，因此对小麦品质的研究是从面筋蛋白质开始的，而沉淀值是蛋白质含量和质量综合反映，是评价面筋强度优劣的重要指标。
沉淀值由主基因和微效基因共同控制，基因数目多且效应较低，易受环境影响。在传统育种中需要进行大量的品质检测选择，工作量大，效率低难以满足现在的需要。另外，沉淀值不像田间农艺性状，可以靠感官选择，因此不能在田间直接选择，而实验室测定需要量较大，因此，沉淀值在育种中难以在田间依靠传统育种方法早代选择。而新兴的分子标记辅助选择不受环境影响，可以进行程序化早代选择和预测，可显著提高目标性状选择的准确性，对加快小麦品质改良及保障我国粮食安全具有重要的现实意义和理论价值。在小麦品质性状上,1B/1R在我国主推品种中仍然占很大比例,一些对品质改良有积极作用的优异基因和QTL尚未得到充分利用,如Bx14+Byl5、Bxl7+Byl8、Wx-Alb、Wx-Dlb等。而与小麦沉淀值有关的基因鉴定则更少，缺乏分子标记辅助选择的有效标记。
目前小麦沉淀值分子标记辅助选择受到以下方面的限制，一方面：目前多数发表的沉淀值QTLs位点没有经过育种过程或品种有效性验证。另外，由于单一遗传群体定位的基因位点，准确度差，而且由于置信区间大，QTLs过多或存在假阳性QTLs，降低了沉淀值分子辅助选择的实际效率，甚至没法有效应用到小麦育种中。
因此需要提供一种针对于小麦沉淀值的实用性分子标记以利于小麦品质育种。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种小麦沉淀值分子标记，位于小麦1B染色体WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增大沉淀值的QSed1B-26基因位点，以加快小麦高品质品种的选育进程，由于采用了专用的沉淀值分子标记不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高品质小麦品种或品系的选择效率和质量，提高了QTL检测的效应和定位精度，开发了实效性分子标记，研制沉淀值分子辅助育种体系，可以程序化应用于育种实践。
发明人提供的具体技术方案如下：
一种小麦沉淀值分子标记，该标记位于小麦1B染色体WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否含有增大沉淀值基因位点的QSed1B-26，具体步骤为：
利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得347bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用Alw44I专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；
判定标准为：不具有增大沉淀值基因的品种或品系中目的条带被切断；具有增大千粒重基因的品种或品系中目的条带未被切断，保持原样。
为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其
正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)
反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:4所示)
通过特异性引物的扩增，以及对产物的酶切结果进行判定，主要原因在于：通过这种方法可以判定该位点是否含有沉淀值增效基因位点，虽然小麦沉淀值受多个基因位点控制，但是由于本发明所判定的位点为主效基因位点，其对于小麦的沉淀值有着十分重要的增效效果，故而即可获知待测小麦品种是否具有沉淀值增效效果的相关基因；为沉淀值基因聚合、进而改良小麦品质提供分子基础，从而可以更好的应用于品种改良中去。
综上所述，本发明的发明人首次提供了一种小麦沉淀值分子标记，该标记位于小麦1B染色体WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增大沉淀值基因位点的QSed1B-26，以加快小麦高产品种的选育进程。由于采用了专用的沉淀值分子标记不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高品质小麦品种或品系的选择效率和质量。
附图说明
图1为利用本发明所述的分子标记和判定方法对优良品质体系和低劣品质体系的酶切验证结果电泳图，通过图中可知，低劣品质体系经过酶切后目的片段被切成2段，而优良品质体系中则没有被切断。
具体实施方式
下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
实施例1小麦的叶片DNA提取
(1)取约0.3-0.5g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末；
(2)加入约1600μL已预热至65℃的缓冲液S，多次倒置混匀，水浴0.5-1h，其间轻摇几次以充分混匀；
(3)降温到室温，等待10分钟，加10-15μL RNA酶(10mg/mL)37℃水浴30钟，其间轻摇几次以充分混匀，约1次/10min；
(4)取出离心管，加入等体积1600μL,4℃苯酚(Tris-平衡酚)：氯仿：异戊醇(25：24：1(体积比)抽提，轻轻混匀10min，4℃冰箱静置5min，然后8000rpm离心10min；
(5)取上清液于另一管，约1300μL，加入等体积冷氯仿(4℃冰箱放置)，轻摇10min混匀，8000rpm离心10min；
(6)取上清液于另一管，加100μL 3M NaAC(醋酸钠)，加入1000μL的冷异丙醇(或2倍体积的冷乙醇)，充分混匀后于-20℃冰箱静置20min；
(7)用枪头挑出絮状的DNA，用70％乙醇清洗2–3次，稍离心5分钟，去掉乙醇，气干后(无乙醇气味即可)，溶于200μL 1×TE，轻轻混匀，-20℃储存；
(8)用微量可见/紫外分光光度计NanoDrop2000，测定DNA浓度，稀释DNA浓度为200ng/μL做为工作液。
附录：溶液配制：
(1)3M NaAc(pH 5.2)
600mL H2O中加408.24g NaAc-3H2O，(或者246.24g无水醋酸钠)溶解后用冰醋酸(冰乙酸)调pH值至5.2，定容至1L，灭菌，备用。
(2)1×TE(pH 8.0)
800mL H2O中加1.211g Tris、0.3723g Na2EDTA-2H2O，用HCL调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用。
(3)RNA酶：(若商业化配置好的1mL处理好的分装RNA酶，可以直接使用。)
将固体RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶浓度为10mg/mL，加热至100℃处理15–20min，慢慢冷却至室温，然后加入0.1倍体积1M Tris-HCL(pH 7.4)，分装后于–20℃冰箱保存。
(4)缓冲液S
按照如下配方配制后，定容至1L。
(5)10％SDS配制：
900ml水中100g溶解电泳级SDS，加热至68度助溶，加几滴浓HCL调节溶液PH到7.2，加水定容到1L，分装备用。(SDS微细晶，易扩散，需戴面罩。10％SDS无需灭菌。
实施例2目标产物扩增
正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)
反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:4所示)
PCR扩增：其PCR扩增体系为20μL
备注：Mix可用：或(Taq酶0.25μL，DNK 2.0μL,Buffer1.5μL,MgCl 0.4μL配置。)
扩增条件：
通过上述扩增即可获得347bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例3PCR产物专一性酶切：
酶切体系10μL：
专一酶Alw44I：0.3μL
PCR产物：2μL
10×NE buffer:1.0μL
ddH2O:6μL
酶切反应条件：PCR扩增产物中添加0.3μL Alw44I专一酶(市场购得)，37℃水浴4h.然后将酶切体系65℃灭火5min。
将上述扩增产物分别在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小为347bp，扩增产物酶切后，不具有增大沉淀值基因的品种或品系(低沉淀值)目的条带被切断，而具有增大沉淀值基因的品种或品系中该片段未被切碎，保持原样。

Claims (3)

1.小麦沉淀值分子标记QSed1B-26，其特征在于：该标记位于小麦1B染色体WPT-8682和TDURUM_CONTIG98378_452之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
2.权利要求1所述分子标记的应用，其特征在于：利用其判定植株是否含有增大沉淀值的QSed1B-26基因位点，具体步骤为：
利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得347bp的片段，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示，之后利用Alw44I专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；
判定标准为：不具有增大沉淀值基因的品种或品系中目的条带被切断如SEQ ID NO:1所述的片段；具有增大千粒重基因的品种或品系中目的条带未被切断，保持原样。
3.根据权利要求2所述的小麦沉淀值分子标记，其特征在于：其特异性引物，
正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)
反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:4所示)。
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