CN117385098B - 与小麦着粒密度相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与小麦着粒密度相关的分子标记及其应用，属于作物选种培育技术领域。所述分子标记为MTA64‑Bgl II和MTA66‑Ddel I，前者的核苷酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示，对应的AX‑108991361位点的基因型分别为TT或CC，后者的核苷酸序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示，对应的AX‑111956072位点的基因型为TT或CC。本发明的有益之处在于：本发明开发的分子标记MTA64‑Bgl II和MTA66‑Ddel I可广泛用于小麦着粒密度的分子标记辅助育种及全基因组选择育种，加快育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记及其应用，具体涉及与小麦着粒密度相关的分子标记及其应用，属于作物选种培育技术领域。
背景技术
小麦（Triticum aestivum L.）是世界上主要的粮食作物之一，其高产和稳产是农业科学的重要研究领域。随着基因组测序技术的发展，全基因组关联分析（genome-wideassociation study，GWAS）是近年来用于研究复杂性状的一种有效方法，被广泛用于挖掘作物产量相关位点，解析作物复杂性状的遗传基础，为作物产量及品质性状遗传改良及分子标记辅助育种提供理论依据和参考。
小麦穗着粒密度是每穗粒数和穗长的一个综合性状，与产量密切相关。当有效穗数和穗长一定时，适当增加着粒密度理论上能增加产量。目前与小麦着粒密度相关的位点和基因报道极少，且靶位点尚未有相关报道。因此，挖掘小麦着粒密度稳定主效位点，开发功能标记并用于育种，对实现小麦高产稳产具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供与小麦着粒密度相关的分子标记及其应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
与小麦着粒密度相关的分子标记，所述分子标记为MTA64-Bgl II和MTA66-DdelI，二者分别标记与小麦着粒密度显著主效相关SNP位点AX-108991361和AX-111956072，AX-108991361的基因型为TT或CC，AX-111956072的基因型为TT或CC，其中：
所述MTA64-Bgl II是由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的一次PCR引物以及SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的二次PCR引物对待测小麦进行一次PCR扩增和二次PCR扩增所得产物经限制性内切酶Taq酶切后得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，对应的AX-108991361位点的基因型为TT，或者核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，对应的AX-108991361位点的基因型为CC；
所述MTA66-Ddel I是由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的一次PCR引物以及SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所示的二次PCR引物对待测小麦进行一次PCR扩增和二次PCR扩增所得产物经限制性内切酶Taq酶切后得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，对应的AX-111956072位点的基因型为TT，或者核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，对应的AX-111956072位点的基因型为CC。
前述的与小麦着粒密度相关的分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I在选育小麦产量相关性状中的应用，所述产量相关性状为着粒密度和千粒重。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明基于全基因组关联分析，挖掘了2个新的与小麦着粒密度显著相关且稳定主效的SNP位点（AX-108991361和AX-111956072），并开发了分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I，此两个分子标记可广泛用于小麦着粒密度的分子标记辅助育种及全基因组选择育种，加快育种进程；
（2）本发明开发出的分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I，实现了芯片标记至分子标记的高效转化，具有扩增稳定、检测效率高及成本低等优点，可用于小麦着粒密度性状的遗传改良，为分子标记辅助育种提供有效的标记资源，助力小麦高产新品种培育；
（3）通过应用本发明开发出的与小麦着粒密度相关的分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I，可判断待测小麦品种（系）着粒密度位点的增效变异存在与否，极大提高了小麦品种（系）的选择效率和质量，最大限度降低成本，直接实现了目标位点在小麦种质资源及育种后代中的鉴定，为小麦产量相关性状的遗传改良和基因组选择辅助育种提供可靠的分子标记。
附图说明
图1是AX-108991361和 AX-111956072位点dCAPS标记检测结果图，其中，左图是AX-108991361位点dCAPS标记检测结果图，右图是AX-111956072位点dCAPS标记检测结果图；
图2是AX-108991361和 AX-111956072位点与千粒重性状关联分析结果图，其中，a是AX-108991361位点与千粒重性状关联分析结果图，b是AX-111956072位点与千粒重性状关联分析结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、与小麦着粒密度相关SNP位点获得及标记转化
1、SNP位点发现
结合296份小麦品种（系）的55K芯片数据和3年8个环境（E1：2020年烟台莱山瀑拉谷试验基地；E2：2020年石家庄栾城试验站；E3：2020年潍坊；E4：2021年烟台鲁东大学农学院试验基地；E5：2021年烟台莱山瀑拉谷试验基地；E6：2021年石家庄栾城试验站；E7：2022年烟台沐浴村试验基地；E8：2022年烟台莱山瀑拉谷试验基地）的着粒密度的表型数据，利用R语言的GAPIT包的混合线性模型（mixed liner model，MLM），进行全基因组关联分析，在8个环境中均稳定检测到了2个新的与小麦着粒密度显著主效相关SNP位点，记为AX-108991361和AX-111956072。
2、标记转化
基于中国春小麦参考基因组序列RefSeq v2.1，利用小麦联盟的dCAPS引物设计工具，对前面所检测到的两个SNP位点（AX-108991361和AX-111956072）分别设计引物。针对AX-108991361，所设计的一次PCR引物为MTA64-Bgl II-1-F/R、二次PCR引物为MTA64-BglII-2-F/R；针对AX-111956072，所设计的一次PCR引物为MTA66-Ddel I-1-F/R、二次PCR引物为MTA66-Ddel I-2-F/R。上述各引物的核苷酸序列具体如下：
MTA64-Bgl II-1-F：ATGGGGCTTCAAGATTCCGG（SEQ ID NO:1）
MTA64-Bgl II-1-R：GCACCTGGTTCCAACTTCCA（SEQ ID NO:2）
MTA64-Bgl II-2-F：tgtttggatccaatcgacgtAga（SEQ ID NO:3）
MTA64-Bgl II-2-R：attcgggaaatcgtcgtgct（SEQ ID NO:4）
MTA66-Ddel I-1-F：TGACGCCCTTGAGCACTG（SEQ ID NO:5）
MTA66-Ddel I-1-R：GCACTTTCATGGACGACGAC（SEQ ID NO:6）
MTA66-Ddel I-2-F：agtatgcatgatagtagtagcccTc（SEQ ID NO:7）
MTA66-Ddel I-2-R：aaattaacctcgggcggtgg（SEQ ID NO:8）
利用上述一次PCR引物MTA64-Bgl II-1-F/R和二次PCR引物MTA64-Bgl II-2-F/R对待测小麦的DNA进行一次PCR扩增和二次PCR扩增，二次PCR扩增产物经限制性内切酶（Taq）酶切后，即可得到对应的分子标记MTA64-Bgl II。
利用上述一次PCR引物MTA66-Ddel I-1-F/R和二次PCR引物MTA66-Ddel I-2-F/R对待测小麦的DNA进行一次PCR扩增和二次PCR扩增，二次PCR扩增产物经限制性内切酶（Taq）酶切后，即可得到对应的分子标记MTA66-Ddel I。
二、与小麦着粒密度相关分子标记的应用
1、基因型鉴定
利用分子标记MTA64-Bgl II及MTA66-Ddel I，分别对296份自然群体材料的2个SNP位点（AX-108991361和AX-111956072）进行基因型鉴定。具体包括以下步骤：
（1）PCR 扩增
① AX-108991361位点
1）一次PCR
利用一次PCR引物MTA64-Bgl II-1-F/R对待测小麦品种的DNA进行一次PCR扩增得到PCR产物A1，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
2）二次PCR
对步骤1）得到的PCR产物A1稀释1000倍得到A2，利用二次PCR引物MTA64-Bgl II-2-F/R对A2进行二次PCR扩增得到PCR产物A3，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
② AX111956072位点
1）一次PCR
利用一次PCR引物MTA66-Ddel I-1-F/R对待测小麦品种的DNA进行一次PCR扩增得到PCR产物B1，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
2）二次PCR
对步骤1）得到的PCR产物B1稀释1000倍得到B2，利用二次PCR引物MTA66-Ddel I-2-F/R对B2进行二次PCR扩增得到PCR产物B3，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
（2）酶切
① AX-108991361位点
利用限制性内切酶Taq对PCR产物A3进行酶切，得到酶切产物C1，酶切体系为10μL，具体有：3μL PCR产物A3、0.2μL限制性内切酶Taq、1μL 10×CutSmart Buffer缓冲液、5.8μLddH2O；反应条件为37℃孵育3-4h。
② AX-111956072位点
利用限制性内切酶Taq对PCR产物B3进行酶切，得到酶切产物D1，酶切体系为10μL，具体有：3μL PCR产物B3、0.2μL限制性内切酶Taq、1μL 10×CutSmart Buffer缓冲液、5.8μLddH2O；反应条件为37℃孵育3-4h。
（3）凝胶电泳检测
将上述得到的酶切产物C1或D1，分别使用质量浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺）进行稳压电泳分离2h。根据电泳结果确定待测小麦基因型：
①若酶切产物C1的大小为176bp（SEQ ID NO:9），则待测小麦在AX-108991361位点的基因型为TT，记为T；
②若酶切产物C1的大小为155bp（SEQ ID NO:10），则待测小麦在AX-108991361位点的基因型为CC，记为C；
③若酶切产物D1的大小为139bp（SEQ ID NO:11），则待测小麦在AX-111956072位点的基因型为TT，记为T；
④若酶切产物D1的大小为162bp（SEQ ID NO:12），则待测小麦在AX-111956072位点的基因型为CC，记为C。
上述方法部分电泳鉴定结果见图1，所有鉴定结果见表1。
表1 AX-108991361和AX-111956072位点在自然群体中基因型鉴定结果
/>
三、与小麦着粒密度相关位点对产量性状遗传效应
对296份自然群体材料在8个环境下的着粒密度和产量相关性状进行测定。利用R语言lme4包计算8个环境下各性状最佳线性无偏估计值（best linear unbiasedestimator，BLUE）。基于上述 2 个与小麦着粒密度稳定且显著的SNP位点（AX-108991361和AX-111956072）所转化的dCAPS标记（MTA64-Bgl II和 MTA66-Ddel I）在296份自然群体材料中的鉴定结果以及8个环境下的表型数据，分析靶位点对产量相关性状（着粒密度、千粒重）的遗传效应。
AX-108991361和AX-111956072位点与着粒密度关联分析结果见表2。
表2 AX-108991361和AX-111956072位点与着粒密度关联分析结果
/>
注：BLUE8表示8个环境下各性状最佳线性无偏估计值。***表示P＜0.001，*表示P＜0.05。
AX-108991361和AX-111956072位点与千粒重关联分析结果见图2。
AX-108991361位点分析结果显示：相比于C类型，T类型在8个环境和BLUE条件下的着粒密度显著提高7%～23%的同时，还显著提高了千粒重（6%～15%）。
AX109348634位点分析结果显示：相比于C类型，T类型在8个环境和BLUE条件下的着粒密度显著提高13%～38%的同时，还显著提高了千粒重（7%～28%）。
以上结果表明，AX-108991361和AX-111956072位点可对小麦产量相关性状（着粒密度、千粒重）的遗传改良发挥重要的育种应用价值。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (3)
1.与小麦着粒密度相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I，二者分别标记与小麦着粒密度显著主效相关SNP位点AX-108991361和AX-111956072，AX-108991361的基因型为TT或CC，AX-111956072的基因型为GG或AA，其中：
所述MTA64-Bgl II是由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的一次PCR引物以及SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的二次PCR引物对待测小麦进行一次PCR扩增和二次PCR扩增所得产物经限制性内切酶Bgl II酶切后得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，对应的AX-108991361位点的基因型为TT，或者核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，对应的AX-108991361位点的基因型为CC；
所述MTA66-Ddel I是由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的一次PCR引物以及SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的二次PCR引物对待测小麦进行一次PCR扩增和二次PCR扩增所得产物经限制性内切酶DdeI酶切后得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，对应的AX-111956072位点的基因型为AA，或者核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，对应的AX-111956072位点的基因型为GG。
2.权利要求1所述的与小麦着粒密度相关的分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I在选育小麦产量相关性状中的应用，所述产量相关性状为着粒密度。
3.权利要求1所述的与小麦着粒密度相关的分子标记MTA64-Bgl II和MTA66-Ddel I在选育小麦产量相关性状中的应用，所述产量相关性状为千粒重。
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| CN117385098A CN117385098A (zh) | 2024-01-12 |
| CN117385098B true CN117385098B (zh) | 2024-03-12 |
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| CN111187852A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-22 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一个与小麦产量相关的snp位点及其应用 |
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-
2023
- 2023-12-12 CN CN202311695119.0A patent/CN117385098B/zh active Active
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