CN110093442B

CN110093442B - 与棉花矮杆和高衣分相关的ssr分子标记

Info

Publication number: CN110093442B
Application number: CN201910384208.0A
Authority: CN
Inventors: 徐珍珍; 孟珊; 沈新莲; 徐鹏; 郭琪; 张香桂
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110093442A

Abstract

本发明公开了与棉花矮杆和高衣分相关的SSR分子标记。本发明提供了一个来自于异常棉的染色体片段，为位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段；所述SSR分子标记NAU2877的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SSR分子标记JAAS4311的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所提供的染色体片段在矮杆和高衣分棉花育种中具有重要应用价值，同时本发明开发的SSR分子标记为培育能应用于生产的矮杆高衣分棉花品种提供分子基础。

Description

与棉花矮杆和高衣分相关的SSR分子标记

技术领域

本发明涉及棉花育种领域，具体涉及与棉花矮杆和高衣分相关的SSR分子标记。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物和纺织工业原料，在国民经济中具有不可替代的地位。近年来，随着国内外经济形势的变化和国家产业政策的调整，棉花种植面积在长江流域和黄河流域大幅下滑。主要原因如下：种植棉花较其它大田作物更费时费工，生产成本增加；城镇化、工业化进程的加快，大量劳动力向城市转移，农村劳动力短缺。因此，提高机械化水平和规模化生产是我国棉花生产发展的必由之路。在众多农艺性状中，株高是影响棉花机械化生产的重要性状之一。棉花植株高大，具有无限生长的习性。我国机械化水平较高的主产棉区-新疆全面推广“矮、密、早”的栽培模式，其中“矮”，主要采用水肥调节、化学调控和人工打顶等技术来调节。尤其是随着化学生长调节剂的出现，缩节胺被广泛应用于棉花生产，在控制株高方面发挥了重要作用。但大量缩节胺等化学试剂的使用，不仅费时费工，对环境也造成了一定程度的污染。

单株结铃数、铃重和衣分是棉花产量构成的三大因素，而衣分是决定棉纤维产量的重要因素，与纤维品质存在显著的负相关关系，所以通过传统的育种手段同步改良棉花纤维品质和提高棉花产量变得越来越困难。

前期研究中，本实验室通过远缘杂交和分子标记辅助选择等技术相结合，获得一个二倍体野生种异常棉(Gossypium anomalum)矮杆单片段代换系CSSL34，与轮回亲本陆地棉苏8289(G.hirsutum acc.Su8289)相比，节间缩短，成熟期株高在不同环境了显著降低，并且衣分明显提高，可作为棉花矮化高衣分育种和矮化、高衣分性状分子遗传机制研究的一个重要矮源。

发明内容

本发明的目的是提供一种与棉花矮杆和高衣分相关的SSR分子标记。

第一方面，本发明要求保护一个DNA片段。

本发明所要求保护的DNA片段为位于异常棉11号染色体上至少含有自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段。

其中，所述SSR分子标记NAU2877的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SSR分子标记JAAS4311的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述DNA片段为位于异常棉11号染色体上自所述SSR分子标记NAU2877起至所述SSR分子标记JAAS4311止的片段。

第二方面，本发明要求保护含有第一方面中所述DNA片段的载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。

所述载体可为人工染色体载体，如细菌人工染色体或酵母人工染色体等。所述重组菌和所述转基因细胞系含有所述人工染色体载体。

第三方面，本发明要求保护第一方面中所述的DNA片段或第二方面中所述的载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

(A1)降低棉花株高和/或提高棉花衣分；

(A2)培育株高降低和/或衣分提高的棉花品种中的应用。

第四方面，本发明要求保护第一方面中所述DNA片段上的SSR分子标记或成套SSR分子标记。

本发明所要求保护的SSR分子标记为如下(a1)-(a6)中任一；所述成套SSR分子标记由如下(a1)-(a6)组成；

(a1)SSR分子标记NAU2877：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(a2)SSR分子标记JAAS4311：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(a3)SSR分子标记NAU1063：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(a4)SSR分子标记JAAS6160：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(a5)SSR分子标记JAAS1260：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子；

(a6)SSR分子标记NAU5418：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子。

第五方面，本发明要求保护用于鉴定第四方面中所述SSR分子标记或成套SSR分子标记的引物对或成套引物对。

本发明所要求保护的引物对为如下(b1)-(b6)中任一；所述成套引物对由如下(b1)-(b6)组成；

(b1)用于鉴定所述SSR分子标记NAU2877的引物对1：根据SEQ ID No.1设计得到；

(b2)用于鉴定所述SSR分子标记JAAS4311的引物对2：根据SEQ ID No.2设计得到；

(b3)用于鉴定所述SSR分子标记NAU1063的引物对3：根据SEQ ID No.3设计得到；

(b4)用于鉴定所述SSR分子标记JAAS6160的引物对1：根据SEQ ID No.4设计得到；

(b5)用于鉴定所述SSR分子标记JAAS1260的引物对1：根据SEQ ID No.5设计得到；

(b6)用于鉴定所述SSR分子标记NAU5418的引物对1：根据SEQ ID No.6设计得到。

在本发明的具体实施方式中，所述引物对1由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；所述引物对3由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成；所述引物对4由SEQID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；所述引物对5由SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16所示的两条单链DNA组成；所述引物对6由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成。

第六方面，本发明要求保护含有第五方面中所述引物对或成套引物对的试剂盒。

所述试剂盒中还可含有PCR扩增缓冲液、双蒸水、DNA聚合酶、dNTP等中的任一种或多种。

第七方面，本发明要求保护第四方面中所述的SSR分子标记或成套SSR分子标记或第五方面中所述的引物对或成套引物对或第六方面中所述的试剂盒在筛选第一方面中所述DNA片段以培育株高降低和/或衣分提高的棉花品种中的应用。

第八方面，本发明要求保护第四方面中所述的SSR分子标记或成套SSR分子标记或第五方面中所述的引物对或成套引物对或第六方面中所述的试剂盒在鉴定或者辅助鉴定棉花株高和/或衣分性状中的应用。

第九方面，本发明要求保护一种培育株高降低和/或衣分提高的棉花品种的方法，包括如下步骤：用至少含有位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段(如位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段)替换受体亲本原有染色体片段，得到株高降低和/或衣分提高的棉花品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明通过远缘杂交和分子标记辅助选择等技术相结合，将异常棉11号染色体上位于SSR分子标记NAU2877和JAAS4311之间的片段置换于陆地棉苏8289遗传背景中，获得了具有染色体片段代换的矮杆高衣分棉花系。因此，本发明开发的染色体片段(异常棉11号染色体上位于SSR分子标记NAU2877和JAAS4311之间的片段)在今后矮杆高衣分棉花育种中具有重要应用价值。

(2)分子标记辅助目标片段选择，具有早期鉴定，快速鉴定以及准确性和稳定性高的特点，因此本发明所提供的6个SSR分子标记及其引物对有望大大提高矮杆高衣分棉花育种的选择效率及育种速度，对于加快矮杆高衣分棉花新品种的培育进程具有重要意义。

(3)本发明提供的矮杆高衣分棉花系，通过SSR分子标记及其引物对可用于矮杆和高衣分基因进行精细定位及相关基因克隆与功能分析，不但可以阐明棉花矮杆和高衣分性状的分子遗传机制，而且为培育能应用于生产的矮杆高衣分品种提供材料与分子基础。

附图说明

图1为本发明异常棉染色体片段代换系的图示基因型和渐渗片段的分布。浅灰色代表轮回亲本陆地棉苏8289的基因型，黑色代表异常棉的基因型，深灰色代表杂合区段。列代表染色体，从左到右依次为Chr.1-Chr.13；行从上到下依次代表74个染色体片段代换系，每个染色体片段代换系右侧对应了渐渗片段个数、长度、占异常棉基因组比例以及占轮回亲本基因组比例的信息。

图2为渐渗系的异常棉染色体片段在13条染色体上的覆盖率。

图3为本发明BC₄F₄胶图。A为SSR分子标记NAU2877；B为SSR分子标记JAAS4311；C为SSR分子标记NAU1063；D为SSR分子标记JAAS6160；E为SSR分子标记JAAS1260；F为SSR分子标记NAU5418。

图4为本发明SSR分子标记JAAS6160的BC₄F₃胶图

图5为本发明中异常棉11号染色体片段与矮杆、高衣分的分析图。

图6为本发明中矮杆高衣分单片段代换系CSSL34与轮回亲本苏8289的矮杆高衣分差异柱形图。

图7为本发明中矮杆高衣分单片段代换系CSSL34不同生长时期与轮回亲本苏8289的对比照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

陆地棉86-1(G.hirsutum var.86-1)、陆地棉苏8289(G.hirsutum var.Su8289)和异常棉(Gossypium anomalum)：均记载于“Caijiao Zhai,Peng Xu,Xia Zhang等.Development of Gossypium anomalum derived microsatellite markers and theiruse for genome-wide identification of recombination between the G.anomalumand G.hirsutum genomes.Theoretical and Applied Genetics,2015,128(8):1531-1540”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

实施例1、与棉花矮杆和高衣分性状相关的染色体片段的确定及相关分子标记的开发

本发明中的矮杆高衣分棉花，由以下步骤培育得到：

以陆地棉86-1为供体，与父本异常棉杂交，获得三倍体F₁(A₁D₁B₁)，通过0.15％的秋水仙素处理三倍体幼苗幼嫩的腋芽部位得到六倍体F₁(A₁A₁D₁D₁B₁B₁)；

以六倍体为母本，与亲本苏8289进行杂交，得到五倍体A₁A₁D₁D₁B₁，种植全部收到的种子，得到97棵单株；

得到的五倍体与苏8289回交，得到BC₂F₁的种子，全部种植，得到384棵单株，重组类型50个，其中36个重组类型可育；

将BC₂F₁的所有个体与苏8289回交，共获得4331个BC₃F₁单株，共40个重组类型；

将BC₃F₁群体中的重组个体和附加系个体与苏8289继续回交，获得8540个BC₄F₁单株，共56个重组类型；

将BC₄F₁群体中的56个重组类型进行自交，获得自交的BC₄F₂种子，种植BC₄F₂群体，总共获得4543个单株。

本发明中重组类型采用SSR标记进行检测，SSR标记的来源：将异常棉特异SSR标记与已公布的棉花全基因组SSR物理图谱进行整合，筛选一套均匀覆盖基因组的异常棉特异SSR标记(230个)并分析该群体，获得异常棉渐渗片段的标记基因型。

从BC₂F₁开始，选择重组个体继续回交两次，自交三次，每一世代根据BC₂F₁重组断裂点的标记信息，从覆盖基因组的230个标记中挑选130个均匀覆盖染色体组的关键SSR标记，并利用PCR技术检测所有重组个体。

PCR扩增条件：以陆地棉苏8289、异常棉、六倍体F₁和杂交后代为模板进行基因型检测。PCR反应体系为10μL：DNA模板2μL、10×buffer(Mg²⁺)1μL、dNTP 0.2μL、Taq DNA聚合酶0.1μL、前后引物各0.5μL、ddH₂O 3.7μL。

PCR热循环程序为：第一步：95℃预变性5min；第二步：94℃变性30s；第三步：55℃退火45s；第四步：72℃延伸1min(第二步到第四步重复30个循环)；第五步：72℃延伸10min，第六步：10℃保存。

PCR扩增产物的检测：清洗玻璃板，晾干后备用；把成套的两块玻璃板对齐，平放，两边用夹子夹紧，至于平板上；用玻璃棒引流，缓慢倒入8％的聚丙烯酰胺凝胶(29:1)，插入梳子。放置15min；待胶凝固后，松掉夹子，把有凝胶的玻璃板装入电泳槽中，倒入1×TBE电泳缓冲液，并用夹子两边加紧，继续加入电泳缓冲液，没过凝胶，拔梳子；点样(上样量为1μL)，180V恒压环境下电泳1.5h。

将2015年所获BC₄F₁群体中的所有重组个体进行自交，收获BC₄F₂种子，2016年夏种植BC₄F₂群体，总共获得4543个单株。根据遗传图谱和BC₂F₁统计数据重组断裂点的标记信息，挑选130对关键的均匀覆盖染色体组的SSR引物检测所有BC₄F₂群体，获得51个重组类型，其中45个为纯合基因型。

2016年12月进一步种植BC₄F₃群体，共1533个单株。根据遗传图谱和BC₂F₁统计数据重组断裂点的标记信息，挑选130对关键的均匀覆盖染色体组的SSR引物检测所有BC₄F₃群体，获得53个重组类型，其中47个为纯合基因型。

2017年种植BC₄F₄群体，共2225个单株，用本课题组开发筛选的均匀覆盖异常棉染色体组的230对SSR(包含130对引物在内)引物进行检测，共获得了74个重组类型，其中71个为纯合的基因型。每一世代群体大小组成详见表1，每一世代重组类型个数见表2。

表1 BC₃F₁、BC₄F₁、BC₄F₂、BC₄F₃、BC₄F₄世代用于标记辅助选择的群体大小

注：第二、第三和第四列括号内数字为筛选到的附加系单株数。

1、BC₄F₂、BC₄F₃和BC₄F₄世代重组类型的检测

将2015年所获得的BC₄F₁群体中的所有重组个体进行自交，收获BC₄F₂种子，2016年夏种植BC₄F₂群体，共获得4543个单株，根据遗传图谱和BC₂F₁重组断裂点的标记信息，挑选130对关键的均匀覆盖染色体组的SSR引物进行检测，获得51个重组类型，其中45个为纯合基因型，详见表2。与BC₄F₁相比，出现了8个新的重组类型，其异常棉染色体片段所在的标记区间分别为Chr.6：NAU2714-JAAS1095、NAU2714-JAAS1095&NAU1272-JAAS2480、JAAS6227-JAAS2480；Chr.9：JAAS1923-JAAS0613；Chr.10：JAAS1256-JAAS3294；Chr.11：JAAS4829-NAU3703、NAU3703-NAU3234和Chr.13：JAAS4570-JAAS2038。

2016年12月的海南BC₄F₃群体，共1533个单株，根据遗传图谱和BC₂F₁重组断裂点的标记信息，挑选130对关键的均匀覆盖染色体组的SSR引物进行检测，获得了53个重组类型，其中有47个为纯合的代换系(表2)。与BC₄F₂相比，在BC₄F₃世代出现了2个新的重组类型，其异常棉染色体片段所在的标记区间分别是Chr.5：DC40130-DC40130和Chr.11：JAAS0280-JAAS3199。

2017年种植BC₄F₄群体，共2225个单株，用本课题组开发筛选的均匀覆盖异常棉染色体组的230对SSR(包含130对引物在内)引物进行检测，共获得了74个重组类型，其中71个为纯合的基因型。与BC₄F₃相比较，在BC₄F₄中检测到了20种新的重组类型，其异常棉染色体片段所在的标记区间分别是Chr.1：JAAS0826-JAAS1148、NAU3615-JAAS1148、NAU3615-JAAS5817、NAU3615-JAAS0392、NAU5100-NAU4045、NAU2083-NAU2083、NAU2083-JAAS2569、NAU4045-NAU4045；Chr.4：JAAS2022-JAAS2076；Chr.8：NAU1037-JAAS6420；Chr.10：JAAS3294-JAAS3294、JAAS1256-JAAS1256；Chr.11：JAAS4829-JAAS4829、JAAS3088-JAAS5224、JAAS4259-JAAS4259。由于所有个体均进行了全基因组水平的标记扫描，检测到的新重组类型中存在不同染色体渐渗区段的组合类型。

异常棉染色体片段代换系群体的构建过程中连续六个世代检测重组类型的情况汇总详见表2。从BC₂F₁到BC₄F₄每一代均有新的重组类型产生，同时由于后代个体育性差和种子活力低等原因，每一代均存在重组类型丢失的现象。为了弥补重组类型丢失的情况，在BC₃F₁、BC₄F₁和BC₄F₂代进行重组个体与轮回亲本回交的同时也进行了附加系与轮回亲本的杂交，使得部分丢失的重组类型得以恢复，也产生了更多的来源于丢失类型的新重组类型。重组类型数目由最初的50个(BC₂F₁)增加到74个(BC₄F₄)，并最终获得能够稳定遗传的异常棉染色体片段代换系71个(基因型纯合)。

具体地，不同群体鉴定的重组类型个数如表2所示。

表2 BC₂F₁、BC₃F₁、BC₄F₁、BC₄F₂、BC₄F₃和BC₄F₄世代中鉴定的重组类型个数

注：括号中的数字表示杂合重组类型个数。^*由于在BC₄F₄代检测到同时包含两条以上染色体片段的重组类型，因此合计总数大于以染色体为单位累加的重组类型总数。

2、异常棉染色体片段代换系的鉴定

在BC₄F₄世代用230对均匀覆盖异常棉基因组的特异SSR引物对所有重组个体进行全基因组前景与背景鉴定，最终确定74个染色体片段代换系，以CSSL1-CSSL74依次编号，其中单片段代换系43个，两片段代换系24个，三片段代换系7个；有1个单片段代换系和2个两片段代换系的渐渗片段还保持杂合状态，其余71个为纯合染色体片段代换系。两片段和三片段代换系的染色体片段主要为Chr.1、Chr.2、Chr.5、Chr.6、Chr.9、Chr.10、Chr.11、Chr.12和Chr.13上渐渗片段之间的组合。染色体片段代换系的种类及对应的渐渗片段类型具体见表3。

表3 BC₄F₄中检测到的异常棉染色体渐渗片段及获得的染色体片段代换系

注：^*该渐渗片段为杂合状态。下划线标注表示利用附加系回交获得。⁺标注的为两片段代换系，^#标注的为三片段代换系，没有标注的为单片段代换系。

通过GGT软件(Van Berloo R.GGT 2.0:Versatile software for visualizationand analysis of genetic data.Journal of Heredity,2008,99(2):232-236.https://doi.org/10.1093/jhered/esm109)，按照Young和Tanksley(Young ND,TanksleySD.Restriction fragment length polymorphism maps and the concept of graphicalgenotypes.Theoretical and Applied Genetics,1989,77(1):95-101.https://doi.org/10.1007/bf00292322)的方法推断株系的染色体组成，界定供体片段的位置和大小等。对74个染色体片段代换系的染色体片段的分布进行作图(图1)，可以发现，对角线上的异常棉片段(黑色)覆盖了绝大多数的基因组，多数染色体片段代换系的片段之间有重叠。染色体片段代换系中异常棉片段的长度在4.75cM(CSSL10)到267.45cM(CSSL59)之间，平均长度68.91cM，累加长度达4972.79cM，相当于异常棉基因组总长度的2.15倍。而由于渐渗片段之间有重叠，所有渐渗片段覆盖异常棉染色体的总长度为1607.1cM，覆盖率约为70％(图2)。具有Chr.1和Chr.11染色体片段的染色体片段代换系数目较多，分别为20个和27个，对这两条异常棉染色体的覆盖率均达到了100％。含有Chr.3和Chr.7染色体片段的染色体片段代换系数目最少，都仅有1个，但由于片段长度较长，染色体覆盖率并不低(分别为59.9％和61.2％)。而覆盖率最低的为Chr.10，仅有17.9％。从图1中还可发现，对角线以外的浅灰色区域上的黑色和深灰色区段并不多，说明这套染色体片段代换系材料的陆地棉苏8289的遗传背景回复率较高，变幅从88.43％(CSSL59)到99.79％(CSSL10)，平均回复率达97.09％。

BC₄F₄株系的SSR检测胶图如图3所示。

图3中A为SSR分子标记NAU2877的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。

图3中B为SSR分子标记JAAS4311的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。

图3中C为SSR分子标记NAU1063的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。

图3中D为SSR分子标记JAAS6160的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。分子标记JAAS6160在CSSL32、CSSL33和CSSL34的基因型与六倍体F₁的基因型相同，原因如下：异常棉B₁与陆地棉At亚组易发生重组。一般情况下，陆地棉Dt亚组还存在一个与At亚组同源的未发生重组的SSR位点。PCR扩增时，引物与异常棉B₁组SSR位点结合的同时，还与Dt亚组的SSR位点结合，因此，CSSL32、CSSL33和CSSL34的基因型与六倍体F₁相同。为了验证这一结论，在CSSL34的BC₄F₃群体中，选择自交的21个单株进行基因型检测，结果发现，其基因型不分离，表明三个染色体片段代换系已稳定遗传，为纯合的染色体片段代换系(图4)。

图3中E为SSR分子标记JAAS1260的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。

图3中F为SSR分子标记NAU5418的检测结果；第1泳道为Marker，第2泳道为陆地棉苏8289的基因型，第3泳道为陆地棉86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道为CSSL32的基因型，第7泳道为CSSL33的基因型，第8泳道为CSSL34的基因型，第9泳道为CSSL31的基因型，第10泳道为CSSL35的基因型，第11泳道为CSSL37的基因型，第12泳道为CSSL38的基因型，第13泳道为CSSL46的基因型，第14泳道为CSSL47的基因型，第15泳道为CSSL63的基因型，第16泳道为CSSL67的基因型，第17泳道为CSSL71的基因型，第18泳道为CSSL72的基因型。

图4为SSR分子标记JAAS6160在CSS34的BC₄F₃世代检测结果。第1泳道为Marker，第2泳道为苏8289的基因型，第3泳道为86-1的基因型，第4泳道为异常棉的基因型，第5泳道为六倍体F₁的基因型，第6泳道-第26泳道为BC₄F₃群体中21个单株的基因型。

SSR标记分析：基因型在基因型数据收集时将与苏8289和86-1相同的带型记为“1”，与异常棉相同的带型记为“2”，与F1相同的带型记为“3”，带型缺失或模糊记为“-”。

由图3所示的BC₄F₄株系的SSR检测胶图可见，SSR分子标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS1260和NAU5418的检测结果中，三个染色体片段代换系CSSL32、CSSL33和CSSL34的带型均与异常棉带型一致(“2”)，SSR分子标记JAAS6160在三个染色体片段代换系CSSL32、CSSL33和CSSL34的带型虽与六倍体F₁带型一致(“3”)，但在CSSL32、CSSL33和CSSL34的BC₄F₃世代不分离(图4)，表明三个染色体片段代换系已稳定遗传，为纯合的染色体片段代换系。因此，CSSL32、CSSL33和CSSL34均含有位于异常棉11号染色体上的SSR分子标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS126和NAU5418。

统计分析发现，矮杆和高衣分棉花系均存在来自异常棉第11号染色体的渐渗片段。

为了验证陆地棉Chr.11渗入的异常棉片段对矮杆和高衣分的遗传贡献，我们分析了11号染色体的染色体片段代换系的基因型和矮杆、衣分。结果见图5。图5中，左侧部分为11号染色体不同染色体片段代换系在11号染色体的遗传背景分析。浅灰色表示苏8289的基因片段，黑色表示异常棉基因片段。右侧部分为不同染色体片段代换系和轮回亲本苏8289的株高和衣分表型统计。^*表示差异显著。

从图5可以看出，11号染色体的染色体片段代换系具有不同的代换片段，其中3个染色体片段代换系CSSL32、CSSL33和CSSL34均含有特定的SSR分子标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS1260和NAU5418(即3个染色体片段代换系均含有位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段)，并且其株高与轮回亲本苏8289相比具有不同程度的降低，衣分与轮回亲本苏8289相比具有不同程度的提升。而其余9个染色体片段代换系不含这6个SSR分子标记所在的异常棉染色体片段，其株高和衣分与轮回亲本苏8289相比差异不显著。这在一定程度上验证了这6个SSR分子标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS1260和NAU5418所在异常棉染色体片段对株高和衣分的遗传贡献。

采用WinQTLCart 2.5软件的单标记分析方法，将11号染色体的所有26个标记与株高和衣分性状进行了相关性分析，结果显示：标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS1260和NAU5418与株高和衣分存在显著相关性，其余标记与株高和衣分无相关性(表4)。

表4 SSR标记NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS1260和NAU5418与株高和衣分的相关性分析

性状	染色体	标记	P值	R<sup>2</sup>
					株高	Chr.11	NAU2877	0.007214442	0.1107
株高	Chr.11	NAU1063	0.007214442	0.1107
					株高	Chr.11	JAAS6160	0.007214442	0.1107
株高	Chr.11	JAAS1260	0.007214442	0.1107
					株高	Chr.11	NAU5418	0.007214442	0.1107
株高	Chr.11	JAAS4311	0.007214442	0.1107
					衣分	Chr.11	NAU2877	0.001247247	0.2064
衣分	Chr.11	NAU1063	0.001247247	0.2064
					衣分	Chr.11	JAAS6160	0.001247247	0.2064
衣分	Chr.11	JAAS1260	0.001247247	0.2064
					衣分	Chr.11	NAU5418	0.001247247	0.2064
衣分	Chr.11	JAAS4311	0.001247247	0.2064

将株系CSSL34分别在不同的环境中种植，环境1：2017年江苏南京江苏省农业科学院溧水植物科学基地；环境2：2018年江苏南京江苏省农业科学院溧水植物科学基地；环境3：2018新疆库尔勒。重复：各试验点均为随机区组排列，重复三次，种植密度和生产管理均与试验地点当地大田生产相同。

统计株高和衣分，如表5和表6所示。

表5株系CSSL34与轮回亲本苏8289的株高表型统计

表6株系CSSL34与轮回亲本苏8289的衣分表型统计

注：“-”表示未检测。

从表5可以看出，第11号染色体一个单片段代换系CSSL34其株高在不同环境下为75.00-83.88cm，显著低于轮回亲本苏8289(92.56-103.25cm)，可作为棉花矮杆分子遗传机制研究的一个重要材料。

从表6可以看出，第11号染色体一个单片段代换系CSSL34其衣分在不同环境下为44.00-49.37，显著高于轮回亲本苏8289(39.87-43.13)，可作为棉花衣分分子遗传机制研究的一个重要材料。

图6对应于表5和表6的数值，(a)为株高；(b)为衣分。

图7为矮杆高衣分单片段代换系CSSL34不同生长时期与轮回亲本苏8289的对比照片。(a)：江苏南京植物培养室，苗期；(b)：江苏省农业科学院溧水植物科学基地，花期；(c)：新疆库尔勒试验基地，吐絮期；(d)：江苏省农业科学院溧水植物科学基地，成熟期。

由上述实验结果，可见：含有位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记(NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的染色体片段可降低棉花株高并提高棉花衣分。该染色体片段上的6个SSR分子标记(NAU2877、JAAS4311、NAU1063、JAAS6160、JAAS1260和NAU5418)以及开发的引物对可以用于筛选目标染色体片段以培育株高降低且衣分提高的棉花品种。

其中，各SSR分子标记及其检测引物的具体信息如下：

SSR分子标记NAU2877的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

SSR分子标记JAAS4311的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

SSR分子标记NAU1063的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

SSR分子标记JAAS6160的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

SSR分子标记JAAS1260的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

SSR分子标记NAU5418的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

用于检测SSR分子标记NAU2877的引物(即图3中A检测所用引物对)如下：

NAU2877-F：5’-CCAAAATCCATGACATTCAA-3’(SEQ ID No.7)；

NAU2877-R：5’-TCTTCCCCGTTTTCTTTATG-3’(SEQ ID No.8)。

用于检测SSR分子标记JAAS4311的引物(即图3中B检测所用引物对)如下：

JAAS4311-F：5’-ACACCACCGTTAAGAAGAAAAATGT-3’(SEQ ID No.9)；

JAAS4311-R：5’-GCATTTAGTATCCCATGGATCTGT-3’(SEQ ID No.10)。

用于检测SSR分子标记NAU1063的引物(即图3中C检测所用引物对)如下：

NAU1063-F：5’-CACACTCACCCCTTTTTCTT-3’(SEQ ID No.11)；

NAU1063-R：5’-AGCAGGTTTACGGTTGTTGT-3’(SEQ ID No.12)。

用于检测SSR分子标记JAAS6160的引物(即图3中D和图4检测所用引物对)如下：

JAAS6160-F：5’-TCCTGCCGTGGTGTATTTGA-3’(SEQ ID No.13)；

JAAS6160-R：5’-TCACAAACCAGTCTGGAGGT-3’(SEQ ID No.14)。

用于检测SSR分子标记JAAS1260的引物(即图3中E检测所用引物对)如下：

JAAS1260-F：5’-CTCGCAGAATCCTTGGGGTT-3’(SEQ ID No.15)；

JAAS1260-R：5’-TGTGTTATATGACATGAAAGCGTGG-3’(SEQ ID No.16)。

用于检测SSR分子标记NAU5418的引物(即图3中F检测所用引物对)如下：

NAU5418-F：5’-GTGACTGAGGAGCCAGAAGT-3’(SEQ ID No.17)；

NAU5418-R：5’-AGCTGGTCCTCTTCTTCCTT-3’(SEQ ID No.18)。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与棉花矮杆和高衣分相关的SSR分子标记

<130> GNCLN191013

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 859

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ataagttaac tcaaaccctt caaaatccct aaacaaaatc ctgagaatct caacttccaa 60

tctttcactt tctaaattta ttgtcttccc cgttttcttt atgaaattaa acctctcaga 120

aaatgcaatc tcttgaaagc atcacagaat ccccatttcc tcaaaaccct aacaattctt 180

catcatcatc atcatcttct tcgattgggt tgtatggatg gctcgttgaa tgtcatggat 240

tttggcataa cttagcactt attatccctt ctctcctctt tgttctgttt ctgggttttc 300

aagctaaaaa aaactttcaa aagctctctc atggaaggtc ttatatcatg atttcttatt 360

acggttgcct ttggctcgtt agcttgctca accttgtttg gtgtttcgtt caggcctggg 420

aatgcactcc tggaaaggaa atggcatgga atatcttatc attgttcaca acttctggga 480

tgctattcct ggaagttagc ttgttggcat ttctactgca aggaaatcat gctagtgggt 540

tgcaagcttt gacacggaca tttgttattt cagggcttat tgttggtttg gacttacttc 600

tcaaggctat ttacctattt ggattcggtg tgcccttgtt cattgacaac tccgaacatc 660

cacgtcagat aaaatggggt ctgtgggttg ttcacaggct agtgctgact gctatttatg 720

gctccatact gtttatgtac cattctaagt ggagagaaag gttacctgca agacctgcat 780

tctacaaata tgttgccttc atgttcatct tgaatgcact agaactgttt gcttgtgcac 840

taactggaaa tggagctag 859

<210> 2

<211> 264

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acaccaccgt taagaagaaa aatgttagct tcccttttaa tccctacaaa tctttatatt 60

tccatgtttt atttgaagta tttcaaaata cagaaattgt tgactgaggt acttgattat 120

taaaattagc aattttgaac taaatggtga ttctttttca cacacacaca caaaaagaaa 180

gtatatttgt ttactggatt gattatgagt atgttgaatt tgagaagaaa attttttatg 240

acagatccat gggatactaa atgc 264

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tacacactca cccctttttc tttctccctc tctcggctca gctttgccgt tgccgttgcc 60

gttgctggtg cttttcttct ttttcccttt aataaccaaa tgaggaaggg agctaagaga 120

aaagccgctt ctcatgagca agaggagaag caagtaaagg cttcgtcttc ttcgcaagag 180

aatctcaaca acaacaaccg taaacctgct cccaaagcta agcttgctaa gacctccaag 240

cctcagcccg agcctgagta tttcgaagat aagcgtaact tggaagattt atggaaagct 300

gcattccctg ttggaacaga ggttggaatt ttgaatttcg atttgaatgt tgaatatttg 360

gtagtgtttt ttaaatgaat ttaagttctg ttgcttatat cgttttcctt ttgttgtttg 420

gaagtgggat caactggact ctgtttacca attcaactgg aacttttcga atttagaaga 480

tgcatttgaa gaggggggga aactatatgg aaagaaagtt tatctctttg gttgtacaga 540

gcctcaattg gtcccttaca aaggagaaaa caaagtcatt tgtatacctg tgattgtggc 600

tgttgagtct cctttcccac cttcagataa gattggtatt aactcagtgc agagagaagc 660

tgaaan 666

<210> 4

<211> 209

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tcctgccgtg gtgtatttga aagaaatgtc tttttttttt tttttaaagt taggaagttt 60

ataagttaaa ataacttata ttcctcttat ttttcttata tcttctattt gattatgatg 120

gcattcacaa taaatagttg gatgagaaga tgaaaacaga aatgtgtata ttttgagaag 180

atatccaaaa cctccagact ggtttgtga 209

<210> 5

<211> 101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ctcgcagaat ccttggggtt tttctttttt tttttgtaat aattgtagtt agggagaaaa 60

gagatgtgga ttaaatccac gctttcatgt catataacac a 101

<210> 6

<211> 630

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (606)..(606)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

ctctgtatag catatagctt aatcatcttc ctcttacttt aaaacttctt cctatataat 60

atctgactaa acttgcgctg aataccatgg ctactgcaga ggttgtaaca gctcaaactg 120

caatccatga ggagaaacct gaagaagtgg tcaaggttga agaaattgca acagaagagg 180

tagtggctgt tgctcctgca acagaacctg ttgctgaaga accaaaggaa gcagtgcctg 240

aagcagcatc cgaagaaccc caggctccag aaactgaagc cacagttgaa actgaatcaa 300

aggaggtggt tgaagagccc aaggctgtga ctgaggagcc agaagttgag aaaaaagaag 360

aagagactcc tgaggaaaca gtagcagagc cagttgcgga ggagtccaag gagactactg 420

agccaaccgt tgaagaaacc aaagaaagca cagagtctac agaagcagca gtagctgcag 480

cagcagaagc agaagtaaaa gcagaagccg aagccgaagc cagcccagag gaagcaacca 540

aagaggaagc tgcaaaggaa gaagaggacc agctgaagct caagctgaga aaatactacc 600

gagtanaata agcttgtaag atggggagca 630

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ccaaaatcca tgacattcaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tcttccccgt tttctttatg 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

acaccaccgt taagaagaaa aatgt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gcatttagta tcccatggat ctgt 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

cacactcacc cctttttctt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

agcaggttta cggttgttgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

tcctgccgtg gtgtatttga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

tcacaaacca gtctggaggt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

ctcgcagaat ccttggggtt 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

tgtgttatat gacatgaaag cgtgg 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gtgactgagg agccagaagt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

agctggtcct cttcttcctt 20

Claims

1.成套引物对或含有所述成套引物对的试剂盒在筛选DNA片段以辅助培育株高降低或衣分提高的以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体中的应用；

所述DNA片段与位于异常棉11号染色体上自SSR分子标记NAU2877起至SSR分子标记JAAS4311止的片段序列相同；

所述DNA片段包括位于异常棉11号染色体上的所述SSR分子标记NAU2877、SSR分子标记NAU1063、SSR分子标记JAAS6160、SSR分子标记JAAS1260、SSR分子标记NAU5418和所述SSR分子标记JAAS4311；

所述SSR分子标记NAU2877的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SSR分子标记JAAS4311的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述SSR分子标记NAU1063的核苷酸序列为SEQID No.3；所述SSR分子标记JAAS6160的核苷酸序列为SEQ ID No.4；所述SSR分子标记JAAS1260的核苷酸序列为SEQ ID No.5；所述SSR分子标记NAU5418的核苷酸序列为SEQ IDNo.6；

所述成套引物对由如下（b1）-（b6）组成；

（b1）用于鉴定所述SSR分子标记NAU2877的引物对1：根据SEQ ID No.1设计得到；

（b2）用于鉴定所述SSR分子标记JAAS4311的引物对2：根据SEQ ID No.2设计得到；

（b3）用于鉴定所述SSR分子标记NAU1063的引物对3：根据SEQ ID No.3设计得到；

（b4）用于鉴定所述SSR分子标记JAAS6160的引物对4：根据SEQ ID No.4设计得到；

（b5）用于鉴定所述SSR分子标记JAAS1260的引物对5：根据SEQ ID No.5设计得到；

（b6）用于鉴定所述SSR分子标记NAU5418的引物对6：根据SEQ ID No.6设计得到；

含有异常棉11号染色体上的所述SSR分子标记NAU2877、所述SSR分子标记NAU1063、所述SSR分子标记JAAS6160、所述SSR分子标记JAAS1260、所述SSR分子标记NAU5418和所述SSR分子标记JAAS4311的植株株高降低或衣分提高。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述引物对1由SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；所述引物对3由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成；所述引物对4由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；所述引物对5由SEQ IDNo.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成；所述引物对6由SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18所示的两条单链DNA组成。

3.成套引物对或含有所述成套引物对的试剂盒在辅助鉴定以陆地棉和异常棉为亲本的世代群体株高或衣分性状中的应用；

所述成套引物对由如下（b1）-（b6）组成；

（b1）用于鉴定SSR分子标记NAU2877的引物对1：根据所述SSR分子标记NAU2877的核苷酸序列SEQ ID No.1设计得到；

（b2）用于鉴定SSR分子标记JAAS4311的引物对2：根据所述SSR分子标记JAAS4311的核苷酸序列SEQ ID No.2设计得到；

（b3）用于鉴定SSR分子标记NAU1063的引物对3：根据所述SSR分子标记NAU1063的核苷酸序列SEQ ID No.3设计得到；

（b4）用于鉴定SSR分子标记JAAS6160的引物对4：根据所述SSR分子标记JAAS6160的核苷酸序列SEQ ID No.4设计得到；

（b5）用于鉴定SSR分子标记JAAS1260的引物对5：根据所述SSR分子标记JAAS1260的核苷酸序列SEQ ID No.5设计得到；

（b6）用于鉴定SSR分子标记NAU5418的引物对6：根据所述SSR分子标记NAU5418的核苷酸序列SEQ ID No.6设计得到；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述引物对1由SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；所述引物对3由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成；所述引物对4由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；所述引物对5由SEQ IDNo.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成；所述引物对6由SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18所示的两条单链DNA组成。