TWI814095B - 同步檢測豬隻基因之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種同步檢測豬隻基因之方法，包含：針對豬隻gDNA樣本之SNP位點，以相對於SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)；同步使用相對於PCR產物之延長引子(extension primer)，使延長引子於SNP位點進行單一鹼基延伸反應，以獲得被延伸之延長引子；檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而決定SNP位點的定型結果；或同步將PCR產物進行建庫(library preparation)，並對該建庫後之產物同步進行定序，從而獲得PCR產物全長序列以及SNP位點的定序結果。
Description
本發明係提供一種檢測豬隻gDNA基因型之高通量、快速且高準確性方式，用以進行豬隻有利基因的篩選。
臺灣豬隻每年的生產總值可達約650億元新臺幣，臺灣飼養的豬隻可分為種豬以及肉豬生產系統兩大類型，其中種豬生產系統中的主要豬隻品種包括藍瑞斯(Landrace)、約克夏(Yorkshire)、杜洛克(Doroc)以及臺灣黑豬；而肉豬生產系統中的主要豬隻品種則為LYD、LD以及黑豬品種。
據農委會2020年之統計年報資料顯示，目前臺灣黑豬約佔臺灣肉豬總生產頭數的12.7%，當中約有2萬頭種公豬、52萬頭成熟種母豬以及7萬頭新女豬。而豬隻的生長、屠體及繁殖性狀為選拔育種的主要指標，關係著臺灣種豬群的性狀生長、屠體及繁殖表現。
目前在臺灣有中央檢定站以及民間場內檢定站可供豬農進行中央級或種豬場內種豬性能的有利基因篩選及育種選拔，如：緊迫基因 (PSS gene)、多產基因(ESR gene)、高肉質基因(H-FABP gene)以及增長基因等，而不論是中央檢定站或是民間場內檢定站，其進行種豬有利基因的篩選方式皆是使用單一基因的MassARRAY或MS-PCR檢測方式來進行，然單一基因檢測方式不僅檢測耗時且所需費用亦較高，且亦需使用較多人力，因此大幅影響豬農的檢測意願。
有鑑於上述，如何有效提供一種檢測快速且費用較低的豬隻基因型檢測方式以進一步加速臺灣種豬性能的優化，已成為當前台灣豬隻育種產業發展上的一項重要議題；為解決上述問題，本發明之主要目的係提供一種同步檢測豬隻基因之方法，包含下列步驟：(1) 針對豬隻之gDNA樣本之至少8個SNP位點，以相對SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)，其中，8個SNP位點為(1) Chr:6_47356917、(2) Chr:1_14418789、(3) Chr:6_87950997、(4) Chr:6_87945930、(5) Chr:6_87945608、(6) Chr:15_94629248、(7) Chr:15_94629236以及(8) Chr:15_94628804；(2-1) 同步使用相對於PCR產物之延長引子(extension primer)，使延長引子於SNP位點進行單一鹼基延伸反應，獲得被延伸之延長引子，檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而獲得8個SNP位點的定型結果；或(2-2) 同步將PCR產物進行建庫(library preparation)，並對建庫後之產物同步進行次世代定序(next generation sequencing)，從而獲得PCR產物全長序列以及8個SNP位點的定序結果。
根據本發明之一個或多個實施例，其中該專一性引子對為下列8組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)。
根據本發明之一個或多個實施例，其中該延長引子(extension primer)為下列8個：第一延長引子(SEQ ID NO：23)、第二延長引子(SEQ ID NO：24)、第三延長引子(SEQ ID NO：25)、第四延長引子(SEQ ID NO：26)、第五延長引子(SEQ ID NO：27)、第六延長引子(SEQ ID NO：28)、第七延長引子(SEQ ID NO：29)、第八延長引子(SEQ ID NO：30)。
根據本發明之一個或多個實施例，其中該被延伸之延長引子之分子量大小係以質譜儀檢測；或對該建庫後之產物以次世代定序儀定序檢測。
根據本發明之一個或多個實施例，其中該步驟(1)進一步包含同步檢測額外之SNP位點，額外之SNP位點係選自由以下所組成之群組：(9) Chr:2_1493346、(10) Chr:2_1474734及(11) Chr:16_20637657。
根據本發明之一個或多個實施例，其中針對額外之SNP位點之專一性引子對為第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20) 以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)。
根據本發明之一個或多個實施例，其中針對額外之SNP位點之延長引子為第九延長引子(SEQ ID NO：31)、第十延長引子(SEQ ID NO：32)以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)。
本發明之另一主要目的係提供一種引子對組合，其包含選自由下列引子對所組成之群組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20) 以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)。
本發明之另一主要目的係提供一種延長引子組合，其包含選自由下列延長引子所組成之群組：第一延長引子(SEQ ID NO：23)、第二延長引子(SEQ ID NO：24)、第三延長引子(SEQ ID NO：25)、第四延長引子(SEQ ID NO：26)、第五延長引子(SEQ ID NO：27)、第六延長引子(SEQ ID NO：28)、第七延長引子(SEQ ID NO：29)、第八延長引子(SEQ ID NO：30)、第九延長引子(SEQ ID NO：31)、第十延長引子(SEQ ID NO：32)以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)。
本發明之再一主要目的係提供一種用於檢測豬隻基因之套組，包含一PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑以及上述之引子對組合。
根據本發明之一個或多個實施例，該套組其進一步包含如上述之延長引子組合。
由上述可知，本發明相較於先前習知的單一基因檢測方式之優勢在於：
1. 可同時檢測大量基因，且不會拉長整體檢測所需耗費的時間與降低檢測的準確性。
2. 大幅降低檢測費用。
3. 提供一具高通量、同步、準確以及快速的基因檢測平台。
為使本發明技術內涵更加詳盡與完備，以下針對本發明的實施態樣與具體實施例進行說明，但以下說明並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式，倘本領域中具通常知識者透過以下敘述可輕易明瞭此發明之必要技術內容，且在不違反其中的精神及範圍下多樣地改變及修飾此發明來適應不同用途及狀況，如此，該實施態樣亦屬於本發明的申請專利範圍。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「一」及「該」亦可解釋為複數。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「包含」、「包括」、「具有」或「含有」係包含性或開放性，並不排除其他未闡述之元素或方法步驟。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「大約」或「約」係指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明所揭示之準確或絕對的數值受未知的第三方非法或非正當使用。因此，除非另有相反的說明，本文中所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。
本發明之主要目的係提供一種同步檢測豬隻基因之方法，包含下列步驟：(1) 針對豬隻之gDNA樣本之至少8個SNP位點，以相對SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)，其中，8個SNP位點為(1) Chr:6_47356917、(2) Chr:1_14418789、(3) Chr:6_87950997、(4) Chr:6_87945930、(5) Chr:6_87945608、(6) Chr:15_94629248、(7) Chr:15_94629236以及(8) Chr:15_94628804；(2-1) 同步使用相對於PCR產物之延長引子(extension primer)，使延長引子於SNP位點進行單一鹼基延伸反應，獲得被延伸之延長引子，檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而獲得8個SNP位點的定型結果；或(2-2) 同步將PCR產物進行建庫(library preparation)，並對建庫後之產物同步進行次世代定序(next generation sequencing)，從而獲得PCR產物全長序列以及8個SNP位點的定序結果。
本發明之另一主要目的係提供一種引子對組合，其包含選自由下列引子對所組成之群組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20) 以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)。
本發明之另一主要目的係提供一種延長引子組合，其包含選自由下列延長引子所組成之群組：第一延長引子(SEQ ID NO：23)、第二延長引子(SEQ ID NO：24)、第三延長引子(SEQ ID NO：25)、第四延長引子(SEQ ID NO：26)、第五延長引子(SEQ ID NO：27)、第六延長引子(SEQ ID NO：28)、第七延長引子(SEQ ID NO：29)、第八延長引子(SEQ ID NO：30)、第九延長引子(SEQ ID NO：31)、第十延長引子(SEQ ID NO：32)以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)。
本發明之再一主要目的係提供一種用於檢測豬隻基因之套組，包含一PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑以及上述之引子對組合。
本文中所使用之術語「gDNA」係指豬隻之染色體DNA，攜帶有可遺傳給下一子代之遺傳訊息，並經由轉錄及轉譯作用被表現於豬隻個體中。其中該豬隻品種較佳為Landrace、Yorkshire、Doroc、臺灣黑豬、LYD、LD以及黑豬品種。
本文中所使用之術語「SNP位點」係指豬隻gDNA序列中單一鹼基對的變異，即豬隻gDNA序列中一定位點出現A、T、C或G的改變。
本文中所使用之術語「專一性引子對」係指可與豬隻gDNA序列中特定SNP位點進行聚合酶鏈鎖反應之核苷酸序列對。
本文中所使用之術語「延長引子(extension primer)」係指可與豬隻gDNA序列中具特定SNP位點之PCR產物進行單一鹼基延伸反應，以獲得被延伸之延長引子。
本文中所使用之術語「建庫(library preparation)」係指將豬隻gDNA序列中具特定SNP位點之PCR產物經核酸萃取後，再將其末端接上轉接子(adaptor)，以作為樣品庫。
本發明以下敘述為此技術領域中具通常知識者可輕易明瞭此發明之必要技術內容，倘在不違反其中的精神及範圍下多樣的改變及修飾此發明來適應不同的用途及狀況，如此，其他的實施態樣亦屬於本發明的申請專利範圍。
實施例
1
：以質譜儀進行
SNP
位點定型
本實施例以下針對豬隻gDNA樣本之目標SNP位點同步進行聚合酶鏈鎖反應，再同步以質譜儀檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而獲得目標SNP位點的定型結果。
實驗步驟
1. 針對待檢測豬隻之gDNA樣本之至少8個SNP位點，以相對該SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應。
於本實施例中，檢測之標的SNP位點係選自下表1中共11個SNP位點中的至少8個。其中Chr6_47356917係用於檢測豬隻緊迫基因之SNP位點；Chr:1_14418789係用於檢測豬隻高產基因之SNP位點；Chr:6_87950997、 Chr:6_87945930以及Chr:6_87945608係用於檢測豬隻肉質基因之SNP位點；Chr:2_1493346係用於檢測豬隻增肌基因之SNP位點；Chr:2_1474734係用於檢測豬隻增長基因之SNP位點；Chr:16_20637657係用於檢測豬隻產精基因之SNP位點；Chr:15_94629248、Chr:15_94629236以及Chr:15_94628804係用於檢測豬隻瘦肉基因之SNP位點。
於本實施例中，相對上述共11個SNP位點之專一性引子對，係經多次實驗後得到結果最佳者，如下表1所示，其中第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2) 係對應於SNP位點Chr6_47356917；第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4) 係對應於SNP位點Chr:1_14418789；第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6) 係對應於SNP位點Chr:6_87950997；第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8) 係對應於SNP位點Chr:6_87945930；第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10) 係對應於SNP位點Chr:6_87945608；第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12) 係對應於SNP位點Chr:2_1493346；第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14) 係對應於SNP位點Chr:2_1474734；第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)係對應於SNP位點Chr:16_20637657；第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)係對應於SNP位點Chr:15_94629248；第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)係對應於SNP位點Chr:15_94629236以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)係對應於SNP位點Chr:15_94628804。
2. 同步使用相對於該PCR產物之延長引子(extension primer)，使該延長引子於該SNP位點進行單一鹼基延伸反應，獲得被延伸之延長引子，檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而獲得至少8個SNP位點的定型結果。
於本實施例中，相對上述共11個SNP位點之延長引子如下表1所示，此係多次實驗後得到之效果最佳者，其中第一延長引子(SEQ ID NO：23)係對應於SNP位點Chr6_47356917；第二延長引子(SEQ ID NO：24)係對應於SNP位點Chr:1_14418789；第三延長引子(SEQ ID NO：25)係對應於SNP位點Chr:6_87950997；第四延長引子(SEQ ID NO：26)係對應於SNP位點Chr:6_87945930；第五延長引子(SEQ ID NO：27)係對應於SNP位點Chr:6_87945608；第六延長引子(SEQ ID NO：28)係對應於SNP位點Chr:2_1493346；第七延長引子(SEQ ID NO：29)係對應於SNP位點Chr:2_1474734；第八延長引子(SEQ ID NO：30)係對應於SNP位點Chr:16_20637657；第九延長引子(SEQ ID NO：31)係對應於SNP位點Chr:15_94629248；第十延長引子(SEQ ID NO：32)係對應於SNP位點Chr:15_94629236以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)係對應於SNP位點Chr:15_94628804。
表1 SNP位點及與其相對之專一性引子對及延長引子
| SNP位點 | 專一性引子對 | 延長引子 |
| (1) Chr:6_47356917 | ACGTTGGATGTGGACTTGATGTGGTTCTCC (SEQ ID NO: 1) ACGTTGGATGATCCTGGAGGTGCTGTACTG (SEQ ID NO: 2) | GATGTTCAGGACCTCAG (SEQ ID NO: 23) |
| (2) Chr:1_14418789 | ACGTTGGATGTTAGAATAGGGTGGAATGGG (SEQ ID NO: 3) ACGTTGGATGGAAGCCTGTTTTTACAGTGAC (SEQ ID NO: 4) | TGGGGACTTGACAAGAAAAG (SEQ ID NO: 24) |
| (3) Chr:6_87950997 | ACGTTGGATGCTCTTCGGAATCTGAGAAGG (SEQ ID NO: 5) ACGTTGGATGAACCGAAGATGTCCATGACC (SEQ ID NO: 6) | CTGAGAAGGAAGCCG (SEQ ID NO: 25) |
| (4) Chr:6_87945930 | ACGTTGGATGAAGGAGGAGGGGACATCTAC (SEQ ID NO: 7) ACGTTGGATGTTCTCCCTCTTCCATGCCTG (SEQ ID NO: 8) | TCTACCCTCTCTCAGGA (SEQ ID NO: 26) |
| (5) Chr:6_87945608 | ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC (SEQ ID NO: 9) ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG (SEQ ID NO: 10) | GCAGATTATTTCTAGCCTGG (SEQ ID NO: 27) |
| (6) Chr:2_1493346 | ACGTTGGATGGTTTTTGGAAAACAGAGCCG (SEQ ID NO: 11) ACGTTGGATGTGAAGAAGGGAGGCGTGTAG (SEQ ID NO: 12) | CGCATCCACACTGTG (SEQ ID NO: 28) |
| (7) Chr:2_1474734 | ACGTTGGATGCATGGCAGGTGCCAATCACT (SEQ ID NO: 13) ACGTTGGATGTTCGGGATGGATGGTGTGG (SEQ ID NO: 14) | CTCCTCCGAGGGTCTGAGACTTCAGA (SEQ ID NO: 29) |
| (8) Chr:16_20637657 | ACGTTGGATGATCGAGGTAATCCAGCCCAC (SEQ ID NO: 15) ACGTTGGATGAGAATCCAGCTGCGAAAGAC (SEQ ID NO: 16) | GGGCCGTGGTGAAGC (SEQ ID NO: 30) |
| (9) Chr:15_94629248 | ACGTTGGATGAGCTGACATTATCCTCTTGG (SEQ ID NO: 17) ACGTTGGATGTATTCACGTGAAAATCGTGC (SEQ ID NO: 18) | TGCAACTTTAGGATAGGA (SEQ ID NO: 31) |
| (10) Chr:15_94629236 | ACGTTGGATGTATTCACGTGAAAATCGTGC (SEQ ID NO: 19) ACGTTGGATGAGCTGACATTATCCTCTTGG (SEQ ID NO: 20) | ACGTGAAAATCGTGCTCAGTTT (SEQ ID NO: 32) |
| (11) Chr:15_94628804 | ACGTTGGATGGGTGAGCTGATTCATTTGAC (SEQ ID NO: 21) ACGTTGGATGAAGTGCAGTTTATATTATTG (SEQ ID NO: 22) | AGATATATGTGACATTTGAAAAATT (SEQ ID NO: 33) |
實驗結果
根據下表2以質譜儀檢測共11個被延伸之延長引子之分子量大小，可獲知所選之至少8個標的SNP位點之定型結果。
表2 延長引子分子量大小及其對應之SNP位點定型結果
| SNP位點 | 延長引子分子量大小 | SNP位點定型結果 |
| (1) Chr:6_47356917 | 5481.6 | T |
| 5497.6 | C | |
| (2) Chr:1_14418789 | 6486.3 | G |
| 6566.2 | A | |
| (3) Chr:6_87950997 | 4898.2 | G |
| 4978.1 | A | |
| (4) Chr:6_87945930 | 5328.5 | C |
| 5408.4 | T | |
| (5) Chr:6_87945608 | 6370.2 | G |
| 6410.2 | C | |
| (6) Chr:2_1493346 | 4760.1 | C |
| 4840 | T | |
| (7) Chr:2_1474734 | 8234.4 | G |
| 8194.4 | C | |
| (8) Chr:16_20637657 | 4921.2 | G |
| 5001.1 | A | |
| (9) Chr:15_94629248 | 5833.9 | A |
| 5849.9 | G | |
| (10) Chr:15_94629236 | 6996.6 | G |
| 7076.5 | A | |
| (11) Chr:15_94628804 | 7999.3 | A |
| 8055.2 | T |
實施例
2
：以
NGS
進行
PCR
產物全長序列以及
SNP
位點定序
本實施例以下針對豬隻gDNA樣本之目標SNP位點同步進行聚合酶鏈鎖反應，再同步將該PCR產物進行建庫，並對該建庫後之產物同步進行次世代定序，從而獲得該PCR產物全長序列以及SNP位點的定序結果。
實驗步驟
1. 針對待檢測豬隻之gDNA樣本之至少8個SNP位點，以相對該SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應。
於本實施例中，檢測之標的SNP位點相同於前述表1中共11個SNP位點中的至少8個。
於本實施例中，相對上述共11個SNP位點之專一性引子對如前述表1所示。
2. 同步將該PCR產物進行建庫(library preparation)，並對該建庫後之產物同步進行次世代定序(next generation sequencing)，從而獲得該PCR產物全長序列以及該8個SNP位點的定序結果。
於本實施例中， 因所獲得之PCR產物僅約100 bp，因此於豬隻之gDNA樣本建庫步驟中，不須再以物理性方法(如超音波震盪法)或酵素裁切等方式將基因序列進行核酸片斷化(fragmentation)，而係直接於該PCR產物之末端接上轉接子(adaptor)，以作為樣品庫。
依照不同的次世代定序平台進行定序。例如，可採用焦磷酸定序法(pyrosequencing)，過程中依序置入帶有 4 個不同鹼基的去氧核苷酸，當核酸聚合酶將去氧核苷酸接合時，釋出焦磷酸根離子(pyrophosphate)，釋出的焦磷酸根因 ATP 硫酸酶(ATP sulfurylase)轉換產生ATP，再藉由冷光酶(luciferase)接收 ATP 能量將冷光素(luciferin)進行氧化，最後由感測器測得訊號，得到定序的結果；或者，將已接上轉接子的核酸小片段，注入到表面帶有轉接子互補序列的晶片上，使每一條核酸小片段像是被種在晶片上，接著在晶片的固態表面進行橋式放大，注入含有4種標記不同螢光且可被移除的去氧核糖核苷酸(dNTP)之反應試劑進行PCR反應，一旦dNTP被接上正在合成的DNA片段，螢光分子就會被釋放後偵測該影像，如此反覆進行螢光標記移除、試劑置換與影像偵測，得到定序結果。乳糜化核酸模板擴增技術(emulsion PCR)，先將核酸片段擴增在Ion Sphere Particle上，再將Ion Sphere Particle放入半導體晶片裡進行定序；或者，於定序時分別注入4種dNTP，聚合酶進行接合作用時會釋放出氫離子，產生電位差改變，故可以半導體晶片內的感測元件判讀是A、T、C、G何種鹼基。經過反覆的步驟與偵測，得到定序結果。本發明並不限定於上述之定序方式。
實驗結果
下表3係以次世代定序所呈現之相對該共11個SNP位點其SNP位點的定序結果，可獲知所選之至少8個標的SNP位點定序PCR產物全長序列後所得到之SNP位點定序結果。
表3 定出PCR產物全長序列得到對應之SNP位點定序結果
| SNP位點 | SNP位點定序結果 |
| (1) Chr:6_47356917 | T |
| C | |
| (2) Chr:1_14418789 | G |
| A | |
| (3) Chr:6_87950997 | G |
| A | |
| (4) Chr:6_87945930 | C |
| T | |
| (5) Chr:6_87945608 | G |
| C | |
| (6) Chr:2_1493346 | C |
| T | |
| (7) Chr:2_1474734 | G |
| C | |
| (8) Chr:16_20637657 | G |
| A | |
| (9) Chr:15_94629248 | A |
| G | |
| (10) Chr:15_94629236 | G |
| A | |
| (11) Chr:15_94628804 | A |
| T |
綜上所述，相較於習知的單一基因檢測方式，本發明可同時檢測大量基因，且不會影響整體檢測所耗費之時間與降低檢測的準確性；降低檢測費用；以及可進而建立一具高通量、同步、準確以及快速的基因檢測平台。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者僅為本發明之一較佳實施態樣與實施例而已，並非用以此限定本發明之範圍，即任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內當可進行之均等變化與修飾，皆仍屬本發明所涵蓋的保護範圍。
無
無。
無。
序列表
<![CDATA[<110> 國立臺灣大學]]>
<![CDATA[<120> 同步檢測豬隻基因隻方法]]>
<![CDATA[<160> 33 ]]>
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gcagattatt tctagcctgg 20
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cgcatccaca ctgtg 15
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ctcctccgag ggtctgagac ttcaga 26
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gggccgtggt gaagc 15
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tgcaacttta ggatagga 18
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acgtgaaaat cgtgctcagt tt 22
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agatatatgt gacatttgaa aaatt 25
無。
Claims (11)
- 一種同步檢測豬隻基因之方法，包含下列步驟：(1)針對該豬隻之gDNA樣本之至少8個SNP位點，以相對該SNP位點之專一性引子對同步進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)，其中，該8個SNP位點為(1)Chr：6_47356917、(2)Chr：1_14418789、(3)Chr：6_87950997、(4)Chr：6_87945930、(5)Chr：6_87945608、(6)Chr：15_94629248、(7)Chr：15_94629236以及(8)Chr：15_94628804；(2-1)同步使用相對於該PCR產物之延長引子(extension primer)，使該延長引子於該SNP位點進行單一鹼基延伸反應，獲得被延伸之延長引子，檢測被延伸之延長引子之分子量大小，從而獲得該8個SNP位點的定型結果；或(2-2)同步將該PCR產物進行建庫(library preparation)，並對該建庫後之產物同步進行次世代定序(next generation sequencing)，從而獲得該PCR產物全長序列以及該8個SNP位點的定序結果。
- 如請求項1所述之方法，其中該專一性引子對為下列8組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)。
- 如請求項2所述之方法，其中該延長引子(extension primer)為下列8個：第一延長引子(SEQ ID NO：23)、第二延長引子(SEQ ID NO：24)、第三延長引子(SEQ ID NO：25)、第四延長引子(SEQ ID NO：26)、第五延長引子(SEQ ID NO：27)、第九延長引子(SEQ ID NO：31)、第十延長引子(SEQ ID NO：32)以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)。
- 如請求項1至3任一項所述之方法，其中該被延伸之延長引子之分子量大小係以質譜儀檢測；或對該建庫後之產物以次世代定序儀定序檢測。
- 如請求項1至3任一項所述之方法，其中該步驟(1)進一步包含同步檢測額外之SNP位點，該額外之SNP位點係選自由以下所組成之群組：(9)Chr：2_1493346、(10)Chr：2_1474734及(11)Chr：16_20637657。
- 如請求項5之方法，其中針對該額外之SNP位點之專一性引子對為第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)以及第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)。
- 如請求項6之方法，其中針對該額外之SNP位點之延長引子為第六延長引子(SEQ ID NO：28)、第七延長引子(SEQ ID NO：29)以及第八延長引子(SEQ ID NO：30)。
- 一種引子對組合，其包含選自由下列引子對所組成之群組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)以及第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)。
- 一種延長引子組合，其包含選自由下列延長引子所組成之群組：第一延長引子(SEQ ID NO：23)、第二延長引子(SEQ ID NO：24)、第三延長引子(SEQ ID NO：25)、第四延長引子(SEQ ID NO：26)、第五延長引子(SEQ ID NO：27)、第六延長引子(SEQ ID NO：28)、第七延長引子(SEQ ID NO：29)、第八延長引子(SEQ ID NO：30)、第九延長引子(SEQ ID NO：31)、第十延長引子(SEQ ID NO：32)以及第十一延長引子(SEQ ID NO：33)。
- 一種用於檢測豬隻基因之套組，包含一PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑以及請求項8之引子對組合。
- 如請求項10之套組，其進一步包含如請求項9之延長引子組合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110136300A TWI814095B (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 同步檢測豬隻基因之方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110136300A TWI814095B (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 同步檢測豬隻基因之方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202313988A TW202313988A (zh) | 2023-04-01 |
| TWI814095B true TWI814095B (zh) | 2023-09-01 |
Family
ID=86943320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW110136300A TWI814095B (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 同步檢測豬隻基因之方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI814095B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110408708A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-05 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法 |
-
2021
- 2021-09-29 TW TW110136300A patent/TWI814095B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110408708A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-05 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Huang et. al., "Efficient SNP Discovery by Combining Microarray and Lab-on-a-Chip Data for Animal Breeding and Selection" Microarrays, 4, MDPI, 2015, p. 570-595 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202313988A (zh) | 2023-04-01 |
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