CN110241181A - 一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法 - Google Patents

一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法 Download PDF

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余伯阳
田蒋为
黄浠桐
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA‑21方法，该方法在磁珠上偶联底物链和被锁定链沉默的脱氧核酶链，当靶标miRNA出现后与锁定链杂交结合，将其从脱氧核酶链上竞争下来，从而激活脱氧核酶切割底物链；释放的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。本发明通过引入脱氧核酶和蔗糖酶对miRNA的检测信号进行双酶放大作用，提高了检测灵敏度，在100‑1000fM具有线性关系，检测限为68.08fM，具有简便、快捷、灵敏、高效、成本低等有点。

Description

一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法
技术领域
本发明涉及miRNA-21的检测方法，特别涉及一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法。
背景技术
微小RNA(miRNA)广泛存在于真核细胞中，是一种短长度(约18-25个核苷酸)的内源性非编码小分子，与信使RNA结合后参与转录后水平的基因表达调控。miRNA调控人体约1/3的基因表达，参与控制细胞分化、增殖和凋亡。然而，由于其在体液中低浓度，短长度和高同源性的特殊性，实现快速，简单，可靠和超灵敏的测定仍具有挑战性。
现有miRNA检测方式，大多需要昂贵的仪器设备和复杂的操作、冗长的等待时间。目前用于核酸检测的方法主要有四种：southern和northern印迹法、聚合酶链反应(PCR)、DNA微阵列、新一代测序(NGS)。对于靶向痕量核酸水平的液体活检，定量逆转录-PCR测定(qRT-PCR)和NGS是最广泛使用的方法。具有非常高灵敏度的qRT-PCR只需要相对低量的RNA进行绝对定量。然而，由于在逆转录和PCR期间选择性相对较低，因此更适合于较长链的DNA/RNA靶标的定量，对于20碱基长度的miRNA则不够灵敏，且需要对温度进行比较精细的控制。新型NGS系统提供比PCR更大的检测动态范围，但miRNA的测序仍然受到相对较高的NGS误差率的限制。此外，NGS对基础设施，计算机容量和人员专业知识有很高的要求，这限制了它的临床应用，一次测试的成本非常高。
公告号为CN107385014A的中国发明专利，公开了一种直接定量检测miRNA的qRT-PCR的方法，该方法需要花费冗长的时间，掌握复杂的操作，使用RT-qPCR才能完成检测；公告号为CN107012210A的中国发明专利，公开了一种基于稀土纳米材料荧光放大的miRNA检测方法，也需要用到荧光分光光度计进行定量，且对实验人员的操作技能有一定专业要求。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种检测灵敏度高和选择性高的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法。
技术方案：本发明提供一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，包括如下步骤：
(1)制备检测探针：以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接脱氧核酶链(SEQ IDNO.1)、底物链(SEQ ID NO.2)-蔗糖酶复合物形成检测探针；
所述脱氧核酶链被锁定链沉默，其结构为5’-生物素-自由链片段1-锁定链(SEQID NO.3)-臂2-催化核心序列-臂1-3’；所述底物链与生物素偶联，其结构为5’-生物素-自由链片段2-片段1-RNA(rA)-片段2-巯基-3’；
所述自由链片段1的序列为：5’-(t)60-3’；所述自由链片段2的序列为：5’-(t)20-3’；所述臂1的序列为：5’-ATAGT-3’；所述臂2的序列为：5’-tctcttc-3’；所述片段1的序列为：5’-actat-3’；所述片段2的序列为：5’-gaagaga-3’；所述催化核心序列的序列为：5’-tccgagccggtcgaa-3’；所述RNA(rA)为RNA的作用位点；
(2)向含有Mn2+离子的溶液中加入待测miRNA-21(SEQ ID NO.4)样品和所述检测探针，待测miRNA-21与检测探针的锁定链结合区域特异性结合，将锁定链竞争下来，启动脱氧核酶链切割底物链的RNA作用位点(RNA(rA))；
(3)加入EDTA终止反应；
(4)反应终止后进行磁分离，转移上清液至蔗糖的溶液中，静置反应；
(5)利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。
进一步地，(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；
(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；
(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；
(4)制备被锁定链沉默的脱氧核酶链：将锁定链和脱氧核酶链混合在PBS缓冲液中，加热至75℃后冷却至25℃；
(5)将底物链-蔗糖酶复合物和脱氧核酶链与以链霉亲和素修饰磁珠偶联：用缓冲液D浸泡以链霉亲和素修饰磁珠，过夜，确保除去吸附在磁珠表面上的磷酸根阴离子，超滤，再向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链，缓冲液B中含有：0.2M氯化钠，0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，0.05％Tween-20，pH值5.5。
进一步地，所述缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3；缓冲液B中含有氯化钠、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和Tween-20，pH值5.5；缓冲液D中含有氯化钾、氯化钠、氯化镁、Tween-20和的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH值7.4。所述步骤(2)中采用Amicon-100K和缓冲液A超滤纯化。所述步骤(3)中采用Amicon-100K超滤纯化。
进一步地，所述步骤(5)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在100-1000fM范围内符合线性方程y＝2.54581+0.02883x，其中，y为葡萄糖浓度，x为miRNA-21浓度。线性检测浓度范围受到血糖仪的检测范围的影响，减小的蔗糖浓度，则可以检测到更高浓度的miR-21。
本发明方法的原理阐述如下：
通过链霉亲和素与生物素将修饰蔗糖酶的底物链和的被锁定链沉默的脱氧核酶链与磁珠偶联；当靶标miR-21出现后竞争锁定链，激活脱氧核酶链切割底物链，释放蔗糖酶；磁分离转移后上清液至蔗糖溶液中，催化蔗糖转化为葡萄糖，生成血糖仪可检测的信号(见图1)。
为了克服现有miRNA检测技术中存在的操作复杂、时间冗长、仪器昂贵等缺点，本发明新型提供一种基于血糖仪的miRNA检测新方法。血糖仪作为一种被广泛应用的床旁即时检测仪器，具备体积小巧、便携易带、操作简单的优点。为了实现超高灵敏度，应用脱氧核酶切割RNA及蔗糖酶双酶放大的信号扩大策略。探针以链霉亲和素修饰磁珠为载体，通过生物素偶联底物链和被锁定链沉默的脱氧核酶链。与qRT-PCR不同，整个检测过程可以通过短链核酸miRNA启动，所需的能量源于脱氧核酶裂解底物链时释放的能量。脱氧核酶的催化作用导致底物链的裂解和蔗糖酶与磁珠的分离。最终，收集到上清液中总蔗糖酶量增加，实现miRNA检测信号的有效放大。
第一方面，选用的脱氧核酶是8-17E脱氧核酶的截短形式，具有切割RNA活性，由臂1(5’-atagt-3’)和臂2(5’-tctcttc-3’)和催化核心序列(5’-tccgagccggtcgaa-3’)组成，臂1和臂2形成锁定区域。脱氧核酶的臂2连接锁定链结合序列(5’-tcagactgatgttga-3’)(自由链片段1)，3’-末端连接含60个胸腺嘧啶碱基的脱氧核糖核酸(5’-(t)60-3’)单链自由链片段，提供脱氧核酶运动行走所需的空间距离；5’端通过亲和素与链霉亲和素抗体磁珠连接。
第二方面，为了构建由特定序列miRNA启动的脱氧核酶链，设计了锁定链，其含有与靶标miRNA-21互补的靶结合序列(5’-taagcta-3’)和与臂2互补的隔离结构序列(5’-aagaga-3’)。锁定链与脱氧核酶基底链杂交形成双链，并且在锁定链的3’端具有7nt的游离序列，用于与靶标miRNA-21结合。靶标miRNA通过链置换反应与锁定链杂交形成双链，被竞争离开基底链。与锁定链杂交的脱氧核酶无活性，当遇到靶标物质miRNA-21时被激活启动，与底物链的RNA(rA)作用，开启其切割底物链的作用。
第三方面，本发明设计的底物链是由RNA(rA)衍生的两个DNA结构域组成DNA-RNA嵌合序列，两个DNA结构域片段1(5’-actat-3’)和片段2(5’-gaagaga-3’)是脱氧核酶的结合区域。为了增强脱氧核酶对底物链的可接近性，在5’-末端处连接20个含胸腺嘧啶的脱氧核糖核酸(5’-(t)20-3’)作为自由序列间隔物，并通过在5’端修饰生物素与链霉亲和素修饰磁珠结合。为了实现从miRNA-21信号到血糖仪读数的关联，利用亲核取代反应，以4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)为连接分子，在底物链3’-端修饰蔗糖酶。
有益效果：本发明双酶放大效应，可提高miRNA检测灵敏度：相比其他需要加入引物多次扩增的检测方法，此探针本身含有的脱氧核酶核酸和蔗糖酶使得只需少量特定miRNA的激活即可启动体系，转化得到明显的检测信号。锁定链结构增强miRNA检测的特异性：可以对特异性靶标进行进行有效识别，对于单碱基错配的目标miRNA也具有良好的识别能力。底物链和脱氧核酶链与磁珠通过亲和链霉素与生物素结合：高效稳定，磁珠比表面积大，可修饰性强，成本低廉，且每个磁珠上含有成千上万底物链，进一步增大了放大效果。应用血糖仪检测，大大降低检测成本和检测时的技术要求：不需要各种工具酶以及多步、复杂难懂的放大步骤，无需冗长的等待时间，大型昂贵的仪器，复杂专业的操作技术，血糖仪读数与标准曲线对照，直接得出miRNA含量，更加简便快捷，适合普通民众使用。
附图说明
图1为本发明miRNA检测原理示意图；
图2为实施1制备得到的底物链-蔗糖酶复合物的6％SDS-PAGE表征示意图；
图3为实施1所涉及探针序列的可行性验证的PAGE表征示意图；
图4为实施2制备得到的探针检测miRNA-21线性标曲；
图5为实施3所述的识别miRNA-21靶标的选择性考察结果。
具体实施方式
以下实施例中，检测所述的血糖仪型号为：罗氏诊断产品(上海)有限公司的ACCU-CHEK Performa NC血糖仪；检测所用的电泳系统为：上海天能科技有限公司型号为VE 180的微型垂直电泳槽；美国BIO-RAD伯乐公司Chemi Doc凝胶成像系统；美国BIO-RAD伯乐公司型号为PowerPac 1000的垂直电泳仪；
每升缓冲液A中含有：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3。
每升缓冲液B中，含有0.2M氯化钠，0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，0.05％Tween-20，pH 5.5。
每升缓冲液C中，含有0.025M Tris-HCl，0.2M氯化钠，pH 8.0。
每升缓冲液D中，含有0.1M氯化钾，0.1M氯化钠，0.001M氯化镁，0.05％Tween-20，0.01M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH 7.4。
以上缓冲液的配制溶液为DEPC水。
实施例1：本发明检测方法可行性验证，在缓冲溶液中评价体系设计序列的竞争与杂交可行性
1、制备底物链和蔗糖酶连接复合物
用DEPC水配制30μL浓度为1mM的底物链，加入2μL pH 5.5的磷酸钠缓冲液(1M)和2μL溶解在Millipore水中的浓度为30mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，将该混合物在室温下静置1小时，然后使用Amicon-10K超滤管超滤纯化8次。
蔗糖酶连接底物链：用缓冲液A配制400μL浓度为20mg/mL的蔗糖酶溶液，与1mgsulfo-SMCC混合；涡旋5分钟后，室温条件置于振荡器上反应1小时，1000r离心5分钟除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化8次。
将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置48小时；然后使用缓冲液A、通过Amicon-100K纯化该溶液8次，以除去未反应的底物链。
2、制备被锁定链沉默的脱氧核酶链
在结合到磁珠之前，通过锁定链将脱氧核酶沉默。将锁定链和脱氧核酶链以3∶1的摩尔比混合在5μL PBS缓冲液(pH 7.4)中。将混合物加热至75℃并逐渐冷却至25℃。
3、将底物链和脱氧核酶链与磁珠偶联
用缓冲液D将磁珠浸泡过夜，以确保除去吸附在磁珠表面上的磷酸根阴离子，因为储存磁珠的PBS缓冲液中含有的磷酸根阴离子可以与Mn2+竞争脱氧核酶之间的结合。使用Amicon-100K超滤管超滤三次将3)和4)的缓冲液转换成缓冲液B，以1∶1比例加入到1mg/mL磁珠溶液中，在室温下充分混合反应120min。最后，使用缓冲液B洗涤三次以除去过量的未连接DNA链。
图2中泳道1为200kb的DNA梯度片段标准物；泳道2为目标miRNA-21的DNA同序列标准物；泳道3为锁定链标准物；泳道4为脱氧核酶链标准物；泳道5为DNA同序列标准物和锁定链双链杂交序列；泳道6为锁定链和脱氧核酶链双链杂交序列；泳道7为用目标miRNA-21与锁定链和脱氧核酶链双链杂交序列共同孵育。
图2给出了实施1制备的探针可行性验证的PAGE表征示意图。
由图可知，泳道7中用目标miRNA-21的DNA同序列标准物与锁定链和脱氧核酶链双链杂交序列共同孵育后，锁定链从脱氧核酶基底链上被竞争下来，生成miRNA-21的DNA同序列标准物和锁定链双链杂交序列，表明序列可行性验证成功。
图3给出了实施1制备得到的DNA-Invertase的6％SDS-PAGE表征示意图。
由图可知，连接底物链后的蔗糖酶的相对分子量变大，表明底物链成功连接上去。
实施例2：考察本发明对miRNA-21的灵敏度
1、实验所需仪器和试剂和实施1一致；
2、考察基于脱氧核酶和蔗糖酶的双酶放大体系测定miRNA-21标准溶液的灵敏度，包括以下步骤：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制100fM-1000fM浓度的miRNA-21标准溶液，使其浓度分别为100fM，200fM，400fM，600fM，800fM，1000fM；
(2)启动反应：每管加入10μL miRNA-21标准溶液和溶解在缓冲液C里面的60μL探针，再分别加入溶解在DEPC水中浓度为0.01M的Mn2+溶液；室温下孵育40min；
(3)终止反应：加入5μL的50mM EDTA终止反应；
(4)磁分离：用磁铁吸附磁珠，转移上清液至100μL浓度为2M蔗糖的溶液中，静置反应40min；
(5)读数：用血糖仪检测产生的葡萄糖浓度信号；
(6)绘制标准曲线：以miRNA-21标准溶液浓度为横坐标，以每一浓度标准曲线对应的血糖仪读数为纵坐标，绘制标准曲线。
图4给出了miRNA-21浓度与血糖仪读数的标准曲线。
由图4可知，目标物的浓度在100fM-1000fM范围内符合方程y＝2.54581+0.02883x，miRNA-21的浓度与血糖仪读数成线性相关(r2＞0.995)，以空白平均值的3倍SD值计算，最低检测限位68.08fM，可用于miRNA的测定。.
实施例3：考察本发明对miRNA-21的选择性
1.实验所需仪器、试剂和探针合成方法与实施1一致；
2.本实验所需的序列除申请权利保护的序列，还需用到以下序列：
名称 寡核苷酸序列
has-mir-200c 5’-cgtcttacccagcagtgtttgg-3’
hsa-mir-423 5’-tgaggggcagagagcgagacttt-3’
hsa-miR-4640 5’-tgggccagggagcagctggtggg-3’
has-miR-21 5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’
Mis-1 5’-uaccuuaucacacugaucuuga-3’
Mis-2 5’-uagcuuaucagacagauguuga-3’
Mis-3 5’-uagcuuaacagacugauguuga-3’
3.基于脱氧核酶和蔗糖酶的双酶放大体系测定miRNA-21及错配序列的选择性，包括以下步骤：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制hsa-miR-200c、hsa-mir-423、hsa-miR-4640、has-miR-21、Mis-1、Mis-2、Mis-3的1000fM浓度的标准溶液，空白对照(Blank)为缓冲液C；
(2)启动反应：每管加入10μL的hsa-miR-200c、hsa-mir-423、hsa-miR-4640、has-miR-21、Mis-1、Mis-2、Mis-3的浓度为1000fM的标准溶液，再加入溶解在缓冲液C里面的60μL探针和溶解在DEPC水中浓度为0.01M的Mn2+溶液；室温下孵育40min；
(3)终止反应：加入5μL的50mM EDTA终止反应；
(4)磁分离：用磁铁吸附磁珠，转移上清液至100μL浓度为2M蔗糖的溶液中，静置反应40min；
(5)读数：用血糖仪检测产生的葡萄糖浓度信号；
(6)绘制柱状图：绘制血糖仪读数柱状图。以每种靶标的名称为横坐标，每种靶标所得血糖仪读数为纵坐标，绘制柱状图。
图5为本实施例所述的识别miRNA-21靶标的选择性的考察结果。
由图5可知，单碱基错配(Mis-2、Mis-3)和三碱基错配(Mis-1)与miRNA-21相比，有着明显的选择性差别，而其他miRNA序列的测定值与空白背景差别不大，说明它们无法有效地启动探针；上述结果也证明了本实施所述检测体系有良好的选择性。
实施例4：考察本发明在尿液样品中对miRNA-21的加样回收率
1.实验所需仪器、试剂和探针合成方法实施1一致；
2.体液环境为小鼠尿液环境
3.实验所用的工作曲线和实施2一致
4.考察检测探针体系在尿液环境中测定miRNA-21的回收率，步骤如下所示：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制浓度为1000fM、800fM、500fM、200fM的miRNA-21标准溶液。
(2)启动反应：每管空白尿液中分别加入1000fM、800fM、500fM、200fM浓度标准溶液，加入溶解在缓冲液C里面的60μL探针，再加入溶解在DEPC水中浓度为0.01M的Mn2+溶液；室温下孵育40min；
(3)终止反应：加入5μL的50mM EDTA终止反应；
(4)磁分离：用磁铁吸附磁珠，转移上清液至含有100.μL含有2M蔗糖的溶液中，静置反应40min；
(5)读数：用血糖仪检测产生的葡萄糖浓度信号，
(6)测定回收率：以实施2所得工作曲线为标准曲线，计算加样后实验对应的回收率。
(7)所述计算方法为：已知在尿液中的加样浓度为C0，将血糖仪测定值代入标准曲线拟合公式求出测量浓度C，将浓度C代入公式C/C0X 100％，即得到回收率。
表1给出了实施4所述的对于体液体系样品中miRNA-21回收的考察结果。
经计算可知，所述回收率在90-110％之间，变异系数小于10％，结果表明，本实施例检测体系可以有效地屏蔽复杂体液环境的干扰，检测方法具有良好的精密度和重现性。
表1尿液中的加样回收实验
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tcagactgat gttgatctct tctccgagcc ggtcgaaata gt 102
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
tttttttttt tttttttttt cactatagga agagat 36
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
aagagatcaa catcagtctg ataagcta 28
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (6)

1.一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备检测探针：以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接脱氧核酶链(SEQ ID NO.1)、底物链(SEQ ID NO.2)-蔗糖酶复合物形成检测探针；
所述脱氧核酶链被锁定链沉默，其结构为5’-生物素-自由链片段1-锁定链(SEQ IDNO.3)-臂2-催化核心序列-臂1-3’；所述底物链与生物素偶联，其结构为5’-生物素-自由链片段2-片段1-RNA(rA)-片段2-巯基-3’；
所述自由链片段1的序列为：5’-(t)60-3’；所述自由链片段2的序列为：5’-(t)20-3’；所述臂1的序列为：5’-atagt-3’；所述臂2的序列为：5’-tctcttc-3’；所述片段1的序列为：5’-actat-3’；所述片段2的序列为：5’-gaagaga-3’；所述催化核心序列的序列为：5’-tccgagccggtcgaa-3’；所述RNA(rA)为RNA的作用位点；
(2)向含有Mn2+离子的溶液中加入待测miRNA-21(SEQ ID NO.4)样品和所述检测探针，待测miRNA-21与检测探针的锁定链结合区域特异性结合，将锁定链竞争下来，启动脱氧核酶链切割底物链的RNA作用位点(RNA(rA))；
(3)加入EDTA终止反应；
(4)反应终止后进行磁分离，转移上清液至蔗糖的溶液中，静置反应；
(5)利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。
2.根据权利要求1所述的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：所述检测探针的制备方法为：
(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；
(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；
(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；
(4)制备被锁定链沉默的脱氧核酶链：将锁定链和脱氧核酶链混合在PBS缓冲液中，加热至75℃后冷却至25℃；
(5)将底物链-蔗糖酶复合物和脱氧核酶链与以链霉亲和素修饰磁珠偶联：用缓冲液D浸泡以链霉亲和素修饰磁珠，过夜，确保除去吸附在磁珠表面上的磷酸根阴离子，超滤，再向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链，缓冲液B中含有：0.2M氯化钠，0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，0.05％Tween-20，pH值5.5。
3.根据权利要求2所述的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：所述缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3；缓冲液B中含有氯化钠、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和Tween-20，pH值5.5；缓冲液D中含有氯化钾、氯化钠、氯化镁、Tween-20和的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH值7.4。
4.根据权利要求2所述的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用Amicon-100K和缓冲液A超滤纯化。
5.根据权利要求2所述的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用Amicon-100K超滤纯化。
6.根据权利要求1所述的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法，其特征在于：所述步骤(5)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在100-1000fM范围内符合线性方程y＝2.54581+0.02883x，其中，y为葡萄糖浓度，x为miRNA-21浓度。
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