CN111855647B - 一种用于检测单链核酸的ecl传感器、其套件及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测单链核酸的ECL传感器、其套件及其方法，涉及生物传感器领域。该方法基于一种新的ECL传感器，以PFO聚合物纳米颗粒作为单一发光体，结合有第一核酸；第一核酸能被待测核酸互补结合并形成单链结构进而能互补结合第二核酸，第二核酸标记有用于催化底物产生酶促反应产物的酶；酶促反应产物能减弱发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL‑1，而增强发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL‑2，根据发光体在不同扫描电位下具有不同的ECL发射性质，在无需添加共反应试剂的情况下，即可获得不同扫描电位下的两ECL信号的相反变化，以该比率型ECL策略实现对单链核酸的检测在生物学分析中具有重要价值。

Description

一种用于检测单链核酸的ECL传感器、其套件及其方法
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，具体而言，涉及一种用于检测单链核酸的ECL传感器、其套件及其方法。
背景技术
电致化学发光(ECL)技术结合了电致发光和化学发光的优点，具有可原位实时检测等性能。比率型ECL分析由于消除了外部干扰并提高了检测可靠性而受到越来越多的关注。目前所报道的ECL比率策略通常是基于两个不同的ECL发光体而构建，且利用两发光体之间或发光体与金属纳米材料之间的共振能量转移，或ECL发光体之间竞争同一共反应试剂如H2O2或者溶解O2，而获得与目标物浓度相关的两个ECL信号的变化，从而实现目标物的比率检测。
目前关于miRNA比率检测的研究报道相对较少，而且均是基于双发光体而构建的。同时具有阴极和阳极ECL发射的发光体较多，但能实现其阴极和阳极ECL信号随目标物浓度变化而呈现不同变化趋势的却很少。例如，Cai等人和Wang等人分别报道了基于石墨烯量子点(GQD)和石墨氮化碳量子点(g-CNQDs)自身的阴极和阳极ECL发射构建比率型生物传感器。这两个体系即使外加了两种共反应物协同作用以增强量子点的ECL信号，但获得的信号强度也仍然很有限，且外加共反应物可能破坏检测体系的微环境，造成稳定性问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测单链核酸的ECL传感器、其套件及其方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供了一种用于检测单链核酸的ECL传感器，所述ECL传感器包括有电极基底以及负载于所述电极基底上的发光体，所述发光体结合有具有发夹结构的第一核酸；
所述第一核酸能够被待测核酸互补结合并形成单链结构进而能够互补结合第二核酸，所述第二核酸标记有用于催化底物产生酶促反应产物的酶；
所述酶促反应产物能够作为猝灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2。
第二方面，实施例提供了一种用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其包括有：如前述实施例所述的用于检测单链核酸的ECL传感器以及如下至少一种组分：所述第二核酸、用于催化产生酶促反应产物的酶以及底物。
第三方面，实施例提供了一种检测单链核酸的方法，其包括采用如前述实施例所述的用于检测单链核酸的ECL传感器或如前述实施例所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件对待测核酸进行检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种用于检测单链核酸的ECL传感器、其套件及其方法，该方法包括基于一种新的电位调控的ECL传感器，以PFO聚合物纳米颗粒作为单一发光体，所述发光体结合有具有发夹结构的第一核酸；所述第一核酸能够被待测核酸互补结合并形成单链结构进而能够互补结合第二核酸，所述第二核酸标记有用于催化底物产生酶促反应产物的酶；所述酶促反应产物能够作为猝灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2，根据所述发光体在不同扫描电位下具有不同的ECL发射性质，在无需添加任何共反应试剂的情况下，即可获得不同扫描电位下的两ECL信号的相反变化，以该比率型ECL策略实现对单链核酸的检测在生物学分析中具有重要价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例中PFO NPs的SEM表征图和粒径分布图；
图2为实施例中的验证SDA和HCR相关反应的PAGE结果图；
图3为实施例中生物传感器的逐步组装过程示意图；
图4为实施例中不同修饰电极的CVs和EIS表征结果图；
图5为验证例1中的SDA扩增反应对该生物传感器性能的影响结果图以及试验例2中酶促反应底物葡萄糖的浓度对检测过程的影响结果图；
图6为验证例3中ECL传感器对不同浓度的miRNA-155的ECL响应曲线；
图7为验证例4中ECL传感器的连续扫描时的稳定性和选择性的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，实施例提供了一种用于检测单链核酸的ECL传感器，述ECL传感器包括有电极基底以及负载于所述电极基底上的发光体，所述发光体结合有具有发夹结构的第一核酸；
所述第一核酸能够被待测核酸互补结合并形成单链结构进而能够互补结合第二核酸，所述第二核酸标记有用于催化底物产生酶促反应产物的酶；
所述酶促反应产物能够作为猝灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2。
优选地，所述发光体为聚(9,9-二-正辛基芴基-2,7-二基)聚合物纳米颗粒。
在一些实施方式中，所述发光体的粒径为30～60nm。
优选地，所述发光体由以下方式制备：将PFO和PSMA的混合溶液超声处理1.5～2.5h，得到聚(9,9-二-正辛基芴基-2,7-二基)聚合物纳米颗粒。
优选地，所述PFO和PSMA的混合溶液由：0.8～1.2mg/mL PFO和0.8～1.2mg/mLPSMA以体积比为(4～6):1混合得到。
聚芴材料是具有特殊的平面联苯刚性结构的有机化合物，其分子内含有芳香族或芳杂环化合物等多个有机共轭π单元。这种特殊的刚性结构使得这些化合物具有较高的荧光量子产率，优异的光稳定性，无毒且易于结构修饰。经发明人研究发现，羧基功能化的PFO聚合物纳米颗粒(PFO NPs)不但具有高效的ECL发射且其发射具有电位可调谐性，即在不同的扫描电位下具有不同的阳极ECL发射，具体为：在无共反应试剂的情况下，该发光体在第一扫描电位下具有强而稳定的第一信号值ECL-1，在第二扫描电位下具有较弱的第二信号值ECL-2。而所述酶促反应产物(如H2O2)对其具有不同作用，将PFO聚合物纳米颗粒作为单一发光体的ECL传感器，在无额外添加任何共反应试剂的情况下，上述酶促反应产物(原位生成的)能够作为淬灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2，通过获得不同扫描电位下的两ECL信号的相反变化，实现对单链核酸(microRNA)的超灵敏检测。
本发明实施例还提供了一种用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其包括有：如前述任一实施方式所述的用于检测单链核酸的ECL传感器以及如下至少一种组分：所述第二核酸、用于催化产生酶促反应产物的酶以及底物。
优选地，所述酶促反应产物为H2O2。
优选地，所述用于催化产生酶促反应产物的酶选自：葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和乳酸氧化酶中的至少一种，所述底物选自：葡萄糖、胆固醇和乳酸中的至少一种。
优选地，所述ECL传感器套件还包括有第三核酸。所述第三核酸能够与所述第二核酸互补结合并与所述第二核酸发生杂交链式反应。
优选地，所述第三核酸标记有用于催化底物形成产生酶促反应产物的酶。
优选地，所述待测核酸包括待检测的第一目标核酸或/或由所述第一目标核酸通过链置换反应产生的第二目标核酸。
所述ECL传感器套件还包括用于引发所述第一目标核酸发生链置换扩增反应以产生第二目标核酸的模板核酸。
优选地，当所述第一目标核酸为miRNA-155时，所述模板核酸的碱基序列如SEQ IDNo.5所示，第二目标核酸的碱基序列如SEQ ID No.6所示，所述第一核酸、所述第二核酸和所述第三核酸的碱基序列分别如SEQ ID No.7～9所示。
此外，本发明实施例还提供了一种检测单链核酸的方法，其包括采用如前述任一实施方式所述的用于检测单链核酸的ECL传感器或如前述任一实施方式所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件对待测核酸进行检测。
优选地，所述方法包括：
步骤a)将所述待测核酸加入到所述ECL传感器上，以使所述待测核酸与所述第一核酸互补结合从而使所述第一核酸形成单链结构；
步骤b)在所述ECL传感器上加入第二核酸，以使第一核酸与所述第二核酸结合；
步骤c)再在所述ECL传感器中加入底物，以使底物被所述酶催化产生酶促反应产物；需要说明是，本步骤中的酶促反应产物为上述任一实施方式所述，能够作为猝灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2的。
步骤d)在所述第一扫描电位下，扫描发光体，获得第一信号值ECL-1；在所述第二扫描电位下，扫描发光体，获得第二信号值ECL-2；通过ECL-1和ECL-2的比率计算待测核酸的水平。
优选地，所述第一扫描电位为0～+(1.20～1.30)V；所述第二扫描电位为0～+(1.90～2.10)V。具体地，在一些实施方式中，ECL-1的扫描范围可以为0～+1.20V、0～+1.21V、0～+1.22V、0～+1.23V、0～+1.24V、0～+1.25V、0～+1.26V、0～+1.27V、0～+1.28V、0～+1.29V或0～+1.30V。
优选地，所述方法包括在步骤b)中加入所述套件中的第三核酸，以使所述第二核酸和所述第三核酸发生杂交链式反应；
优选地，杂交链式反应的条件为：35～39℃，孵育1.5～2.5h。
优选地，在步骤c)中，所述底物的工作浓度为≥1.2mmol/L。在该浓度范围下，酶促反应底物溶液的浓度对ECL-1和ECL-2的比率不造成干扰，检测的结果更稳定。
本实施例提供的方法的原理：
利用PFO NPs修饰的电极，并捕获第一核酸(发夹结构H1)，H1被待测核酸打开，通过引入的第二核酸(H2)和第三核酸(H3)以发生杂交链式反应(HCR)。需要说明的是，在不具有H3的情况下，也可以将用于催化产生酶促反应产物的酶引入电极表面。但通过HCR反应，能够将大量的用于催化底物产生酶促反应产物的酶(如葡萄糖氧化酶，GOx)引入电极表面，并与检测溶液中的底物(如葡萄糖)反应，以原位生成酶促反应产物(如H2O2)。生成的酶促反应产物H2O2能作为淬灭剂减弱发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2。而随着待测核酸浓度的增加，生成的H2O2的量增加，ECL-1的信号逐渐减小而ECL-2的信号逐渐增加，通过获取ECL-1和ECL-2的信号的相反变化，实现对待测单链核酸的超灵敏检测。
该方法具有很低的检测限度，优良的稳定性和抗干扰性。这种基于原位生成酶促反应产物H2O2对单一发光体PFO NPs不同扫描电位下的两阳极ECL发射(ECL-1和ECL-2)的相反作用而构建的电位调控型ECL比率策略，与现有的ECL比率完全不同，即排除了共振能量转移的距离依赖性限制，也避免或减少了外加共反应物所引起的稳定性问题，同时还克服了目前基于单一发光体如氧化石墨烯量子点的ECL效率低的局限性，为ECL比率检测提供了一种新的思路。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
实验仪器
ECL强度通过购于西安瑞迈分析仪器有限公司的MPI-E多功能ECL系统记录。测试时，光电倍增管(PMT)电压设置为800V，扫描速度设置为0.3V/s。用CHI660E电化学工作站进行循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)测试。ECL和电化学测试(CV和EIS)时，工作电极均是裸的或者修饰了的玻碳电极(GCE，Φ＝4.0mm)，辅助电极均是铂丝，参比电极分别是Ag/AgCl电极(ECL检测)和饱和甘汞电极(SCE)(CV和EIS检测)。
利用扫描电子显微镜表征纳米材料。BG-verMIDI标准垂直电泳仪和Bio-Rad GelDoc XR+系统分别用于天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶成像。
试剂和材料
聚(9,9-二正辛基芴基-2,7-二基)(PFO，分子量≥20000)，四氢呋喃(THF)和聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA，MW～1700，苯乙烯含量68％)，二甲基亚砜(DMSO)，以及三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)均购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(美国)。Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd(东京，日本)提供了3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(MBS，98.0％)。葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA，96～99％)购自成都市科龙化工试剂厂。湖州河马生物科技有限公司(中国，湖州)提供了所有RNA和DNA寡核苷酸，表1显示了其详细的序列信息。
Nb.BbvCI限制性内切酶购买于NEB有限公司。Phi29聚合酶和dNTPs分别由美国赛默飞世尔科技公司和北京鼎国昌盛生物技术有限公司提供。将120mmol·L-1Tris，5mmol·L-1KCl，140mmol·L-1NaCl，1.0mmol·L-1CaCl2和1.0mmol·L-1MgCl2用于配制Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)。上海泰坦科技有限公司提供了用于此工作的其他试剂，包括1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)等。
表1序列信息
Figure BDA0002618378570000081
PFO NPs的制备
首先，分别制备PFO和PSMA的储备溶液(溶剂为THF，且浓度均为1.0mg·mL-1)。然后，在强力超声处理下将PFO和PSMA储备溶液按比例(v/v，5/1)混合。在超声混合处理大概2h后，将1.0mL上述混合液在剧烈超声处理下快速添加至超纯水中。最后，通过氮气汽提法除去THF后，获得PFO NPs悬浮液(0.20mg·mL-1)。
利用扫描电子显微镜(SEM)技术表征了PFO NPs的微观形貌，如图1中A所示，可以看到均匀分散的球状颗粒，并且从图1中B的粒径分布图中可以看到，大部分粒径为40nm左右，计算后得到平均粒径为50nm。所得到的形貌与粒径符合预期，因此证明该材料PFO NPs制备成功。
H1、G-H2和G-H3的制备
首先，将单链H1，H2和H3用pH 7.4的Tris-HCl缓冲液配置成2.0μmol·L-1的溶液，将其分别加热至95℃并保持10min。然后在30min内冷却至室温，形成发夹结构H1、H2和H3以用于后续实验。
选择MBS作为交联剂，将GOx结合至发夹H2和H3上。具体步骤为：(1)将10mmol·L- 1TCEP分别添加到3'-SH修饰的发夹H2和5'-SH修饰的发夹H3中，以还原S-S键并进一步通过Millipore(35kDa)去除过量的TCEP；(2)混合1.0mL的GOx(1.0mg·mL-1)和25μL的MBS溶液(以DMSO为溶剂，浓度为6.4mmol·L-1)，在25℃下反应1h，以获得MBS活化的GOx；(3)向100μLMBS活化的GOx中加入100μL巯基修饰的H2和H3(100μmol·L-1)，并在室温下反应1h，然后用Millipore(100kDa)纯化后将得到的G-H2(连接有Gox的H2)和G-H3(连接有Gox的H3)悬浮于PBS中以供进一步使用。
链置换扩增反应(SDA)
为了进行可行性研究，首先，将目标物(miRNA-155，不同浓度)，模板核酸template(1.0μmol·L-1)在Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中混合。然后，将混合溶液加热至95℃保持10min，接着在大约1.0h内缓慢冷却至室温，退火以使miRNA-155与template充分杂交。加入dNTPs(500μmol·L-1)，Nb.BbvCI(100U·mL-1)和phi29(100U·mL-1)后，将混合物在恒温培养箱中于37℃下反应2.0h。最后，通过在80℃下热处理20min来终止反应系统，并且将从这种链置换扩增(SDA)反应获得的第二目标核酸(ST)储存在4.0℃下以供下一步实验使用。
使用新鲜制备的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证SDA反应。如图2中A所示，lane A-1到A-3中的条带分别对应于靶标miRNA-155(2.0μmol·L-1)、template(1.0μmol·L-1)、1.0μmol·L-1miRNA-155和template的杂交体，lane A-4对应于添加了dNTPs(500μmol·L-1)、Nb.BbvCI(100U·mL-1)和phi29(100U·mL-1)的1.0μmol·L-1miRNA-155和template的杂交体混合物，lane A-5对应于标准分子量DNA marker。将miRNA-155与template混合杂交后(lane A-3)，可以观察到一条明显的很亮的带，其迁移缓慢，这表明miRNA-155与template杂交成功。然后，在添加了dNTPs、Nb.BbvCI和phi29后，miRNA-155与template的杂交条带变暗，并且产生了一条新的较暗的带(lane A-4)，表示SDA反应的成功，并且产生了新的DNA短链即第二目标核酸链。
传感器的组装
图3显示了生物传感器的逐步组装过程。首先，以常规方法处理玻璃碳电极(GCE，Φ＝4.0mm)并在其表面滴涂8.0μL PFO NPs分散液(0.20mg·mL-1)，室温下干燥成膜。
借助交联剂(EDC/NHS，n/n，4/1)来处理PFO NPs/GCE电极，在室温下将20μL EDC/NHS在电极上孵育30min以活化PFO NPs表面上的羧基，然后用5.0μL发夹H1(2.0μmol·L-1)孵育2.0h，将H1交联在PFO NPs表面上。洗去多余的H1后将5.0μL BSA(0.25wt％)在电极上孵育30min以封闭电极表面未反应的结合位点。
随后，将10μL所获得的ST(不同浓度)滴加到电极表面，在37℃反应30min用于打开H1。最后，将10μL制备好的G-H2和G-H3于37℃在电极上孵育2.0h，以发生HCR反应。
使用新鲜制备的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证HCR反应。如图2中B所示，lane B-1到B-5中的不同条带分别对应于：第二目标核酸(ST)，H1，ST与H1的杂交体，ST与H1的杂交体与H2和H3的混合物，标准分子量DNA marker。由附图可知，将ST与H1混合杂交后(lane B-3)，可以观察到一条明显的迁移缓慢的带，这可以表明ST与H1杂交成功。其次，在添加了H2和H3后，在lane B-4中产生了HCR反应的特征条带，证明HCR反应的成功。上述PAGE数据证明了由目标miRNA-155引发的SDA反应以及随后的HCR反应。
随着G-H2和G-H的引入，大量GOx也被引入到电极上。GOx催化测试溶液中的葡萄糖(glu)以原位生成H2O2，并猝灭较低电位ECL-1的发射和增强较高电位ECL-2的发射。
含有1.2mmol·L-1葡萄糖的3.0mL PBS(0.10mol·L-1，pH 7.4)用作检测溶液，先设置扫描范围为0～+1.25V记录ECL-1，然后设置扫描范围为0～+2.0V记录ECL-2。通过目标物引起的ECL-1的猝灭和ECL-2的增强而实现目标物的比率检测。
传感器组装过程的表征
使用电化学方法即循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)来探究生物传感器的逐步组装过程。
不同孵育电极的CV表征在4.0mL[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液(5.0mmol·L-1)中进行，电势扫描范围为-0.2V至0.6V。
请参照附图4中A，曲线a为裸GCE，曲线b为PFO NPs/GCE，曲线c为H1/PFO NPs/GCE，曲线d为BSA/H1/PFO NPs/GCE；曲线e为ST/BSA/H1/PFO NPs/GCE，曲线f为G-H2+G-H3/ST/BSA/H1/PFO NPs/GCE。
曲线a展示了裸GCE的良好氧化还原峰。当修饰了PFO NPs之后，由于PFO NPs较差的导电性，氧化还原电流(曲线b)下降。当H1，BSA，ST和G-H2与G-H3的混合物在电极上逐步孵育时，由于寡核苷酸链和蛋白质有阻碍电子传递的作用，导致峰值电流依次降低(曲线c，d，e，f)。
此外，在[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液(5.0mmol·L-1)中进行EIS表征。如图4中B所示，裸的GCE呈现出较小的半圆形直径(曲线a)证明电子转移电阻(Ret)小。将PFO NPs(曲线b)修饰到GCE上后，半圆直径(曲线b)明显增大，证明电子转移电阻(Ret)增大，这是由于PFONPs的导电性差。当H1，BSA，ST和G-H2与G-H3的混合物在电极上逐步孵育时，半圆直径依次增大(曲线c，d，e，f)，这是寡核苷酸链和蛋白质的阻碍电子传递作用导致的。EIS结果与CV结果相符。总而言之，CV和EIS表征结果证明了拟议的比率型生物传感器的成功组装。
验证例1
在该传感器中，SDA扩增的产物第二目标核酸和目标物miRNA-155均可以直接打开修饰在电极表面的H1，以引发后续的HCR反应，本验证例验证SDA扩增反应对该生物传感器性能的影响。
采用实施例提供的方法进行ECL比率的检测，对照设置1组空白对照例(无待测核酸，对PBS缓冲液进行检测)和一组对比例，对比例中不进行实施例中的SDA反应。结果如附图5中A所示。
由附图可知，相比较于空白值(a列)，单扩增反应后产生了明显的信号变化(b列，没有发生SDA)，而引入双重扩增反应的生物传感器相比于单扩增反应产生了更大的信号变化(c列，发生SDA)，这是由于miRNA-155引发SDA扩增产生的大量ST可以引发更多的HCR反应，导致更多的GOx被引入到电极上，从而原位产生更多的信号转换物质H2O2，提高生物传感器的灵敏度，因此双重核酸扩增反应的引入可以极大地提高生物传感器的灵敏度。
验证例2
酶促反应底物溶液中葡萄糖的浓度对检测过程的影响。
根据实施例提供的方法，在3.0mL含有不同浓度葡萄糖的PBS(0～1.80mol·L-1，pH7.4，酶促反应底物溶液)的情况下，检测所构建的生物传感器的ECL响应，结果如附图5中B所示。
由附图可知，随着葡萄糖浓度的增加，ECL-1与ECL-2相比后的对数值逐渐降低，这是由于葡萄糖浓度的变化导致原位产生的H2O2浓度变化使得ECL-1逐渐降低而ECL-2逐渐增加，而其比值的对数值随之逐渐降低。当葡萄糖浓度增长至1.2mmol·L-1时，对数值曲线基本趋于平稳。
验证例3
验证实施例提供的ECL传感器对不同浓度miRNA-155的ECL响应性能。
采用实施例提供的方法检测不同浓度miRNA-155下的ECL响应，结果如附图6所示，附图6中，曲线a代表50amol/LmiRNA-155、b代表100amol/L、c代表1fmol/L、d代表10fmol/L、e代表100fmol/L、f代表1pmol/L、g代表10pmol/L、h代表100pmol/L。
如图6中A所示，当目标物miRNA-155浓度从50amol·L-1增加到100pmol·L-1时，ECL-1强度如预期的那样逐渐降低，而ECL-2强度逐渐增加。并且，ECL-1与ECL-2比值的对数与miRNA-155浓度的对数呈现出良好的线性关系。相应的校准曲线如图6中D所示，回归方程表示为：
lg(I1/I2)＝–1.7412–0.1553lg(c/mol·L-1)；
相关系数值(R)为0.9954，(I1为ECL-1的强度，I2为ECL-2的强度，c为目标物miRNA-155的浓度)。此外，计算得出miRNA-155的检测限是17amol·L-1(S/N＝3)。如表2所示，与已报道的miRNA-155检测方法(对比例1～5)相比，该生物传感器表现出可接受的检测限和相对较宽的检测范围。
表2检测miRNA-155的不同方法的比较结果
Figure BDA0002618378570000131
Figure BDA0002618378570000141
其中，对比例1的检测方法请具体参照文献：Y.Liu,M.Wei,Y.Li,A.Liu,W.Wei,Y.Zhang and S.Liu,Application of Spectral Crosstalk Correction for ImprovingMultiplexed MicroRNA Detection Using a Single Excitation Wavelength,Anal.Chem.,2017,89,3430-3436。
对比例2的检测方法请具体参照文献：K.M.Koo,L.G.Carrascosa,M.J.A.Shiddikyand M.Trau,Poly(A)Extensions of miRNAs for Amplification-Free ElectrochemicalDetection on Screen-Printed Gold Electrodes,Anal.Chem.,2016,88,2000-2005.。
对比例3的检测方法请具体参照文献：Y.Zhou,Y.Chai and R.Yuan,HighlyEfficient Dual-Polar Electrochemiluminescence from Au25Nanoclusters:The NextGeneration of Multibiomarker Detection in a Single Step,Anal.Chem.,2019,91,14618-14623。
对比例4的检测方法请具体参照文献：L.Lu,J.Wang,W.Miao,X.Wang and G.Guo,Electrogenerated Chemiluminescence Biosensor with a Tripod Probe for theHighly Sensitive Detection of MicroRNA,Anal.Chem.,2018,91,1452-1459。
对比例5的检测方法请具体参照文献：F.Wang,C.Fu,C.Huang,N.Li,Y.Wang,S.Geand J.Yu,Paper-based closed Au-Bipolar electrode electrochemiluminescencesensing platform for the detection of miRNA-155,Biosensors andBioelectronics,2020,150,111917。
验证例4
验证实施例提供的ECL传感器的稳定性和选择性。
探究实施例中的ECL传感器，在3.0mL PBS(pH 7.4)中目标物浓度为10fmol·L-1时，扫描电位分别在0～+1.25V和0～+2.0V时的连续扫描稳定性，结果如附图7中A和B所示。
如图7中A和图7中B所示，在8个周期的连续扫描下，0～+1.25V时的ECL-1以及0～+2.0V时的ECL-2均没有表现出明显的变化，其RSD值分别为1.67％和3.15％。证明该比率型生物传感器在低电位扫描范围(0～+1.25V)和高电位扫描范围(0～+2.0V)下均具有良好的稳定性。
以miRNA-21、miRNA-141和miRNA-126作为可能的干扰物来探究该生物传感器的选择性。
检测了ECL传感器分别在空白、孵育10fmol·L-1miRNA-155、以及100倍浓度(相对于miRNA-155)的干扰物miRNA-21、miRNA-141、miRNA-126以及目标物干扰物的混合物(包含miRNA-155、miRNA-21、miRNA-141和miRNA-126)时的ECL响应。
结果如图7中C所示，除miRNA-155和包含miRNA-155的混合物以外，都没有表现出明显的ECL变化，即只有目标检测物miRNA-155才能导致生物传感器的ECL-1和ECL-2的信号变化。由此可证明该比率型生物传感器具有优秀的选择性。
综上，利用H2O2对羧基化的聚(9,9-二正辛基芴基-2,7-二基)聚合物纳米颗粒(PFONPs)在不同电位下的ECL发射的不同作用，基于此信号转换模式构建新型电位调控型比率ECL生物传感器应用于microRNA-155(miRNA-155)的检测。在该体系中，在没有外加共反应物以及不以溶解氧为共反应物的条件下，PFO NPs在0～+1.25V的扫描下有强的ECL发射(ECL-1)，在0～+2.0V的扫描下产生弱的发射(ECL-2)。与目标物浓度相关的原位生成的H2O2能够有效猝灭ECL-1并增强ECL-2，从而实现目标物miRNA-155的比率检测。提出的比率ECL生物传感器对miRNA-155的检测表现出优良的性能，具有低的检测限和较宽的检测范围，稳定性和选择性方面也表现出色。本工作提出的基于PFO NPs和H2O2构建的电位调控型ECL比率生物传感器扩展了比率传感器的构建模式，也拓展了芴基聚合物PFO NPs在生物分析领域中的应用，并在microRNA的超灵敏检测中表现出一定的应用潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种用于检测单链核酸的ECL传感器，其特征在于，所述ECL传感器包括有电极基底以及负载于所述电极基底上的发光体，所述发光体结合有具有发夹结构的第一核酸；
所述第一核酸能够被待测核酸互补结合并形成单链结构进而能够互补结合第二核酸，所述第二核酸标记有用于催化底物产生酶促反应产物的酶；
所述酶促反应产物能够作为猝灭剂减弱所述发光体在第一扫描电位下的第一信号值ECL-1，同时作为共反应物增强所述发光体在第二扫描电位下的第二信号值ECL-2；通过ECL-1和ECL-2的比率计算待测核酸的水平；
所述酶促反应产物为H2O2；
所述发光体为聚（9,9-二-正辛基芴基-2,7-二基）聚合物纳米颗粒。
2.一种用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，其包括有：如权利要求1所述的用于检测单链核酸的ECL传感器以及如下组分：所述第二核酸、用于催化产生酶促反应产物的酶以及底物。
3.根据权利要求2所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，所述用于催化产生酶促反应产物的酶选自：葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和乳酸氧化酶中的至少一种，所述底物选自：葡萄糖、胆固醇和乳酸中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，所述ECL传感器套件还包括有第三核酸；
所述第三核酸能够与所述第二核酸互补结合并与所述第二核酸发生杂交链式反应。
5.根据权利要求4所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，所述第三核酸标记有用于催化底物产生所述酶促反应产物的酶。
6.根据权利要求4所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，所述待测核酸包括待检测的第一目标核酸和/或由待检测的第一目标核酸通过链置换反应产生的第二目标核酸；
当所述待测核酸包括第二目标核酸时，所述ECL传感器套件还包括用于引发待检测的第一目标核酸发生链置换扩增反应以产生第二目标核酸的模板核酸。
7.根据权利要求6所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件，其特征在于，当所述第一目标核酸为miRNA-155时，所述模板核酸的碱基序列如SEQ ID No.5所示，第二目标核酸的碱基序列如SEQ ID No.6所示，所述第一核酸、所述第二核酸和所述第三核酸的碱基序列分别如SEQ ID No.7~9所示。
8.一种检测单链核酸的方法，其特征在于，其包括采用如权利要求1所述的用于检测单链核酸的ECL传感器或如权利要求2~7任一项所述的用于检测单链核酸的ECL传感器套件对待测核酸进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测单链核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤a）将所述待测核酸加入到所述ECL传感器上，以使所述待测核酸与所述第一核酸互补结合从而使所述第一核酸形成单链结构；
步骤b）在所述ECL传感器上加入第二核酸，以使第一核酸与所述第二核酸结合；
步骤c）再在所述ECL传感器中加入底物，以使底物被酶催化产生酶促反应产物；
步骤d）在所述第一扫描电位下，扫描发光体，获得第一信号值ECL-1；在所述第二扫描电位下，扫描发光体，获得第二信号值ECL-2；通过ECL-1和ECL-2的比率计算待测核酸的水平。
10.根据权利要求9所述的检测单链核酸的方法，其特征在于，所述第一扫描电位为0～+（1.20～1.30）V；所述第二扫描电位为0～+（1.90～2.10）V。
11.根据权利要求9所述的检测单链核酸的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤b）中加入第三核酸，以使所述第二核酸和所述第三核酸互补结合并发生杂交链式反应。
12.根据权利要求11所述的检测单链核酸的方法，其特征在于，杂交链式反应的条件为：35~39℃，孵育1.5~2.5h。
13.根据权利要求9所述的检测单链核酸的方法，其特征在于，在步骤c）中，所述底物的工作浓度为≥1.2 mmol/L。
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An ultrasensitive sensing platform for microRNA-155 based on H2O2 quenched hydroxide-dependent ECL emission of PFO Pdots;Di Liu 等;《BIOSENSORS & BIOELECTRONICS》;20200215;第150卷;第1页"摘要"和第8页图1 *

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