CN100590200C - 借助分析物/聚合物活化剂双层排列检测分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析传感器领域。具体而言，本发明涉及借助电极排列检测样品中分析物的方法，所述电极排列的特征在于在电极表面形成分析物和增加所述分析物导电性的试剂的导电双层。本发明还涉及用于进行这种方法的电极排列，以及这种电极排列作为生物传感器的用途。还公开了适合用于分析物的电化学检测的新类型的氧化还原聚合物。另外也公开了制造该类型聚合物的方法。

Description

借助分析物/聚合物活化剂双层排列检测分析物的方法
本发明涉及分析传感器领域。具体而言，本发明涉及借助电极排列检测样品中分析物的方法，所述电极排列的特征在于在电极表面形成分析物和增加所述分析物导电性的试剂的导电双层。本发明还涉及用于进行这种方法的电极排列，以及这种电极排列作为生物传感器的用途。
发明背景
诸如大分子生物聚合物的分析物的检测和定量是分析化学以及生物化学、食品工程或医学中的基本方法。至今为止，用于确定生物聚合物存在和浓度的最常用方法包括通过放射自显影、荧光、化学发光或生物发光以及电化学技术进行的检测(例如在Bakker，E.and Telting-Diaz.M.(2002)Anal.Chem.74，2781-2800中综述)。
但是，放射自显影由于使用危险的放射物质而在许多领域不能应用，而光学检测方法通常涉及繁杂的标记程序以及昂贵的试剂与技术设备。另一方面，电化学检测技术由于高灵敏度和低成本已经变成有吸引力的替代手段。
在核酸分子的检测方面，目前使用三种主要的电化学检测方法，即导电性测量(Park，S.J.et al.(2002)Science 295，1503-1506)、核酸嵌入方法(Zeman，S.M.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，11561-11565；Erkkila，K.E.et al.(1999)Chem.Rev.99，2777-2795)和通过催化性扩增的检测(Caruana，D.J.& Heller，A.J.(1999)J.Am.Chem.Soc.121，769-774；Patolsky，F.et al.(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41，3398-3402)。
Park等，同上报道了使用经金纳米颗粒功能化的寡核苷酸的DNA阵列检测方法。但是发现500fM的检测限不足以鉴定非常稀少的核酸物质，例如编码转录因子或某些细胞表面受体的核酸物质。核酸嵌入方法经常受制于低的信噪比，因为大多数DNA嵌入剂不仅嵌入到双链DNA(dsDNA)中，还通过静电相互作用和单链DNA分子结合，虽然结合程度低得多。但是已经合成了改进的二茂铁标记的萘二酰亚胺穿线(threading)嵌入剂，其更高选择性(但非派他性)地与dsDNA结合(Takenaka，S.etal.(2000)Anal.Chem.72，1334-1341)。
目前DNA生物电子学方面的进展集中于采用核酸/酶偶联物作为生物电催化剂(Caruana & Heller，同上；Patolsky et al.，同上)。类似地，也使用核酸功能化的脂质体或纳米颗粒作为颗粒标记来放大DNA传感过程。最近，报道了使用酶放大检测法对于38个碱基的寡核苷酸的检测限是0.5fM，这对应于约3000个分子(Zhang，Y.et al.(2003)Anal.Chem.，page EST 2.4)。但是，只有当分析通常长度为20-50个碱基的短DNA寡核苷酸时才达到这种灵敏度。已经表明使用这些方法来检测较大的核酸分子如基因组DNA是困难的，因为背景信号高，这导致pM或甚至nM级的相当低灵敏度。
因此，仍需要能够克服上述缺陷并允许以高灵敏度检测大分子分析物的替代性分析物检测方法。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了借助检测电极对分析物分子进行电化学检测的方法，该方法包括：
(a)将能够结合待检测分析物分子的捕获分子固定在检测电极上；
(b)使电极和假设含有待检测分析物分子的溶液接触；
(c)使所述溶液中所含的分析物分子与电极上的捕获分子结合，从而使得形成捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述复合物在电极上形成第一层；
(d)使检测电极与电化学活化剂接触，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，从而在电极上形成第二层，其中所述第二层和所述第一层一起形成导电双层；
(e)使检测电极与能够分别从电极向电化学活化剂或相反方向传递电子的试剂接触；
(f)在检测电极上进行电测量；和
(g)通过将获得的电测量结果和对照测量结果比较来检测分析物。
在另一个方面中，本发明提供了一种电极排列，包含用于如本文所述对分析物分子进行电化学检测的检测电极，包含：
(a)检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子；和
(b)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
在另一个方面中，本发明提供了电化学检测分析物分子的生物传感器，包含：
(a)检测电极；
(b)检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子；和
(c)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
在另一个方面中，本发明提供了一种水溶性氧化还原聚合物，包含：
(a)包含可聚合二茂铁衍生物的第一单体单元；和
(b)包含丙烯酸衍生物的第二单体单元，所述丙烯酸衍生物具有能够获得净电荷的(末端)一级酸或碱、酸或碱官能团。
在一种实施方案中，该新型水溶性氧化还原聚合物中的丙烯酸衍生物由通式(I)表示：
Figure C20048003205300071
其中R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基链可以是任选取代的，并且其中n是0-12的整数。
在另一个方面中，本发明提供了制备水溶性氧化还原聚合物的方法，所述方法包括：
将第一单体单元和第二单体单元聚合，所述第一单体单元包含可聚合的二茂铁衍生物，所述第二单体单元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能够获得净电荷的酸或碱官能团，其中所述聚合在含水的醇介质中进行。
附图说明
参照详细描述，并结合非限制性的实施例和附图，将更好地理解本发明，所述附图中：
图1描述了根据本发明的检测方法的示意性说明。首先，如图1a所示，将能够结合待检测分析物的捕获分子20固定在检测电极10的表面上。任选的，可以加入封闭剂15——单独加入或和捕获分子一起加入——以占据电极表面上的自由结合位点，从而减少背景信号。接着使检测电极暴露于假设含有目标分析物30的溶液。使得分析物分子与捕获分子结合，在检测电极的表面上形成第一层。然后，使电化学活化剂40和试剂50与电极表面接触(以任意顺序或作为混合物)，其中所述的试剂50用于从电极向电化学活化剂或相反方向传递电子。电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，从而在电极上形成第二层，其中所述的第二层和第一层一起形成导电双层。在任选的底物分子55存在下，从底物的催化性氧化产生的电流经电流分析检测。电流与样品溶液中的目标分析物浓度直接相关。图1b说明了使用接头分子以改性检测电极的表面(如金电极)。
图2描述了编码全长大鼠TP53cDNA(泳道1-3)和全长GAPDH cDNA(泳道4-6)的、使用不同比例的生物素-dUTP/dTTP的PCR产物的代表性凝胶电泳分离。泳道M，DNA大小标记物。泳道1-3分别对应的生物素-16-dUTP/dTTP比例为0∶100、35∶65和65∶35。泳道4-6分别对应的生物素-21-dUTP/dTTP比例为0∶10、1∶10和2∶10。
图3说明金电极的循环伏安图，其中(a)在2.5mM K3Fe(CN)6和0.50M Na2SO4中、包覆有混合自组装单层，(b)在PBS中、包覆有DNA/氧化还原聚合物双层，(c)在2.5mM K3Fe(CN)6和0.50M Na2SO4中，包覆有DNA/氧化还原聚合物双层。扫描速率：100mV/s。为清楚起见，(b)中的电流刻度放大了10倍。
图4说明在PBS(曲线a)和20mM葡萄糖溶液(曲线b)中和GAPDH cDNA杂交后金电极的循环伏安图，(A)使用与GAPDH cDNA互补的捕获探针，(B)使用与GAPDH cDNA不互补的捕获探针。扫描速率：10mV/s。
图5说明在PCR混合物中与GAPDH cDNA杂交后金电极的电流分析反应，(a)使用与GAPDH cDNA互补的捕获探针，(b)使用与GAPDH cDNA不互补的捕获探针。工作电位：0.36V，40mM葡萄糖。
图6说明分别与50、100、200和500fM TP53cDNA在2.5μl小滴中杂交后金电极的电流分析反应。工作电位：0.36V，40mM葡萄糖。
图7说明与大肠杆菌16S rRNA、大肠杆菌23S rRNA和全长大鼠GAPDH cDNA的混合物杂交后金电极的电流分析反应。曲线(a)对应于大肠杆菌16S rRNA的反应，曲线(b)对应于大鼠GAPDH cDNA的反应，而曲线(c)表示空白对照。使用1μl小滴。工作电位：0.35V，60mM葡萄糖。
图8说明与200fM的大肠杆菌16S rRNA特异性DNA捕获探针在1μl小滴中杂交后金电极的电流分析反应，所述探针分别具有(a)完全互补的合成寡核苷酸、(b)单碱基错配的寡核苷酸和(c)两个碱基错配的寡核苷酸，以评价分析系统的灵敏度。工作电位：0.35V，60mM葡萄糖。
图9说明氧化电流对分析物浓度的依赖性。将GAPDH cDNA捕获探针固定在金电极的表面上，并与10μM的生物素化的GAPDH cDNA接触。杂交后，通过亲合素-生物素相互作用结合葡萄糖氧化酶/亲合素偶联物。最后，通过层层间静电自组装将氧化还原聚合物带到电极表面上。葡萄糖检测介质：PBS(pH 7.4)。工作电位：0.35V。
图10所示为发生在氧化还原聚合物介导的生物传感器中的偶联氧化还原反应的示意图。
图11说明本发明的水溶性并可交联的聚合物的基本单元的结构。该图示出了乙烯基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚物中发现的重复单元。
图12说明乙烯基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚反应中的一般反应方程式。
图13所示为根据本发明方法产生的氧化还原聚合物PAA-VFc和PAAS-VFc的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱。
图14所示为Fc、PAA、PAAS和与VFc共聚而得到的共聚物的紫外-可见光谱。
图15所示为不同系统中的氧化还原聚合物的循环伏安图。使用磷酸盐缓冲液，获得伏安图所使用的电位扫描速率为100mV/s。
图16示出了与金电极上的葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)膜交联的氧化还原聚合物PAA-VFc的另一循环伏安图。使用磷酸盐缓冲液，获得伏安图所使用的电位扫描速率为50mV/s。
具体实施方式
本发明基于下列发现，即分析物如生物聚合物(通常是非导电性的或仅有弱的导电性)的检测灵敏度可以通过使用电化学活化剂显著提高，所述电化学活化剂以溶解形式存在，其在溶液中的净电荷与待检测的分析物分子或包含待检测的分析物分子的复合物的净电荷互补(即相反)。由于其相反的电荷，分析物和包含分析物的复合物与电化学活化剂一起通过静电层层自组装形成非常稳定的双层。该双层充当跨电极全部表面的“电子交换桥”(或电子穿梭)，影响用来检测分析物的电极处的电流流动。与本领域中已知的其他程序相比，使用双层还具有提供与电极的更大和更均匀接触面积的优点，有利于增加本发明检测方法的灵敏度。
根据本发明的术语“检测”指样品中分析物的定性和定量检测，意味着术语“检测”也包括确定样品中分析物的缺失。通过使用本方法，可以明确地检测到低至约1fM(即10-15M)的分析物浓度。本发明方法中适于检测的分析物浓度范围为约10-12M～10-15M。进行检测的分析物浓度上限通常为10-11M。从这一点上说应注意在明确认为样品中分析物的存在量高于10-11M时可以将样品稀释，使其量位于本发明的灵敏度范围内。
本文所用的术语“捕获分子”可以指单一类型的分子，例如具有特定核酸序列的单链核酸探针。但是，捕获分子也可包含不同类型的分子，例如具有不同核酸序列的核酸探针(因此其也表现出不同的结合特异性)。捕获分子也可以是抗体或其他类型的蛋白质结合分子，如
Figure C20048003205300101
类型(象抗体一样表现出对给定配体的特异性结合特征的多肽，也参见Beste et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,1898-1903)，其识别蛋白质化合物的不同表面区域(表位)。使用不同类型的捕获分子不仅允许同时或依次检测不同的分析物，如两种或多种基因组DNA，它们中的每一种具有对一种特定类型捕获分子的结合特异性，还允许通过不同的识别序列如核酸分子的5’-和3’-末端或受体分子的两个配体结合位点来检测相同的分析物，增强检测到样品中甚至几个拷贝的分析物的可能性。
本文所用的术语“电化学活化剂”指能够活化在分析物和电极之间传递电子的因子、与待检测分析物结合(优选特异性结合)、并表现出高于所述分析物的导电性的任意化合物。
在本发明的一种实施方案中，电化学活化剂是聚合物氧化还原介质。在本发明的一些实施方案中，电化学活化剂含有氧化还原活性金属离子。这种金属离子的例子有银、金、铜、镍、铁、钴、锇或钉离子或其混合物，它们都能作为阳离子通过静电相互作用与待检测分析物表面上的带负电的基团结合。例如，如果待检测分析物是核酸，这种阳离子与所述核酸的带负电荷的磷酸骨架结合。如果要检测蛋白质，这种阳离子可以与酸性氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸的侧链结合。
通常，合适的聚合物氧化还原介质应该具有在样品被分析期间阻止或实质性减少氧化还原物质扩散损失的化学结构。一种类型的这种非释放性聚合物氧化还原介质包含与聚合化合物共价结合的氧化还原物质。这种氧化还原聚合物通常是过渡金属化合物，其中基于氧化还原活性的过渡金属的侧基与合适的聚合物骨架共价结合，所述聚合物骨架本身可以具有或不具有电活性。这种类型的例子有聚(乙烯基二茂铁)和聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)。作为替代方案，聚合物氧化还原介质可以包含离子性结合的氧化还原物质。通常，这些介质包括与带相反电荷的氧化还原物质结合的带电荷的聚合物。这种类型的例子包括与带正电荷的氧化还原物质如锇或钉聚吡啶基阳离子结合的带负电荷的聚合物，如
Figure C20048003205300111
(Dupont)，或反之，与带负电荷的氧化还原物质如铁氰化物或亚铁氰化物结合的带正电荷的聚合物，如聚(1-乙烯基咪唑)。此外，氧化还原物质还可以与聚合物配位结合。例如，氧化还原介质可以通过将锇或钴2，2’-二吡啶基络合物和聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)配位而形成。另一个例子是与锇4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶基络合物配位结合的聚(4-乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺)。有用的氧化还原介质及其合成方法描述在美国专利No.5,264,104；5,356,786；5,262,035；5320,725；6,336,790；6,551494和6,576,101。
在本发明的另一种实施方案中，电化学活化剂选自本文后面详细描述的新型氧化还原聚合物。简言之，新型氧化还原聚合物包含聚(乙烯基二茂铁)、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸，以及聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸，其中n是0-12的整数。
本文所用的术语“能够传递电子的试剂”指由电化学活化剂活化时能够分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子的任意试剂，即能够提供并重新接受电子、导致所述试剂的至少一个原子的氧化态降低或增加的试剂。因此，该试剂分别结合、嵌入或连接由分析物/捕获分子复合物和电化学活化剂分子形成的导电双层。
传递电子的试剂可以只用于这一目的。但是，它还可能是能够传递电子的试剂同时充当捕获分子。当待检测分析物是酶底物是尤其是这种情形，所述酶底物的转化可以通过电测量来检测(参见实施例2)。
在本发明的一种实施方案中，能够传递电子的试剂是酶或酶偶联物。通常，可以使用导致可检测电流产生的任意酶。酶可以选自氧化还原酶。合适的氧化还原酶的例子有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、醇脱氢酶、羟基丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甘油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、苹果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆碱脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、胆红素氧化酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、细胞色素C氧化酶和儿茶酚氧化酶。
通过本发明方法检测的分析物可以是核酸、寡核苷酸、蛋白质、肽或其复合物，如DNA/蛋白质复合物或RNA/蛋白质复合物。分析物也可以是寡糖或多糖或表现出免疫性半抗原特征的游离或偶联形式的低分子量化合物。仅举几个例子，这种化合物的例子有小分子药物、营养物、杀虫剂或毒素。
在本发明的一种优选实施方案中，待检测分析物是核酸分子。因此，本文所用的术语“核酸或核酸分子”指基因组DNA、cDNA以及RNA分子。根据本发明的术语“寡核苷酸”指长度约为10-80个碱基对(bp)的较小核酸分子(DNA和RNA)，优选长度为15-40bp的分子。核酸可以是双链的，但是也可以具有至少一个单链区，或完全以单链形式存在，这种单链形式例如是为其检测而预先热变性或进行另一种链分离所导致的。在本发明的一种优选实施方案中，待检测核酸的序列是预定的，即是已知的，其中可以已知全序列或其至少一部分。由于本发明检测方法的高度灵敏度，待检测核酸分子可以来源于基因组样品，并可以以低拷贝数、中等拷贝数或高拷贝数存在。
用于根据本发明方法检测核酸的合适捕获分子是核酸探针，即单链DNA或RNA分子。优选使用具有与各自的核酸的单链区部分或完全互补的序列的探针。核酸探针可以是合成的寡核苷酸或较长的核酸序列，只要较长的核酸序列不折叠成阻止探针与待检测核酸杂交的任意结构即可。还优选包含修饰核苷酸如带有生物素、地高辛或硫醇标记物的核酸探针作为捕获分子。但是，也可以使用DNA或RNA结合蛋白或试剂作为捕获分子。
在本发明的另一个实施方案中，待检测分析物是蛋白质或肽。这些可以由21个天然存在的氨基酸(包括硒代半胱氨酸)组成，但是也可以含有例如由糖残基或任意类型的翻译后修饰而修饰的氨基酸残基。通过本发明方法，还可以检测核酸和蛋白质的复合物，如RNA结合蛋白和其相关RNA靶的复合物，或转录因子和其相应DNA结合结构域的复合物。
用于检测蛋白质或肽的优选捕获分子是对待检测蛋白质或肽具有结合活性的任意类型配体。这种配体的例子有低分子量酶激动剂或拮抗剂、受体激动剂或拮抗剂、药物、糖、抗体或能够特异性结合蛋白质或肽的任意分子。
无论与之有结合活性的分析物如何，都可以将捕获分子通过合适的物理或化学相互作用固定到检测电极上。这些相互作用例如包括疏水相互作用、范德华相互作用或离子(静电)相互作用以及共价键。这还意味着捕获分子可以通过疏水相互作用、范德华相互作用或静电相互作用直接固定到电极表面上，或者如果电极表面不适于直接固定时使用接头分子进行共价偶联。还可以使用对捕获分子具有结合活性的分子作为接头分子，通过由非共价相互作用即形成复合物与接头分子结合而固定捕获分子(参见实施例2，其中葡萄糖氧化酶分子用作捕获分子)。
根据本发明的方法实际上可以通过使用本领域中已知的包含检测或工作电极的任意电极排列进行。这种电极排列通常还包含反电极和参考电极。检测电极可以是常规金属电极(金电极、银电极等)或由聚合物材料或碳制成的电极，其表面任选地改性，以促进捕获分子的固定。包含检测电极的电极排列也可以是常见的硅或砷化镓衬底，其上覆有金层和氮化硅层，随后通过常规的平版印刷和蚀刻技术结构化，以产生电极排列。在结构化中，检测电极和反电极之间的距离可以改变，取决于所用结构化技术的种类和待检测分析物的类型。电极之间的距离通常为约50μm至1000或几个1000μm之间。
根据本发明的方法还使得在单次测量中同时或依次检测多于一种分析物。为此，可以使用含有本文中公开的多个电极排列的衬底，其中将不同类型的捕获分子固定在单个电极排列的电极上，所述不同类型捕获分子的每一种表现出对特定待检测分析物的(特异性)结合亲和力。作为替代方案，还可以使用多个电极排列，其中每一个仅被提供一种捕获分子。
可以用来实施本发明方法的电极排列的一个例子是常规的交错电极(interdigitated electrode)。因此，可以使用提供有多个交错电极的排列，即电极阵列，以进行平行或多重测定。另一个可用的电极排列是槽或腔形式的电极排列，该排列例如通过容纳位于两个相对侧壁上的区域如金层而形成，所述金层上固定有能够结合分析物的捕获分子。
作为第一步，本发明的方法包括将能够结合待检测分析物的捕获分子固定到电极表面上。捕获分子可以通过本领域已知的任意常规技术固定。如果进行多重分析，例如可以借助喷墨印刷技术施加捕获分子。
任选的，可以加入封闭剂——单独加入或和捕获分子一起加入——以降低背景信号。当单独加入时，封闭剂可以在样品溶液前加入，或在电极(包覆有捕获分子)已经与样品溶液接触后加入，以防止不与分析物分子结合的那些捕获分子以非特异性方式和电化学活化剂相互作用。能够固定在电极上并能够防止(或至少显著降低)捕获分子与分析物分子之间相互作用的任意试剂都适合于该目的。这种试剂的例子有硫醇分子、二硫化物、噻吩衍生物和聚噻吩衍生物。本发明使用的封闭剂的一种特别有用类型是硫醇分子，如16-巯基十六烷酸、12-巯基十二烷酸、11-巯基癸酸或10-巯基癸酸。
然后将假设含有待检测分子的溶液如电解质与电极接触，使得分析物分子可以与捕获分子结合，在电极表面上形成第一层。如果溶液含有多种不同的待检测分析物，选择条件使得所述分析物可以同时或依次与其相应的捕获分子结合。
使得分析物分子与捕获分子结合后，可以从电极除去未结合的捕获分子。除去未结合的捕获分子是任选的，但经常是有利的，因为某些捕获分子(如寡核苷酸)不仅能够结合待检测分析物，还能够结合用于增加所述分析物导电性的试剂(如可还原金属阳离子)，这必然会干扰电化学测量的结果。
未结合的捕获分子可以酶法除去。在捕获分子是DNA探针的情况下，这可以通过选择性降解单链DNA的酶来完成，如绿豆核酸酶、核酸酶P1或核酸酶S1。如果捕获分子是低分子量配体，这些配体通过可被酶切割的共价键固定在电极上，例如通过酯键固定。在这种情况下，例如可以使用羧基酯水解酶(酯酶)，以除去未结合的配体分子。该酶选择性地水解电极和未结合配体分子之间的酯键。相反，电极和由肽或蛋白质结合的配体分子之间的酯键保持完整，因为该键的立体可接近性降低。
然后使通过特异性捕获分子固定有待检测分析物的检测电极与电化学活化剂接触，使得电化学活化剂与所述分析物结合并赋予它们导电性。电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，从而在电极上形成第二层，其中所述第二层和第一层一起通过静电自组装形成稳定的导电双层。
进而，使检测电极与能够分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子的试剂接触，这可以促进或甚至放大分析物和电极之间的电子传递。能够传递电子的试剂可以和电化学活化剂同时加入，在使电极排列与电化学活化剂接触之前加入，或在电化学活化剂已经结合于电极排列之后加入。可以使用经电化学活化剂活化(任选地在底物分子存在下)后能够向或从电化学活化剂传递电子的能够传递电子的任意试剂。因此，试剂结合、嵌入或连接电极表面上形成的导电双层。在本发明的一种优选实施方案中，试剂是酶或酶偶联物。导电双层结构的层层构造显著降低或甚至消除能够传递电子的试剂的非特异性吸附和静电相互作用，从而导致更高的信噪比和更高的检测限。
然后，在检测电极处进行电测量。根据本发明的电测量包括电流和电压的测量。然后将获得的结果与对照测量结果相比，所述对照测量中使用不能与待检测分析物结合的捕获分子。这种“对照”捕获分子的例子是序列不与目标核酸分子的序列互补的核酸探针，或不能与待检测受体分子相互作用的低分子量配体。如果两次电测量，即“样品”和“对照”测量的区别程度使得所测值的差异大于预定阈值，则样品溶液中含有待检测的相关分析物。
还可以以这样的方式设计方法，使得参照测量和检测分析物的测量同时进行。例如这可以通过同时进行仅用对照介质的参照测量和用假设含有待检测分析物的样品溶液的测量来实现。
本发明还涉及电极排列，包含检测电极，该检测电极适于如本文所公开的那样对分析物分子进行电化学检测，包含：
(a)固定在检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子；和
(b)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
在本发明的一种优选电极排列中，在检测电极上形成部分导电双层的电化学活化剂是能够在分析物和电极之间传递电子的聚合物氧化还原介质。更优选的是电化学活化剂含有金属离子的电极排列，特别优选的实施方案中，这些金属离子选自银、金、铜、镍、铁、钴、锇、钉及其混合物。
在本发明的一种实施方案中，电极排列还包含能够分别从电极向聚合物氧化还原介质传递电子或从聚合物氧化还原介质向电极传递电子的试剂，其中试剂结合、嵌入或连接检测电极上的导电双层。在根据本发明的一种优选电极排列中，试剂是酶或酶偶联物。
本发明的检测电极和相应电极排列可以用作生物传感器。在许多领域如分析化学、生物化学、药理学、微生物学、食品技术或医学领域中都需要这种传感器，以分析给定样品中特定分析物的存在和浓度。例如，生物传感器可以用于监测糖尿病患者血液或尿液样品中的葡萄糖或危急护理事件期间的乳酸。但是，这些生物传感器还可用于检测或定量饮用水、奶或任意其他食物中的污染物。另一种应用是这种生物传感器在基因组计划中的用途，例如用于检测作为疾病原因或结果的基因或基因突变，如单核苷酸多态性(SNP)。另一方面，这种生物传感器也可用于蛋白质组学，例如用于分析蛋白质-蛋白质相互作用，以及鉴定特定受体分子的配体。
本发明还提供了电化学检测分析物分子的生物传感器，包含：
(a)检测电极；
(b)检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子；和
(c)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
本发明还涉及基于二茂铁的新型氧化还原聚合物，其非常适于用作本发明检测方法以及其他任意电化学检测中的电化学活化剂。虽然含有二茂铁的单体通常非常难以进行自由基聚合，本发明人发现含有二茂铁的氧化还原聚合物可以极好地并容易地使用醇介质和作为自由基引发剂的过硫酸盐制备，所述醇介质例如从乙醇和水的混合物制得。
这些基于二茂铁衍生物的聚合物可以用作均相系统中的扩散电子传递介质。
这些基于二茂铁衍生物的聚合物还可以用作固定在电极表面上的介质，然后通过酶和氧化还原聚合物的侧链中发现的可交联官能团之间的交联结合于蛋白质分子，如酶或抗原。
可以用作第一单体以形成氧化还原聚合物的合适可聚合二茂铁衍生物应具有含不饱和键的侧链单元，所述不饱和键如C-C双键或三键，或N-N双键或S-S双键。这种侧链单元的例子包括由通式R1-C＝C-表示的烯基。双键可以位于沿碳链的任意位置。也可以使用芳香基团，如苯基、甲苯酰基和萘基基团。另外，可聚合的基团也可以含有取代的C原子，其中例如卤素(如氟、氯、溴或碘)、氧或羟基取代基团中碳原子上的一个或多个氢原子。其他的例子包括炔基和二硫基。
在本发明聚合物的一些实施方案中，可聚合的二茂铁衍生物选自乙烯基二茂铁、乙炔二茂铁、苯乙烯基二茂铁和氧化乙烯基二茂铁。
这些衍生物中不饱和键的存在将使得二茂铁分子通过与另一种物质通过自由基聚合的共聚而结合至聚合物骨架，所述另一种物质也具有至少一个不饱和C-C双键或三键，或N-N双键或S-S双键。
至于用于和可聚合二茂铁衍生物共聚的第二种单体单元，可以使用具有能够获得净电荷的一级酸或碱官能团的任意丙烯酸衍生物。这意味着本发明提供带正电荷以及带负电荷的聚合物，从而保证可以形成如上所解释的导电双层，而与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的净电荷无关。通常，选择用作单体的合适丙烯酸衍生物有两个要求。为了使之与二茂铁衍生物共聚，它应该具有至少一个不饱和键，例如可由C-C双键或三键、N-N双键或S-S双键提供。其次，丙烯酸衍生物应该能够分别通过产生H+离子或通过接受H+离子来分别充当Bronsted-Lowry酸或碱。能够提供Bronsted-Lowry酸或碱功能的官能团的例子包括能够接受H+离子以形成带电胺基的伯胺基团，或羧基，或硫酸，当酸官能团解离释放H+离子时能提供H+离子。从这方面说，应注意的是，虽然在本发明中优选使用伯胺基团，对技术人员显而易见的是，也可使用存在于丙烯酸衍生物中的仲胺基或叔胺基来产生带正电荷的氧化还原聚合物。从这方面说，还应注意的是，酸或碱官能团，即使是一级的，也不必需是末端基团，但是对于分支的侧链，可以存在于较短一个侧链的“内部”。
虽然可以使用具有酸或碱官能团的任意合适丙烯酸衍生物，用作本发明传感器的氧化还原聚合物中第二单体的优选单体是通式(I)表示的丙烯酸衍生物：
Figure C20048003205300191
其中R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基链是任选取代的，其中n是0-12、优选0-8的整数。因此，烷基可以是直链或支链的，还可以含有双键或三键或环结构，如环己基。仅举几个例子，取代基R中合适脂肪族基团的例子是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、环己基或辛基。脂肪族基团还可以被芳香基团如苯基、卤素原子、另外的碱或酸基团或O-烷基取代。可以作为取代基存在的示例性芳香基团有苯基、甲苯酰基或萘基。卤素基团可以选自氟、氯或溴。合适o-烷基的实例有甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，而n-烷基选自-NHMe、-N(Me)2、-N(乙基)2或-N(丙基)2。
在一些实施方案中，本发明的氧化还原聚合物分子量为约1000-5000道尔顿，或优选为约2000-4000道尔顿。
本发明人发现自由基引发剂的量影响聚合程度。大量的自由基引发剂显著降低聚合效率，导致氧化还原聚合物具有较低的分子量。这还意味着与常规的自由基聚合反应相比，聚合过程中需要相对更少的自由基引发剂。除了所用的自由基引发剂的量之外，将结合本发明方法更详细讨论的反应物添加顺序也影响聚合效率。
在本发明的另一种实施方案中，氧化还原聚合物的二茂铁含量为约2％-约20％，通常为约3％-约14％。
本发明还涉及制备这种水溶性氧化还原聚合物的方法。该方法基本包括使可聚合二茂铁衍生物的第一单体单元与包含丙烯酸衍生物如伯、仲或叔丙烯酰胺的第二单体单元聚合，以产生共聚物。丙烯酸衍生物具有能够获得净电荷的酸或碱官能团。重要的是，聚合反应在引发剂的存在下于含水醇介质中进行。
单体和引发剂的添加顺序可以改变。例如，可以将第一和第二单体在醇介质中混合，然后加入引发剂来引发反应。还可以首先将一种单体溶解在含水醇介质中，然后加入引发剂，之后再将另一种单体加入混合物中。
醇介质例如可以用与水混溶的任意有机醇来制备，例如用脂肪醇如乙醇或芳香醇如苯酚。体积比通常为5∶1-1∶1(醇/水)。在有些实施方案中，约为3∶1。
在本发明的一种实施方案中，使用包含乙醇和水的含水醇溶剂实施所述方法。
虽然可以不加入引发剂来进行聚合，期望加入引发剂，所述引发剂攻击单体中不饱和键处的富电子中心。因此，在本发明的另一种实施方案中，通过加入自由基引发剂来引发聚合。
可以使用任意自由基引发剂。例子包括无机盐如过硫酸盐或有机化合物如过氧化苯甲酰或2，2’-偶氨-双-异丁酰腈(AIBN)，它们能够产生称作引发剂片段的自由基片段，其中每一个具有一个不配对电子，充当攻击单体单元中不饱和键的自由基。
在根据本发明方法的一些实施方案中，自由基引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸钠。
在本发明这些实施方案的一些实施方案中，所加入自由基引发剂的重量比为每1g单体中约20mg-40mg。
根据本发明的方法可以在室温以上但通常低于100℃的回流下进行。在一种实施方案中，聚合在温度为约60℃-80℃的回流下进行。
聚合所需的时间长度可以依赖于所用的温度和向反应液中加入的引发剂的量。通常，聚合进行的时间为10-40小时，优选为约24小时。
本发明方法的一种实施方案还包括在将所述第一和第二单体聚合之前产生预反应混合物，包括：
将丙烯酸衍生物单体单元溶解在含水醇介质中，然后
加入自由基引发剂；然后
向混合物中加入可聚合的二茂铁衍生物单体单元。
在上述方法的进一步实施方案中，预反应混合物中丙烯酸衍生物与可聚合二茂铁衍生物的进料比优选为占所加单体重量的约5％-15％，以获得具有合适分子量和粘度的氧化还原聚合物。
在另一种实施方案中，可聚合二茂铁衍生物单体单元在加入反应混合物之前溶解于含水醇介质中。
实施例
实施例1：核酸的检测
通常，根据本发明的核酸检测如图1所示进行。首先，将用作捕获分子(20)的硫醇化寡核苷酸(还携带生物素修饰作为标记物)和用作封闭剂(15)以降低背景的硫醇分子的混合物固定在金电极表面(10)上。然后，使电极暴露于假设含有目的分析物(30)的溶液。与其互补的生物素化目标DNA(即捕获分子)杂交后，通过亲合素-生物素相互作用结合酶偶联物(50)。最后，通过层-层静电自组装将氧化还原聚合物(40)带到电极表面上。氧化还原聚合物层电化学活化结合于目标DNA的酶标记物。在底物分子(55)存在下，由底物的催化氧化产生的电流得以电流分析检测。电流与样品溶液中目标分析物的浓度直接相关。
实施例1.1：从大鼠组织的mRNA提取和生物素化cDNA的合成
使用
Figure C20048003205300211
mRNA DIRECTTM Kit(Dynal ASA，Oslo，Norway)，根据生产商的说明进行大鼠肝脏mRNA的提取。对于逆转录(RT)，在20μl总体积中使用10ng该mRNA，所述20μl总体积中含有Sigma-Aldrich的1×eAMV缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.3，40mM KCl，8.0mM MgCl2，1mM DTT)、500μM每种dNTP、1.0μM反义引物、20U RNase抑制剂和20U增强的禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(eAMV)。将样品在DNA热循环仪(Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中于56℃孵育50min，将所得到的cDNA直接用作PCR扩增的模板。
在50μl总体积中使用2.0μl RT-反应混合物进行PCR，所述50μl总体积中含有Sigma-Aldrich的1×AccuTaq缓冲液(5mM Tris-HCl，15mM硫酸铵，pH 9.3，2.5mMMgCl2，0.1％Tween 20)、0.40μM每种引物、2.5U JumpStart AccuTaq LA DNA聚合酶和10mM dNTP(Roche，Basel，Swizerland)。选择两种不同的基因作为分析物，即管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和受调控的肿瘤蛋白基因53(TP53)。
使用下列引物：GAPDH正义，5′-ATGGTGAAG GTCGGTGTCAA-3′(SEQ ID NO：1)；GAPDH反义，5′-TTACTCCTTGGA GGCCATGT-3′(SEQ ID NO：2)；TP53正义，5′-ATGGAGGATTCACAGTC GGA-3′(SEQ ID NO：3)和TP53反义，5′-TCAGTCTGAGTCAGGCCC-3′(SEQ ID NO：4)。
为了合成生物素化的cDNA，向反应物中加入不同量的生物素-16-dUTP(Roche，Germany)或生物素-21-dUTP(Clontech，Palo Alto，USA)。使用下列程序进行扩增：95℃持续5min的初始变性步骤之后，进行35个扩增循环：95℃30s，55.5℃ 1min，72℃ 2min。包括72℃持续10min的最后延伸步骤，以确保合成全长的DNA链。扩增后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，并通过用溴化乙锭染色显示(图2)。
在图2中，泳道1和4所示为不加生物素-dUTP的对照试验。扩增到的PCR片段分别和全长大鼠TP53(泳道1，1176bp)和GAPDH(泳道4，1002bp)基因的大小一致。为了标记，将不同量的生物素修饰的核苷酸和dNTP混合，并加入到PCR反应混合物中，以检测标记效率(对于TP53见泳道2和3，对于GAPDH见泳道5和6)。生物素-16-dUTP(或生物素-21-dUTP)/dTTP的比例越高，凝胶中对片段的阻滞越强。但是，随着生物素修饰的核苷酸比正常核苷酸的比例增加，扩增效率下降，这可能是因为生物素修饰核苷酸的庞大侧链。
实施例1.2：捕获探针固定和单层质量的评价
在DNA分析物的检测之前，将用作捕获探针的硫醇化寡核苷酸和硫醇分子的混合物通过自组装固定到金电极表面上。为了将与目标DNA非杂交相关的吸收最小化，使用阴离子硫醇分子形成混合单层的封闭组分。使用下列捕获探针：用于GAPDH检测，5′-T12TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3′(SEQ ID NO：5)；和5′-T12ATGGTGAAGGTCGGTGTCAACGG-3′(SEQ ID NO：6)；用于TP53检测，
5′-T12ATGGAGGATTCACAGTCGGA-3′(SEQ ID NO：7)和
5′-T12TCAGTCTGAGTCAGGCCCCA-3′(SEQ ID NO：8)；以及用作对照，
5′-T12CCTCTCGCGAGTCAACAGAAACG-3′(SEQID NO：9)。寡核苷酸根据常规程序使用11-巯基十一烷酸进行硫醇化，并通过将清洁的电极暴露于50μM寡核苷酸溶液中3-16小时而组装到金电极上。剩余表面用11-巯基十一烷酸(MUA)进行封闭。
金电极上混合自组装单层的形成通常由椭圆偏光、接触角和表面覆盖测量进行监测。所有获得的数据都表明在金电极上包被了单一的致密混合分子层。如所期望的，单层包被电极和溶液中电子活性物质之间电子传递的明显通路将通过跨绝缘单层的电子隧道效应。在含有2.5mM铁氰化物的0.50M Na2SO4溶液中通过循环伏安分析研究了捕获探针单层和混合单层的电子隧道屏蔽特征(图3)。如图3a所示，与裸露金电极处获得的可逆过程的59mV值相比，在混合单层包覆的金电极处观察到了具有非常大峰峰间电位分离(100mVs-1处＞400mV)的Fe(CN)6 3-/4-的不可逆伏安波，说明单层阻碍电极和溶液之间的电子传递。主要由跨单层的电子隧道效应引起的氧化还原电流显著减小，并丧失其可逆特征。使用通过吡啶与Os(4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶)2Cl+/2+部分络合的聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺)共聚物(PVP-PAA-Os)作为氧化还原聚合物(Gao，Z.et al.(2003)Angew.Chem.Int.Ed.41，810-813)。但是，由于氧化还原聚合物带有正电荷，电极带有负电荷，电极在5.0mg/ml PVP-PAA-Os溶液中的短暂浸泡导致通过层-层静电自组装在电极上形成DNA/氧化还原聚合物双层。如图3b所示，正如所期望的，双层包被的电极表现出高可逆性表面固定的氧化还原电对，其用水和PBS彻底洗涤后和-0.4V至+0.8V的多次重复电位循环后几乎没有变化，显示出在金电极上高度稳定的表面固定的静电双层。这种结果确证了所有锇氧还中心可以到达电极表面，并进行可逆的异质电子传递。从氧化峰或还原电流峰的面积估算结合态锇氧还中心的总量1.8-8.0×10-10mole/cm2，其依赖于阴离子物质(核酸和酶标记物)的量和结合于电极的核酸的量。随后铁氰化物溶液中的伏安法测试示出与裸露电极处所得相同的结果(图3c)。这些改变归因于双层形成所致的电子隧道效应下降。膜中阴离子物质的存在不明显改变氧化还原聚合物的电化学。
实施例1.3：GAPDH cDNA杂交和检测
在初步杂交测试中，使用PCR扩增混合物作用分析物，而不进行进一步纯化。使用生物素化的GAPDH cDNA(见实施例1.1)作为目标物，使用含0.10M NaCl的TE(10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA)作为杂交缓冲液。在杂交之前，将目标cDNA于95℃变性5min，并在冰上冷却。在55℃水浴中进行杂交30分钟，其中GAPDHcDNA选择性地与互补性捕获探针结合，从而固定在电极的表面上。使用杂交缓冲液的重复洗涤步骤除去所有的非特异性核酸。然后，将电极于35℃暴露于2.5μl葡萄糖氧化酶/亲合素D偶联物(GOx-A，5mg/ml；Vector Laboratories，San Diego，CA，USA)中30分钟。用PBS缓冲液进行3次洗涤步骤以除去过量的酶标记物之后，将电极暴露于2.5μl PVP-PAA-Os氧化还原聚合物溶液至少10分钟，并用PBS缓冲液漂洗。
在法拉第笼中用低噪音CH Instruments Model 660A电化学工作站(CHInstrumens，Austin，TX，USA)和Pentium计算机联用进行电化学测量。在PBS缓冲液和含有20mM葡萄糖的PBS缓冲液中进行循环伏安分析。使用Ag/AgCl电极(Cypress Systems，Lawrence，KS，USA)作为参考电极，使用铂线作为反电极。在0.36V下进行电流测量。该报道中所有的电位都相对于Ag/AgCl参考电极。
图4中示出了与目标分析物杂交的电极的典型循环伏安图。图4A是杂交后PBS缓冲液(曲线a)和20mM葡萄糖溶液(曲线b)中具有与GAPDH cDNA互补的捕获探针的电极的伏安图。在葡糖糖的存在下，由于双层中葡萄糖氧化酶的存在观察到了明显的催化电流。相反，非互补探针不能从PCR混合物中捕获任何的GAPDHcDNA，因而没有酶标记物能够结合到电极表面上，导致没有可检测的催化电流(图4B，分别为曲线a和b)。
当将电极组件浸在PBS缓冲液中时，将40mM葡萄糖加入到缓冲液中后，电流分析中氧化电流在0.36V(与Ag/AgCl相比)处增加10.2nA(图5)。在使用非互补捕获探针的对照实验中，观察到的电流改变可以忽略。电流分析结果与循环伏安分析数据一致，再一次证实GAPDH cDNA以高特异性从PCR混合物中得以成功检测。在优化的实验条件下，动态范围发现在2.0fM和1.0pM之间，检测限为0.50fM。
实施例1.4：大鼠TP53 cDNA的检测
如实施例1所述合成生物素化的大鼠TP53cDNA。PCR扩增后，TP53cDNA的总量测定为17.2ng/μl(22.5pM)。分析含有10、50、100、200、500和800fM TP53cDNA的样品(稀释在TE缓冲液中)。分别在加入酶标记物和氧化还原聚合物之前，将存在于PCR混合物中的TP53特异性cDNA通过其互补性捕获探针固定在电极表面上(参见实施例1.3)。在电压0.36V处检测催化电流，其直接对应于TP53cDNA的量。如图6所示，在此范围内，电流随TP53cDNA浓度线性增加。检测限发现为约1.0fM。考虑到样品体积，使用所提出的方法成功地检测到少至1500拷贝的TP53DNA分子。据我们所知，这是目前报道的电化学检测到基因组DNA的最低量。
实施例1.5：核酸混合物中核酸的检测
将核酸生物传感器应用于检测含有下列组分的混合物中的大肠杆菌16S rRNA和GAPDH cDNA：0.5-1500fM大肠杆菌16S rRNA，100-5000fM大肠杆菌23S rRNA，0.2-2000fM全长大鼠GAPDH cDNA，1-500mM BSA，和1-100mM鲑精DNA。通过如实施例1.1所述分离大鼠肝脏mRNA并随后进行PCR扩增来制备GAPDH cDNA。所获得的GAPDH cDNA的总量为5.0±0.5μg。然后，PCR产物用pH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释106倍。
使用下列探针：大肠杆菌16S rRNA特异性捕获探针：
5′-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA-3′(SEQ ID NO：10)；大肠杆菌16S rRNA特异性检测探针：
5′-AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′(SEQ ID NO：11)。如实施例1.2所述将捕获探针固定在金电极上。
在大肠杆菌RNA样品上进行直接杂交和电化学检测(分别参见实施例1.3和1.4)。引入葡萄糖氧化酶和氧化还原聚合物之后，在0.35V处检测催化电流，其直接对应于核酸的量。将非互补捕获探针作为对照固定到电极表面上。电流分析反应对于大肠杆菌16S rRNA来说是2.95nA，对于GAPDH cDNA来说是1.65nA，分别对应于290fM大肠杆菌16S rRNA和150fM GAPDH cDNA的浓度(图7)。这些结果与通过凝胶电泳分析获得的值一致性良好(310fM大肠杆菌16S rRNA和160fMGAPDH cDNA，数据未示出)。
实施例16：检测系统的选择性
使用上述捕获探针
5′-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAAAA-3′(SEQID NO：10)以及下列合成寡核苷酸评价生物传感器的选择性：互补的
5′-AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO：12)；单碱基错配的
5′-AAATTGAAGAGTTTGATCATGTCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO：13)；两碱基错配的
5′-AAATTGAAGAGTATGATCATGTCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO：14)(核苷酸变异以粗体和下划线示出)。如实施例1.2所述将捕获探针固定到金电极上。
在1μl小滴中使用三种不同DNA寡核苷酸的200fM溶液在有利于完全匹配序列的杂交条件下进行杂交(分别参见实施例1.3和1.4，只是杂交温度使用53℃)。所获得的电流分析反应总结在图8中。将60mM葡萄糖加入到完全匹配序列的检测介质中时电流增量是4.3±0.4nA(曲线a)，而对于单碱基错配(曲线b)和二碱基错配(曲线c)分别检测到1.0±0.3nA和0.3±0.1nA。因而，所述生物传感器容易区分完全匹配和错配的DNA寡核苷酸。
实施例2：小(低分子量)酶底物的检测
为了评价氧化电流对分析物浓度的依赖性，将饱和量的GAPDH cDNA捕获探针固定到金电极的表面上，并与10μM生物素化的互补性GAPDH cDNA接触。杂交后，使葡萄糖氧化酶/亲合素偶联物通过亲合素-生物素相互作用结合。最后，将氧化还原聚合物通过层层静电自组装带到电极表面上。使用PBS(pH 7.4)作为检测介质，工作电位为0.35V。如图9所示，直到约20mM葡萄糖，在所获得的氧化电流和检测到的分析物的量之间都有线性关系。
从这方面说，应注意的是该实施例中用到的双层设置和实施例1中完全相同。但是，当要如实施例1中所述检测核酸时，在本发明方法中可以使用非常高的葡萄糖浓度，以将酶“饱和”，或者换句话说，可以使用非常高的葡萄糖氧化速率，以获得足够的灵敏度。当不是要检测核酸，而是要检测氧化还原酶的酶底物时，可以通过用非常高的核酸浓度、用互补性核酸和氧化还原酶如葡萄糖氧化酶将捕获探针饱和进行工作来实现这一点。因为电流是由于溶液中葡萄糖氧化(或一般意义的酶底物氧化)所致，存在电流-浓度关系，其可用于检测葡萄糖或一般意义的可氧化酶底物。还应注意的是，在实施例2中，葡萄糖氧化酶分子用作捕获分子，同时用做能分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子的试剂。因此，实施例2示出了本发明的检测方法，其中捕获分子(也)能够分别从电极向电化学活化剂传递电子，或从电化学活化剂向电极传递电子。
实施例3：多肽的检测
蛋白质的检测(如核酸相似，参见实施例1)如图1a和图1b所列进行。这种情况下，电极首先包被硫醇分子(如16-巯基十六烷酸)，其在这里充当接头分子，用于共价结合捕获分子。然后将包被电极浸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的混合物中，以活化接头的羧酸基团，所述羧酸基团继尔与捕获分子的氨基基团形成共价键。例如，捕获分子可以是对蛋白质分析物具有结合亲合力的抗体或低分子量配体。然后使电极与怀疑含有分析物的溶液接触，使得在在捕获分子和分析物分子之间形成复合物。然后，将连接有酶标记物的氧化还原聚合物通过层-层静电自组装带到电极表面上(参见图1a)。在底物分子存在下，电流分析检测由底物的催化氧化所产生的电流。该电流与样品溶液中目标分析物的浓度直接相关。还可以如图1b所示以类似三明治ELISA的方式进行检测。为此，包含作为捕获分子的抗体和分析物的复合物与对分析物也具有结合亲和力的第二抗体接触。该第二抗体可以与酶如葡萄糖氧化酶偶联，充当能分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子的试剂。然后，使结合有酶标记物的氧化还原聚合物与电极表面接触，从而形成层-层静电自组装件(参见图1a)，并允许检测多肽。
实施例4：低分子量配体的检测
使用实施例3中解释的“三明治-ELISA样”程序，其中使用抗体作为捕获分子，并使该捕获抗体与分析物的复合物与偶联合适酶的第二抗体接触，显然事实上任意小配体如药物(例如可卡因、吗啡(morphium))、营养物(蔗糖、氨基酸等)、环境有害产物(杀虫剂如三嗪、DDT等)都可通过本发明检测。
实施例5.1：聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)、聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸)和 聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺基-磺酸)共聚物的合成
葡萄糖氧化酶(GOx，EC 1.1.3.4，Aspergillus niger，191单位/mg)购自Fluka(CH-9470 Buchs，Switzerland)。二茂铁(Fc)、乙烯基二茂铁(VFc)、丙烯酰胺(AA)、丙烯酸(AC)、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(“丙烯酰胺基磺酸”，AAS，目录号28，273)和过硫酸盐购自Sigma Aldrich(St.Luis，MO，USA.)。所有的其他化学试剂如丙酮、乙醇和磷酸盐缓冲液都是验证合格的分析级。所有用到的溶液都用去离子水制备。
实验中产生聚合物的UV光谱在Agilent 8453紫外可见光谱仪上进行并记录。用Toyo Soda高效凝胶渗透色谱在水中测定分子量，并用标准聚氧化乙烯和聚乙二醇进行校准。
i)聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)聚合物的合成
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶剂的1.0g丙烯酰胺的三个样品。脱氧10分钟后，将0.30ml份的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液加入到每个样品中。将0.05g-0.16g范围的3种量的乙烯基二茂铁溶解于脱气乙醇中，形成3个乙烯基二茂铁溶液样品，计算每个样品所加入二茂铁的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂铁进料比(w/w)分别为95∶5、90∶10和85∶15。然后将每个乙烯基二茂铁样品加入到丙烯酰胺-引发剂混合物中。反应混合物在氮气氛中于70℃回流24小时。冷却后，将反应混合物分别滴加到快速搅拌的丙酮中，以沉淀氧化还原聚合物。将沉淀的氧化还原聚合物用丙酮洗，并通过多次水溶解丙酮沉淀循环进行纯化。然后将纯化的产物于50℃真空干燥。
ii)聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸)聚合物的合成
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶剂的1.0g丙烯酸的三个样品。脱氧10分钟后，将0.30ml份的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液加入到每个样品中。将0.05g-0.16g范围的3种量的乙烯基二茂铁溶解于脱气乙醇中，形成3个乙烯基二茂铁溶液样品，计算每个样品所加入二茂铁的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂铁进料比(w/w)分别为95∶5、90∶10和85∶15。然后将每个乙烯基二茂铁样品加入到丙烯酰胺-引发剂混合物中。反应混合物在氮气氛中于70℃回流24小时。冷却后，将反应混合物分别滴加到快速搅拌的丙酮中，以沉淀氧化还原聚合物。将沉淀的氧化还原聚合物用丙酮洗，并通过多次水溶解丙酮沉淀循环进行纯化。然后将纯化的产物于50℃真空干燥。
iii)聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺基磺酸)聚合物的合成
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶剂的1.0g丙烯酸的三个样品。脱氧10分钟后，将0.30ml份的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液加入到每个样品中。将0.05g-0.16g范围的3种量的乙烯基二茂铁溶解于脱气乙醇中，形成3个乙烯基二茂铁溶液样品，计算每个样品所加入二茂铁的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂铁进料比(w/w)分别为95∶5、90∶10和85∶15。然后将每个乙烯基二茂铁样品加入到丙烯酰胺-引发剂混合物中。反应混合物在氮气氛中于70℃回流24小时。冷却后，将反应混合物分别滴加到快速搅拌的丙酮中，以沉淀氧化还原聚合物。将沉淀的氧化还原聚合物用丙酮洗，并通过多次水溶解丙酮沉淀循环进行纯化。然后将纯化的产物于50℃真空干燥。
基于常规的自由基聚合反应进行乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的共聚。一般性反应方程式示于图12。
但是，为了将单体成功地共聚，非常关注系统中乙烯基二茂铁的终止作用。乙烯基二茂铁通常用作聚合系统中的自由基清除剂。发现自由基引发剂的量大大小于一般聚合系统中所必需的量。更高量的自由基引发剂明显降低聚合效率和产物的分子量。此外，加入次序也影响聚合效率。
当将过硫酸盐自由基引发剂加入到乙烯基二茂铁和丙烯酰胺的溶液中时，观察到低于20％的聚合。这可能是因为反应混合物中形成二茂铁鎓(ferrocenium)，导致阻滞聚合速率并非常早地终止聚合物链生长过程。如表1所示，在优化条件下，获得了相对较高的产量。
表1.乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的共聚
  进料比(w/w)   产率(％)  VFc含量(％)   分子量
  AA/VFc95∶5 80 4％ 3600
  AA/VFc90∶10 72 9％ 3100
  AA/VFc85∶15 56 11％ 2400
  AC/VFc95∶5 75 3％ 2800
  AC/VFc90∶10 55 7％ 2500
  AC/VFc85∶15 45 6％ 2000
  AAS/VFc95∶5 85 6％ 4000
  AAS/VFc90∶10 75 9％ 3500
  AAS/VFc85∶15 62 14％ 3000
但是，聚合物产率随乙烯基二茂铁进料比增加而降低，说明虽然在聚合过程中已经非常注意，仍存在自由基聚合的终止作用。还发现当反应混合物变蓝时获得微小的产量，这是因为聚合溶液中形成相当大量的二茂铁鎓。二茂铁加载量在3-14％之间变动，总是小于单体进料中二茂铁的含量。
氧化还原聚合物中二茂铁的加载量由元素分析确定。能量色散X射线分析(Energy Dispersive X-ray Analysis，EDX)用于该目的。用在所产生的氧化还原聚合物样品上的电子束能量为120keV。用锂漂移硅检测器(lithium drifted silicon detector)分析样品产生的X射线。
通过凝胶渗透色谱测定氧化还原聚合物的分子量。通常，用较高二茂铁进料比制备的氧化还原聚合物具有较低的分子量和较宽的分子量分布。
合成的共聚物为淡黄色的粉末状物质。共聚物的分子量为2000-4000道尔顿。FT-IR实验(参见图13)清楚表明1650处的乙烯基光吸收完全消失，说明丙烯酰胺和乙烯基二茂铁成功地聚合了，所得的氧化还原聚合物是高纯度的，没有单体。进一步的证据存在于1000-1300cm-1区域。1126cm-1处伴随一个弱峰的极强吸收说明氧化还原聚合物中存在二茂铁单元，1218cm-1处的强吸收说明聚合物中存在酰胺基团。紫外实验再次证实了乙烯基二茂铁和丙烯酰胺之间的成功共聚。300nm处的小肩峰明确指示共聚物中有二茂铁基团(参见图13)。氧化还原聚合物中具有二茂铁和胺或羧酸基团使它们具有双重功能：介导电子的氧化还原活性和与蛋白质交联的化学活性。
增加乙烯基二茂铁的进料比是意图增加氧化还原聚合物中二茂铁基团的比例。但是，改变乙烯基二茂铁的量也影响聚合物产率。当乙烯基二茂铁进料比最低时获得最高产量，这和自由基聚合中二茂铁化合物的不寻常行为非常一致。如表1所示，虽然聚合物中二茂铁基团的含量随乙烯基二茂铁进料比增加而增加，但是远不是线性的。发现对于生物传感目的，乙烯基二茂铁进料比10％是足够的，其具有良好的介导功能和良好的经济性。用于聚合的引发剂的量也影响氧化还原聚合物的组成和产率。发现当引发剂为每克单体20-40mg时获得良好的氧化还原聚合物。
实施例5.2：获得氧化还原聚合物的循环伏安图
氧化还原聚合物位于存在0.0μg和10μg GOx和10μg GOx和10μM葡萄糖的磷酸盐缓冲(PBS)溶液中。
在general purpose electrochemical system(GPES)manager 4.9版下用AutoLabpotentiostat/galvanostat运行进行电化学测试。3-电极系统池装在法拉第笼中。所述电极是(Ag/AgCl)参比电极、铂线反电极和Au工作电极(表面面积为7.94mm2)。
与乙烯基二茂铁相比，合成的氧化还原聚合物在水中具有高的溶解性，但是不溶于多数有机溶剂。该特征使得氧化还原聚合物理想地用作生物传感、尤其是酶联生物传感中的介质，因为多数酶仅在水性介质中有活性。
图15示出了仅含有氧化还原聚合物的PBS的典型循环伏安图，伏安图表现出高度可逆的溶液电化学：氧化还原波中心为～0.18V(与Ag/AgCl相比)，伏安图具有扩散受限的形状，阳极和阴极峰电流的幅度相同，峰峰间电位分离为60mV，与25℃下理论值59mV非常接近。这些氧化还原波可以归因于氧化还原聚合物中二茂铁基团的氧化和还原，指示聚合物的优异氧化还原活性。伏安分析实验再一次验证了乙烯基二茂铁成功地与丙烯酰胺及其衍生物共聚，并且聚合物中的二茂铁基团保留其电活性。PBS中的氧化还原聚合物是具有自由扩散行为的真溶液形式。向该溶液中掺加不同量的葡萄糖完全不改变伏安图，说明单独的氧化还原聚合物不催化氧化葡萄糖。另外，当在氧化还原聚合物溶液中加入少量的GOx时未观察到明显变化。所得溶液的电化学实际上与单独的氧化还原聚合物溶液的电化学相同。但是，当向该溶液中加入10mM葡萄糖时，溶液中进行GOx对葡萄糖的酶促氧化。GOx中的氧还中心，FAD被转化成FADH2。当电极电位扫描过氧化还原聚合物的氧化还原电位时，在电极表面附近，氧化还原聚合物中显著量的二茂铁基团氧化成二茂铁鎓。GOx中FAD/FADH2的氧化还原电位是-0.36V(与Ag/AgCl相比)，远低于二茂铁/二茂铁鎓电对的氧化还原电位，FADH2附近的二茂铁鎓基团将它氧化回FAD，氧化还原聚合物中的二茂铁鎓基团还原成起始的二茂铁基团。这两个反应形成催化循环，如图10所示，或者换句话说，GOx的葡萄糖氧化由氧化还原聚合物介导。
因此，氧化还原聚合物的催化反应大大增加含葡萄糖的溶液中的氧化电流，见图13(浅灰色迹线)。如果FADH2、氧化还原聚合物和电极之间的电子交换都非常快，电化学氧化中产生大量的二茂铁鎓基团，所述二茂铁鎓基团又快速被FADH2所消耗。这是与无葡萄糖的溶液中获得的还原电流相比二茂铁鎓基团的还原电流低得多的原因。这些数据表明氧化还原聚合物在酶促反应中有效地作为氧化还原介质起作用，使电子在酶的氧还中心和电极表面之间穿梭。
实施例5.3：包含与葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)交联的乙烯基二茂铁- 共聚-丙烯酰胺的膜的合成
进行氧化还原聚合物与蛋白质的交联反应，以研究所得膜的电化学特性。在本实施例中使用酶GOx。选择戊二醛和聚乙二醇二缩水甘油基醚(PEG)作为交联剂。生物学级的戊二醛(50％水溶液，产品编号00867-1EA)和聚乙二醇二缩水甘油基醚(PEGDE)(产品编号03800)得自Sigma-Aldrich。
首先，将从实施例5.1得到的聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)沉积到金电极上。用交联剂修饰GOx-BSA，以提供具有脂肪族碳链的GOx-BSA，所述脂肪族碳链具有末端醛官能团，其能够提供与固定化介质上合适官能团的交联。随后，使修饰的GOx-BSA沉积，并与固定化引发剂反应。修饰的GOx-BSA上的醛基团与PAA-VFc上的胺基反应，形成共价的交联键。反应进行后，使PAA-VFc-GOx-BSA膜干燥。
将金电极上交联的PAA-VFc-GOx-BSA膜进行伏安分析。使用空白PBS，施加的电位扫描速率为50mV/s。图16所示为空白PBS中金电极上与GOx和BSA进行PEG交联的PAA-VFc的循环伏安图。如图16所示，正如所期望的，交联膜表现出高度可逆的表面固定的氧化还原电对(A.J.Bard，L.R.Faulkner，Electrochemical Methods，John Wiley & Sons：NewYork，2001.)，其用水和PBS彻底洗涤后、和-0.2V至+0.8V之间多次重复性电位循环后几乎没有变化，显示出金电极上高度稳定的表面固定的二茂铁膜。在＜100mV/s的慢扫描速率下，如预期那样，对于限定表面的一电子氧化还原系统记录到明显对称的信号，表现出理想的能斯特行为：峰电流与电位扫描速率成比例，峰峰间电位分离远小于59mV，正如在溶液中扩散行为的情况下观察到的(见图15)，半峰高处电流的宽度为约90mV。该结果证实：所有的二茂铁氧还中心都允许到达电极表面，并进行可逆的异质电子传递。向PBS溶液中加入10mM葡萄糖时，获得典型的催化性电化学曲线。但是，氧化还原聚合物的还原峰消失(图16，灰色迹线)。这意味着通过将电子从还原态GOx向二茂铁基团传递，传感层均匀地维持在还原状态。检测到的快速应答和电流表明氧化还原聚合物的优异介导功能，生物传感器的高电流灵敏度(750nA/mM葡萄糖)。
<110>科技研究局
<120>借助分析物/聚合物活化剂双层排列检测分析物的方法
<150>US 60/515,229
<151>2003-10-29
<160>14
<170>MS W0rd for Windows
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ATGGTGAAGG TCGGTGTC                                    18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
TTACTCCTTG GAGGCCATGT                                  20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ATGGAGGATT CACAGTCGGA                                  20
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
TCAGTCTGAG TCAGGCCC                                   18
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400>5
TTTTTTTTTT TTTTACTCCT TGGAGGCCAT GTAGG                35
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400>6
TTTTTTTTTT TTATGGTGAA GGTCGGTGTC AACGG                35
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>XXX
<220>
<223>捕获探针
<400>7
TTTTTTTTTT TTATGGAGGA TTCACAGTCG GA                   32
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400>8
TTTTTTTTTT TTTCAGTCTG AGTCAGGCCC CA                       32
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400>9
TTTTTTTTTT TTCCTCTCGC GAGTCAACAG AAACG                    35
<210>10
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400>10
GCCAGCGTTC AATCTGAGCC ATGATCAAAC TCTTCAAAAA AAAAAAAAA     49
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>检测探针
<400>11
AAAAAAAAAA AAAAGCTGCC TCCCGTAGGA GT                       32
<210>12
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>12
AAATTGAAGA GTTTGATCAT GGCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA    50
AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C                                   71
<210>13
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>13
AAATTGAAGA GTTTGATCAT GTCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA    50
AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C                                   71
<210>14
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
AAATTGAAGA GTATGATCAT GTCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA    50
AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C                                   71

Claims (23)

1.借助检测电极对分析物分子进行电化学检测的方法，所述方法包括：
(a)将能够结合待检测分析物分子的捕获分子固定在检测电极上；
(b)使电极和假设含有待检测分析物分子的溶液接触；
(c)使所述溶液中所含的分析物分子与电极上的捕获分子结合，从而使得形成捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述复合物在检测电极上形成第一层；
(d)使检测电极与电化学活化剂接触，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，从而在电极上形成第二层，其中所述第二层和所述第一层一起形成导电双层；
(e)使检测电极与能够分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子的试剂接触，其中该试剂是氧化还原酶或氧化还原酶的混合物；
(f)在检测电极上进行电测量；和
(g)通过将获得的电测量结果和对照测量结果比较来检测分析物。
2.权利要求1的方法，其中所述的电化学活化剂是能够在分析物和电极之间传递电子的聚合物氧化还原介质。
3.权利要求2的方法，其中所述的电化学活化剂包含金属离子。
4.权利要求3的方法，其中所述的金属离子选自银、金、铜、镍、铁、钴、锇、钌及其混合物。
5.权利要求4的方法，其中所述的电化学活化剂选自聚(乙烯基二茂铁)、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸，以及聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸，其中n＝0-12。
6.权利要求1的方法，其中所述的氧化还原酶选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、醇脱氢酶、羟基丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甘油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、苹果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆碱脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、胆红素氧化酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、细胞色素C氧化酶和儿茶酚氧化酶。
7.权利要求1的方法，其中所述的捕获分子能够特异性结合待检测的分析物。
8.权利要求1的方法，其中所述的待检测分析物选自核酸、寡核苷酸、蛋白质、肽、寡糖、多糖，及其复合物。
9.权利要求8的方法，其中所述的待检测分析物是核酸分子。
10.权利要求9的方法，其中所述的核酸分子具有预定序列。
11.权利要求10的方法，其中所述的核酸分子包含至少一个单链区。
12.权利要求11的方法，其中所述的捕获分子是具有与待检测核酸分子的单链区互补的序列的至少一种核酸探针。
13.权利要求8的方法，其中所述的待检测分析物是蛋白质或肽。
14.权利要求13的方法，其中所述的捕获分子是能够结合蛋白质或肽的至少一种配体。
15.权利要求1的方法，其中在使电极与假设含有分析物分子的溶液接触之前将封闭试剂固定在电极上。
16.借助检测电极对分析物分子进行电化学检测的方法，所述方法包括：
(a)将能够结合待检测分析物分子的捕获分子固定在检测电极上；
(b)使电极和假设含有待检测分析物分子的溶液接触；
(c)使所述溶液中所含的分析物分子与电极上的捕获分子结合，从而使得形成捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述复合物在检测电极上形成第一层；
(d)使检测电极与电化学活化剂接触，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，从而在电极上形成第二层，其中所述第二层和所述第一层一起形成导电双层，并且其中捕获分子能够分别从电极向电化学活化剂传递电子或从电化学活化剂向电极传递电子；
(e)在检测电极上进行电测量；和
(f)通过将获得的电测量结果和对照测量结果比较来检测分析物。
17.一种电极排列，包含检测电极，适于对分析物分子进行如权利要求1所限定的电化学检测，包含：
(a)检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子；和
(b)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
18.权利要求17的电极排列，其中所述的电化学活化剂是能够在分析物和电极之间传递电子的聚合物氧化还原介质。
19.权利要求18的电极排列，其中所述电化学活化剂包含金属离子。
20.权利要求19的电极排列，其中所述的金属离子选自银、金、铜、镍、铁、钴、锇、钌及其混合物。
21.权利要求17的电极排列，还包含能够分别从电极向聚合物氧化还原介质传递电子或从聚合物氧化还原介质向电极传递电子的试剂，其中所述试剂结合、嵌入或连接导电双层并且所述试剂是氧化还原酶或氧化还原酶的混合物。
22.权利要求17的电极排列作为生物传感器的用途。
23.用于电化学检测分析物分子的生物传感器，包含：
(a)检测电极；
(b)检测电极上的第一层，包含捕获分子和分析物分子之间的复合物，所述捕获分子能够结合待检测的分析物分子，并且所述捕获分子固定在检测电极上；和
(c)包含电化学活化剂的第二层，其中所述的电化学活化剂具有静电净电荷，其与捕获分子和分析物分子之间形成的复合物的静电净电荷互补，其中所述第二层和第一层一起形成导电双层。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7511142B2 (en) 2004-07-28 2009-03-31 Agency For Science, Technology And Research Mediator-modified redox biomolecules for use in electrochemical determination of analyte
US7351770B2 (en) * 2004-09-30 2008-04-01 Lifescan, Inc. Ionic hydrophilic high molecular weight redox polymers for use in enzymatic electrochemical-based sensors
US8998884B2 (en) * 2005-11-09 2015-04-07 The Invention Science Fund I, Llc Remote controlled in situ reaction method
US20080272006A1 (en) * 2005-11-30 2008-11-06 Zhiqiang Gao Electrochemical Method of Detecting an Analyte
US20100133117A1 (en) * 2006-08-08 2010-06-03 Agency For Science, Technology And Research Methods for electrochemical detection/quantification of a nucleic acid
WO2008020813A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Agency For Science, Technology And Research Method of electrically detecting a biological analyte molecule
GB0617730D0 (en) * 2006-09-08 2006-10-18 Smart Holograms Ltd Analyte detection
JP2008071584A (ja) * 2006-09-13 2008-03-27 Toyota Motor Corp 電子伝達メディエータ修飾酵素電極及びこれを備える生物燃料電池
WO2008097190A1 (en) * 2007-02-05 2008-08-14 Agency For Science, Technology And Research Methods of electrically detecting a nucleic acid by means of an electrode pair
JP5441275B2 (ja) * 2008-08-29 2014-03-12 テイジン・アラミド・ビー．ブイ． 複数の高強度、高モジュラス芳香族ポリアミドフィラメントの製造方法
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
EP2182359B1 (en) * 2008-10-30 2015-03-04 Sysmex Corporation Method for detecting analyte
JP5172606B2 (ja) * 2008-10-30 2013-03-27 シスメックス株式会社 被検物質の特異的検出方法および装置、ならびに検査チップ
JP5502413B2 (ja) * 2008-10-31 2014-05-28 シスメックス株式会社 検査チップ、被検物質検出装置および被検物質の特異的検出方法
US9868991B2 (en) 2010-03-26 2018-01-16 The Regents Of The University Of California Nanomotors and motion-based detection of biomolecular interactions
US9746468B2 (en) * 2011-01-28 2017-08-29 The Regents Of The University Of California Bioaffinity sensors based on surface monolayers
CN107219358A (zh) * 2011-03-24 2017-09-29 康奈尔大学 芳香族阳离子肽及其用途
JP5917248B2 (ja) 2011-05-09 2016-05-11 アークレイ株式会社 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途
US10066260B2 (en) * 2013-03-14 2018-09-04 Life Technologies Corporation Matrix arrays and methods for making same
CN103333945B (zh) * 2013-05-24 2015-07-08 宁波美康生物科技股份有限公司 一种直接胆红素检测试剂
CN103399070A (zh) * 2013-08-15 2013-11-20 无锡百灵传感技术有限公司 一种基于氢氧化镍和葡萄糖氧化酶的用于葡萄糖检测的高灵敏电化学传感器制备方法
US20160178562A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Ohmx Corporation Competitive enzymatic assay
US10670595B2 (en) * 2015-05-26 2020-06-02 Oncogenesis, Inc. System, method and kit for detection of analytes by production of electrochemical species
SG11201804275TA (en) 2015-12-08 2018-06-28 Berkeley Lights Inc Microfluidic devices and kits and methods for use thereof
WO2018039585A1 (en) * 2016-08-25 2018-03-01 Hitachi Chemical Co. America, Ltd. Redox mediator-functionalized water-soluble polymer
CN106404865A (zh) * 2016-11-04 2017-02-15 北京农业信息技术研究中心 一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器及其应用
US20200072825A1 (en) * 2016-12-09 2020-03-05 Digital Sensing Limited Electrochemical sensors and methods of use thereof
KR20190117540A (ko) * 2017-02-22 2019-10-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 센서 장치용 전극의 중합체-코팅
EP3418741A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-26 Safeguard Biosystems Holdings Ltd. Three-dimensional polymer networks and their use
WO2019027879A1 (en) * 2017-07-31 2019-02-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. BUTTER PROTEIN (S) FOR IMPROVED STORAGE OF ONE OR MORE ANALYTE DETECTION SENSORS AND METHOD OF USE THEREOF (S)
GB2566516A (en) 2017-09-15 2019-03-20 Univ Oxford Innovation Ltd Electrochemical recognition and quantification of cytochrome c oxidase expression in bacteria
US20210055259A1 (en) * 2018-06-29 2021-02-25 Beijing Savant Biotechnology Co., Ltd. Electrochemical Detection Method Based on Tracers Labeling
CN108918625B (zh) * 2018-07-27 2020-11-24 三诺生物传感股份有限公司 一种生物传感膜的制备方法、生物传感膜及监测装置
CN109557064A (zh) * 2018-12-30 2019-04-02 长春中医药大学 一种通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法
CN110108624B (zh) * 2019-05-08 2020-06-16 中国科学院化学研究所 一种功能化磷脂制备纳米单颗粒的方法及该纳米单颗粒的检测
CN114235790A (zh) * 2021-11-29 2022-03-25 北京华晟源医疗科技有限公司 体液中乳酸含量检测试纸的制备方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4341881A (en) * 1976-11-03 1982-07-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Flexible polyvinyl chloride plastics having improved flame retardancy and reduced smoke generating properties
US5286364A (en) * 1987-06-08 1994-02-15 Rutgers University Surface-modified electochemical biosensor
US5132181A (en) * 1989-08-23 1992-07-21 Aluminum Company Of America Phosphonic/phosphinic acid bonded to aluminum hydroxide layer
IL116921A (en) * 1996-01-26 2000-11-21 Yissum Res Dev Co Electrochemical system for determination of an analyte in a liquid medium
US6096273A (en) * 1996-11-05 2000-08-01 Clinical Micro Sensors Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids
US7381525B1 (en) * 1997-03-07 2008-06-03 Clinical Micro Sensors, Inc. AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
AU4833899A (en) * 1998-06-24 2000-01-10 Therasense, Inc. Multi-sensor array for electrochemical recognition of nucleotide sequences and methods
US6338790B1 (en) * 1998-10-08 2002-01-15 Therasense, Inc. Small volume in vitro analyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator
JP2000146894A (ja) * 1998-11-04 2000-05-26 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａの増感型検出方法
KR100360774B1 (ko) * 1999-12-27 2002-11-13 한국전자통신연구원 효소전극센서 및 그 제조방법
AU2002365119A1 (en) * 2001-07-30 2003-09-04 Meso Scale Technologies, Llc. Assay electrodes having immobilized lipid/protein layers and methods of making and using the same
US7052591B2 (en) * 2001-09-21 2006-05-30 Therasense, Inc. Electrodeposition of redox polymers and co-electrodeposition of enzymes by coordinative crosslinking

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Simple enzyme-amplified amperometric detection of a38-baseoligonucleotide at 20pmol L-1 concentration in a 30-ul droplet. Yongchao Zhang et al.Anal Bioanal Chem,Vol.374 No.6. 2002
Simple enzyme-amplified amperometric detection of a38-baseoligonucleotide at 20pmol L-1 concentration in a 30-ul droplet. Yongchao Zhang et al.Anal Bioanal Chem,Vol.374 No.6. 2002 *

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