JP5917248B2 - HGF遺伝子のpolyArepeat数変異多型検出用プローブおよびその用途 - Google Patents
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Description
配列番号1
5’−GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA−3’
配列番号2
5’−AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT−3’
〈1〉 融解曲線分析によりHGF遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであって、配列番号5に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号15に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、および配列番号16に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドより選択される少なくとも1種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、多型検出用プローブ。
(II)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程と、
(III)前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるTm値を評価する工程と、
(IV)前記Tm値に基づいて、HGF遺伝子における、多型の存在を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、〈4〉に記載のHGF遺伝子の多型検出方法。
本発明の多型検出用プローブは、HGF遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記(P1−1)、(P1−2)、(P1’−1)、(P1’−2)、(P2−1)、(P2−2)、(P2’−1)、(P2’−2)、(P3−1)、(P3−2)、(P3’−1)および(P3’−2)のいずれかから選択される、少なくとも1種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P1−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号95〜100および塩基番号132と、前記塩基番号95〜100の3’末端と前記塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜94塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号95に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号95に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P1−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号95〜100および塩基番号132と、前記塩基番号95〜100の3’末端と前記塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜94塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号95に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号95に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P1’−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号95〜100と、前記塩基番号95〜100の3’末端と塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む7〜55塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号95に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号95に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P1’−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号95〜100と、前記塩基番号95〜100の3’末端と塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む7〜55塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号95に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号95に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P2−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号92〜100および塩基番号132と、前記塩基番号92〜100の3’末端と前記塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む11〜94塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号92に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号92に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P2−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号92〜100および塩基番号132と、前記塩基番号92〜100の3’末端と前記塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む11〜94塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号92に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号92に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P2’−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号92〜100と、前記塩基番号92〜100の3’末端と塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む10〜55塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号92に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号92に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P2’−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号92〜100と、前記塩基番号92〜100の3’末端と塩基番号132との間に挟まれる1〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む10〜55塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号92に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号92に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P3−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号100および塩基番号132〜134と、前記塩基番号100と前記塩基番号132〜134の5’末端との間に挟まれる4〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜120塩基の塩基配列であり、塩基番号134の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号134の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P3−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号100および塩基番号132〜134と、前記塩基番号100と前記塩基番号132〜134の5’末端との間に挟まれる4〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜120塩基の塩基配列であり、塩基番号134の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号134の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P3’−1)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号132〜134と、塩基番号100と前記塩基番号132〜134の5’末端との間に挟まれる5〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜56塩基の塩基配列であり、塩基番号134の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3の塩基配列に対して少なくとも80%以上の同一性を有し、前記塩基番号134の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド;
(P3’−2)配列番号3に示す塩基配列の塩基番号132〜134と、塩基番号100と前記塩基番号132〜134の5’末端との間に挟まれる5〜31塩基のいずれかの個数の連続するTからなる塩基配列と、を含む8〜56塩基の塩基配列であり、塩基番号134の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号3に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号134の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
poly A repeat数30(31)、46mer、配列番号4
5’−CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数30(31)、42mer、配列番号5
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数0(1)、12mer、配列番号6
5’−TTGTGAGCTGCC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数30(31)、46mer、配列番号7
5’−TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数30(31)、42mer、配列番号8
5’−TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数0(1)、11mer、配列番号9
5’−GAGCTGCCTGC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数30(31)、46mer、配列番号10
5’−AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数30(31)、36mer、配列番号11
5’−GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−(蛍光標識)−3’
poly A repeat数2(3)、8mer、配列番号12
5’−GCTTTCAC−(蛍光標識)−3’
本発明のHGF遺伝子の多型検出方法(HGF遺伝子のpoly A repeat数変異の検出方法)は、前述した多型検出用プローブを使用することを特徴とする。すなわち、本発明の多型検出方法は、前述した本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
(I)前記多型検出用プローブおよび試料中の1本鎖核酸を接触させ、蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび1本鎖核酸のハイブリッドを得る工程。
(II)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
(III)前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるTm値を評価する工程。
(IV)前記Tm値に基づいて、HGF遺伝子における、多型の存在を検出する工程。
本発明の薬剤の評価方法は、前述のHGF遺伝子の多型検出方法を利用することにより、HGF遺伝子に関連する疾患に利用できる薬剤の耐性または薬効を評価することを特徴とする。すなわち、本発明の薬剤の評価方法は、前述のHGF遺伝子の多型検出方法を用いて評価することに特徴があり、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
(I)前述のHGF遺伝子の多型検出方法により、HGF遺伝子における多型を検出する工程。
(II)検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価する工程。
本発明のHGF遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。すなわち、本発明のHGF遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことに特徴があって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。なお、前述の多型検出用プローブの(P1−1)、(P1’−1)、(P2−1)、(P2’−1)、(P3−1)または(P3’−1)(特徴が類似する(P1−2)、(P1’−2)、(P2−2)、(P2’−2)、(P3−2)または(P3’−2)についても含む)の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含まれていてもよい。
実施例1では、本発明の多型検出用プローブを利用し、HGF遺伝子のプロモーター領域におけるpoly A repeat数変異について、全自動SNPs検査装置(商品名i−densy(IS−5310)、アークレイ社製)を用いTm解析を行った。i−densy(IS−5310)に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。
3T−HGF−WT−F1プローブ、配列番号5、30(31)
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−(TAMRA)−3’
3T−HGF−WT−F1プローブは、上記配列の3’末端のCにTm解析のための蛍光色素として、TAMRAを用いた。
HGF−R−A30−60、配列番号13、30(31)
5’−ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa−3’
HGF−R−A25−60、配列番号14、25(26)
5’−gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact−3’
実施例2では、前述の実施例1で用いた本発明の多型検出用プローブとは異なる本発明の多型検出用プローブを用い、Tm解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については、前述の実施例1と同様である。
3T−HGF−WT−F3プローブ、配列番号15、30(31)
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−(TAMRA)−3’
このように、3T−HGF−WT−F3プローブは、実施例1と同様に、上記配列の3’末端のCにTm解析のための蛍光色素として、TAMRAを用いた。
HGF−R−A30−60、配列番号13、30(31)
5’−ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa−3’
HGF−R−A25−60、配列番号14、25(26)
5’−gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact−3’
実施例3でも、前述の実施例1および実施例2で用いたプローブとは異なる本発明の多型検出用プローブを用い、Tm解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については、前述の実施例1と同様である。
3T−HGF−WT−R1プローブ、配列番号16、30(31)
5’−gctttttttttttttttttttttttttttttttcac−(TAMRA)−3’
このように、3T−HGF−WT−R1プローブは、実施例1と同様に、上記配列の3’末端のcにTm解析のための蛍光色素として、TAMRAを用いた。
HGF−F−A30−60、配列番号17、30(31)
5’−TTTGGCAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAG−3’
HGF−F−A25−60、配列番号18、25(26)
5’−AGTTTGGCAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCC−3’
比較例では、本発明の多型検出用プローブとは異なるプローブを用い、Tm解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については前述の実施例1と同様である。
3T−HGF−WT−F2プローブ、配列番号19、30(31)
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTC−(TAMRA)−3’
このように、3T−HGF−WT−F2プローブでも、実施例1と同様に、上記配列の3’末端のCにTm解析のための蛍光色素として、TAMRAを用いた。
HGF−R−A30−60、配列番号13、30(31)
5’−ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa−3’
HGF−R−A25−60、配列番号14、25(26)
5’−gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact−3’
実施例4では、PCRの工程を間に入れ、HGF遺伝子におけるpoly A repeat変異について、Tm解析を行った。PCRおよびTm解析を行うための装置は、前述の実施例1、実施例2および実施例3と同様の、i−densy(IS−5310)を使用した。添加するプローブ等の溶液・試薬の組成を下記の表の通りである。
HGF−KKD−F、配列番号20、32mer、Tm=63.6℃
5’−GGGACAGGCTATGGACAATGACTGTTTCTTGG−3’
HGF−KKD−R、配列番号21、28mer、Tm=61.4℃
5’−gggtgtggtattgtggggccaaaataag−3’
3T−HGF−WT−R1プローブ、配列番号16、30(31)
5’−gctttttttttttttttttttttttttttttttcac−(TAMRA)−3’
3T−HGF−WT−R1プローブは、上記配列の3’末端のcにTm解析のための蛍光色素として、前述と同様にTAMRAを用いた。
正常型、配列番号5、30(31)
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
poly A repeat 1塩基欠失、配列番号25、29(30)
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
poly A repeat 3塩基欠失、配列番号26、27(28)
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
poly A repeat 5塩基欠失、配列番号27、25(26)
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
正常型、配列番号15、30(31)
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−3’
poly A repeat 1塩基欠失、配列番号28、29(30)
5’−gcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttt−3’
poly A repeat 3塩基欠失、配列番号29、27(28)
5’−gcaggcagctttttttttttttttttttttttttttt−3’
poly A repeat 5塩基欠失、配列番号30、25(26)
5’−gcaggcagctttttttttttttttttttttttttt−3’
正常型、配列番号16、30(31)
5’−gctttttttttttttttttttttttttttttttcac−3’
poly A repeat 1塩基欠失、配列番号31、29(30)
5’−ttttttttttttttttttttttttttttttcac−3’
poly A repeat 3塩基欠失、配列番号32、27(28)
5’−ttttttttttttttttttttttttttttcac−3’
poly A repeat 5塩基欠失、配列番号33、25(26)
5’−ttttttttttttttttttttttttttcac−3’
配列番号34
5’−AGCTGCC−3’
配列番号35
5’−GAGCTGCC−3’
配列番号36
5’−TTGTGAGCTGCC−3’
配列番号37
5’−AAAGCTGCC−3’
配列番号38
5’−AAAAAAGCTGCC−3’
配列番号39
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
配列番号40
5’−TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
配列番号41
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTG−3’
配列番号42
5’−CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
配列番号43
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCA−3’
配列番号44
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATG−3’
配列番号45
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGG−3’
配列番号46
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGC−3’
配列番号47
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCA−3’
配列番号48
5’−GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTT−3’
配列番号49
5’−GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTTGTTTT−3’
配列番号50
5’−AGCTGCCTGC−3’
配列番号51
5’−GAGCTGCCTGC−3’
配列番号52
5’−AAAGCTGCCTGC−3’
配列番号53
5’−AAAAAAGCTGCCTGC−3’
配列番号54
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC−3’
配列番号55
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−3’
配列番号56
5’−TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−3’
配列番号57
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTC−3’
配列番号58
5’−TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC−3’
配列番号59
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGG−3’
配列番号60
5’−AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCA−3’
配列番号61
5’−GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTT−3’
配列番号62
5’−GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTTGTTTT−3’
配列番号63
5’−CTCAC−3’
配列番号64
5’−CTTCAC−3’
配列番号65
5’−TTTCAC−3’
配列番号66
5’−CTTTCAC−3’
配列番号67
5’−TTTTCAC−3’
配列番号68
5’−CTTTTCAC−3’
配列番号69
5’−TTTTTCAC−3’
配列番号70
5’−TTTTTTTCAC−3’
配列番号71
5’−TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−3’
配列番号72
5’−CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−3’
配列番号73
5’−GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−3’
配列番号74
5’−AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC−3’
配列番号75
5’−CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACAAAATAAACTTGTCTGATCTGACTTTTTAAGAGAAAGTCC−3’
配列番号76
5’−CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACAAAATAAACTTGTCTGATCTGACTTTTTAAGAGAAAGTCCAAGAAACAGTCATTGTCCATAGCCT−3’
配列番号77
5’−TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATA−3’
配列番号78
5’−TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCAC−3’
配列番号79
5’−TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACA−3’
Claims (8)
- 融解曲線分析によりHGF遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであって、配列番号5に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号15に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、および配列番号16に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドより選択される少なくとも1種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、多型検出用プローブ。
- 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする、請求項1に記載の多型検出用プローブ。
- 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする、請求項2に記載の多型検出用プローブ。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の多型検出用プローブを用いることを特徴とする、HGF遺伝子の多型検出方法。
- (I)請求項1ないし3のいずれか1項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の1本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記1本鎖核酸のハイブリッドを得る工程と、
(II)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程と、
(III)前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるTm値を評価する工程と、
(IV)前記Tm値に基づいて、HGF遺伝子における、多型の存在を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項4に記載のHGF遺伝子の多型検出方法。 - さらに、前記(I)のハイブリッドを得る前、または、前記(I)のハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅する工程を含むことを特徴とする、請求項5に記載のHGF遺伝子の多型検出方法。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、HGF遺伝子の多型検出用キット。
- 配列番号5に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号15に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、または配列番号16に示す塩基配列からなり、3’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項7に記載のHGF遺伝子の多型検出用キット。
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