CN110579468A - 一种无共反应试剂的生物传感器、制备方法、试剂盒、使用方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无共反应试剂的生物传感器、制备方法、试剂盒、使用方法及应用,涉及电化学发光技术领域。其包括电极,电极上修饰有PFBT的聚合物纳米材料,PFBT的聚合物纳米材料通过与生物复合酶形成酰胺键共价交联;生物传感器不含有共反应试剂和标记物;生物复合酶为能催化底物产生过氧化氢使电极ECL猝灭的复合酶。这种无共反应试剂型的ECL策略可以避免由于外加物质或溶解的O2作为共反应试剂而导致的缺点。通过生物复合酶诱导的反应释放H2O2,H2O2对PFBT PNPsECL产生猝灭作用,该无共反应试剂型ECL酶生物传感器有利于环境监测和生物分析。
Description
技术领域
本发明涉及电化学发光技术领域,具体而言,涉及一种无共反应试剂的生物传感器、制备方法、试剂盒、使用方法及应用。
背景技术
电化学发光(ECL)作为一种新的技术,由于响应快,灵敏度高,成本低,易于控制,因此在生物分析,环境监测和临床诊断中引起了广泛关注(Chinnadayyala等,2019)。在ECL检测中,对目标的高灵敏度检测不仅取决于发光体的高发光效率,还取决于有效的信号切换模式。
为了实现发光体高的ECL效率,通常需要加入共反应试剂。应用共反应试剂的常用策略有其自身的缺点。例如,直接向检测溶液中加入共反应试剂会改变测试系统的微环境,导致ECL检测的重复性和稳定性差(Jiang等,2019;Wang等,2009)。在电极表面上固定共反应试剂可能涉及复杂的预处理过程。共反应试剂很容易从电极表面泄漏(Muzyka等,2017)。使用溶解氧(O2)作为共反应试剂也会由于其浓度的不确定性而遇到差的重复性和稳定性问题,因为它容易受到温度和压力的影响(Kitte等,2017;Wang等,2012)。此外,大多数共反应试剂对环境有害,并且不适合在特定的测试溶液(例如胞质溶胶)中进行检测。因此,开发不包括外加物质或溶解的O2作为共反应物的ECL系统具有重要的意义。
此外,寻求优异的ECL发光体也是解决ECL效率低的关键。目前用于生物分析的ECL发光体包括:鲁米诺(Wang等,2019),钌(II)三(2,2'-联吡啶)(Ru(bpy)3 2+)(Qin等,2018),量子点(Stewart等),石墨烯氮化碳(g-C3N4)(Sha等人,2019)和金属纳米团簇(Zhou等人,2018)。然而,这些ECL发光体通常需要外加物质或溶解的O2作为共反应试剂以获得令人满意的结果,且常规的ECL发光体的发光效率和稳定性均有待提高。
ECL信号切换包括“信号接通”和“信号关闭”(Zhou等,2018)。为了实现信号关闭状态,常用的策略包括:(1)将淬灭剂(如二茂铁(Zhou等,2017)或多巴胺(Gu等,2019)直接引入ECL系统;(2)应用ECL共振能量转移(ECL-RET)(Fu等,2019);(3)通过沉积或生物识别反应的空间位阻来抑制ECL发射(Zhu et al。,2017);(4)利用基于核酸的切割策略(Chen等,2015)。在上述策略中,引入二茂铁和多巴胺作为ECL猝灭剂通常涉及繁琐的标记和纯化程序。ECL-RET是一个依赖于距离的过程,它受到RET供体-受体对的选择以及供体和受体之间的距离的限制(Fu等,2019)。而基于空间位阻的策略,其灵敏度不能满足高灵敏度分析的要求。基于核酸的切割策略,剪切效率将受到剪切条件的极大限制,例如温度,时间和复杂的预处理过程。因此,选择合适的ECL信号切换策略显得尤为必要。
有机磷(OPs)农药作为一种典型的农药,已广泛应用于作物保护,以消除害虫。然而,OPs的残留物也可能极大地污染环境并对人体的某些器官产生不可逆的影响,例如神经和呼吸系统(Stocka等,2011)。因此,开发一种简单灵敏地检测OPs的方法尤为必要。现有的OPs检测策略不仅涉及共反应试剂的应用,而且还通过消耗诸如溶解的O2或H2O2等共反应试剂才能实现ECL信号关闭。而这种OPs检测策略需要克服如下问题:外加共反应试剂而引起的稳定性问题以及溶解氧浓度的不确定性问题。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无共反应试剂的生物传感器、制备方法、试剂盒、使用方法及应用以改善上述技术问题。
本发明是这样实现的:
一种无共反应试剂的生物传感器,其包括电极,电极上修饰有PFBT的聚合物纳米材料,PFBT的聚合物纳米材料通过与生物复合酶形成酰胺键共价交联;生物传感器不含有共反应试剂和标记物;生物复合酶为能催化底物产生过氧化氢(H2O2)使电极电化学发光猝灭的复合酶。
PFBT中文名称为聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(1,4-苯并-{2,1',3}-噻二唑)],其具有高的ECL发射效率。通过在电极上修饰PFBT的聚合物纳米材料以实现电极的发光物质固定。本实施例中通过PFBT与PSMA纳米沉淀法混合制备得到含有羧基的PFBT PNPs(聚合物纳米材料)。进一步地,生物复合酶通过氨基与电极表面的PFBT PNPs的羧基形成酰胺键以共价交联,从而使得生物复合酶交联在电极上。
在本发明应用较佳的实施例中,上述生物复合酶为乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的复合酶。
乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChOx)能催化底物乙酰硫代胆碱(ATCl)以产生H2O2,H2O2将淬灭PFBT PNPs的ECL信号,导致ECL信号关闭状态。
一种生物传感器的制备方法,其包括如下步骤:在电极表面修饰PFBT的聚合物纳米材料,最后将生物复合酶滴加至电极表面,生物复合酶通过酰胺键与PFBT的聚合物纳米材料交联,孵育获得生物传感器。
在电极上修饰有PFBT的聚合物纳米材料需要对电极进行活化,通过活化羧基以促进生物复合酶的氨基与羧基以酰胺键交联。
在本发明应用较佳的实施例中,上述生物复合酶为生物复合酶溶液,生物复合酶溶液包括125-150U/ml的乙酰胆碱酯酶和250-270U/ml的胆碱氧化酶。
PFBT的聚合物纳米材料作为发光体,当该发光体与生物复合酶溶液在上述添加体积比时,能高效的实现电极上的发光体通过羧基与生物复合酶的氨基通过酰胺键交联。生物复合酶的溶液中包含上述浓度的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶时,能够保证酶促反应中心与底物充分反应。
一种试剂盒,其包括生物传感器和催化底物。
在本发明应用较佳的实施例中,上述催化底物为乙酰硫代胆碱,催化底物的浓度为0.25-0.3mM;
优选的,催化底物的浓度为0.27mM。
生物传感器中的乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChOx)能催化底物乙酰硫代胆碱(ATCl)以产生H2O2,H2O2将淬灭PFBT PNPs的ECL信号,导致ECL信号关闭状态。
在本发明应用较佳的实施例中,上述试剂盒还包括缓冲液;
优选的,缓冲液为PBS缓冲液,PBS缓冲液的pH为7.0-8.0;
优选的,PBS缓冲液的pH为7.4-7.5。
在上述pH下的PBS缓冲液能够保证生物传感器上的酶高效催化底物,从而控制ECL信号的状态。
一种生物传感器或试剂盒在检测有机磷中的应用。在不存在OPs的情况下,源自酶促反应的H2O2将淬灭PFBT PNPs的ECL信号,导致ECL信号关闭状态。存在OPs的情况下,ECL信号明显增加,因为乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶活性被OPs抑制。
一种使用试剂盒进行有机磷检测的方法,其包括如下步骤:将生物传感器在含有机磷的待测样品中孵育,再将孵育后的生物传感器置于催化底物中,检测ECL信号。
在本发明应用较佳的实施例中,上述方法还包括根据ECL信号检测待测样品中有机磷的含量。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种无共反应试剂的生物传感器,该生物传感器修饰有PFBT的聚合物纳米材料,该PFBT的聚合物纳米材料在没有外加共反应试剂和溶解氧的条件下具有高的ECL(电致化学发光)发射效率,是一种优异的ECL发光体。PFBT的聚合物纳米材料通过与生物复合酶形成酰胺键以共价交联,生物传感器上交联有生物复合酶从而催化底物产生H2O2,H2O2可以使PFBT的聚合物纳米材料ECL猝灭。当电极没有与催化底物接触时,电极具有高的ECL发射效率,当电极与催化底物接触后,电极上的生物复合酶催化底物产生H2O2,H2O2使PFBT的聚合物纳米材料ECL猝灭,导致ECL信号关闭状态。当含有有机磷时,有机磷能抑制生物复合酶的活性,从而使得产物H2O2的量减少,导致ECL恢复,从而实现对有机磷的高灵敏度检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为PFBT PNPs的制备,生物传感器的制备及响应机理和PFBT PNPs的ECL机理示意图;
图2为PFBT PNPs的TEM图像、FT-IR光谱、三维表面图像、热图图像、FL光谱(FL)、FL激发光谱(FLE)、最大ECL发射光谱和紫外-可见吸收光谱;
图3中(A)PFBT PNPs/GCE在(a)空气饱和氛围下和(b)N2气氛下的0.10M PBS(pH7.4)中的IECL-E曲线,(c)在含有0.10M TBAPF6的MeCN溶液中,在空气饱和下的IECL-E曲线;(B)PFBT PNPs/GCE在0.10M PBS(pH 7.4)中(a)没有L-cys和SOD,(b)有L-cys和(c)有SOD的ECL响应;(C)PBS(0.10M)的pH对PFBT PNPs/GCE的ECL响应的影响(扫描电位范围:0~1.25V,扫描速率:300mV·s-1);
图4为L-cys和SOD对PFBT PNPs/GCE的ECL响应的影响及EPR光谱图;
图5为生物传感器制备过程的表征图;
图6为不同pH的PBS溶液和底物ATCl的浓度对生物传感器的ECL性能影响;
图7为信号强度与H2O2浓度的对数关系以及信号强度与OPs浓度的关系图;
图8为生物传感器的稳定性和重现性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种无共反应试剂的生物传感器的制备方法,其包括如下步骤:
(1)PFBT的聚合物纳米材料的合成。
分别称取4mg的PFBT(聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(1,4-苯并-{2,1',3}-噻二唑)])和0.8mg的聚(苯乙烯-共马来酸酐)(PSMA)溶解在THF(四氢呋喃)中,剧烈超声处理超过5小时,分别得到1mg/mL的溶液。再将两种溶液充分混合并快速注入到10mL超纯水中。然后连续搅拌混合物溶液直至溶剂THF在空气气氛下完全蒸发,用440nm的膜过滤器进行过滤处理,收集滤液即制得PFBT的聚合物纳米材料,如下简称PFBT PNPs。图1中的A图描述了PFBT PNPs的合成。
(2)制备生物传感器。
生物传感器的制备流程参照图1所示,先用0.3μm粒径的氧化铝对玻璃碳电极(GCE)进行初次抛光处理,再用0.05μm粒径的氧化铝对玻璃碳电极进行二次抛光,以去除GCE表面的杂质。抛光处理后,用超纯水和乙醇交替洗涤直径为4.0mm的GCE,洗涤后在空气中自然干燥。
取步骤(1)制得的PFBT PNPs分散液7μL滴加在GCE表面上,室温干燥。PFBT PNPs的分散液在GCE表面具有良好的成膜性,PFBT PNPs的分散液吸附在GCE表面。
再将干燥后的GCE与10μL的EDC与NHS体积比为4:1的混合液室温孵育1小时以活化PFBT PNPs的羧基。
制备生物复合酶溶液,称取乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChOx),溶于水中制备得到含有125U/ml乙酰胆碱酯酶和250U/ml胆碱氧化酶的生物复合酶溶液(AChE-ChOx)。
取10μL的生物复合酶溶液滴加在羧基活化后的GCE表面上,孵育8小时,制备得到生物传感器(AChE-ChOx/PFBT PNPs/GCE),在4℃下保存备用。图1中的B图描述了生物传感器的制备,生物复合酶通过氨基与GCE表面的PFBT PNPs的羧基形成酰胺键交联。
实施例2
本实施例提供了一种生物传感器的ECL测量方法,具体包括如下步骤:取实施例1制备得到的生物传感器在4℃下置于一定浓度的有机磷溶液中孵育20min。通过有机磷孵育以促进有机磷对生物传感器表面的酶活性进行充分抑制。
取出有机磷孵育后的生物传感器,置于含有0.27mM ATCl的3.0mL PBS(0.10M,pH7.4)中,进行ECL检测。本实施例以修饰的GCE作为工作电极,铂丝作为辅助电极,Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极,设置光电倍增管(PMT)电压为800V,扫描电位范围为0V-1.25V,记录ECL信号。
实验例1
本实验例针对实施例1制得的PFBT PNPs进行了形貌的观察。将实施例1制备的PFBT PNPs进行TEM观察,参照图2中的A图所示,可以观察到直径为60-80nm的球形颗粒,图2中A图的插图为尺寸分布直方图,由尺寸分布直方图可知制得的PFBT PNPs的平均尺寸约为70nm。
本实验例还针对制得的PFBT PNPs进行了FI-IR光谱仪分析,以确定PFBT PNPs的组成,分析结果参照图2中的B图所示。原始的PFBT的吸收曲线(曲线a)显示出2924.5cm-1和2851.9cm-1处的吸收峰,这是由于PFBT烷烃链上C-H键的反对称伸缩振动。在817.6cm-1处的峰来自烷烃链上C-H的面外变形振动。在1461cm-1处观察到来自PFBT芳环的骨架振动的信号。与原始PFBT相比,PFBT PNPs(曲线b)在1778.6cm-1处呈现出新的FT-IR峰,此处峰与-COOH相关,即制备得到的PFBT PNPs具有-COOH结构。因此,图2中B图的FT-IR光谱的结果表明PFBT PNPs成功制备。
本实验例还测量了PFBT PNPs的荧光和ECL光谱,在含有10μL的三乙胺(TEA)溶液的3.0mL的PBS(pH7.4)中测量合成的PFBT PNPs的ECL三维表面图像模型和热图图像,结果参照图2中的C图和D图所示。本实验例选择在含有三乙胺的PBS中测量PFBT PNPs的ECL光谱可以获得更高的ECL信号,便于三维ECL图像的制作。设置热图图像的扫描电位:0~1.25V。由图可知,最大的ECL波长为534nm,其接近位于542nm的荧光最大发射波长(参照图2中的E图所示),因此,推测ECL的发射可能与光致发光的发射相似。图2中的E图显示了PFBT PNPs的FL光谱(FL)、FL激发光谱(FLE)和最大ECL发射光谱(具有1.25V的电位)。由图2中的E图可知PFBT PNPs的荧光最大激发波长为450nm。
PFBT PNPs在水溶液中的紫外-可见吸收光谱参照图2中的F图所示。由图可知,PFBT PNPs在300nm~600nm范围内显示出宽的吸收带,这归因于聚合物链的塌缩和弯曲,导致较低的共轭程度(Wu等人,2013)。PFBT PNPs的两个特征吸收峰分别位于322nm和459nm。图2中F图的插图分别显示了在可见光辐射(左)和356nm UV光辐射(右)下的PFBT PNPs的颜色。在UV光辐射下观察到较黄的颜色。
实验例2
本实验例针对PFBT PNPs的ECL机制和H2O2的猝灭效应进行探究。
首先测试修饰有PFBT PNPs的电极(PFBT PNPs/GCE)在空气饱和气氛(图3中的A图,曲线a)和N2气氛(图3中的A图,曲线b)下,0.10M PBS(pH 7.4)溶液中的ECL响应以此来研究溶解O2的影响。由图3中的A图可知,空气饱和气氛和N2气氛两种情况下的ECL信号强度几乎相同,约为9866a.u.,表明溶解氧不参与ECL反应,即溶解的O2不作为PFBT PNPs的共反应试剂。
其次,本实验例还给出了测试介质对ECL信号的影响。在含有四丁基六氟磷酸铵(TBAPF6)作为支持电解质的MeCN溶液中测试了PFBT PNPs/GCE的ECL响应。由图3中的A图可知,与在空气饱和气氛的PBS(pH 7.4)溶液相比(图3中的A图,曲线a),在MeCN溶液中观察到明显更低的ECL信号强度(图3中的A图,曲线c),表明水溶液作为测试介质更有利于ECL信号的检测。
再次,本实验例还给出了活性氧类(如羟基自由基和超氧自由基)对ECL信号的影响。L-半胱氨酸(L-cys)和超氧化物歧化酶(SOD)分别作为典型羟基自由基(OH·)和超氧自由基(O2·-)的清除剂(Mezyk等,1996;Zhang等,2005)。参照图3中的B图所示,与没有L-cys和SOD的情况(曲线a)相比,当在L-cys+PBS(曲线b)或SOD+PBS系统(曲线c)中监测PFBT PNPs/GCE时,未观察到明显的ECL信号变化,说明OH·和O2·-不参与PFBT PNPs的ECL反应。
排除活性氧物种家族(OH·和O2·-)在PFBT PNPs的ECL反应中的作用,推测PBS溶液中的痕量OH-可能在扫描阳极电位期间与发光体PFBT PNPs反应。本实验例还探讨了PBS溶液的pH是否在PFBT PNPs的ECL反应期间发挥作用。参照图3中的C图所示,当PBS溶液的pH从1升至11时,PFBT PNPs的ECL信号也随之加强,表明OH-确实与PFBT PNPs的ECL发射有关。
即首先将PFBT PNPs进行氧化以在阳极电位扫描下产生PFBT PNPs·+阳离子自由基。然后,PFBT PNPs·+阳离子自由基与OH-反应,通过失去质子产生PFBT PNPs·自由基。最后,当PFBT PNPs·+与PFBT PNPs·碰撞时产生激发态PFBT PNPs*,从而产生ECL发射(参照图1中的B图和C图)。实际上,已有文献报道了OH-和发光体之间类似的ECL反应(Zheng等人,2009;Feng等人,2016)。
为研究H2O2对PFBT PNPs的ECL发射的阻碍机制,本实验例还进行了ECL和电子顺磁共振(EPR)测定。图4中A图为PFBT PNPs/GCE在0.10M PBS(pH 7.4)中,不含H2O2(曲线a),含有0.10μMH2O2(曲线b),含有0.10μM H2O2+L-cys(曲线c)和含有0.10μMH2O2+SOD(曲线d)情况下的ECL响应图;B图为在黑暗(曲线a)和光照射(曲线b)下PFBT PNPs分散体在不含H2O2情况下的EPR光谱;在黑暗(曲线c)和光照射(曲线d)下PFBT PNPs+H2O2系统的EPR光谱。参照图4中的A图所示,在0.10M PBS测试溶液中,在PFBT PNPs/GCE处观察到具有高强度的ECL峰(曲线a)。当将0.10μMH2O2引入测试溶液时,ECL强度减弱(曲线b)。
为了探究猝灭效应是否由来自H2O2的OH·和O2·-引起,检测了PFBT PNPs/GCE在含有H2O2和L-cys的0.10M PBS中的ECL响应(曲线c),PFBT PNPs/GCE的在含有H2O2和SOD的0.10M PBS中的ECL响应(曲线d)。由图4中A图的c曲线和d曲线所观察到的,在有或没有L-cys和SOD的情况下,H2O2的猝灭效应几乎没有变化,表明来自H2O2的OH·和O2·-对ECL信号没有猝灭作用。
进一步利用EPR测量来探索PFBT PNPs的空穴(h+)。参照图4中的B图所示,当PFBTPNPs置于没有H2O2(曲线a)和有H2O2(曲线c)的黑暗环境中时,观察到来自典型TEMPO自由基三重峰的强峰。而且,两种情况下的信号强度几乎相同。在光照下,PFBT PNPs分散液EPR光谱呈现非常低的信号强度(曲线b),这是由于PFBT PNPs的光生h+的产生。在PFBT PNPs分散液中加入H2O2后,TEMPO自由基EPR谱的信号强度明显增加(曲线d)。可能的原因可能如下,在光照下,光生h+可以直接氧化H2O2(Du等,2019),导致h+量减少,从而阻断了PFBT PNP的ECL发射。
实验例3
本实验例针对不同的生物传感器进行性能的表征。对照组1为裸GCE(图5中A图的曲线a),对照组2为PFBT PNPs修饰的GCE(图5中A图的曲线b),实验组为本发明实施例1制备的AChE-ChOx/PFBT PNPs/GCE(图5中A图的曲线c)。曲线c为AChE-ChOx/PFBT PNPs/GCE在含有5.0mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的0.10M PBS(pH 7.4)中的CV响应曲线,扫描电位为-0.2~0.6V,扫描速率为100mV·s-1,通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)进行性能表征。
由图5中的A图可知,相比于a曲线,由于PFBT PNPs的导电性差,b曲线对应的氧化还原峰电流下降。当AChE-ChOx生物复合材料通过交联途径孵育到电极表面上时,由于非导电生物大分子的阻塞,峰值电流进一步下降(曲线c)。
使用EIS技术对不同的生物传感器进行性能的表征,参照图5中的B图所示,电位为0.22V,幅度为5mV,频率为10-1~105Hz,其结果与A图一致,表明所提出的生物传感器如预期成功构建。图5中B图的曲线a,b和c均与图5中A图的图注相同。
实验例4
本实验例针对不同pH的PBS溶液和底物ATCl的浓度对生物传感器的ECL性能影响进行实验。不同pH的PBS溶液对生物反应器上的酶活性影响较大,进而影响ECL强度。
保持0.27mM的恒定底物浓度下优化PBS溶液的pH。参照图6中的A图所示,当PBS溶液的pH从6.0增加到7.4时,ECL强度逐渐降低,这归因于酶促反应中原位产生的H2O2量的增加。ECL信号在7.4处达到最小值,表明在该pH条件下产生的H2O2达最大量。当pH超过7.4时,ECL信号随着pH的升高而增加,这可能是由于在高pH条件下AChE和ChOx的酶活性受到抑制,导致产生的H2O2的量减少。因此,pH7.4用于以下实验。
ATCl用于原位生成猝灭剂H2O2,因此ATCl的浓度被认为是获得优化的ECL性能的另一个关键因素。参照图6中的B图所示,ECL信号随着ATCl浓度从0.00mM增加到0.27mM而不断降低,当ATCl浓度达到0.27mM时,ECL信号达到最小值。实验表明在0.27mM的情况下酶的活性中心已被底物ATCl完全占据(Chen等,2017)。因此,选择0.27mMATCl用于以下实验以获得低ECL背景信号。
实验例5
本实验例给出了生物传感器在有机磷检测中的应用。
本实验例首先通过直接应用PFBT PNPs修饰的GCE构建了H2O2传感器,结果如图7中的A图所示。A图中PFBT PNPs/GCE对H2O2的ECL响应,从(a)到(h):9.68×10-13,4.84×10-12,4.84×10-11,9.68×10-11,9.68×10-10,4.84×10-9,9.68×10-8和4.84×10-7M,扫描电位范围:0~1.25V,扫描速率:300mV·s-1。随着H2O2浓度的升高,PFBT PNPs的ECL信号降低。在信号强度和H2O2浓度的对数之间观察到线性变化(参照图7中的B图所示)。H2O2的线性范围为9.86×10-13~4.85×10-7M,线性方程表示为I=-700.003lgc1-1302.734,检出限为3.29×10-13M。高灵敏度ECL PFBT PNPs/GCE对H2O2的响应进一步证实了H2O2对PFBT PNPs的ECL发射的猝灭作用。
当AChE和ChOx被修饰到PFBT PNPs/GCE上用于OPs的定量分析时,由于靶标有机磷(OPs)对AChE活性的抑制,酶促反应产生的H2O2减少,导致放大的ECL信号随着OPs浓度的增加而增加(图7中的C图),C图中,AChE-ChOx/PFBT PNPs/GCE对OPs的ECL响应,从(a)到(i):1.0×10-12,5.0×10-12,5.0×10-11,1.0×10-10,5.0×10-10,1.0×10-9,1.0×10-8,5.0×10-8,1.0×10-7M。在1.0×10-12-1.0×10-7M(图7中的D图)的浓度范围内,获得ECL强度与OPs浓度的对数之间的线性变化。线性方程为I=830.83lgc2+12925.75。相关系数和检测限分别为0.9942M和1.5×10-13M(S/N=3)。与现有的OPs检测策略相比,由于PFBT PNPs的高ECL效率和H2O2的有效猝灭效应,本发明构建的生物传感器表现出更优异的灵敏度和更宽的线性范围,不同传感器的比较参照表1所示。
表1用于测定OPs的不同传感器的比较
实验例6
本实验例进行了实施例1制备的生物传感器的稳定性和重现性检测。
用5.0×10-12M OPs孵育的生物传感器,在连续循环扫描10圈的情况下检测生物传感器在0.10M PBS中的ECL响应情况来监测该传感器的稳定性。图8中的A图清楚地显示了几乎相同的ECL信号,RSD约为3.84%,表明生物传感器具有良好的稳定性。
另外,通过批内和批间的测定进一步估计重现性。参照图8中的B图所示,来自相同或不同批次的四个孵育有5.0×10-11M OPs的生物传感器(AChE-ChOx/PFBT PNPs/GCE)的ECL响应差异不显著,RSD均低于3%。这表明构建的生物传感器具有可接受的重现性。
实验例7
本实验例采用本发明实施例1制备的生物传感器对不同的蔬菜进行有机磷残留量的检测。
从超市获得的生菜,卷心菜和小白菜被选作实际样品,以研究所提出的生物传感器的可用性。分别用超纯水和乙醇洗涤三种蔬菜(生菜,卷心菜和小白菜)。然后,分别取上述样品15g研磨成植物汁,然后依次加入12mL PBS和3mL乙醇。将所得分散体系在8000rpm下快速离心15分钟,收集上部样品溶液4℃下保存备用。
以上述生菜,卷心菜和小白菜的样品溶液作为溶剂,分装9个容器中,每种样品溶液分装3个容器。在每个容器中对应添加如下表2中10nM、1nM和0.1nM浓度的分析纯有机磷。将9个生物反应器置于容器中孵育,孵育后将生物反应器置于含有0.27mM ATCl的3.0mLPBS(0.10M,pH7.4)中进行ECL检测。记录ECL信号,代入线性方程为I=830.83lgc2+12925.75中,求得有机磷浓度cdetected,重复3次。
结果参照表2所示。由表2可知,在生菜,卷心菜和小白菜样品溶液中未检测到残留的OPs,回收率分别为93.0%~98.8%,93.0%~103%和97.5%~101%,表明无共反应试剂ECL酶生物传感器具有在实际生物分析中快速,灵敏地检测OPs的潜在可用性。
在其他实施例中,进行待测样品的有机磷残留量检测时,首先,需要根据已知梯度浓度的有机磷绘制生物传感器的标准曲线方程,再根据测定的待测样品的ECL信号,代入方程求得有机磷浓度。
表2不同蔬菜样品中OPs的回收率
(a表示平均测量3次)
在没有任何外加共反应试剂的情况下,PFBT PNPs表现出高ECL发光效率。本发明还创造性的发现H2O2对PFBT PNPs的ECL发射的猝灭效应。通过PFBT PNPs和H2O2的结合构建了用于OPs检测的无共反应试剂型ECL酶生物传感器。这种ECL策略避免了应用外加物种或溶解O2作为共反应物的缺点,因此为生物分析提供了有希望的ECL平台。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无共反应试剂的生物传感器,其特征在于,其包括电极,所述电极上修饰有PFBT的聚合物纳米材料,所述PFBT的聚合物纳米材料通过与生物复合酶形成酰胺键共价交联;所述生物传感器不含有共反应试剂和标记物;所述生物复合酶为能催化底物产生过氧化氢使电极电化学发光猝灭的复合酶。
2.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物复合酶为乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的复合酶。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的生物传感器的制备方法,其特征在于,其包括如下步骤:在电极表面修饰PFBT的聚合物纳米材料,最后将生物复合酶添加至电极表面,生物复合酶通过酰胺键与PFBT的聚合物纳米材料交联,孵育获得生物传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述生物复合酶为生物复合酶溶液,所述生物复合酶溶液包括125-150U/ml的乙酰胆碱酯酶和250-270U/ml的胆碱氧化酶。
5.一种试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1-2任一项所述的生物传感器和催化底物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述催化底物为乙酰硫代胆碱,所述催化底物的浓度为0.25-0.3mM;
优选的,所述催化底物的浓度为0.27mM。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括缓冲液;
优选的,所述缓冲液为PBS缓冲液,所述PBS缓冲液的pH为7.0-8.0;
优选的,所述PBS缓冲液的pH为7.4-7.5。
8.一种如权利要求1-2任一项所述的生物传感器或权利要求5-7任一项所述的试剂盒在检测有机磷中的应用。
9.一种使用权利要求5-7任一项所述的试剂盒进行有机磷检测的方法,其特征在于,其包括如下步骤:将生物传感器在含有机磷的待测样品中孵育,再将孵育后的生物传感器置于催化底物中,检测ECL信号。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述方法还包括根据ECL信号检测待测样品中有机磷的含量。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111855647A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-10-30 | 西南大学 | 一种用于检测单链核酸的ecl传感器、其套件及其方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010003647A1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-06-14 | Ji Sun | Coreatant-including electrochemiluminescent compounds, methods, systems and kits utilizing same |
CN103940878A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-07-23 | 福州大学 | 一种无试剂电化学发光传感器及其制备方法 |
CN104597039A (zh) * | 2014-12-28 | 2015-05-06 | 福建医科大学 | 一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法及用途 |
CN106501240A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-03-15 | 西南大学 | 具有双信号源的电致化学发光传感器及其制备方法和应用 |
CN110146566A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-20 | 西南大学 | 修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用 |
-
2019
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010003647A1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-06-14 | Ji Sun | Coreatant-including electrochemiluminescent compounds, methods, systems and kits utilizing same |
CN103940878A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-07-23 | 福州大学 | 一种无试剂电化学发光传感器及其制备方法 |
CN104597039A (zh) * | 2014-12-28 | 2015-05-06 | 福建医科大学 | 一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法及用途 |
CN106501240A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-03-15 | 西南大学 | 具有双信号源的电致化学发光传感器及其制备方法和应用 |
CN110146566A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-20 | 西南大学 | 修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HAN ZHANG ET AL.: "A novel electrochemiluminescent biosensor based on resonance energy transfer between poly(9,9-di-n-octylfluorenyl-2,7-diyl) and 3,4,9,10- perylenetetracar-boxylic acid for insulin detection", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
QIUYU HU ET AL.: "In situ H2O2 generation with gold nanoflowers as the coreactant accelerator for enzyme-free electrochemiluminescent immunosensing", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
SHAN SHAN MIAO ET AL.: "Electrochemiluminescence biosensor for determination of organophosphorous pesticides based on bimetallic Pt-Au/multi-walled carbon nanotubes modifi ed electrode", 《TALANTA》 * |
王海军等: "基于多种信号放大策略的电致化学发光生物传感器的研究进展", 《化学传感器》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111855647A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-10-30 | 西南大学 | 一种用于检测单链核酸的ecl传感器、其套件及其方法 |
CN111855647B (zh) * | 2020-08-05 | 2021-10-08 | 西南大学 | 一种用于检测单链核酸的ecl传感器、其套件及其方法 |
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