CN104535626B - 一种纸基自供能生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种纸基自供能生物传感器的制备方法及应用。本发明公开了一种操作简单、低成本、自供能的三维中空通道微流控纸芯片适配体传感器并成功用于现场检测。该传感器成功将生物燃料电池引入到三维中空通道微流控纸芯片上，利用生物燃料电池阴阳极对底物的催化效果自行产生电信号，摆脱对外部供能设备的限制。通过长金制备生物燃料电池的阳极改善电极导电性，将葡萄糖脱氢酶固定在阳极上；生物燃料电池阴极采用碳纳米管‑铂纳米复合材料催化氧气还原，利用葡萄糖作为燃料；在金‑阳极上发生适配体与重金属离子之间相互识别；通过电化学工作站检测电流强度，实现对水中重金属离子进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及水中重金属离子检测技术领域，更具体地说是一种能够检测重金属离子的便携式电化学传感器制备，本发明还涉及采用中空通道纸芯片构建生物燃料电池，以生物燃料电池作为自供能生物传感器核心部件测定水样中痕量重金属离子的方法。
背景技术
水体重金属离子污染是指含有重金属离子的污染物进入水体对水体造成的污染。矿冶、机械制造、化工、电子、仪表等工业生产过程中产生的重金属废水（含有铬、镉、铜、汞、镍、锌等重金属离子）是对水体污染最严重和对人类危害最大的工业废水之一。废水中的重金属是各种常用水处理方法不能分解破坏的，而只能转移它们的存在位置和转变它们的物理化学状态。因此，重金属废水应当在产生地点就地处理，不同其他废水混合。如果用含有重金属离子的污泥和废水作为肥料和灌溉农田，会使土壤受污染，造成农作物中及进入水体后造成水生生物中重金属离子的富集，通过食物链对人体产生严重危害。20世纪60年代震惊世界的日本公害病-水俣病和痛痛病，就是分别由含汞废水和含镉废水污染水体造成的。随着经济的快速发展，废水的大量排放，土壤和水源中重金属积累的加剧，重金属的污染也日益严重。由于重金属易通过食物链而生物富集，构成对生物和人体健康的严重威胁。如何有效地治理重金属污染已成为人类共同关注的问题。因此，对重金属的检测，尤其是水中重金属残留的快速检测成为公众关注的焦点。
检测重金属离子的方法主要有1）原子荧光光度法，通过待测元素的原子蒸汽在辐射能激发下所产生荧光的发射强度来测定待测元素；2）电感耦合等离子体质谱法，是将电感耦合等离子体与质谱连用，利用电感耦合等离子体使样品汽化并原子化，将待测金属分离出来，从而进入质谱依据元素质量特征进行测定；3）电感耦合等离子发射光谱法，高频感应电流产生的高温将反应气加热、电离，利用待测元素发出的特征谱线对其进行测定，特征谱线的强度与该重金属的量成正比；4）高效液相色谱法，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析；5）酶分析法，是重金属离子对于某些酶的活性中心具有特别强的亲和力，与之结合后会改变酶活性中心的结构与性质引酶活性下降，从而使底物-酶系统产生一系列的变化，诸如使显色剂的颜色、电导率、pH值和吸光度等发生变化，这些方法可以直接用肉眼加以辨别或者是通过电信号、光信号被检测到，这样可以判断重金属的存在或者测定其浓度；6）生物传感器，利用生物识别物质与待测物质结合，发生的变化通过信号转换器转化成易于捕捉和检测到的电信号或者光信号等，通过检测电信号、光信号或者其他信号等来判断待测物质的量，酶生物传感器、微生物传感器、免疫传感器、DNA传感器、细胞传感器等在重金属检测方面都有应用。但是上述方法一起仪器比较昂贵、操作复杂，同时对能源有很强的依赖性，不利于随时随地的现场检测，限制了其在当前的应用和发展。因此迫切需要开发各种特异性强、灵敏度高、速度快、成本低、检测面广的分析检测方法和技术来适应形势的发展。
发明内容
本发明解决的技术问题是在三维中空通道微流控纸芯片上构建以生物燃料电池为核心的自供能生物传感器，实现对重金属离子的随时随地现场检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的三维中空通道微流控纸芯片结合生物燃料电池来实现的，该三维中空通道微流控纸芯片的制备方法为：
（1）在计算机上设计三维中空通道微流控纸芯片的四个疏水蜡批量打印图案，分别为蜡批量打印图案A，式样如附图1所示，蜡批量打印图案B，式样如附图2所示，蜡批量打印图案C，式样如附图3和4所示，以及蜡批量打印图案D式样如附图5所示，利用打孔器和激光切割机对蜡批量打印图案A、B和C进行打孔切割，制备溶液入口、中空通道，并在设计的阳极区域和阴极区域分别印刷碳电极式样如附图6-11所示，将蜡批量打印图案A、B、C、和D分别剪开分成a、b、c和d单个单元；
（2）通过长金制备生物燃料电池纸阳极，将捕获适配体DNA链修饰在阳极上，用牛血清白蛋白封装活性位点，将制备好的纸阳极保存在4℃的冰箱中备用；
（3）制备碳纳米管-铂纳米复合材料，并滴加在生物燃料电池纸阴极上作为阴极材料；
（4）将信号适配体DNA链和葡萄糖脱氢酶修饰在金纳米粒子上；
（5）将a、b、c和d四个单元依次堆叠，式样如附图12所示，并用电路板夹住连接电化学工作站；
（6）将被测重金属离子和标记的信号适配体DNA链混合溶液从三维微流控纸芯片入口加入，反应10分钟，多余的溶液从器件入口吸出，注入葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合溶液，通过电化学工作站测定电流；
（7）反应过程所需要的溶液由a单元的入口加入，溶液附着在c单元设计的半亲水纸通道，沿着b单元所设计的中空通道流动，流动到a、d单元的电极区域引发反应。
本发明所述通过长金制备生物燃料电池纸阳极，包括以下步骤：将金纳米粒子滴加在纸阳极上，室温条件下晾干，然后加入质量浓度为1%的氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液滴加在纸阳极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗，得到长金修饰的生物燃料电池纸阳极。
本发明所述碳纳米管-铂纳米复合材料制备过程包括以下步骤：首先将碳纳米管在硝酸溶液中加热至60℃回流6小时，然后得到的碳纳米管加入到浓硫酸和浓硝酸混合溶液中60℃下反应24小时，离心洗涤，然后烘干。将制备得到的碳纳米管10mg加入到0.25mL38.6mM的氯铂酸溶液中超声反应1小时，然后加入2mL乙二醇搅拌1小时，接着超声反应1.5小时，离心水洗得到碳纳米管-铂纳米复合材料。
本发明所述碳纳米管-铂纳米做生物燃料电池阴极制备过程包括以下步骤：将0.5mL制备得到的碳纳米管-铂纳米复合材料加入到含有0.5M的氯化钠的质量浓度为0.25%的聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液中超声30分钟，离心除去多余的聚二烯基丙二甲基氯化铵，将产物加入二次水超生溶解，将50µL聚二烯基丙二甲基氯化铵活化的碳纳米管-铂纳米滴加到纸阴极上，得到生物燃料电池阴极。
本发明的有益效果：
（1）在微流控纸芯片实验室中引入中空通道，极大地缩短了试验时间，减少实验过程中溶液的蒸发以及纸纤维对分子的吸附；
（2）将生物燃料电池技术和中空通道微流控纸芯片，降低了试检测本；
（3）生物燃料电池可以自行产生电信号，无需外加能量激发反应，摆脱了对能源要求的限制，有利于随时随地的现场检测；
（4）采用碳纳米管-铂纳米复合材料作为生物燃料电池阴极催化材料，可以提高铂纳米的分散性有利于提高催化效率，同时可以避免酶的变性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述
图1为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案A，黑色区域为蜡打印疏水区域，1区域为纸纤维亲水区域，一个用于印刷碳电极，一个打孔作为溶液入口；
图2为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案B，黑色区域为蜡打印疏水区域，1区域为纸纤维亲水区域；
图3为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案C，黑色区域为蜡打印疏水区域，2区域为蜡疏水区域，1区域为纸纤维亲水区域；
图4为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案C反面，黑色区域为蜡打印疏水区域，1区域为纸纤维亲水区域；
图5为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案D，黑色区域为蜡打印疏水区域，1区域为纸纤维亲水区域，用于印刷碳电极；
图6为利用打孔器打孔和印刷电极后三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案A，3区域为打孔后的形成的中空区域作为溶液入口，4为印刷电极；
图7为利用激光切割机切割后三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案B，3区域为打孔和切割后形成的中空通道；
图8为利用打孔器打孔后三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案C，2区域为蜡疏水区域，3区域为打孔后形成的中空区域；
图9为利用打孔器打孔后三维中空通道微流控芯片中滤纸片的疏水蜡批量打印图案C的反面，1区域为纸纤维亲水区域，3区域为打孔后形成的中空区域；
图10为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的蜡批量打印图案D碳电极印刷图案，4为印刷电极；
图11为三维中空通道微流控芯片中滤纸片的蜡批量打印图案D碳电极印刷图案反面，1区域为纸纤维亲水区域；
图12为a、b、c和d四个单元依次堆叠图案，1为纸纤维亲水区，3为中空区，4为印刷电极。
具体实施方式
实施例1：地下水中重金属离子Hg2+的检测
（1）在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计三维中空通道微流控纸芯片，其中单个器件大小为35×20mm，分别为蜡批量打印图案A，式样如附图1所示，蜡批量打印图案B，式样如附图2所示，蜡批量打印图案C，式样如附图3和4所示，以及蜡批量打印图案D，式样如附图5所示，蜡批量打印图案A上两个圆形区域，分别为纸阳极和溶液入口，直径为5mm，蜡批量打印图案B上通道宽度为2mm，长度为20mm，圆形区域直径为5mm，蜡批量打印图案C上通道宽度为2mm，长度为20mm，圆形区域直径为5mm，蜡批量打印图案D上圆形区域（纸阴极）直径为5mm。
（2）利用直径4mm的打孔器对蜡批量打印图案A、B和C的圆形区域打孔，利用激光切割机对蜡批量打印图案B上的通道进行切割，式样如附图6-9所示；
（3）采用丝网印刷技术分别在蜡批量打印图案A和D的阳极、阴极区域印刷碳电极，式样如附图6、10和11所示，电极直径为5mm；
（4）制备合成金纳米粒子和碳纳米管-铂纳米复合材料，具体实施过程如下：制备金纳米，首先将160mL水加热到90℃，加入质量浓度为1%的氯金酸1.6mL，升温到96℃，保持1分钟，加入质量浓度为1%的柠檬酸钠5.6mL，搅拌15分钟，溶液变成酒红色，室温冷却，制备得到金纳米；碳纳米管-铂纳米复合材料制备，首先将碳纳米管在60℃的硝酸溶液中回流6小时，然后将得到的碳纳米管加入到浓硫酸和浓硝酸混合溶液中60℃下反应24小时，然后烘干。将制备得到的碳纳米管10mg加入到0.25mL 38.6mM的氯铂酸溶液中超声反应1小时，然后加入2mL乙二醇搅拌1小时，接着超声反应1.5小时，离心水洗得到碳纳米管-铂纳米复合材料；
（5）设计捕获Hg2+适配体DNA链序列为：5’-NH2-(CH2)6-CAGTTTGGAC-3’；
Hg2+信号适配体DNA链序列为：5’-NH2-GTCCTTTCTG-3’；
（6）通过长金制备生物燃料电池金-纸阳极，并将捕获适配体DNA链修饰在金-纸阳极上，随后用牛血清白蛋白封装，具体实施过程如下：将制备的金纳米滴加在纸阳极上，晾干，然后将1%氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液滴加在纸阳极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗制备得到金-纸阳极，然后加入捕获适配体DNA链反应50 µL反应10分钟，随后用pH为7.0的缓冲溶液冲洗，加入牛血清白蛋白封闭活性位点然后用pH为7.0的缓冲溶液冲洗，制备好的阳极保存在4℃冰箱备用；
（7）制备碳纳米管-铂纳米复合材料-纸阴极，具体实施过程如下：将0.5mL制备得到的碳纳米管-铂纳米复合材料加入到含有0.5M的氯化钠的质量浓度为0.25%的聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液中超声30分钟，离心除去多余的聚二烯基丙二甲基氯化铵，将产物加入二次水超声溶解，将50µL 聚二烯基丙二甲基氯化铵活化的碳纳米管-铂纳米滴加到纸阴极上，得到生物燃料电池阴极；
（8）将a、b、c和d四个单元依次堆叠，随后用电路板夹住，连接电化学工作站，从入口加入不同浓度的Hg2+的标准溶液和Hg2+的信号适配体DNA链混合溶液，反应5分钟，用pH为7.0的缓冲溶液清洗，多余的溶液从入口吸出，加入葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合溶液，通过电化学工作站测定电流，得到本发明对Hg2+测定的线性范围为0.1 nM-5µM，最低检测限为85 pM。
实施例2：地下河水中重金属离子Ag+的检测
（1）在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计三维中空通道微流控纸芯片，其中单个器件大小为35×20mm，分别为蜡批量打印图案A，式样如附图1所示，蜡批量打印图案B，式样如附图2所示，蜡批量打印图案C，式样如附图3和4所示，以及蜡批量打印图案D，式样如附图5所示，蜡批量打印图案A上两个圆形区域，分别为纸阳极和溶液入口，直径为5mm，蜡批量打印图案B上通道宽度为2mm，长度为20mm，圆形区域直径为5mm，蜡批量打印图案C上通道宽度为2mm，长度为20mm，圆形区域直径为5mm，蜡批量打印图案D上圆形区域（纸阴极）直径为5mm。
（2）利用直径4mm的打孔器对蜡批量打印图案A、B和C的圆形区域打孔，利用激光切割机对蜡批量打印图案B上的通道进行切割，式样如附图6-9所示；
（3）采用丝网印刷技术分别在蜡批量打印图案A和D的阳极、阴极区域印刷碳电极，式样如附图6、10和11所示，电极直径为5mm；
（4）制备合成金纳米粒子和碳纳米管-铂纳米复合材料，具体实施过程如下：制备金纳米，首先将160mL水加热到90℃，加入质量浓度为1%的氯金酸1.6mL，升温到96℃，保持1分钟，加入质量浓度为1%的柠檬酸钠5.6mL，搅拌15分钟，溶液变成酒红色，室温冷却，制备得到金纳米；碳纳米管-铂纳米复合材料制备，首先将碳纳米管在60℃的硝酸溶液中回流6小时，然后将得到的碳纳米管加入到浓硫酸和浓硝酸混合溶液中60℃下反应24小时，然后烘干。将制备得到的碳纳米管10mg加入到0.25mL 38.6mM的氯铂酸溶液中超声反应1小时，然后加入2mL乙二醇搅拌1小时，接着超声反应1.5小时，离心水洗得到碳纳米管-铂纳米复合材料；
（5）设计捕获Ag+适配体DNA链序列为：5’-HS-CTCTCT CTC TCT CTC TCT CTC-3’；
Ag+信号适配体DNA链序列为：5’-HS-CAC ACACAC ACA CAC ACA CAC-3’；
（6）通过长金制备生物燃料电池金-纸阳极，并将捕获适配体DNA链修饰在金-纸阳极上，随后用牛血清白蛋白封装，具体实施过程如下：将制备的金纳米滴加在纸阳极上，晾干，然后将1%氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液滴加在纸阳极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗制备得到金-纸阳极，然后加入捕获适配体DNA链反应50 µL反应10分钟，随后用pH为7.0的缓冲溶液冲洗，加入牛血清白蛋白封闭活性位点，然后用pH为7.0的缓冲溶液冲洗，制备好的阳极保存在4℃冰箱备用；
（7）制备碳纳米管-铂纳米复合材料-纸阴极，具体实施过程如下：将0.5mL制备得到的碳纳米管-铂纳米复合材料加入到含有0.5M的氯化钠的质量浓度为0.25%的聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液中超声30分钟，离心除去多余的聚二烯基丙二甲基氯化铵，将产物加入二次水超声溶解，将50µL 聚二烯基丙二甲基氯化铵活化的碳纳米管-铂纳米滴加到纸阴极上，得到生物燃料电池阴极；
（8）将a、b、c和d四个单元依次堆叠，随后用电路板夹住，连接电化学工作站，从入口加入不同浓度的Ag+标准溶液和Ag+的信号适配体DNA链混合溶液，反应5分钟，用pH为7.0的缓冲溶液清洗，多余的溶液从入口吸出，加入葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合溶液，通过电化学工作站测定电流，得到本发明对Ag+测定的线性范围为0.1 nM-500 nM，最低检测限为49 pM。
Claims (6)
1.一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）在计算机上设计三维中空通道纸芯片，分别为批量蜡打印图案A，B，C和D；
（2）根据现有方法制备合成金纳米，制备合成碳纳米管-铂纳米复合材料；
（3）通过长金制备金纸电极作为生物燃料电池阳极基底；
（4）制备以碳纳米管-铂纳米复合材料为基底的生物燃料电池阴极；
（5）将制备好的自供能生物传感器结合电化学工作站用于金属离子检测。
2.根据权利要求1所述一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是，所述步骤（1）具体方法为，首先通过计算机设计三维中空通道纸芯片，设计纸阳极、纸阴极、中空通道、半亲水通道以及溶液入口，通过蜡打印机打印出来，利用打孔器和激光切割机制备中空通道。
3.根据权利要求1所述一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是，所述步骤（2）中金纳米的制备方法为，首先将160mL水加热到90℃，加入质量浓度为1%的氯金酸1.6mL，升温到96℃，保持1分钟，加入质量浓度为1%的柠檬酸钠5.6mL，搅拌15分钟，溶液变成酒红色，室温冷却，制备得到金纳米；碳纳米管-铂纳米复合材料的制备方法为，首先，将碳纳米管在60℃的硝酸溶液中回流6小时，然后得到的碳纳米管加入到浓硫酸和浓硝酸混合溶液中60℃下反应24小时，然后烘干，将制备得到的碳纳米管10mg加入到0.25mL 38.6mM的氯铂酸溶液中超声反应1小时，然后加入2mL乙二醇搅拌1小时，接着超声反应1.5小时，离心水洗得到碳纳米管-铂纳米复合材料。
4.根据权利要求1所述一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是，所述步骤（3）中长金纸阳极制备方法为，将制备的金纳米滴加在纸阳极上，晾干，然后将质量浓度为1%的氯金酸和0.2M盐酸羟胺混合溶液滴加在纸阳极上，在室温条件下反应10分钟，然后用二次水冲洗。
5.根据权利要求1所述一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是，所述步骤（4）中碳纳米管-铂纳米复合材料纸阴极的制备方法为，将0.5mL制备得到的碳纳米管-铂纳米复合材料加入到含有0.5M的氯化钠的质量浓度为0.25%的聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液中超声30分钟，离心除去多余的聚二烯基丙二甲基氯化铵，将产物加入二次水超声溶解，将50µL聚二烯基丙二甲基氯化铵活化的碳纳米管-铂纳米滴加到纸阴极上。
6.根据权利要求1所述一种纸基自供能生物传感器的制备方法，其特征是，所述步骤（5）中进行重金属离子测定方法为，在纸阳极上依次修饰捕获适配体DNA链、金属离子和修饰信号适配体DNA链，将三维中空通道纸芯片折叠，加入葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合溶液进行样品测定，溶液从入口加入沿着设计的中空通道流动到电极区域进行反应。
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|---|---|---|---|---|
| CN101820073A (zh) * | 2010-05-26 | 2010-09-01 | 福州大学 | 新型微流控芯片生物燃料电池的制作方法 |
| CN103041876A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-17 | 济南大学 | 一种高通量、低成本、操作简单的电化学三维微流控纸芯片的制备及在现场检测中的应用 |
| CN103008038A (zh) * | 2013-01-11 | 2013-04-03 | 西安交通大学 | 双极电极-纸基微流控的芯片及其制备方法 |
| CN103191787A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-07-10 | 华南理工大学 | 一种羧基化碳纳米管催化剂载体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Self-Powered and Sensitive DNA Detection in a Three-Dimensional Origami-Based Biofuel Cell Based on a Porous Pt-Paper Cathode;Yanhu Wang等;《Chem. Eur. J.》;20140922;第20卷;第12453-12462页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104535626A (zh) | 2015-04-22 |
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