CN112444548B - 一种快速检测水体bod的微流控微生物电化学传感器及应用 - Google Patents

Abstract

一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器的设计和应用，具有检测速度快(BOD常规检测是5天，COD是2‑3小时)，便携，易操作免维护，可以实现实时在线监测，制作成本及操作维护成本极低的特点。本发明通过合理的结构设计，制作出微升体积的BOD微生物反应器，用于水质生化需氧量的传感与测试，该传感器响应周期最短缩至1‑5分钟，大大降低了测试时间。本设计适合大规模生产，由于其较宽的监测范围和极低的制作运行维护成本，适合大范围和大面积的应用。在污水厂的运行管理和地表/地下水监测包括垃圾渗滤液监测等领域有很好的应用前景。

Description

一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器及应用

技术领域

本发明属于微生物电化学传感器领域，特别涉及一种通过微细加工技术制备的微流控微生物电化学传感器用来快速评估水质生化需氧量的方法。

背景技术

污水水质指标尤其是水体生化需氧量的实时监测，不仅能够提供实时的水质信息，而且能够在地表/地下水管理和污水处理厂的运行中发挥核心作用，水质指标的及时反馈可以有效降低饮用水安全隐患，并且可以有效提高污水处理厂的运行管理和污水处理效率，降低运维成本，以满足环境生态系统的自净能力和政策法规的要求。国家标准测试法的“五日生化需氧量法”耗时长、误差大，不能满足水质信息及时反馈的需求。

BOD微生物传感器阳极附着产电微生物在代谢有机物的同时生成电流，因此有潜力用于快速测定水体生化需氧量的应用中。但是制作成本高、响应时间相对较长等因素制约了其大面积的推广应用，而微体积的微生物传感器具有制作成本低、响应时间快以及便于在线监测等特点是解决这一问题的有效措施。

BOD微生物传感器基本处在实验室研究阶段，而制约其投入实际生产应用的主要原因是设备制作过程复杂、成本高且对水质生化需氧量的响应时间相对较慢，不能够对水质变化做出及时可靠的响应。而缩小微生物电化学传感器的体积是提高生物传感器性能、降低响应时间的有效措施。但是目前基于微流控技术的常见微制造方法包括光刻技术、软光刻技术以及激光烧灼技术等虽然能有效降低反应器体积到微升(uL)级别且精度较高，但是这些技术往往需要特定的精密仪器、无菌的操作环境以及良好的专业训练，往往不能达到批量化生产，且操作门槛较高。所以我们需要找到一种低成本、制作周期短、操作简单的微制造技术应用于微生物电化学传感器的设计和制作，并最终用于水质传感器的构建，考察响应时间、测试范围等指标，以进一步实现产品化和推广于实际的应用。

发明内容

为解决上述技术中存在的问题，本发明提供一种操作简单、制作成本低、周期短且适于批量生产的一种微制造技术，通过合理的设计，制作出微升体积的微生物电化学反应器，并用于水质生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)的传感与测试，评估其适用性和应用前景。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案获得：

一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器，该传感器包括阳极室1、离子交换膜d、阴极室2、阳极液入口3、阳极液出口4、阴极液入口5、阴极液出口6、阳极导线7和阴极导线8；所述阳极室1与阴极室2通过离子交换膜d隔开；

其中，所述阳极室1由阳极层a、阳极碳布层b及阳极腔室层c叠加构成；所述阴极室2由阴极层g、铂薄膜层f及阴极腔室层e叠加构成；

所述阳极液入口3与阳极液出口4为阳极层a上两个圆孔通过黏贴有PDMS立体块9构成；阴极液入口5和阴极液出口6为阳极层a上另外两个圆孔通过黏贴有PDMS立体块9构成；所述PDMS立体块9有硅胶导管穿入并与圆孔位置对应；

所述阳极层a和阳极腔室层c对应贯穿的圆孔组成阳极液通道；所述阳极层a、阳极腔室层c、离子交换膜d和阴极腔室层e上对应的贯穿的圆孔组成阴极液通道；

所述阳极导线7通过与阳极碳布层b接触并穿过阳极层a中椭圆形小孔；所述阴极导线8依次通过贯穿于阴极腔室层e、离子交换膜d、阳极腔室层c和阳极层a另一侧的椭圆小孔穿出；

如图8所示，所述阳极碳布层b采用倒置结构放置，即微生物生长在阳极碳布层下表面，即完全靠微生物自身的附着力而生长和定植在阳极表面。

进一步，所述阳极室1的有效反应体积为0.72-4.5uL。也可根据所需阳极表面积大小和腔室层数量调整而定，如阳极表面积设定为4mm×4mm，阳极腔室层为3层时，其有效反应体积为0.72uL。

进一步，所述阳极腔室层c和阴极腔室层e的数量为1-5层。可依据所需腔室体积而灵活设定为1层或多层。

一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器的设计，其特征在于：该微流控微生物电化学传感器制备过程如下：

将1-5层阳极腔室层与离子交换膜上下对齐压实贴合为一个整体；

将阳极层和碳布层叠加，并且在压实之前将阳极导线通过与碳布接触并穿过对应的椭圆小孔，得到完整的阳极室；

将阴极腔室层粘贴到离子交换膜的下层，并且各个孔位置一一对应，通过调整阴极腔室层的数量来调整阴极室的厚度；

将阴极层和阴极材料上下对应粘贴于阴极腔室层下表面，将阴极导线依次通过贯穿于阴极腔室层e、离子交换膜d、阳极腔室层c和阳极层a的椭圆小孔穿出，压实后，整个反应器的组装过程完成。

一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器的应用，所述微流控微生物电化学传感器用于构建微流控微生物电化学传感器测试系统；所述微流控微生物电化学传感器测试系统包括微流进样模块、传感器模块、电信号测试模块和数据采集模块。

微流控微生物电化学传感器测试系统如图1所示，此系统为实验室搭建的测试平台，用于检测传感器对水体中存在的有机物浓度(一般用生化需氧量)的响应。而在日后大量应用于野外或者污水厂的实际检测则可以相应的简化装置或者利用物联网技术实现数据无线传输。整个测试系统包括：微流进样模块、传感器模块、电信号测试模块和数据采集模块。微流进样模块主要由两个注射器组成，分别用来完成阳极液和阴极液的进样过程，传感器采用“序批模式”测试时需要手动缓慢注入待测样品和阴极液，而采用“连续流模式”测试时可将注射器连接至微流注射泵即可完成连续流的进样。具体依照实际测试需求可灵活切换模式。传感器模块由本发明产品微生物电化学传感器和出水收集装置组成。电信号测试模块主要由导线、外电阻以及恒电势器串联组成。数据采集模块主要由一台显示器和数据采集软件组成，用于记录和存储电信号数据，本测试系统的电流数据采集和记录，采集频率设置为每分钟10个数据，并实时在显示器中进行可视化展示以便依据实时数据响应情况调整测试进程。

一种微流控微生物电化学传感器在BOD检测中的应用，检测步骤具体如下：

1)微流控微生物电化学传感器的启动

向阳极室引入菌液和培养液，观测电流信号值的变化，电流值先升高后降低至平稳时加入新的培养液，最终峰值稳定后，生物膜培养完成，即传感器启动成功；

2)微流控微生物电化学传感器的测试

采用微流控微生物电化学传感器测试系统，阳极室和阴极室中依次加入不同浓度的待测溶液和阴极液，从样品注入开始记录时间，直到新的峰值出现为响应时间；将BOD值作为横坐标，电流值和响应时间作为两个纵坐标得出电流值和BOD之间成线性关系。

微流控微生物电化学传感器设计与运行原理：

本发明产品微流控微生物电化学传感器的结构设计原理由传统的双室微流控BOD微生物传感器的反应机理而来。如附图3所示为该传感器的剖面及各部件名称示意图，右侧为局部非等比例放大示意图，图中所示材料和名称与图2所示的材料和名称一一对应。该剖面示意图为在阳极液流经方向，即阳极液由左侧圆孔流入，由右侧圆孔流出，而阴极液的流向则是由垂直于纸张方向流入。随着阳极液的流入，其含有的有机质则被阳极表面附着生长的产电微生物所代谢利用，并产生电子和质子，质子经过离子交换膜，到达阴极室，而电子则通过外电路到达阴极室，与质子、氧分子结合产生水分子。所以理论上阳极液中的有机质含量越高，产电微生物代谢产生的电子越多，相应的电信号值也越高，因而我们可以依据所检测到的电信号来响应水体中的有机物的含量，也就是微流控BOD微生物传感器的工作原理。而本设计过程中一个与以往不同的创新点就是我们的阳极是采用倒置结构放置，这个设计一方面降低了由于生物膜过量生长而导致微通道堵塞的风险，另一方面倒置形成的高效选择性可以将代谢活性高、产电能力强且有较强附着能力的微生物优选附着在阳极表面，那些代谢活性差或者附着力差的微生物将会随着阳极液流出体系，而使留下的生物膜有较强的产电能力和鲁棒性，更适应于高强度的检测和相对恶劣生长环境。

微流控微生物电化学传感器测试流程

本发明的传感器测试水体中化学需氧量步骤如下：首先，微流控微生物电化学传感器的制备，主要分为腔室和液体通道的设计(可根据不同需求合理更改腔室的尺寸，控制有效反应体积)、材料准备与切割、反应器组装与固定；其次，反应器阳极生物膜的培养，分为菌液接种和营养物质培养两个过程。最后，测试传感器性能，即测试不同浓度的人工废水(一般由乙酸钠浓度进行调节BOD值)，得到BOD浓度和电信号关系的标准曲线。测试过程中可以采用序批式进样，即将待测样品加入阳极室后，使其自行反应，观察电流响应情况，达到电流峰值时即为反应完全，记下电流峰值和所消耗的时间即为响应时间。此外，也可以采用连续流式测试传感器性能，即采用微流注射泵将样品连续的注入传感器，具体操作依据传感器尺寸和需要满足的检测要求而定(依据我们前期的研究经验可知，流速越大、响应时间越快且BOD浓度越高响应时间越长)。

本发明有益效果：

(1)本发明中制备的微流控微生物电化学传感器制作成本低、效率高。所需材料价格低廉且所需设备仅为一台工业用切割机，以4mm×10mm阳极尺寸的1.8微升反应器为例，制作成本仅需2.5元人民币，制备过程仅需10分钟。

(2)本发明将阳极倒置放置，有利于高效筛选代谢活性高、阳极附着能力强的产电微生物，在提高了传感器性能的同时也避免了微通道的堵塞问题的发生。

(3)利用本发明中传感器反应体积小的特点，通过优化运行模式，进一步将水体生化需氧量的检测时间缩短到1分钟，检测范围为20-450mg/L BOD值，这是迄今为止反应最快且检测范围最大的微流控微生物电化学传感器。

附图说明

为使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为微流控微生物电化学传感器测试系统图；

图2为微流控微生物电化学传感器结构示意图；

图3为微流控微生物电化学传感器设计和工作原理图；

图4为微流控微生物电化学传感器实物图；

图5为微流控微生物电化学传感器启动示意图；

图6为微流控微生物电化学传感器阳极生物膜的SEM图；

图7为微流控微生物电化学传感器对水体生化需氧量的测试结果图；

图8为阳极碳布层倒置结构示意图；

其中，包括阳极室1、离子交换膜d、阴极室2、阳极液入口3、阳极液出口4、阴极液入口5、阴极液出口6、阳极导线7、阴极导线8、PDMS立体块9、阳极层a(含有圆孔a1,a3,a4,a6和椭圆小孔a2,a5)、碳布层b、PDMS立方体小块示意图h、微流控微生物电化学传感器组装后示意图i、阳极腔室层c(含有圆孔c1,c3,c4,c6和椭圆小孔c2)、离子交换膜d(含有圆孔d3,d4和椭圆小孔d2)、阴极腔室层e(含有圆孔e3,e6和椭圆小孔e2)、铂薄膜层f、阴极层g。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1

微流控微生物电化学传感器结构如图2所示，该传感器的制作过程主要是通过“堆叠组装”完成，如图2(a-g)所示，微流控微生物电化学传感器由七个结构部分组成，其阳极层a、阳极腔室层c、阴极腔室层e及阴极层g材质为聚酯塑料材料(PET plastic)，其单层厚度为125μm；离子交换膜的厚度为460μm；碳布层b以碳布作为阳极材料，其厚度为330μm；铂薄膜层f以铂金属的薄膜材料用作阴极材料，其自身60μm厚。在反应器组装之前，除了电极材料可以直接用剪刀剪出所需形状外，其余结构层的材料需要按照设计好的图形通过一台操作简单的微加工领域常用的切割绘制机来切割出相应的形状之后，各层之间上下对齐粘合固定。随后将提前制备好的带有硅胶导管穿入的4个PDMS(聚二甲基硅氧烷)立方体小块，通过双面有机硅胶粘贴至阳极层a对应的4个圆形小孔上面，作为阳极液和阴极液的入水和出水通道。图中a,c,d,e层中出现的椭圆形小孔最终作为阳极和阴极导线通道。将a-g层堆叠组装完成之后d层以上构成了阳极室，即阳极溶液经由PDMS和导管流入，且只流经离子交换层的上表面一层，从另一端流出，而e-g层则相应的构成了阴极室，即阴极液也是由表层的PDMS和导管流入，但是阴极液的入口直接通过离子交换膜的两个圆孔贯穿到其下表层，且只流经离子交换层的下表面一层，同样阴极液的出口在对应的另一端，从表层导出。最终成品示意如图2所示。并且图4展示了以阳极和阴极面积4mm×10mm为例的实物图，该实物图在制作过程中阳极层采用3层聚酯塑料，阴极层采用2层聚酯塑料。所以阳极室的有效反应体积计算之后为1.8微升。

实施例2

图2展示了本发明中BOD微生物传感器的结构示意图。该传感器由阳极室、阴极室和离子交换膜相互堆叠而成。离子交换膜使阳极室和阴极室之间隔离且只允许正离子通过。由图2可以明显观察到，阳极层a、阳极腔室层c和离子交换膜d相叠加构成了阳极室；同理，离子交换膜d、阴极腔室层e和阴极层g相叠加构成了阴极室，碳布层b和铂薄膜层f分别是本发明所使用的阳极材料和阴极材料，在这里我们使用碳布和铂金属分别作为阳极材料和阴极材料。在本设计中我们使用薄碳纤维作为导线材料，与碳布层接触后穿出阳极层后用铜箔胶带固定(如图4中A所示)，作为接触点与外电路连接，用于电化学分析测试。本设计最终可以实现阳极液在离子交换膜的上表层流动，阴极液在离子交换膜的下表层流动，彼此不干扰，为了验证本设计的合理性，我们将不同颜色的液体模拟阳极液和阴极液导入，如实物图4中的B和D所示，分别是正面和背面的实物图，进而证实了本设计的合理性。图2中i展示了制作完成后的示意图。

实施例3

传感器的启动

图5展示了本发明微流控微生物电化学传感器的启动过程，即阳极生物膜的培养过程，包括微生物接种阶段和培养阶段。接种过程具体指向阳极室引入菌液和培养液。接种阶段我们向阳极室引入体积比1:1的菌液和培养液，通过观测电流信号值的变化，当出现一个明显的先增加后降低的过程之后，即可判定微生物已经定植在碳布上，接下来进入培养阶段，连续引入3个周期，每个周期电流值先升高后降低至平稳，最终峰值稳定后，认为生物膜培养完成，即传感器启动成功。为了观察生物膜生长状态，我们通过SEM扫描电镜技术观察培养后的生物膜，结果如图6所示，有明显的微生物附着现象。

实施例4

传感器性能测试

本实施例介绍连续流模式下的传感器测试结果。具体操作如下：

按照图1所示搭建好测试系统，其中微流进样模块采用双通道微流注射泵完成。两个注射器分别通过硅胶导管连接到已经培养好阳极生物膜的微流控微生物电化学传感器的阳极液和阴极液的进样口，对应的出水分别用两个塑料烧杯收集，外电路串联一个10欧姆的定值电阻和恒电势器，并通过数据记录软件与显示器相连接，完成整个测试系统的搭建(如图1所示)。根据我们前期实验结果可知，在测试过程中利用恒电势器向阳极和阴极之间持续施加一个1mV小额的电压，可以达到较好的测试效果。测试过程中依次将事先配制好不同BOD浓度的待测溶液和阴极液引入反应器，为了维持两个腔室的气压平衡，所以保持阴极液和阳极液同步同速度进样，从样品注入开始记录时间，一直到新的峰值出现为响应时间。本实施例中所使用的阳极液为通过调节溶液中乙酸钠浓度而获得的BOD浓度分别为49、129、321、492mg/L，这个测试范围足以满足日常污水处理厂的测试需求。整个测试过程在恒温(25℃)的实验室进行，且每个样品测试3个重复，最终将BOD值作为横坐标，电流值和响应时间作为两个纵坐标绘制如图7所示的结果图。可以看出电流值和BOD之间成线性关系，且当测试49mg/L的样品时，响应时间仅为1.1min。

Claims (8)

1.一种快速检测水体BOD的微流控微生物电化学传感器，其特征在于：该传感器包括阳极室(1)、离子交换膜(d)、阴极室(2)、阳极液入口(3)、阳极液出口(4)、阴极液入口(5)、阴极液出口(6)、阳极导线(7)和阴极导线(8)；所述阳极室(1)与阴极室(2)通过离子交换膜(d)隔开；

其中，所述阳极室(1)由阳极层(a)、阳极碳布层(b)及阳极腔室层(c)叠加构成；所述阴极室(2)由阴极层(g)、铂薄膜层(f)及阴极腔室层(e)叠加构成；

所述阳极液入口(3)与阳极液出口(4)为阳极层(a)上两个圆孔通过黏贴有PDMS立体块(9)构成；阴极液入口(5)和阴极液出口(6)为阳极层(a)上另外两个圆孔通过黏贴有PDMS立体块(9)构成；所述PDMS立体块(9)有硅胶导管穿入并与圆孔位置对应；

所述阳极层(a)和阳极腔室层(c)对应贯穿的四个圆孔组成阳极液通道；所述阳极层(a)、阳极腔室层(c)、离子交换膜(d)和阴极腔室层(e)上对应的贯穿的8个圆孔组成阴极液通道；

所述阳极导线(7)通过与阳极碳布层(b)接触并穿过阳极层(a)中椭圆形小孔；所述阴极导线(8)依次通过贯穿于阴极腔室层(e)、离子交换膜(d)、阳极腔室层(c)和阳极层(a)另一侧的椭圆小孔穿出；

所述阳极碳布层(b)采用倒置结构放置，即微生物生长在阳极碳布层下表面；

阳极层(a)含有圆孔(a1)、(a3)、(a4)、(a6)和椭圆小孔(a2)、(a5)，阳极腔室层(c)含有圆孔(c1)、(c3)、(c4)、(c6)和椭圆小孔(c2),离子交换膜(d)含有圆孔(d3)、(d4)和椭圆小孔(d2)，阴极腔室层(e)含有圆孔(e3)、(e6)和椭圆小孔(e2)；

对于阳极室(1)的形成，组装过程中圆孔(a1)与圆孔(c1)对应并通过双面有机硅胶黏贴，组成阳极液入口(3)；圆孔(a4)与圆孔(c4)对应并通过双面有机硅胶黏贴，组成阳极液出口(4)；对于阴极室(2)的形成，圆孔( a3) 与圆孔( c3) 对应并通过双面有机硅胶黏贴，与阴极层(g)中使用双面有机硅胶黏贴之后的圆孔(d3)和圆孔(e3)贯穿对应组成阴极液入口(5)；圆孔(a6)与圆孔(c6)对应并通过双面有机硅胶黏贴，与阴极层(g)中使用双面有机硅胶黏贴之后的圆孔(d6)和圆孔(e6)贯穿对应组成阴极液出口(6)；当阳极腔室层(c)和阴极腔室层(e)层分别作为阳极室(1)和阴极室(2)的通道层，通过镂空的通道结构与各自的上下层叠加组成阳极室(1)和阴极室(2)的腔室结构。

2.根据权利要求1所述的微流控微生物电化学传感器，其特征在于：所述阳极室(1)的有效反应体积为0.72-4.5uL。

3.根据权利要求1所述的微流控微生物电化学传感器，其特征在于：所述阳极腔室层(c)和阴极腔室层(e)的数量为1-5层。

4.根据权利要求1所述的微流控微生物电化学传感器，其特征在于：该微流控微生物电化学传感器制备过程如下：

将1-5层阳极腔室层与离子交换膜上下对齐压实贴合为一个整体；

将阳极层和碳布层叠加，并且在压实之前将阳极导线通过与碳布接触并穿过对应的椭圆小孔，得到完整的阳极室；

将阴极腔室层粘贴到离子交换膜的下层，并且各个孔位置一一对应，通过调整阴极腔室层的数量来调整阴极室的厚度；

将阴极层和阴极材料上下对应粘贴于阴极腔室层下表面，将阴极导线依次通过贯穿于阴极腔室层(e)、离子交换膜(d)、阳极腔室层(c)和阳极层(a) 的椭圆小孔穿出，压实后，整个反应器的组装过程完成；

在反应器组装之前，除了电极材料可以直接用剪刀剪出所需形状外，其余结构层的材料需要按照设计好的图形通过一台操作简单的微加工领域常用的切割绘制机来切割出相应的形状之后，各层之间上下对齐粘合固定。

5.一种如权利要求1-3任一项所述微流控微生物电化学传感器的应用，其特征在于：所述微流控微生物电化学传感器用于构建微流控微生物电化学传感器测试系统；所述微流控微生物电化学传感器测试系统包括微流进样模块、传感器模块、电信号测试模块和数据采集模块。

6.一种如权利要求1-3任一项所述微流控微生物电化学传感器在BOD检测中的应用，其特征在于：检测步骤具体如下：

1)微流控微生物电化学传感器的启动，阳极生物膜的培养

向阳极室引入菌液和培养液，观测电流信号值的变化，电流值先升高后降低至平稳时加入新的培养液，最终峰值稳定后，生物膜培养完成，即传感器启动成功；

2)微流控微生物电化学传感器性能的测试

采用微流控微生物电化学传感器测试系统，阳极室和阴极室中依次同时加入不同浓度的待测溶液和阴极液，从样品注入开始记录时间，直到新的峰值出现为响应时间；将BOD值作为横坐标，电流值和响应时间作为两个纵坐标得出电流值和BOD之间成线性关系；所述阳极液和阴极液保持同步同流速进样。

7.根据权利要求6所述的微流控微生物电化学传感器在BOD检测中的应用，其特征在于：所述BOD的检测范围为20-450mg/L，响应时间为1-5min。

8.根据权利要求6所述的微流控微生物电化学传感器在BOD检测中的应用，其特征在于：所述测试采用序批模式或连续流模式。

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