CN104267073A - 纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,先制作纸基微流控芯片,再利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性,基于微生物呼吸链-对BQ体系电化学检测原理,在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上,采用小片纤维素膜导通亲水微通道上的疏水阀来控制液流释放和流动时间,实现培养液与细胞分离、清洗和污染物孵育细胞等环节,从而降低在采用电流信号检测装置的阳极电流定量测定污染物毒性时的干扰,具有质量轻、便携、低成本、一次性分析、所需样品的体积小、分析速度快,适用于偏远地区、野外现场水污染、土壤污染、食品安全以及空间搭载等场合的生物毒性检测。
Description
技术领域
本发明涉及微流控分析应用于微生物检测污染毒性技术领域,特别涉及纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法。
背景技术
微流控芯片作为从九十年代提出的微全分析系统的核心技术,是当前发展最迅速的领域之一,而纸质微流控芯片是近期发展起来的一种新的微流控芯片形式。纸基微流控以色谱纸作为芯片材料,使用光刻、等离子体氧化、喷墨印刷、蜡印刷和打印PDMS等技术制作而成(Xu Li,et al.,2012,6,1932-1058)。以试纸和侧向流动的应用为特征的纸基微流控芯片,由于其便携、批量印刷、制备工艺简单、无需复杂外围设备、可一次性使用、低成本、样品和试剂用量小、分析速度快和同时检测多种成份等优点,可以促使在家庭、资源匮乏的偏远地区、野外现场以及空间飞行器等场合使用,当然也就适合在消费市场迅速普及(Ali Kemal Yetisen,et al.,Lab Chip,2013,13,2210-2251)。多种类型和广泛的应用场合使纸基微流控芯片在化学、生物、医学、环境保护和空间生命科学等领域有着广阔发展前景。
用微生物测定样品溶液毒性试验是基于微生物的光学性质(如发光细菌)、呼吸链活性(如氧化还原介质O2和BQ等)或毒物诱导微生物形态变化等类型的基本原理。就以细菌呼吸链活性测量污染物毒 性而言,2008年Wang等用冻干大肠杆菌的生物传感器经复苏并加入氧化还原介质BQ后,用CellSense软件记录传感器电流(Hong Wang,et al.,Chinese Chemical Letters,2008,19,211-214),成为申请人所见到的最初采用氧化还原介质BQ反映污染物影响大肠杆菌呼吸链活性的电化学方法。Li等采用明胶包埋大肠杆菌细胞于玻碳电极表面,仍以BQ作为氧化还原介质测定了混合重金属离子溶液的生物毒性(Jiuming Li,et al.,Electrochimica Acta,2013,97,52-57)。Yu等仍采用BQ作为氧化还原介质并与污染物孵育大肠杆菌后,用微玻碳阵列电极测定反映重金属离子毒性的阳极电流(Dengbin Yu,et al.,Analyst,2013,138,3297-3302)。上述三篇Wang、Li和Yu的文献,都是基于污染物影响微生物呼吸链活性原理,用电化学方法通过氧化还原介质BQ检测污染物毒性。但是,它们都没有将样品预处理和电化学检测两类不同的操作单元集成在一个微流控芯片(特别是廉价可以批量印刷的纸基微流控芯片)上。实现这类原理方法的检测过程还涉及细菌悬浮液离心和细胞清洗等步骤和相应外围设备(超声震荡器、离心机和电化学工作站等)。因此,若能够在纸基微流控芯片上实现样品预处理和电化学检测两个单元的恰当集成,全面地减少污染物的生物毒性检测成本,显著减少试剂用量和操作时间,大幅降低操作难度,这对基于这类原理检测污染物生物毒性在多个领域的应用,具有重要的现实意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供纸基微流 控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,基于微生物呼吸链-对BQ体系电化学检测原理,在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上,采用小片纤维素膜导通亲水微通道上的疏水阀来控制液流释放和流动时间,实现培养液与细胞分离、清洗和污染物孵育细胞等环节,从而降低在采用电流信号检测装置的阳极电流定量测定污染物毒性时的干扰,克服了传统方法的缺陷,具有质量轻、便携、低成本、一次性分析、所需样品的体积小、分析速度快,适用于偏远地区、野外现场水污染、土壤污染、食品安全以及空间搭载等场合的生物毒性检测,从而为在环境保护、生命科学、医学和生物化学等领域的生物毒性测定提供了一种新类型设备和新方法。
为了达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,包括如下步骤,
步骤一、先制作纸基微流控芯片
(1.1)、先用绘图软件设计包含对电极4、工作电极5和参比电极6的三电极,将三电极加工成第一网板21,在色谱纸22正面用碳浆丝网印刷,烘箱中150℃烘1小时,得到包含三电极的色谱纸;
(1.2)、再用绘图软件设计包括五个微通道和进样区3,五个微通道为上微通道13、下微通道15、左微通道14、右第一微通道12、右第二微通道11,以及与右第二微通道11连通的电化学检测区7、与上微通道13连通的A废液区8、与左微通道14连通的B废液区9、与下微通道15连通的C废液区10的微流控芯片构型,将微流控芯 片构型加工成第二网板23,在包含三电极的色谱纸的背面对应位置用聚二甲基硅氧烷PDMS与正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷,PDMS与TEOS液态胶混合物质量比8:1,保证三电极对应在电化学检测区7,烘箱中75℃烘1小时;
(1.3)、在色谱纸正面的A废液区8、B废液区9和C废液区10以及电化学检测区7分别粘贴与对应区域尺寸相同的吸收垫;
(1.4)、再在步骤1.3所得的色谱纸的背面粘贴硬质纸质底片2,得到纸基微流控芯片,将纸基微流控芯片加固、平整,用高密度打孔机沿纸基微流控芯片上的虚线MN加工虚线划痕20,加工虚线划痕20将纸基微流控芯片三个废液区8、9、10所在的A区和电化学检测区7所在的B区分开,以便在完成细胞样品预处理后使A区和B区容易分离;
步骤二、利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性
(2.1)、在上述纸基微流控芯片的进样区3滴加培养12小时的含有大肠杆菌混合液,用与左疏水阀18尺寸相同的纤维素膜导通亲水左微通道14上的左疏水阀18,使得左微通道14与进样区3相连通,使培养液沿左微通道14与大肠杆菌细胞分离;
(2.2)、用与上疏水阀17和下疏水阀19尺寸相同的纤维素膜导通亲水上微通道13和下微通道15上的上疏水阀17和下疏水阀19,在上述包含大肠杆菌的纸基微流控芯片进样区3滴加中性磷酸盐缓冲液清洗大肠杆菌两次,使两次清洗废液依次沿上微通道13和下微通道15与大肠杆菌细胞分离;
(2.3)、再在进样区3滴加混合液,混合液为浓度1.25mM的苯醌溶液与已知浓度的重金属离子溶液以及中性磷酸盐缓冲液,三者体积比为5:1:4,并37℃孵育60分钟反应,再用纤维素膜导通亲水右第一微通道12上的右疏水阀16,使反应后含氢醌成分的混合液经过亲水右第一微通道12和右第二微通道11与细胞分离进入连通三电极的电化学检测区7;
(2.4)、沿纸基微流控芯片上的虚线MN使B区与A区分离,把B区的三电极连接到外部设备电流信号检测装置,记录阳极电流,根据电流计算呼吸链活性抑制比:
式中i和i0分别表示水污染物存在与不存在时所记录的电流。
所述的大肠杆菌混合液中的大肠杆菌能够用酵母菌、亚硝化单胞菌以及它们的混合菌替代。
在毒性污染物的存在下,微生物的呼吸活性被抑制,所以更少的电子可以被转移到苯醌,因此氢醌氧化减少,测得的电流减少,而呼吸链抑制比就增大。因此,在该测试区间内Cu2+浓度越大,电流值越小,抑制比越大。
本发明具有下列优点,
1)本发明通过设计加工纸基微流控芯片样品预处理单元(A区),改进了现有电化学检测样品预处理步骤(细胞离心、清洗和孵育等),减少了对离心机和超声震荡器等设备的依赖。不仅减少了试剂和样品用量,也减少了设备或制作成本,简化了样品预处理操作步骤;
2)本发明通过微通道把电化学检测单元(B区)与样品预处理单元(A区)集成在同一个纸基微流控芯片上,当样品预处理完成后使B区与A区分离,弃去A区芯片,只将B区芯片插入微型弱电信号装置(代替电化学工作站)记录阳极电流,实现样品预处理纸基微流控芯片和电化学检测装置的一体化和便携化。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为本发明阳极电流-细菌呼吸链活性检测水污染物生物毒性的纸基微流控芯片总装示意图。
图2为本发明用于细菌呼吸链活性检测水污染物生物毒性的纸基微流控-电化学三电极芯片加工流程图。
图3为本发明用纸基微流控-电化学三电极芯片检测水污染物生物毒性的主要步骤示意图。
图4为本发明用自制纸基微流控芯片检测水污染物生物毒性获得不同Cu2+浓度下氢醌阳极电流响应及其细菌呼吸链活性抑制比曲线。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做详细叙述。
纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,包括如下步骤,
步骤一、先制作纸基微流控芯片,制作步骤参照图2,最终所得芯片结构参照图1,
(1.1)、先用CorelDRAW 9绘图软件设计包含对电极4、工作电极5和参比电极6的三电极,将三电极加工成200目第一网板21,在Whatman 1号色谱纸22正面用碳浆(Henkel)丝网印刷,烘箱中150℃烘1小时;得到包含三电极的色谱纸;
(1.2)、再用绘图软件设计包括五个微通道和进样区3,五个微通道为上微通道13、下微通道15、左微通道14、右第一微通道12、右第二微通道11,以及与右第二微通道11连通的电化学检测区7、与上微通道13连通的A废液区8、与左微通道14连通的B废液区9、与下微通道15连通的C废液区10的微流控芯片构型,将微流控芯片构型加工成250目第二网板23,在包含三电极的色谱纸的背面对应位置用聚二甲基硅氧烷PDMS与正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷,PDMS与TEOS液态胶混合物质量比8:1,保证三电极对应在电化学检测区7,烘箱中75℃烘1小时;
(1.3)、在色谱纸正面的A废液区8、B废液区9和C废液区10以及电化学检测区7分别粘贴与对应区域尺寸相同的吸收垫(Ge3MM);
(1.4)、再在步骤1.3所得的色谱纸的背面粘贴硬质纸质底片(2),得到纸基微流控芯片,将纸基微流控芯片加固、平整,用高密度打孔机沿纸基微流控芯片上的虚线MN加工虚线划痕20,加工虚线划痕20将纸基微流控芯片三个废液区8、9、10所在的A区和电 化学检测区7所在的B区分开,以便在完成细胞样品预处理后使A区和B区容易分离;
步骤二、利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性,参照图3,
(2.1)、在上述纸基微流控芯片的进样区3滴加100μL培养12小时的OD600=16的大肠杆菌混合液,用与左疏水阀18尺寸相同的纤维素膜(Ge)导通亲水左微通道14上的左疏水阀18,使得左微通道14与进样区3相连通,使培养液沿左微通道14与大肠杆菌细胞分离;
(2.2)、用与上疏水阀17和下疏水阀19尺寸相同的纤维素膜导通亲水上微通道13和下微通道15上的上疏水阀17和下疏水阀19,在上述包含大肠杆菌的纸基微流控芯片进样区3滴加(pH=7.0)磷酸盐缓冲液清洗大肠杆菌两次,每次100μL,使两次清洗废液依次沿上微通道13和下微通道15与大肠杆菌细胞分离;不限于大肠杆菌,还可以是酵母菌、亚硝化单胞菌以及它们的混合菌代替;
(2.3)、再在进样区3滴加混合液100μL,混合液为浓度1.25mM的苯醌溶液与已知浓度的Cu2+溶液以及中性磷酸盐缓冲液,三者体积比为5:1:4,Cu2+溶液浓度分别为0、20、40、250和500μM,并37℃孵育60分钟反应,再用纤维素膜导通亲水右第一微通道12上的右疏水阀16,使反应后含氢醌成分的混合液经过亲水右第一微通道12和右第二微通道11与细胞分离进入连通三电极的电化学检测区7;
(2.4)、沿纸基微流控芯片上的虚线MN使B区与A区分离,把B区的三电极连接到外部设备电流信号检测装置,电流信号检测装置是一个自带接触式弱电信号检测区即芯片插孔、电化学软件和显示屏 的微型电化学工作站,记录阳极电流,根据电流计算呼吸链活性抑制比:
式中i和i0分别表示水污染物存在与不存在时所记录的电流。
本实施例结果分析。用不同浓度Cu2+溶液分别与苯醌BQ孵育大肠杆菌后,弱电信号显示装置记录的氢醌HQ阳极电流(μA)随时间(s)的变化曲线,如图4所示,曲线1、2、3、4和5分别对应孵育溶液Cu2+浓度为0、20、40、250和500μM。在该纸基微流控芯片上进行大肠杆菌与培养液分离、细胞清洗及孵育60分钟操作完成后,含有HQ等成分的溶液沿微通道充满电化学检测区的吸收垫7后开始计时(0s),以稳定电流值(如900s时)计算细菌呼吸链活性抑制比。其中细菌呼吸链活性抑制比按Li和Yu等(Jiuming Li,et al.,Electrochimica Acta,2013,97,52-57;Dengbin Yu,et al.,Analyst,2013,138,3297-3302)文献中的定义,
式中i和i0分别表示水污染物存在与不存在时所记录的电流。在毒性污染物的存在下,微生物的呼吸活性被抑制,所以更少的电子可以被转移到BQ,因此HQ氧化减少,测得的电流减少,而呼吸链抑制比就增大。因此,在该测试区间内Cu2+浓度越大,电流值越小,抑制比越大。
Claims (2)
1.纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,其特征在于,包括如下步骤,
步骤一、先制作纸基微流控芯片
(1.1)、先用绘图软件设计包含对电极(4)、工作电极(5)和参比电极(6)的三电极,将三电极加工成第一网板(21),在色谱纸(22)正面用碳浆丝网印刷,烘箱中150℃烘1小时;得到包含三电极的色谱纸;
(1.2)、再用绘图软件设计包括五个微通道和进样区(3),五个微通道为上微通道(13)、下微通道(15)、左微通道(14)、右第一微通道(12)、右第二微通道(11),以及与右第二微通道(11)连通的电化学检测区(7)、与上微通道(13)连通的A废液区(8)、与左微通道(14)连通的B废液区(9)、与下微通道(15)连通的C废液区(10)的微流控芯片构型,将微流控芯片构型加工成第二网板(23),在包含三电极的色谱纸的背面对应位置用聚二甲基硅氧烷PDMS与正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷,PDMS与TEOS液态胶混合物质量比8:1,保证三电极对应在电化学检测区(7),烘箱中75℃烘1小时;
(1.3)、在色谱纸正面的A废液区(8)、B废液区(9)和C废液区(10)以及电化学检测区(7)分别粘贴与对应区域尺寸相同的吸收垫;
(1.4)、再在步骤1.3所得的色谱纸的背面粘贴硬质纸质底片(2),得到纸基微流控芯片,将纸基微流控芯片加固、平整,用高密度打孔机沿纸基微流控芯片上的虚线MN加工虚线划痕(20),加工虚线划痕(20)将纸基微流控芯片三个废液区(8、9、10)所在的A区和电化学检测区(7)所在的B区分开,以便在完成细胞样品预处理后使A区和B区容易分离;
步骤二、利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性
(2.1)、在上述纸基微流控芯片的进样区(3)滴加培养12小时的含有大肠杆菌混合液,用与左疏水阀(18)尺寸相同的纤维素膜导通亲水左微通道(14)上的左疏水阀(18),使得左微通道(14)与进样区(3)相连通,使培养液沿左微通道(14)与大肠杆菌细胞分离;
(2.2)、用与上疏水阀(17)和下疏水阀(19)尺寸相同的纤维素膜导通亲水上微通道(13)和下微通道(15)上的上疏水阀(17)和下疏水阀(19),在上述包含大肠杆菌的纸基微流控芯片进样区(3)滴加中性磷酸盐缓冲液清洗大肠杆菌两次,使两次清洗废液依次沿上微通道(13)和下微通道(15)与大肠杆菌细胞分离;
(2.3)、再在进样区(3)滴加混合液,混合液为浓度1.25mM的苯醌溶液与已知浓度的重金属离子溶液以及中性磷酸盐缓冲液,三者体积比为5:1:4,并37℃孵育60分钟反应,再用纤维素膜导通亲水右第一微通道(12)上的右疏水阀(16),使反应后含氢醌成分的混合液经过亲水右第一微通道(12)和右第二微通道(11)与细胞分离进入连通三电极的电化学检测区(7);
(2.4)、沿纸基微流控芯片上的虚线MN使B区与A区分离,把B区的三电极连接到外部设备电流信号检测装置,记录阳极电流,根据电流计算呼吸链活性抑制比:
式中i和i0分别表示水污染物存在与不存在时所记录的电流。
2.根据权利要求1所述的纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法,其特征在于,所述的大肠杆菌混合液中的大肠杆菌能够用酵母菌、亚硝化单胞菌以及它们的混合菌替代。
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