CN104931551B - 筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，先在纸上印刷多个微流控单元，以及细菌呼吸电化学测量的碳浆三电极阵列等单元，形成两类阵列对偶的纸基微室共同培养和活性筛选功能单元，在色谱纸上采用丝网印刷依次套印碳浆电极、PDMS的通道和微培养室等，进一步在无菌环境下印刷模型细菌阵列单元；再利用样本细菌‑模型细菌的对偶微室共同培养阵列单元以及样本细菌的次生代谢物对相邻模型细菌呼吸链的抑制，用与对偶微室相伴印刷的碳浆三电极发现某个活性样本细菌菌落的位置；最后用纸基2‑维电泳分离活性样本细菌的次生代谢产物，再用阵列碳浆三电极发现经2‑维电泳分离的活性成份的位置；本发明适用多领域的活性细菌和活性复杂成份筛选。
Description
技术领域
本发明涉及活性细菌的微生物筛选和进一步的活性成份筛选，特别涉及筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，主要是一种在纸上丝网套印包括样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养、分离成份部位-模型细菌的对偶微室、2-维电泳以及细菌呼吸电化学测量阵列等单元的纸基2-维电泳微流控芯片。
背景技术
1928年Alexander Fleming发现青霉素和抑菌环(A.Fleming,1929,12,226-236)。12年后弗洛里和钱恩分离得到第一个临床应用抗生素---青霉素。Lewis(K.Lewis,2012,485,439-440)指出，在抗生素发现黄金时代(40～60年代)大多数抗生素从土壤源放线菌中被筛选出来，但该法收益递减，20年后这类方法和平台却不灵了，随后从合成化合物筛选，也因多数缺乏透过细菌包膜能力也努力失败。他强调思考抗菌发现的黄金时代，不要放弃过去成功的筛选土壤细菌的方法。
当前在环境污染抗性细菌普遍出现和繁衍的情况下，唯有采用现代先进技术才能保持我们期望的抗菌素耐药和新药发现的平衡，从而使往日成功得以复制。Kaeberlein等设计了一个模拟海洋沉积物在0.03μm孔径聚碳酸酯膜间形成微生物扩散生长室，来孵育不可培养的(野生)海洋微生物的自然生长(T.Kaeberlein et al.,2002,296,1127-1129)。Nichols(D.Nichols et al.,2010,76,2445-2450)等使用一种新型隔离芯片，原位地、高通量地从不同环境中分离、并培养了‘野生’微生物物种。这种芯片包含数百个可接种单个细胞的微扩散室，形成庞大且多样的阵列排布，能够发现先前难以培养的微生物。Huacca等采用聚二甲基硅氧烷PDMS喷墨打印纸基便携装置来培养细菌(M.F.Huacca et al.,2012,12,4269-4278)。但是，这些芯片都没有包含阵列样本细菌-模型细菌对偶微室这样的活性细菌筛选单元，也不涉及活性细菌的次生代谢产物经过2-维分离后的阵列活性成份筛选单元。
目前，复杂抗生素样品(如细菌次级代谢物)通常采用毛细管电泳-质谱(P.I.Koczka et al.,2014,35,2534-2537)或液相色谱-质谱(M.Gbylik-Sikorska etal.,2015,119,8-15)分离检测；微流控芯片包括纸基微流控芯片(E.K.Sackmann et al.,2014,507,181-189)包含自动进样、样品预处理等多个功能也被广泛应用于复杂样品(如活性细菌次级代谢产物)的分离和检测；Shameli等基于2-维微流控芯片分离蛋白质并采用荧光标记蛋白进行检测(S.M.Shameli et al.,2015,87,3593-3597)。2007年Martinez等提出光刻法实现复杂图案的亲水区域和通道，并利用纸基自动虹吸输液的纸基微流控芯片(A.W.Martinez et al.,2007,46,1318-1320)。其实，Gross早在1959就采用2-维纸基平板电泳分离和苦味酸色包含至少27种氨基酸和酰胺的复杂生物样品(DR.D.Gross,1959,184,1298-1301)。上述文献说明，2-维纸基平板电泳特别是具有相间电泳通道(有降低焦耳热的优点)的2-维垂直通道的纸基电泳芯片应该具有强大的分离复杂生物样品(如活性细菌次级代谢产物)的能力，但通过质谱、荧光标记蛋白或苦味酸染色检测等都不能直接地(原位地)筛选成份的活性。
纸基电化学传感器作为测向流动和微流控装置，其便宜、快速、灵活和容易使用在及时检测中得到越来越多的应用(B.W.Liu et al.,2014,26,1214-1223)。Wang等把大肠杆菌固定到普通碳电极，通过氢醌阳极电流指示毒物影响细菌呼吸程度(H.Wang et al.,2008,19,211-214)；Yu等在重金属毒物和苯醌溶液环境孵育大肠杆菌，用铂微电极工作电极-饱和KCl溶液Ag/AgCl参比电极-铂丝对电极反映毒物毒性的氢醌阳极电流(D.B.Yu etal.,2013,138,3297-3302)。
申请号为201410392974.9的中国发明专利，公开了一种纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，该方法基于微生物呼吸链-对氢醌体系电化学检测原理，在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上，但是该专利不能用于筛选土壤活性细菌和成份，因此，必须发展高自动化程度、高通量、低成本、全程一体化的微流控平台技术，才能实现在污染抗性环境下土壤细菌新抗菌素的有效地筛选。
发明内容
针对污染土壤抗生素活性细菌和活性抗生素组份获取的难度大、概率低、费时费力的缺陷，本发明的目的在于提供一种筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，通过在色谱纸上多次套印细菌-明胶阵列培养、PDMS 2-维电泳、碳浆电泳电极和电化学三电极阵列单元得到纸基微流控芯片，再利用阵列对偶的样本细菌-模型细菌纸基微室共同培养筛选土壤样本抗生素活性细菌，再在利用2-维垂直通道的纸基电泳以及均匀分布在纸基2-维平面的分离成份部位-模型细菌的阵列微室，来原位地捕获或发现2-维分离的活性成份。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备，包括如下步骤：
步骤一、设计多功能纸基微流控芯片
(1.1)、设计第一维的等电聚焦电泳IEF分离通道2，该通道与左侧缓冲液池3和右侧缓冲液池4相连，在该通道左侧缓冲液池3的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26相连，再在该通道右侧缓冲液池4的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26相连，并在该通道的左侧设计碳浆(+)电极5和右侧设计碳浆(-)电极6；
(1.2)、设计纸基阵列活性细菌筛选功能单元1，该阵列功能单元紧邻IEF分离通道2上方，并沿该通道紧密地阵列分布；
(1.3)、设计第二维的竖直、平行且间隔、阵列的毛细管区带电泳CZE分离通道7，该阵列通道位于第一维IEF分离通道2的下方，而且垂直并连接IEF分离通道2的不同位置，平行阵列CZE分离通道7的上方共用碳浆(+)电极8和下方的共用碳浆(-)电极9，在每个CZE通道7上方与IEF分离通道2垂直连接的纸基背面各个位置C1+，C2+，...处设计进样纸条25，进样纸条25并与缓冲液26相连，作为该阵列CZE的(+)极缓冲液池；同理，在CZE通道下方的纸基背面各个位置C1-，C2-，...处也设计进样纸条25并与同样缓冲液26相连，作为该阵列CZE的(-)极缓冲液池10，以保证不同位置的已完成IEF第一维分离的活性细菌次生代谢物成份迅速进入邻近的相应CZE通道7，开始CZE第二维分离；
(1.4)、设计纸基阵列活性成份筛选单元11，该功能单元是沿各阵列CZE分离通道7左侧最大紧密地阵列均匀排布的，在完成CZE活性细菌次生代谢产物第二维分离后，在2-维分离和模型细菌纸基层I的下层另外加一层模型细菌纸基层II，使得独立阵列模型细菌培养室15阵列分布于CZE分离通道7正下方，并通过紧密接触使对应位置的活性成份筛选单元11与CZE分离通道7导通，保证CZE分离通道7经2-维分离的、各个位置的次生代谢产物成份独立地扩散到其邻近的各个阵列活性成份筛选单元11里面；
(1.5)、设计最下层的培养基-阵列电极纸基层III，该纸基层III包含着独立阵列的培养基供给单元，每个供给单元包括了直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13，以及处于纸基层I的模型细菌培养室14和纸基层II独立阵列模型细菌培养室15的碳浆三电极结构单元16，浆三电极结构单元16与其上层的阵列活性细菌筛选功能单元1的位置相对应；
步骤二、制作多功能纸基微流控芯片
(2.1)、丝网印刷碳浆电泳电极、PDMS活性细菌筛选功能单元、2-维分离通道和模型细菌，依据步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作左侧碳浆+电极5、右侧设计碳浆-电极6和上方共用碳浆+电极8、下方共用碳浆-电极9的丝网印刷网板A，在第一层色谱纸的正面丝网印刷这四个碳浆电泳电极，150℃烘1小时；再依据步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作阵列活性细菌筛选功能单元1中的模型细菌培养室14和样本细菌培养室17、IEF分离通道2、左侧缓冲液池3、右侧缓冲液池4、CZE分离通道7和CZE的-极缓冲液池10的网板B，再在第一层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷，形成第一层色谱纸上包含正面的碳浆电泳电极、背面的细菌培养室和2-维分离通道层的结构，灭菌处理；再制作阵列活性细菌筛选功能单元1中的模型细菌培养室14构型的网板C，再在模型细菌培养室14内，在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第一层的2-维分离和模型细菌纸基层I；
(2.2)、活性成份筛选功能单元的PDMS结构和模型细菌的丝网印刷，依据步骤(1.4)的设计制作阵列活性成分筛选功能单元11的构型的丝网印刷网板D，在第二层色谱纸用质量比8:1的PDMS和TEOS液态胶混合物丝网印刷，得到包含活性成份筛选功能单元11中的阵列模型细菌培养室15的色谱纸，并灭菌处理；再在该阵列模型细菌培养室15内，进一步在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第二层的模型细菌纸基层II；
(2.3)、阵列碳浆三电极的碳浆丝网印刷，依据步骤(1.5)设计的碳浆三电极结构单元16，先制作活性细菌筛选功能单元1和活性成份筛选单元11中的所有阵列三电极结构16丝网印刷的网板E，再在第三层色谱纸的正面上进行碳浆丝网印刷，150℃烘1小时，得到处于最下层的阵列碳浆三电极色谱纸，碳浆三电极结构单元16包含对电极18、工作电极19和参比电极20；
(2.4)、培养基供给单元的PDMS丝网印刷，先制作包含直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13的培养基供给单元21结构的丝网印刷网板F，再在第三层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS与TEOS液态胶混合物丝网印刷，75℃烘1小时，形成培养基供给单元21，培养基供给单元21和阵列碳浆三电极结构单元16共同构成了第三层的培养基-阵列电极纸基层III，并灭菌处理；
(2.5)、依次按照对应位置从上至下第一层I、第二层II和第三层III叠放印刷有上述结构的色谱纸，进而构成了多功能纸基微流控芯片的核心结构IV；
步骤三、形成具有土壤细菌原位培养、活性土壤菌筛选、次生代谢物2-维电泳分离和活性成份筛选多功能单元的完整纸基微流控芯片V：
(3.1)、将不同地点的土壤进行编号，用经灭菌的0.2μm聚碳酸酯膜覆盖包裹，滴加一定量培养基溶液使得土壤潮湿，形成聚碳酸酯膜封装的土样22，该过程在无菌一定湿度的环境下操作，作为样本菌的来源；
(3.2)、将聚碳酸酯膜封装的土样22放置在多功能纸基微流控芯片的核心结构IV上，使土样22位于样本细菌培养室17的上方，再用0.03μm聚碳酸酯膜23来包裹土样22和多功能纸基微流控芯片的核心结构IV表面，得到多功能纸基微流控芯片。
基于上述制备所得筛选土壤活性细菌和成份的多功能纸基微流控芯片的应用，用多功能纸基微流控芯片进行活性细菌筛选、次生代谢产物的2-维电泳分离以及活性成份的筛选，包括以下步骤：
(1)、活性细菌筛选单元中模型细菌和样本细菌的培养基供给，通过泵或纸基自动虹吸液体培养基沿直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13，来培养模型细菌和样本细菌，其中样本细菌应与聚碳酸酯膜封装土样22湿润接触；
(2)、样本细菌的获取，以及样本细菌与模型细菌扩大培养，聚碳酸酯膜封装土样22与样本细菌培养室17进行湿润接触，土壤样本细菌由0.2μm微孔进入样本细菌培养室17，样本细菌再进行进一步扩大培养，获取较大量的样本细菌及其次生代谢产物，同时，模型细菌菌落也在其培养室14内生长，从而形成样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养阵列单元，在该扩大培养的过程中，样本菌落的次生代谢产物逐步扩散穿过两个培养室14和17之间的亲水区域24，进而与模型细菌菌落作用而抑制其呼吸或生长；
(3)、阵列纸基微流控芯片生物毒性阳极电流检测筛选土壤活性菌，通过机器人或人工阵列同时滴加苯醌(BQ)于阵列模型细菌培养室14，导通阵列碳浆三电极16，以单电位阶跃计时电流法同时检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的土壤活性细菌；
(4)、土壤活性细菌的活性次生代谢产物进入第一维的IEF分离通道，实现IEF分离，将筛选出的土壤活性菌落位置的分布于纸基上次生代谢物产物剪切折叠，并置于第一维的IEF分离通道2中间位置，通过位于(+)极缓冲液池3和(-)极缓冲液池4背面的进样纸条25分别插入盛有不同pH缓冲液26的小容器27，不同pH的缓冲液26包括pH 3.0磷酸盐和pH10.0磷酸盐，并在左侧碳浆+电极5、右侧设计碳浆-电极6加合适电压，完成土壤活性细菌分泌的次生代谢物产物的第一维IEF分离；
(5)、活性次生代谢产物的第二维分离，经第一维IEF分离后，把C1+，C2+，...，和C1-，C2-，...，多组对应的进样纸条25插入盛有缓冲液26的小容器27，在上方共用碳浆+电极8、下方共用碳浆-电极9加电压，进行次生代谢物产物的第二维CZE分离；缓冲液26包括pH 3.0磷酸盐；
(6)、用纸基阵列生物传感器原位筛选2-维电泳分离的活性成份，经第二维CZE分离后，使模型细菌纸基层II与包含碳浆电泳电极、2-维分离通道和模型细菌纸基层I紧密接触，使纸基层II上的阵列模型细菌培养室15与纸基层I上对应的阵列CZE分离通道7完全吻合，通过机器人或人工阵列同时滴加BQ于阵列模型细菌培养室15，依次瞬间间隔导通阵列碳浆三电极16，仍以单电位阶跃计时电流法同时原位地检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的活性成份。
本发明具有下列优点：
1)本发明的优势在于丝网印刷使细菌-明胶阵列培养、PDMS 2-维电泳通道、碳浆电泳电极和碳浆三电极阵列等复杂多功能单元，以极低成本在多层纸基微流控装置上得以实现。
2)采用样本细菌-模型细菌阵列对偶的纸基微室共培养替代培养皿溶菌环，大大提高了土壤活性细菌的筛选通量、极大地节约了培养时间、减少了培养基消耗。
3)设计加工丝网印刷包含垂直于第一维的IEF分离通道的阵列间隔的第二维CZE平行通道，实现复杂生物样品活性成份的纸基IEF-CZE 2-维分离。
4)设计加工丝网印刷了成份部位-模型细菌对偶阵纸基层，用于完成纸基2-维分离成份的直接原位活性成份筛选，这类方法扩展现有2-维分离成份分析如染色、质谱等检测方法。
5)设计加工丝网印刷的阵列模型细菌纸基微室中的原位微电化学生物毒性检测，非常有利于多日细菌培养等待条件下发现活性细菌或有效成份的发现或筛选。
附图说明
图1为本发明用于筛选土壤活性细菌和成份的多功能纸基微流控芯片总装示意图。
图2A为本发明不同结构的多层色谱纸集成为2-维电泳微流控芯片的核心结构的集成示意图。
图2B为本发明2-维分离和模型细菌纸基层I结构示意图。
图2C为本发明的模型细菌纸基层II结构示意图。
图2D为本发明的培养基-阵列电极纸基层III结构示意图。
图3A为本发明阵列活性细菌筛选功能单元1的剖面图。
图3B为本发明阵列活性细菌筛选功能单元1的正视图。
图4为本发明设计的进样纸条与缓冲液相连的示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做详细叙述。
筛选土壤活性细菌和成份的多功能纸基微流控芯片，其制备包括如下步骤：
步骤一、设计多功能纸基微流控芯片，芯片结构参照图1—图4所示，
(1.1)、先用CorelDRAW 9绘图软件设计第一维的等电聚焦电泳(IEF)分离通道2，该通道与左侧缓冲液池3和右侧缓冲液池4相连，在该通道左侧缓冲液池3的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26(如pH 3.0磷酸盐)相连，再在该通道右侧缓冲液池4的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26相连，并在该通道的左侧设计碳浆(+)电极5和右侧设计碳浆(-)电极6；
(1.2)、设计纸基阵列活性细菌筛选功能单元1，该阵列功能单元紧邻IEF分离通道2上方，并沿该通道紧密地阵列分布，一旦其中某个位置的活性细菌筛选功能单元的土壤活性菌落被发现，其次级代谢产物将被进一步冲入第一维IEF分离通道2或进一步扩大培养该活性细菌；结构示意见图3A和图3B；
(1.3)、设计第二维的竖直、平行且间隔、阵列的毛细管区带电泳(CZE)分离通道7，该阵列通道位于第一维IEF分离通道2的下方，而且垂直并连接IEF分离通道2的不同位置，平行阵列CZE分离通道7的上方共用碳浆(+)电极8和下方的共用碳浆(-)电极9，在每个CZE通道7上方与IEF通道垂直连接的纸基背面各个位置C1+，C2+，...处设计进样纸条25，进样纸条25并与缓冲液26(如pH 3.0磷酸盐)相连，作为该阵列CZE的(+)极缓冲液池；同理，在CZE通道下方的纸基背面各个位置C1-，C2-，...处也设计进样纸条25并与同样缓冲液26(如pH3.0磷酸盐)相连，作为该阵列CZE的(-)极缓冲液池10，以保证不同位置的已完成IEF第一维分离并分布于不同位置的活性细菌次生代谢物成份迅速进入邻近的相应CZE通道7，开始CZE第二维分离；
(1.4)、设计纸基阵列活性成份筛选单元11，该功能单元是沿各阵列CZE分离通道7左侧最大紧密地阵列均匀排布的，在完成CZE活性细菌次生代谢产物第二维分离后，在2-维分离和模型细菌纸基层I的下层另外加一层模型细菌纸基层II使得独立阵列模型细菌培养室15阵列分布于CZE分离通道7正下方，并通过紧密接触使对应位置的活性成份筛选单元11与CZE分离通道7导通，保证CZE分离通道7经2-维分离的、各个位置的次生代谢产物成份独立地扩散到其邻近的各个阵列活性成份筛选单元11里面，可能的活性成份将被某个位置的功能单元11发现；
(1.5)、设计最下层的培养基-阵列电极纸基层III，该纸基层III包含着独立阵列的培养基供给单元，每个供给单元包括了直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13，以及处于纸基层I的模型细菌培养室14和纸基层II独立阵列模型细菌培养室15的碳浆三电极结构单元16，浆三电极结构单元16与其上层的阵列活性细菌筛选功能单元1的位置相对应；
步骤二、制作多功能纸基微流控芯片，
(2.1)、丝网印刷碳浆电泳电极、PDMS活性细菌筛选功能单元、2-维分离通道和模型细菌，依据步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作左侧碳浆+电极5、右侧设计碳浆-电极6和上方共用碳浆+电极8、下方共用碳浆-电极9的丝网印刷网板A，在第一层Whatman 1号色谱纸的正面用丝网印刷这四个碳浆(Henkel)电泳电极，150℃烘1小时；再依据步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作阵列活性细菌筛选功能单元1中的模型细菌培养室14和样本细菌培养室17、IEF分离通道2、左侧缓冲液池3、右侧缓冲液池4、CZE分离通道7和CZE的-极缓冲液池10的网板B，再在第一层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS和TEOS液态胶混合物丝网印刷，形成第一层色谱纸上包含正面的碳浆电泳电极、背面的细菌培养室和2-维分离通道层的结构，灭菌处理；再制作阵列活性细菌筛选功能单元1中的模型细菌培养室14构型的网板C，再在模型细菌培养室14内，在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第一层的2-维分离和模型细菌纸基层I；结构示意见图2B；
(2.2)、活性成份筛选功能单元的PDMS结构和模型细菌的丝网印刷，依据步骤(1.4)的设计制作阵列活性成分筛选功能单元11的构型的丝网印刷网板D，在第二层Whatman 1号色谱纸质量比8:1的PDMS和TEOS液态胶混合物丝网印刷，得到包含活性成份筛选功能单元11中的阵列模型细菌培养室15的色谱纸，并灭菌处理；再在该阵列模型细菌培养室15内，进一步在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第二层的模型细菌纸基层II；结构示意见图2C；
(2.3)、阵列碳浆三电极的碳浆丝网印刷，依据步骤(1.5)设计的碳浆三电极结构单元16，先制作包含活性细菌1和成份筛选11功能单元中的所有阵列三电极结构16丝网印刷的网板E，再在第三层Whatman 1号色谱纸的正面上进行碳浆丝网印刷，150℃烘1小时，得到处于最下层的阵列碳浆三电极色谱纸，碳浆三电极结构单元16包含对电极18、工作电极19和参比电极20；
(2.4)、培养基供给单元的PDMS丝网印刷，先制作包含直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13的培养基供给单元21结构的丝网印刷网板F，再在第三层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS与TEOS液态胶混合物丝网印刷，75℃烘1小时，形成培养基供给单元21，培养基供给单元21和阵列碳浆三电极结构单元16共同构成了第三层的培养基-阵列电极纸基层III，结构并灭菌处理；示意见图2D；
(2.5)、依次按照对应位置从上至下第一层I、第二层II和第三层III叠放印刷有上述结构的色谱纸，进而构成了多功能纸基微流控芯片的核心结构IV，把印有不同结构的多层色谱纸集成为2-维电泳微流控芯片的核心结构IV，用于直接筛选活性细菌和活性成份；集成顺序见图2A示意图；
步骤三、形成具有土壤细菌原位培养、活性土壤菌筛选、次生代谢物2-维电泳分离和活性成份筛选等多功能单元的完整纸基微流控芯片V，见图1所示；
(3.1)、将不同地点垃圾场、废弃工厂、污水池、医院、沼泽地的土壤分别进行编号①、②、③、④、⑤号，做一定预处理，用经灭菌的0.2μm聚碳酸酯膜覆盖包裹，滴加一定量培养基溶液使得土壤潮湿，形成聚碳酸酯膜封装的土样22，该过程在无菌一定湿度的环境下操作)，作为样本菌的来源；
(3.2)、将聚碳酸酯膜封装的土样22放置在多功能纸基微流控芯片的核心结构IV上，使土样22分别位于五个样本细菌培养室17的上方，再用0.03μm聚碳酸酯膜23来包裹土样22和多功能纸基微流控芯片的核心结构IV表面，以便隔绝空气中杂菌侵入该芯片；
基于上述制备所得筛选土壤活性细菌和成份的多功能纸基微流控芯片的应用，用多功能纸基微流控芯片进行活性细菌筛选、次生代谢产物的2-维电泳分离以及活性成份的筛选，包括以下步骤：
(1)、活性细菌筛选单元中模型细菌和样本细菌的培养基供给，通过泵或纸基自动虹吸M9液体培养基沿直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13，来培养模型细菌和样本细菌，其中样本细菌应与聚碳酸酯膜封装土样22湿润接触，而维持了特有土壤微环境养份；
(2)、样本细菌的获取，以及样本细菌与模型细菌扩大培养，聚碳酸酯膜封装土样22与样本细菌培养室17进行数小时(以细菌种类而定)湿润接触，土壤样本细菌由0.2μm微孔(以细菌种类而定)进入样本细菌培养室17。样本细菌再进行十几个小时(以细菌种类而定)的进一步扩大培养，获取较大量的样本细菌及其次生代谢产物。同时，模型细菌菌落也在其培养室14内生长，从而形成样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养阵列单元，在该扩大培养的过程中，样本菌落的次生代谢产物逐步扩散穿过两个培养室14和17之间的亲水区域24，进而与模型细菌菌落作用而抑制其呼吸或生长；
(3)、阵列纸基微流控芯片生物毒性阳极电流检测筛选土壤活性菌，通过机器人或人工阵列同时滴加100μl BQ于阵列模型细菌培养室14，导通阵列碳浆三电极16，以单电位阶跃计时电流法，同时检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的土壤活性细菌；
(4)、土壤活性细菌的活性次生代谢产物进入第一维的IEF分离通道，实现IEF分离，将筛选出的土壤活性菌落位置的分布于纸基上次生代谢物产物剪切折叠，并置于第一维的IEF分离通道2中间位置，通过位于(+)极缓冲液池3和(-)极缓冲液池4背面的进样纸条25分别插入盛有不同pH的缓冲液pH 3.0磷酸盐26和pH 10.0磷酸盐26的离心管27中，并在左侧碳浆+电极5、右侧设计碳浆-电极6加合适电压，完成土壤活性细菌分泌的次生代谢物产物的第一维IEF分离；进样纸条25与缓冲液26相连的示意如图4所示；
(5)、活性次生代谢产物的第二维分离，经第一维IEF分离后，把C1+，C2+，...，和C1-，C2-，...，等多组对应的进样纸条25插入盛有缓冲液pH 3.0磷酸盐26的离心管27中，在上方共用碳浆+电极8、下方共用碳浆-电极9加合适电压，进行次生代谢物产物的第二维CZE分离；
(6)、用纸基阵列生物传感器原位筛选2-维电泳分离的活性成份，经第二维CZE分离后，使模型细菌纸基层II与包含碳浆电泳电极、2-维分离通道和模型细菌纸基层I紧密接触，使纸基层II上的阵列模型细菌培养室15与纸基层I上对应的阵列CZE分离通道7完全吻合，通过机器人或人工阵列地滴加100μl BQ于阵列模型细菌培养室15，依次瞬间间隔导通阵列碳浆三电极16，仍以单电位阶跃计时电流法，同时原位地检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的活性成份。
Claims (2)
1.筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、设计多功能纸基微流控芯片
(1.1)、设计第一维的等电聚焦电泳IEF分离通道(2)，该通道与左侧缓冲液池(3)和右侧缓冲液池(4)相连，在该通道左侧缓冲液池(3)的纸基背面设计进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，再在该通道右侧缓冲液池(4)的纸基背面设计进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，并在该通道的左侧设计碳浆+电极(5)和右侧设计碳浆-电极(6)；
(1.2)、设计纸基阵列活性细菌筛选功能单元(1)，该阵列功能单元紧邻IEF分离通道(2)上方，并沿该通道紧密地阵列分布；
(1.3)、设计第二维的竖直、平行且间隔、阵列的毛细管区带电泳CZE分离通道(7)，该阵列通道位于第一维IEF分离通道(2)的下方，而且垂直并连接IEF分离通道(2)的不同位置，平行阵列CZE分离通道(7)的上方共用碳浆+电极(8)和下方的共用碳浆-电极(9)，在每个CZE分离通道(7)上方与IEF分离通道(2)垂直连接的纸基背面各个位置C1+，C2+，...处设计进样纸条(25)，进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，作为该阵列CZE的+极缓冲液池；同理，在CZE分离通道(7)道下方的纸基背面各个位置C1-，C2-，...处也设计进样纸条(25)并与同样缓冲液(26)相连，作为该阵列CZE的-极缓冲液池(10)，以保证不同位置的已完成IEF第一维分离的活性细菌次生代谢物成份迅速进入邻近的相应CZE分离通道(7)，开始CZE第二维分离；
(1.4)、设计纸基阵列活性成份筛选单元(11)，该功能单元是沿各阵列CZE分离通道(7)左侧最大紧密地阵列均匀排布的，在完成CZE活性细菌次生代谢产物第二维分离后，在2-维分离和模型细菌纸基层I的下层另外加一层模型细菌纸基层II，使得独立阵列模型细菌培养室(15)阵列分布于CZE分离通道(7)正下方，并通过紧密接触使对应位置的阵列活性成份筛选单元(11)与CZE分离通道(7)导通，保证CZE分离通道(7)经2-维分离的、各个位置的次生代谢产物成份独立地扩散到其邻近的各个阵列活性成份筛选单元(11)里面；
(1.5)、设计最下层的培养基-阵列电极纸基层III，该纸基层III包含着独立阵列的培养基供给单元，每个供给单元包括了直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)，以及处于纸基层I的模型细菌培养室(14)和纸基层II独立阵列模型细菌培养室(15)的碳浆三电极结构单元(16)，碳浆三电极结构单元(16)与其上层的阵列活性细菌筛选功能单元(1)的位置相对应；
步骤二、制作多功能纸基微流控芯片
(2.1)、丝网印刷碳浆电泳电极、PDMS活性细菌筛选功能单元、2-维分离通道和模型细菌，依据步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作左侧碳浆+电极(5)、右侧设计碳浆-电极(6)和上方共用碳浆+电极(8)、下方共用碳浆-电极(9)的丝网印刷网板A，在第一层色谱纸的正面丝网印刷这四个碳浆电泳电极，150℃烘1小时；再依据步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)中的模型细菌培养室(14)和样本细菌培养室(17)、IEF分离通道(2)、左侧缓冲液池(3)、右侧缓冲液池(4)、CZE分离通道(7)和CZE的-极缓冲液池(10)的网板B，再在第一层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷，形成第一层色谱纸上包含正面的碳浆电泳电极、背面的细菌培养室和2-维分离通道层的结构，灭菌处理；再制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)中的模型细菌培养室(14)构型的网板C，再在模型细菌培养室(14)内，在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第一层的2-维分离和模型细菌纸基层I；
(2.2)、活性成份筛选功能单元的PDMS结构和模型细菌的丝网印刷，依据步骤(1.4)的设计制作阵列活性成份筛选功能单元(11)的构型的丝网印刷网板D，在第二层色谱纸用质量比8:1的PDMS和TEOS液态胶混合物丝网印刷，得到包含阵列活性成份筛选单元(11)中的独立阵列模型细菌培养室(15)的色谱纸，并灭菌处理；再在该独立阵列模型细菌培养室(15)内，进一步在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第二层的模型细菌纸基层II；
(2.3)、阵列碳浆三电极的碳浆丝网印刷，依据步骤(1.5)设计的碳浆三电极结构单元(16)，先制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)和阵列活性成份筛选单元(11)中的所有阵列三电极结构(16)丝网印刷的网板E，再在第三层色谱纸的正面上进行碳浆丝网印刷，150℃烘1小时，得到处于最下层的阵列碳浆三电极色谱纸，碳浆三电极结构单元(16)包含对电极(18)、工作电极(19)和参比电极(20)；
(2.4)、培养基供给单元的PDMS丝网印刷，先制作包含直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)的培养基供给单元(21)结构的丝网印刷网板F，再在第三层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS与TEOS液态胶混合物丝网印刷，75℃烘1小时，形成培养基供给单元(21)，培养基供给单元(21)和阵列碳浆三电极结构单元(16)共同构成了第三层的培养基-阵列电极纸基层III，并灭菌处理；
(2.5)、依次按照对应位置从上至下第一层I、第二层II和第三层III叠放印刷有上述结构的色谱纸，进而构成了多功能纸基微流控芯片的核心结构IV；
步骤三、形成具有土壤细菌原位培养、活性土壤菌筛选、次生代谢物2-维电泳分离和活性成份筛选多功能单元的完整纸基微流控芯片V：
(3.1)、将不同地点的土壤进行编号，用经灭菌的0.2μm聚碳酸酯膜覆盖包裹，滴加一定量培养基溶液使得土壤潮湿，形成聚碳酸酯膜封装的土样(22)，该过程在无菌一定湿度的环境下操作，作为样本菌的来源；
(3.2)、将聚碳酸酯膜封装的土样(22)放置在多功能纸基微流控芯片的核心结构IV上，使土样(22)位于样本细菌培养室(17)的上方，再用0.03μm聚碳酸酯膜(23)来包裹土样(22)和多功能纸基微流控芯片的核心结构IV表面，得到多功能纸基微流控芯片。
2.基于权利要求1所述制备方法所得到的筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片的应用，用多功能纸基微流控芯片进行活性细菌筛选、次生代谢产物的2-维电泳分离以及活性成份的筛选，包括以下步骤：
(1)、活性细菌筛选单元中模型细菌和样本细菌的培养基供给，通过泵或纸基自动虹吸液体培养基沿直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)，来培养模型细菌和样本细菌，其中样本细菌应与聚碳酸酯膜封装土样(22)湿润接触；
(2)、样本细菌的获取，以及样本细菌与模型细菌扩大培养，聚碳酸酯膜封装土样(22)与样本细菌培养室(17)进行湿润接触，土壤样本细菌由0.2μm微孔进入样本细菌培养室(17)，样本细菌再进行进一步扩大培养，获取较大量的样本细菌及其次生代谢产物，同时，模型细菌菌落也在其模型细菌培养室(14)内生长，从而形成样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养阵列单元，在该扩大培养的过程中，样本菌落的次生代谢产物逐步扩散穿过模型细菌培养室(14)和样本细菌培养室(17)之间的亲水区域(24)，进而与模型细菌菌落作用而抑制其呼吸或生长；
(3)、阵列纸基微流控芯片生物毒性阳极电流检测筛选土壤活性菌，通过机器人或人工阵列同时滴加苯醌(BQ)于阵列排布的模型细菌培养室(14)，导通阵列碳浆三电极(16)，以单电位阶跃计时电流法同时检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的土壤活性细菌；
(4)、土壤活性细菌的活性次生代谢产物进入第一维的IEF分离通道，实现IEF分离，将筛选出的土壤活性菌落位置的分布于纸基上次生代谢物产物剪切折叠，并置于第一维的IEF分离通道(2)中间位置，通过位于左侧缓冲液池(3)和右侧缓冲液池(4)背面的进样纸条(25)分别插入盛有不同pH缓冲液(26)的小容器(27)，不同pH的缓冲液(26)包括pH 3.0磷酸盐和pH 10.0磷酸盐，并在左侧碳浆+电极(5)、右侧设计碳浆-电极(6)加合适电压，完成土壤活性细菌分泌的次生代谢物产物的第一维IEF分离；
(5)、活性次生代谢产物的第二维分离，经第一维IEF分离后，把C1+，C2+，...，和C1-，C2-，...，多组对应的进样纸条(25)插入盛有缓冲液(26)的小容器(27)，在上方共用碳浆+电极(8)、下方共用碳浆-电极(9)加电压，进行次生代谢物产物的第二维CZE分离；缓冲液(26)包括pH 3.0磷酸盐；
(6)、用纸基阵列生物传感器原位筛选2-维电泳分离的活性成份，经第二维CZE分离后，使模型细菌纸基层II与包含碳浆电泳电极、2-维分离通道和模型细菌纸基层I紧密接触，使纸基层II上的独立阵列模型细菌培养室(15)与纸基层I上对应的阵列CZE分离通道(7)完全吻合，通过机器人或人工阵列同时滴加苯醌于独立阵列模型细菌培养室(15)，依次瞬间间隔导通阵列碳浆三电极(16)，仍以单电位阶跃计时电流法同时原位地检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的活性成份。
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