CN111289344A - 一种三维等电聚焦装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维等电聚焦装置及方法，将醋酸纤维素膜加工为流体通道片层，将醋酸纤维素膜流体通道片层构建成三维分离通道，将色谱纸加工为储液池，将铂片电极和电源的引线固定在聚甲基丙烯酸甲酯板上，利用聚甲基丙烯酸甲酯板将电源、铂片电极、储液池和三维分离通道组装成等电聚焦装置。将蛋白质样品溶液加载到三维分离通道，酸、碱性溶液滴加到储液池。施加直流电压后，样品溶液中的蛋白质组分在三维分离通道中实现等电聚焦分离。本发明具有成本低、装置小型化的优点，适用于现场、快速的蛋白样品制备。

Description

一种三维等电聚焦装置及方法
技术领域
本发明涉及分析化学中的蛋白质样品预处理，具体涉及一种基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦装置及方法。
背景技术
随着患者和社会对医院内诊疗向院外社区诊疗扩展的需求不断增长，以微流控芯片和纸基分析为代表的医学检验技术，例如，即时检测(Point of Care Testing,POCT)技术产生并快速发展。生理样品中的蛋白分析对疾病诊断和精准医疗具有重要的意义。人体血清和尿液是易采集、样品量大且富含疾病诊断信息的生理样品。血清和尿液样品中蛋白标志物含量较低及此类样品组成复杂是目前即时检测面临的重要挑战。
等电聚焦(IEF)是一种基于蛋白质的等电点分离、富集和提纯蛋白质的电泳技术，在蛋白质分析中发挥着重要作用。但是传统的固定pH梯度等电聚焦和毛细管等电聚焦都需要配套的仪器。而以醋酸纤维素膜为基底的醋酸纤维素膜电泳具有操作简单、快速、廉价的优点，而且电泳过程中醋酸纤维素膜对蛋白质样品的吸附极低。但是传统的二维醋酸纤维素膜电泳技术依然需要配套的电泳槽和电泳仪，无法满足即时检测的需求。因此需要发展一种操作简单、便携的适用于蛋白现场快速预处理的等电聚焦装置。
中国专利CN106248763A公开了一种在纸基分析装置上等电聚焦和分离两性物质的方法，其具体采用经两性物质样品溶液浸润的醋酸纤维素膜与酸性溶液池、碱性溶液池及电源构成直流电压加载回路，通过在纸条(醋酸纤维素膜)平面内形成的pH梯度实现样品中不同蛋白组分的聚焦分离，尽管其可以加快蛋白组分分离速度，但相应的电源加载电压也较高(超过100V)，而且纸条在等电聚焦操作后需要对其上分离的不同蛋白组分分别进行剪裁、溶解后方可回收，剪裁过程容易对于蛋白组分的回收造成误差，也降低了后续对蛋白组分开展分析的效率。
目前，尚未见到以三维纸基分离通道实现等电聚焦的装置及方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维等电聚焦装置及方法，在实现较快的蛋白等电聚焦分离速度的同时，解决传统二维纸基等电聚焦装置安全性低、对仪器要求高，及聚焦分离蛋白组分后续处理复杂的问题。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种三维等电聚焦装置，该等电聚焦装置包括直流电源、与直流电源的正极和负极分别相连的两个电极片(例如，铂片电极)以及设置于两个铂片电极之间的纸基纤维层叠体，所述纸基纤维层叠体包括三维分离通道(例如，三维分离通道可以为柱形)，三维分离通道的一端与其中连接至直流电源负极的一个铂片电极之间设置有用于储存碱性溶液的吸水纸垫，三维分离通道的另一端与其中连接至直流电源正极的另一个铂片电极之间设置有用于储存酸性溶液的吸水纸垫。
优选的，所述纸基纤维层叠体包括多组醋酸纤维素膜片，每组醋酸纤维素膜片包括设置于一个以上的醋酸纤维素膜片上的用于构成三维分离通道片层的亲水区，该亲水区的边界是通过裁切及在经过裁切的醋酸纤维素膜片上设置位于亲水区外侧的疏水区(通过疏水处理)而形成的，每组醋酸纤维素膜片的亲水区通过折叠依次贴合。
优选的，所述醋酸纤维素膜片按照3～6个为一组(以使得蛋白质组分更容易聚焦于一组或连续的几组醋酸纤维素膜片，便于后续分析)，组内其他醋酸纤维素膜片与排列在该组某一端位置的醋酸纤维素膜片的边缘相对齐(即组内各醋酸纤维素膜片通过折叠相互重叠)，各组醋酸纤维素膜片的边缘相对齐(即各组醋酸纤维素膜片通过堆叠相互重叠)。
优选的，所述纸基纤维层叠体中，每组醋酸纤维素膜片中的醋酸纤维素膜片的亲水区可通过相互连接并对称分布的疏水区按一字形间隔排列方式展开。
优选的，所述三维分离通道是通过对醋酸纤维素膜依次进行激光切割(例如，一次可至少对一组的醋酸纤维素膜片进行整体切割加工)、膜片局部疏水处理、折叠、堆叠而获得。
优选的，所述三维分离通道由5～30组醋酸纤维素膜片形成(可根据分离效果灵活选择具体组数，组数过多则分离时间延长，但延长时间对已经完成分离的蛋白质组分的分离效果无明显改善作用)。
优选的，所述三维分离通道的长度(即通道两个端面之间的距离)为0.4～3cm，所述直流电源在三维分离通道上生成的电场强度为1～85V/cm；所述三维分离通道的截面面积(即由亲水区形成的片层的面积)为0.25～1cm2(横截面积过小则不利于分离通道的固定，横截面积过大则易造成蛋白质组分在片层上分布不均匀)。
优选的，所述吸水纸垫包括设置在一个以上的色谱纸片上的用于构成储液池的亲水区，该亲水区的边界是通过裁切及在经过裁切的色谱纸片上设置位于亲水区外侧的疏水区(通过疏水处理)而形成的。
优选的，所述吸水纸垫的色谱纸片个数根据储液池需要承载的对应酸性、碱性溶液的体积确定，多个色谱纸片的亲水区通过折叠依次贴合，酸性、碱性溶液的储液池分别与对应铂片电极及三维分离通道对应端面紧密接触。
优选的，所述吸水纸垫中的色谱纸片的亲水区可通过相互连接并对称分布的疏水区按一字形间隔排列方式展开。
优选的，所述储液池是通过对色谱纸依次进行激光切割(例如，一次可至少对三维分离通道一端的色谱纸片进行整体切割加工)、纸片局部疏水处理后进行或不进行折叠而获得。
优选的，所述酸性溶液选自浓度为1～20mM的H3PO4溶液，碱性溶液选自浓度为1～20mM的NaOH溶液。
优选的，所述三维分离通道加载的蛋白质样品溶液包括载体两性电解质、增粘剂及待分离的若干种蛋白质组分，按质量分数计载体两性电解质的浓度为0.5％～4％，增粘剂(例如，羟乙基纤维素)的浓度为0.15％～0.6％(增粘剂添加过多，易导致蛋白质组分的条带无法良好聚焦，例如，同一蛋白质组分出现在分离通道的多个离散的片层位置处，增粘剂添加过少，易导致聚焦的蛋白质组分在通道上的条带过宽)。
优选的，所述蛋白质样品溶液的体积(加载量)为50～300μL(以充分浸润形成三维分离通道的醋酸纤维素膜片相应亲水区为准)，酸性、碱性溶液的体积(储存量)分别为90～110μL(以充分浸润形成储液池的色谱纸片相应亲水区为准)。
优选的，所述直流电源包括电池以及小型升压模块，小型升压模块分别与电池及电源引线相连，直流电源通过电源引线(正极引线、负极引线)与两个铂片电极相连，直流电源的输出电压为1.5～36V。
优选的，所述等电聚焦装置还包括夹具，夹具包括两个间距可调(通过螺母和螺栓的配合松开或紧固)的绝缘固定板(例如，聚甲基丙烯酸甲酯板)，两个铂片电极分别设置在两个绝缘固定板上。
利用上述三维等电聚焦装置进行等电聚焦的方法，该等电聚焦的方法包括以下步骤：
1)将上述纸基纤维层叠体以及位于其三维分离通道两端的吸水纸垫夹持在两个铂片电极之间；
2)将上述蛋白质样品溶液均匀加载到三维分离通道中；
3)利用通过其中一个铂片电极连接至上述直流电源正极的吸水纸垫储存上述酸性溶液，利用通过另一个铂片电极连接至上述直流电源负极的吸水纸垫储存上述碱性溶液；
4)通过直流电源及两个铂片电极施加直流电压，使所述蛋白质样品溶液内的蛋白质组分通过等电聚焦分离并按照载体两性电解质形成的pH梯度分布在三维分离通道的对应片层位置(例如，片层位置可以对应一组醋酸纤维素膜片或对应多组连续排列的醋酸纤维素膜片)。
优选的，所述步骤2)中，将蛋白质样品溶液滴加到三维分离通道的不同片层位置，然后利用用于形成三维分离通道片层的醋酸纤维素膜的毛细作用将滴加的蛋白质样品溶液吸入三维分离通道内部，从而实现均匀加载(样品溶液充分浸润通道)。通过将蛋白质组分和载体两性电解质均匀加载在分离通道内部，有利于在分离通道上快速构建pH梯度和快速分离蛋白。
优选的，所述步骤3)具体包括以下步骤：将酸性溶液和碱性溶液分别滴加到三维分离通道对应端外侧由色谱纸片形成的储液池(通过铂片电极与电源正极连接的储液池及与电源负极连接的储液池)上，利用色谱纸对酸性、碱性溶液的吸附作用，从而将酸性溶液和碱性溶液填充至对应的储液池中(酸性、碱性溶液充分浸润储液池)。
优选的，所述步骤4)中，施加的直流电压为1.5～36V，等电聚焦分离的时间为≤25分钟(三维分离通道片层数减少，则蛋白质组分等电聚焦分离所需时间相应减少)。
优选的，所述等电聚焦的方法还包括以下步骤：经过步骤4)的等电聚焦分离后，松开螺母并将纸基纤维层叠体完整取出，然后将其三维分离通道的片层展开，并根据蛋白质的等电点和载体两性电解质在分离通道上形成的pH梯度将含有同一蛋白质组分的对应片层提取出来，便于与后续检测技术结合，实现对分离后蛋白质组分独立的分析。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用由纸基纤维片层构成的三维流体通道作为等电聚焦的分离基体，分离通道的片层层叠三维结构缩短了等电聚焦时阳极和阴极之间的距离，不仅可以减少等电聚焦分离蛋白质组分的时间，而且可以降低等电聚焦所需电压。本发明所述三维等电聚焦装置具有结构简单、成本低、小型化、便携的特点，适用于现场、快速的蛋白样品制备。
本发明的三维等电聚焦装置无需电泳槽，也无需用矿物油对纸基部分(分离通道、储液池)进行封闭，同时可以在安全电压下进行分离(例如，不超过36V)，使得相应的等电聚焦方法具有操作简单、快速、安全的特点，更有利于蛋白组分的后续分析。
附图说明
图1为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦装置的结构示意图(主视图，未显示电源)；
图2为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦装置(俯视图，未显示电源)中分离通道的装配示意图；
图3为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦装置的实物(夹具、储液池、三维分离通道)装配展示图；
图4为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦分离蛋白质的原理图，其中：上层表示不同蛋白组分的电迁移，下层表示不同蛋白组分在通道中的pH梯度下分离；
图5为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦对两种蛋白组分的分离及其效果图(通道未展开)，其中：(a)等电聚焦前；(b)等电聚焦后；
图6为基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦分离两种蛋白组分的效果图(通道展开)；
图中：1-正极引线，2-负极引线，3-铂片电极，4-聚甲基丙烯酸甲酯板，5-色谱纸片，6-醋酸纤维素膜片，7-分离通道片层，8-疏水区，9-储液池。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)三维等电聚焦装置
如图1、图2及图3所示，本发明所使用的基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦装置包括一个由醋酸纤维素膜片6叠合形成的等电聚焦三维分离通道、两个由色谱纸片5形成的储液池9及两个可连接至电源的铂片电极3，其中，所述三维分离通道位于两个铂片电极3之间，两个储液池9分别位于三维分离通道与对应铂片电极3之间，铂片电极3及储液池9通过聚甲基丙烯酸甲酯板4固定在三维分离通道两端。
参见图2及图3，所述三维分离通道的制作过程如下：在醋酸纤维素膜上通过激光切割技术加工出4个连续排列的含有圆形区域的醋酸纤维素膜片6(即一组醋酸纤维素膜片6)，其中各醋酸纤维素膜片6的圆形区域间隔排列，用于在折叠后形成4个分离通道片层7，相邻分离通道片层7之间通过位于醋酸纤维素膜片6上圆形区域对应侧的近似三角形的疏水区8(处理工艺：对醋酸纤维素膜片6上位于亲水区两侧的区域滴加疏水性SiO2纳米溶胶或用疏水性SiO2纳米溶胶进行浸泡处理，使得该区域完全浸润，然后进行干燥)连接为一体。在加工出多组醋酸纤维素膜片6后，利用折纸技术和堆叠技术在保证圆形区域对齐的情况下将所有二维的醋酸纤维素膜片6构建成三维结构，该三维结构的端面与单个醋酸纤维素膜片6的形状相同，所有醋酸纤维素膜片6的圆形区域则形成了位于三维结构中间的圆柱状的分离通道(即三维分离通道)。
参见图2及图3，所述储液池9的制作过程如下：在色谱纸上通过激光切割技术加工2个连续排列的含有圆形区域的色谱纸片5，其中各色谱纸片5的圆形区域间隔排列，圆形区域之间通过位于色谱纸片5上圆形区域对应侧的近似矩形的疏水区8(处理工艺：对色谱纸片5上位于亲水区两侧的区域滴加疏水性SiO2纳米溶胶或用疏水性SiO2纳米溶胶进行浸泡处理，使得该区域完全浸润，然后进行干燥)连接为一体，从而在沿2个色谱纸片5分界位置(图2中所示色谱纸片5展开后的虚线位置)对折后可形成一个位于中间的储液池9；按以上过程制作两个储液池9，将两个储液池9置于三维分离通道两端，储液池9的尺寸需要足以完全覆盖三维分离通道两端的界面，以便在通道中形成与通道形状相应(即覆盖通道截面)的pH梯度，避免聚焦位置的片层中蛋白组分分布不均匀。
参见图3，所述铂片电极3的连接及安装过程如下：将电源正、负极引线1、2分别通过双面胶带固定在两个聚甲基丙烯酸甲酯板4上，然后将导电铜胶带借助双面胶带与引线粘接在一起，将铂片电极3借助导电铜胶带粘接并固定在对应聚甲基丙烯酸甲酯板上，从而使连接至两个聚甲基丙烯酸甲酯板上的电源正、负极引线1、2与对应铂片电极3保持良好电接触。
将两个储液池9及位于储液池9之间的三维分离通道，利用连接在两个聚甲基丙烯酸甲酯板4上的螺栓紧固，确保聚甲基丙烯酸甲酯板4上的铂片电极3与对应端的储液池9，及储液池9与三维分离通道对应端的界面良好接触，即可进行基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦蛋白分离实验(图5a)。
如图4所示，基于醋酸纤维素膜的三维等电聚焦分离蛋白的原理为：将含有蛋白质、增粘剂和载体两性电解质的样品溶液滴加到三维分离通道上，将酸性溶液(例如，H3PO4溶液)滴加到与电源正极连接的储液池，将碱性溶液(例如，NaOH溶液)滴加到与电源负极连接的储液池后，在两个铂片电极3之间施加直流电压，随滴加的样品溶液吸入三维分离通道内的载体两性电解质会在分离通道中形成pH梯度。随滴加的样品溶液吸入三维分离通道内的蛋白质由于其带电性随所处位置pH而变化，处于分离通道中不同位置的蛋白质所带电荷不同，带正电的蛋白向阴极迁移，带负电的蛋白向阳极迁移，直至停留在其等电点的位置(此时蛋白质不带电荷)。因此基于蛋白质之间等电点的差异实现蛋白质组分的分离。
(二)等电聚焦实例
实例1
配制浓度皆为0.5mg/L的藻蓝蛋白(蓝色，可参考的等电点包括4.75)和牛血红蛋白(黄色，可参考的等电点包括6.8)混合溶液，在该溶液中添加终浓度(质量分数)2％的载体两性电解质(pH 3-10)以及终浓度(质量分数)0.45％的羟乙基纤维素(25℃下粘度为2600～3300mpa·s)，得蛋白质样品溶液。将150μL蛋白质样品溶液加载到三维分离通道(例如，利用滴加的蛋白质样品溶液在三维分离通道侧面上往复画线)，三维分离通道两端的储液池9上分别滴加100μL 10mM的H3PO4溶液和100μL 10mM的NaOH溶液。然后以36V恒压直流电源供电，进行等电聚焦，其中，三维分离通道长度1.5cm、截面积0.36cm2，共堆叠了17组醋酸纤维素膜片6。
如图5b及图6所示，在直流电压作用20分钟后，藻蓝蛋白、牛血红蛋白在三维分离通道内得到了有效分离并在通道不同位置处形成聚焦条带(参考图4)。将三维分离通道展开，也可观察到藻蓝蛋白、牛血红蛋白分别聚焦于不同组的醋酸纤维素膜片，无需剪裁即可方便的提取出两个蛋白组分，并分别进行后续分析处理。上述结果证实了此等电聚焦方法分离蛋白的可行性、安全性、便利性。
实例2
将三维分离通道中的醋酸纤维素膜片6的组数降为5组，以36V恒压直流电源供电，进行等电聚焦，可以在4～5分钟内完成以上蛋白质样品溶液(约50μL)中藻蓝蛋白、牛血红蛋白的等电聚焦分离。

Claims (10)

1.一种三维等电聚焦装置，其特征在于：包括直流电源、纸基纤维层叠体以及与直流电源的正极和负极分别相连的电极片，所述纸基纤维层叠体包括三维分离通道，三维分离通道的一端与连接至直流电源负极的电极片之间设置有用于储存碱性溶液的吸水纸垫，三维分离通道的另一端与连接至直流电源正极的电极片之间设置有用于储存酸性溶液的吸水纸垫。
2.根据权利要求1所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述纸基纤维层叠体包括多个醋酸纤维素膜片(6)以及设置在该醋酸纤维素膜片(6)上的用于构成三维分离通道片层(7)的亲水区，该亲水区的边界是通过裁切及在醋酸纤维素膜片(6)上设置位于亲水区外侧的疏水区(8)而形成的，各醋酸纤维素膜片(6)的亲水区依次贴合。
3.根据权利要求2所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述醋酸纤维素膜片(6)按照3～6个为一组，各组醋酸纤维素膜片(6)的边缘相对齐。
4.根据权利要求3所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述三维分离通道由5～30组醋酸纤维素膜片(6)形成。
5.根据权利要求1所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述三维分离通道的长度为0.4～3cm，所述直流电源在三维分离通道上生成的电场强度为1～85V/cm；所述三维分离通道的截面面积为0.25～1cm2。
6.根据权利要求1所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述吸水纸垫包括一个以上的色谱纸片(5)以及设置在该色谱纸片(5)上的用于构成储液池(9)的亲水区，该亲水区的边界是通过裁切及在色谱纸片(5)上设置位于亲水区外侧的疏水区(8)而形成的，多个色谱纸片(5)的亲水区依次贴合；所述酸性溶液及碱性溶液在吸水纸垫上的储液池(9)分别与对应电极片及所述三维分离通道对应端面紧密接触。
7.根据权利要求1所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述三维分离通道加载的蛋白质样品溶液包括载体两性电解质、增粘剂及待分离的若干种蛋白质组分，按质量分数计载体两性电解质的浓度为0.5％～4％，增粘剂的浓度为0.15％～0.6％。
8.根据权利要求7所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述蛋白质样品溶液的加载量为50～300μL，所述酸性溶液及碱性溶液的储存量分别为90～110μL。
9.根据权利要求1所述一种三维等电聚焦装置，其特征在于：所述直流电源的输出电压为1.5～36V。
10.一种三维等电聚焦方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将纸基纤维层叠体以及位于该纸基纤维层叠体的三维分离通道两端的吸水纸垫夹持在两个电极片之间；
2)将蛋白质样品溶液均匀加载到所述三维分离通道；利用通过其中一个电极片连接至直流电源正极的吸水纸垫储存酸性溶液，利用通过另一个电极片连接至该直流电源负极的吸水纸垫储存碱性溶液；
3)通过直流电源及两个电极片施加电压，使所述蛋白质样品溶液内的蛋白质组分通过等电聚焦分离并按照该蛋白质样品溶液内的载体两性电解质形成的pH梯度分布在所述三维分离通道的对应片层位置。
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