JP5256437B2 - 生体分子分離装置 - Google Patents

Description

本発明は、電気泳動を用いて生体分子の分離を行う装置に関するものである。

プロテオーム解析では、１次電気泳動、２次電気泳動、および膜へのサンプルの転写が連続して行われる。これらの手順を簡略化する技術が求められている。

特許文献１には、１次電気泳動および２次電気泳動を自動化するための装置が開示されている。

特許文献２には、電気泳動と転写とを両方行う生体分子分離装置が開示されている。

ただし、特許文献２に記載の装置では、電気泳動後にゲルを一度剥がす必要があり、依然煩雑かつ熟練を要する操作が必要であった。

特許文献３は、ゲルを剥がす必要のない操作が簡便な電気泳動と転写とを両方行う生体分子分離装置を提案している。
特開２００７−６４８４８号公報（平成１９年３月１５日公開） 特開２０００−２８５７８号公報（平成１２年１月２８日公開） 特開２００６−７１４９４号公報（平成１８年３月１６日公開）

しかしながら、簡便な操作で電気泳動と転写とを両方行い得る実用的な生体分子分離装置は、未だ存在していない。

上述したように、特許文献２に記載の装置では、熟練を要する操作または煩雑な操作が必要である。また、本発明者らが検討したところ、特許文献３に記載の装置のように、単に、電気泳動の経路上に転写用電極が設けられた構成の装置では、電気泳動を行うことが非常に困難であった。具体的には、上記のような構成の電気泳動と転写とを両方行う生体分子分離装置では、電気泳動の際、電圧を印加し得ず、サンプルを移動させ得なかった。

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で電気泳動と転写とを両方行う実用的な生体分子分離装置を提供することを目的とする。

本発明に係る生体分子分離装置は、上記課題を解決するために、生体分子を分離するための生体分子分離装置であって、第１分離用電極が配置される第１緩衝液槽と、第２分離用電極が配置される第２緩衝液槽と、片側が第１緩衝液槽に露出しており、反対側が第２緩衝液槽に露出している、該生体分子を分離するための生体分子分離媒体と、該生体分子を吸着する生体分子吸着膜と、第１緩衝液槽および第２緩衝液槽によって規定される第１方向に並べられた、第１方向に直交する直交方向に伸びる複数の線状の導電体からなる第１転写用電極および第２転写用電極と、第１転写用電極、該生体分子吸着膜、該生体分子分離媒体、および第２転写用電極を、この順に積層して保持する保持部とを備えていることを特徴としている。

上記構成によれば、第１分離用電極と第２分離用電極とによって上記生体分子分離媒体中の生体分子を分離した後に、該生体分子分離媒体、および該生体分子分離媒体に積層された上記生体分子吸着膜を対になって挟んでいる第１転写用電極および第２転写用電極を用いて該生体分子分離媒体から該生体分子吸着膜へと該生体分子を転写することができる。

ここで、第１および第２転写用電極が、第１緩衝液槽および第２緩衝液槽によって規定される第１方向に並べられた、第１方向に直交する直交方向に伸びる複数の線状の導電体からなることにより、第１および第２転写用電極が存在していても、第１および第２分離用電極による電圧の印加を妨げない。これにより、分離用電極および転写用電極への通電状態を操作するだけで、生体分子の分離および転写を連続して行うことができる。

このように、上記構成によれば、熟練を要する操作または煩雑な操作が必要ない、電気泳動と転写とを両方行い得る実用的な生体分子分離装置を提供することができる。

上記生体分子分離装置では、第１転写用電極が第１基材上に設けられており、第２転写用電極が第２基材上に設けられており、上記保持部は、第１基材および第２基材を保持していることが好ましい。

上記構成によれば、第１転写用電極が設けられた第１基材および第２転写用電極が設けられた第２基材と上記保持部とは別個に形成され、上記保持部が第１基材および第２基材を保持するので、第１基材および第２基材を例えば何種類か作製した後、適宜選択して上記生体分子分離装置を構成することができる。これにより、用途に応じた転写用電極を備えた生体分子分離装置を容易に構成することができる。

上記生体分子分離装置では、第１基材および第２基材が、樹脂または紙からなることが好ましい。

上記構成によれば、第１基材および第２基材を容易に多孔質として構成することができる。これにより、第１転写用電極および第２転写用電極の近傍に、多孔質の物質を配置することができる。上記電極からは、水の電気分解に起因する気泡が発生し、これが転写に影響を及ぼすが、上記構成によれば、上記電極において発生した気泡を上記多孔質の物質に吸収させて、容易に除去することができる。

上記生体分子分離装置では、第１転写用電極および第２転写用電極が、上記保持部上に形成されているものであってもよい。

上記構成によれば、上記生体分子分離装置の部品数が少なくなるため、製造工程を簡略化することができる。

上記生体分子分離装置では、第１転写用電極の上記直交方向における片方の端部と、第２転写用電極の該直交方向における該端部とは反対側の端部とが、上記保持部から露出していることが好ましい。

上記構成によれば、第１転写用電極および第２転写用電極の端部が交互に露出しているため、上記端部全体に接触し得る導電体を用意することにより、容易に結線して、電圧を印加することができる。これにより、第１方向に並べられた、第１方向に直交する直交方向に伸びる複数の線状の導電体からなるという、独自の構造を有する転写電極に対しても、容易に導電接続を行うことができる。

上記生体分子分離装置では、第１転写用電極および上記生体分子吸着膜の間、ならびに、上記生体分子分離媒体および第２転写用電極の間に、多孔質膜をさらに備えており、該多孔質膜は、片側が第１緩衝液槽に露出しており、反対側が第２緩衝液槽に露出していることが好ましい。

上記構成によれば、第１緩衝液槽または第２緩衝液槽に貯められた緩衝液が、多孔質膜中を浸透するため、上記生体分子分離媒体が乾燥することを防ぐことができるとともに、第１転写用電極および第２転写用電極において発生した気泡が、多孔質膜に吸収されるので、当該気泡を除去することができる。

本発明に係る生体分子分離装置によれば、第１および第２転写用電極が存在していても、第１および第２分離用電極による電圧の印加を妨げないため、分離用電極および転写用電極への通電状態を操作するだけで、生体分子の分離および転写を連続して行うことができ、これによって、簡便な操作で電気泳動と転写とを両方行い得る実用的な生体分子分離装置を提供することができる。

図１は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置１００の概略構造を示す模式図である。以下、図１を参照して生体分子分離装置１００の構造を説明する。

〔構造の概略〕
生体分子分離装置１００は、分離用電極１０１が配置される緩衝液槽１０３と、分離用電極１０２が配置される緩衝液槽１０４と、緩衝液槽１０３および１０４に挟まれた分離部（保持部）１０５と、電源１０６とを備えている。なお、上記の構造のうち、緩衝液槽１０３および１０４ならびに分離部１０５からなる部分を、生体分子分離用構造体（チップ）１０７と呼ぶこともある。

図１に示すように、分離部１０５は、分離部筐体１０８、多孔質膜１２０、生体分子吸着膜１２２、剥離膜１２３、生体分子分離媒体１２５、剥離膜１２４、多孔質膜１２１および分離部筐体１０９を備えており、これらの部材が、この順に、緩衝液槽１０３および緩衝液槽１０４によって規定される第１方向（緩衝液槽１０３から１０４へ向かう方向またはその逆方向）に直交する第２方向に向けて積層された構造を有している。なお、上記の積層された構造のうち、生体分子吸着膜１２２、剥離膜１２３、生体分子分離媒体１２５および剥離膜１２４からなる部分を、分離部積層体１２９と呼ぶこともある。

分離部筐体１０８および１０９の互いに対向する面（すなわち、多孔質膜１２０または１２１と接する面）には、転写用電極１１０および１１１がそれぞれ設けられている。図１に示すように、転写用電極１１０の一端１１２、および転写用電極１１１の一端１１３は、分離部筐体１０８および１０９から、互い違いに露出している。

生体分子分離媒体１２５は、第１方向に分割された２つの部分、すなわち、緩衝液槽１０３側（分離用電極１０１側）の第１段階分離媒体１２６と、緩衝液槽１０４側（分離用電極１０２側）の第２段階分離媒体１２７とからなる。

また、多孔質膜１２０、生体分子分離媒体１２５および多孔質膜１２１は、その上記第１方向における両端部がそれぞれ緩衝液槽１０３および１０４に露出するように設けられている。なお、図１では、第１段階分離媒体１２６を作製するためのカバー１６５が生体分子分離媒体１２５を覆っているが、生体分子分離装置１００を動作させる際には、カバー１６５は取り外される。

〔動作の概略〕
生体分子分離装置１００は、次のように動作する。まず、準備として、緩衝液槽１０３および１０４を緩衝液１６０によって満たし、分離すべき生体分子を含んだ試料を、第１段階分離媒体１２６に導入する。その後、電源１０６と、分離用電極１０１および１０２とを電気的に接続することにより、分離工程を実施する。

なお、生体分子分離装置１００を二次元目の電気泳動のために用いる場合、生体分子を含んだ試料としては、一次元目の電気泳動によって生体分子が分離された状態の細長いゲル等を用いる。試料の第１段階分離媒体１２６への導入は、ゲルである試料を、第１段階分離媒体１２６の表面に接触または押し付けることにより行うことができる。

また、他の実施形態において、試料として生体分子を含んだ溶液を用い、第１段階分離媒体１２６に、試料を注入するための孔を設け、試料の第１段階分離媒体１２６への導入を、上記孔に、試料を注入することによって行ってもよい。

何れの方法であっても、分離すべき生体分子を、第１段階分離媒体１２６内に取り込ませることができる。

分離工程では、分離用電極１０１および１０２の間に電圧が印加され、これによって、生体分子分離媒体１２５内の生体分子を電気泳動する。このとき、生体分子分離媒体１２５の第２段階分離媒体１２７は、分子篩として働き、上記生体分子は、その分子量の違いによって分離される。

詳細に述べると、分離工程は、第１段階（濃縮段階）と、第２段階（分離段階）とを含んでいる。第１段階では、第１段階分離媒体１２６に取り込まれた生体分子は、依然第１段階分離媒体１２６中にある。このとき、第１段階分離媒体１２６の分子篩効果は、第２段階分離媒体１２７よりも非常に小さく、そのため、上記生体分子は第１段階分離媒体１２６内を第２段階分離媒体１２７内よりも速く移動するため、上記生体分子は、一旦、第１段階分離媒体１２６と第２段階分離媒体１２７との界面に濃縮されることとなる。これによって、試料中における生体分子の位置等に起因する誤差を防ぐことができる。上記界面に濃縮された生体分子は、その後、第２段階分離媒体１２７において、分離される。

次に、電源１０６と、分離用電極１０１および１０２との間の電気的な接続を切断し、代わりに、電源１０６と、転写用電極１１０および１１１とを、それぞれの端部１１２および１１３を介して電気的に接続することにより、転写工程を実施する。

転写工程では、転写用電極１１０および１１１との間に電圧が印加され、これによって、生体分子分離媒体１２５内の生体分子を生体分子吸着膜１２２方向へ電気泳動して、生体分子吸着膜１２２に転写する。

以上により、分離された生体分子が吸着された生体分子吸着膜１２２を得ることができる。例えば、回収工程として、分離部筐体１０８および１０９とを、剥離させることにより、生体分子吸着膜１２２を回収する。回収した生体分子吸着膜１２２は、その後の解析（蛍光反応や免疫反応等）に供することができる。

〔各部の詳細〕
緩衝液槽１０３および１０４ならびに分離部筐体１０８および１０９は、絶縁体によって構成すればよく、特に材質等は限定されない。

緩衝液槽１０３および１０４は、緩衝液１６０を漏洩させることなく保持し、分離用電極１０１および１０２を、緩衝液１６０に接触するように配置可能な構造であればよい。例えば、典型的には、図１のような四角柱の外面形状を用いることができるが、液体を貯め得る形状であれば、特に限定されない。

分離部筐体１０８および１０９は、分離部積層体１２９を保持するとともに、転写用電極１１０および１１１の端部１１２および１１３を露出させる構造であればよい。なお、本実施形態では、端部１１２および１１３は互い違いに露出されているが、これに限定されるものではなく、一方向に露出されていてもよい。

ここで、後述するように、転写用電極１１０および１１１は、図３に示すような独自の構造を有しており、従来技術に係る平板の電極を用いた転写装置において用いられるような単純な結線方法では、転写用電極と電源とを電気的に接続することができない。

しかしながら、本実施形態に係る生体分子分離装置１００のように、端部１１２および１１３が露出していることにより、転写用電極１１０および１１１と電源１０６とを容易に電機的に接続することができる。例えば、これに限定されるものではないが、電源１０６から伸びた導線の先に、上記端部全体に接触し得る導電体からなる治具を設け、この治具を端部１１２および１１３にそれぞれ接触させる。上記治具が、上記端部全体に接触することにより、図３に示す転写用電極の線状導電体１１７の一本一本と接触され、容易に転写用電極と電源とを電機的に接続することができる。なお、図３において、端部１１２は、図中上端または下端となる。

なお、端部１１２および１１３は一方向に向けて露出されていてもよいが、本実施形態に係る生体分子分離装置１００のように、端部１１２および１１３を互い違いに露出させていれば、一方の端部における接続を行う際に、他方の端部との接触を考慮する必要がないため、さらに好ましい。

なお、端部１１２および１１３を露出させているのは、上述したように、転写用電極１１０および１１１と電源１０６とを電機的に接続されるためなので、他の実施形態において、転写用電極１１０および１１１と電源１０６とを電機的に接続できるのであれば、端部１１２および１１３が露出していなくともよい。その場合、例えば、分離部筐体１０８および１０９中に電線を設けて、転写用電極１１０および１１１と電源１０６とを電機的に接続させればよい。上記接続の切換はスイッチ機構等の公知の回路技術を用いることができる。

緩衝液槽１０３および１０４ならびに分離部筐体１０８および１０９は、一体として形成してもよく、いくつかの部品が組み立てられて形成されていてもよい。本実施形態では、少なくとも分離部筐体１０８および分離部筐体１０９は、別の部品によって構成されており、組み立てられて使用される。これにより、分離部積層体１２９を他の場所で作製したのち、生体分子分離装置１００内に組み込むことが容易である。

また、生体分子分離装置１００の使用後、生体分子吸着膜１２２を回収する際、分離部筐体１０８および分離部筐体１０９が容易に剥離可能な構成であれば、生体分子吸着膜１２２の回収を容易に行うことができるため好ましい。本実施形態において、分離部筐体１０８および１０９ならびに緩衝液槽１０３および１０４は、分離部筐体１０８および１０９の間で分割されるように構成されており、その接合部には、図１に示されるように、溝１１４が形成されている。そのため、溝１１４にへら等を差し込むことにより、容易に分離部筐体１０８および分離部筐体１０９を剥離して、生体分子吸着膜１２２を回収することができる。

分離用電極１０１および１０２は、導電性がある素材によって構成されていればよい。例えば、簡易に行いたければ、単なる針金等を用いることができる。分離用電極１０１および１０２と電源１０６との電気的な接続は、周知慣用技術によればよく、例えば、簡易に行いたければ、クリップ等を用いることができる。なお、本実施形態では、分離用電極１０１を陰極、分離用電極１０２を陽極として使用する。これは、陰電荷を有する生体分子を生体分子分離媒体１２５の当該生体分子を含む試料を導入する側から他方へと分離させるためであり、特に電極の方向は限定されない。

電源１０６は、一般的な電源であればよく、定電圧回路または定電流回路を備えているものがより好ましい。

転写用電極１１０および１１１は、後述するように、何らかの基材の上に形成される。一実施形態において、転写用電極１１０および１１１は、分離部筐体１０８および１０９上に直接形成されていてもよい。これにより、生体分子分離装置１００の部品数を減らし、製造工程を簡略化することができる。

また、一実施形態において、図２に示すように、転写用電極１１０は分離部筐体１０８とは別部材である基材１１５上に形成されており、転写用電極１１１は分離部筐体１０９とは別部材である基材１１６上に形成されており、生体分子分離装置１００を組み立てる際に、分離部筐体１０８と基材１１５とを組合せ、分離部筐体１０９と基材１１６とを組合わせる構成であってもよい。

基材１１５または１１６と分離部筐体１０８または１０９とを組み立てるための仕組みは、例えば、勘合等を利用した物理的なものであってもよいし、接着剤等を用いた化学的なものであってもよい。分離部筐体１０８および１０９と、転写用電極１１０および１１１とを切り離して作製することにより、用途に応じて様々なタイプ（詳しくは後述）の転写用電極１１０および１１１を選択して生体分子分離用構造体１０７を組み立てることができる。

次に、転写用電極１１０および１１０の構造について詳細に説明する。転写用電極１１０および１１１は、第１方向（緩衝液槽１０３および緩衝液槽１０４によって規定される方向）および第２方向（分離部積層体１２９の積層方向）に直交する第３方向（直交方向）に向かって伸びた複数の線状導電体１１７が第１方向に沿って並べられた構造を有している。図３に、転写用電極１１０の概略構造を模式的に示す。転写用電極１１０および１１１は、その形状から、ストライプ電極と称されることもある。

ここで、転写用電極１１０および１１１が、転写用電極として通常用いられる平板状の電極でなく、ストライプ電極として構成されていることの効果を説明する。

図４は、生体分子分離装置１００の動作を説明する模式図である。（ａ）は、分離工程における動作を説明し、（ｂ）は、転写工程における動作を説明する。

図４（ａ）に示すように、分離工程では、分離用電極１０１が−の電位を有し、分離用電極１０２が＋の電位を有するため、生体分子分離媒体１２５内の生体分子は、分離用電極１０１から１０２へ向かう第１方向（図中、矢印で示す方向）に移動する。このとき、転写用電極１１０および１１１は、第１方向に直交する第３方向に伸びている線状の導電体１１７からなるため、第３方向へ沿って電位が一定となるが、第１方向へ沿った電位の勾配を邪魔しない。よって、転写用電極１１０および１１１は、上記生体分子の移動を妨げない。一方、平板上の電極が、転写用電極１１０および１１１の位置にあった場合、第１方向へ沿って電位が一定となるため、上記生体分子は、移動しない。

すなわち、転写用電極１１０および１１１は、電圧の印加方向に直交するように設けられており、互いに絶縁され、かつ、該印加方向に沿って並べられた複数の線状の導電体からなる。そのため、電圧の印加方向の電位を一様にすることがなく、生体分子分離媒体１２５内の生体分子を首尾よく分離することができる。

そして、図４（ｂ）に示すように、転写工程では、分離用電極１０１および１０２は生体分子分離媒体１２５に電圧を印加せず、転写用電極１１０が＋の電位を有し、転写用電極１１１が−の電位を有するため、生体分子分離媒体１２５内の生体分子は、生体分子吸着膜１２２が配置された第２方向（転写用電極１１１から１１０へと向かう方向）へと移動する。以上により、上記生体分子を分離して生体分子吸着膜１２２に転写することができる。

転写用電極１１０および１１１は、導電性がある素材によって構成されていればよく、本実施形態では白金を用いるがこれに限定されない。金等、他の金属を用いてもよい。転写用電極１１０および１１１は、上述した構造を有していればよく、特に製造方法は限定されないが、後述するように、転写用電極１１０および１１１を形成する基材（分離部筐体１０８、１０９、基材１１５または１１６）上に、導電性の物質を成膜したのち、レーザー彫刻機等を用いて溝を彫刻することにより、上述したような特定方向に並べられた複数の線状導電体１１７を形成することができる。上記基材としては、樹脂、ガラス等の絶縁体を用いればよい。

上記基材として、樹脂を用いる場合、延伸法、造孔法等により多孔質として形成したものが好ましい。この場合、基材として用いる樹脂が、後述するような多孔質膜１２０および１２１としても働くため好ましい。樹脂としては、例えば、（メタ）アクリル樹脂、フッ素樹脂等の合成樹脂を用いることができる。

また、他の実施形態において、転写用電極１１０および１１１を製造するために、インクジェット技術等の印刷技術を用いて、導電性の物質を、図３に示すように、線状に、上記基材上に形成してもよい。この場合、上記基材としては、ガラス基板等のほかにも、樹脂フィルム等を用いることもできる。この方式によれば、より簡便に転写用電極１１０および１１１を作製することができる。

また、さらに他の実施形態において、公知の織物技術を用いて、ろ紙等の紙に、導電性の繊維を特定方向に編みこむことによって、転写用電極１１０および１１１を形成してもよい。この場合、基材として用いるろ紙が、後述するような多孔質膜１２０および１２１としても働くため好ましい。

多孔質膜１２０および１２１は、多孔質の素材によって形成されていればよく、例えば、簡易に行いたければ、一般的なろ紙を用いることができる。他にも、例えば、合成樹脂、ゴム、セラミック等を用いることができる。厚さは、特に限定されないが、典型的には、１０〜３００μｍ程度とすることができる。

多孔質膜１２０および１２１は、多孔質であるので、緩衝液１６０が浸透する。ここで、多孔質膜１２０および１２１は、緩衝液槽１０３および１０４に露出しているため、多孔質膜１２０および１２１には、分離工程および転写工程を通じて緩衝液が浸透している。これにより、多孔質膜１２０および１２１は、乾燥することを避けたほうが好ましい生体分子分離媒体１２５に対して、緩衝液１６０を供給することができる。

また、それとともに、多孔質膜１２０および１２１は、多孔質であるので、気泡を吸収することができる。転写工程時、転写用電極１１０および１１１において水の電気分解が起こり、陽極からは酸素が、陰極からは水素が発生する。こうして発生した気泡が、生体分子分離媒体１２５と生体分子吸着膜１２２との間に入り込んだ場合、または当該気泡が、生体分子分離媒体１２５中に入り込んだ場合、生体分子分離媒体１２５から生体分子吸着膜１２２への上記生体分子の転写パターンに悪影響を及ぼす。多孔質膜１２０および１２１によれば、上記気泡を吸収して、上記悪影響を防ぐことができる。

なお、転写用電極１１０および１１１から発生する気泡は、水の電気分解によって発生する酸素および水素であるため、陰極における気泡の発生量は、陽極における気泡の発生量のほぼ二倍である。そこで、本実施形態では、転写用電極１１０が陽極であり、転写用電極１１１が陰極であるので、転写用電極１１１側の多孔質膜１２１を転写用電極１１０側の多孔質膜１２０のほぼ二倍の厚さとする。これにより、好適に上記気泡を除去することができる。

生体分子吸着膜１２２は、転写膜とも称されるものであり、生体分子分離媒体１２５（電気泳動ゲル）中の生体分子を、その分離パターンを保ったまま転写するものである。用いる素材等は、特に限定されず、当該分野において慣用されているものを用いればよいが、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース混合エステル膜、セルロースアセテート膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ポリオレフィン膜等が挙げられる。

剥離膜１２３は、生体分子分離媒体１２５と生体分子吸着膜１２２との間に挟まれることにより、生体分子分離媒体１２５と生体分子吸着膜１２２との間の剥離を容易にするものである。剥離膜１２３としては、分離工程において分離した生体分子を、分離パターンを維持したまま、生体分子分離媒体１２５から生体分子吸着膜１２２に透過させるものであれば、特に限定されないが、多孔質膜であることが好ましく、均質な孔を有する多孔質薄膜であることがより好ましい。このような多孔質膜としては、例えば、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン等を主成分とする多孔質膜が挙げられる。これらの膜は、生体分子分離媒体１２５の重合を妨げず、かつ、電気泳動による生体分子等の分離および転写を妨げない。その他、一般にろ過膜として用いられている膜を商業的に入手して剥離膜１２３として使用してもよい。

生体分子分離媒体１２５としては、分子篩効果を有する担体であれば特に限定されないが、一般に電気泳動に用いられるゲルを使用することが好ましい。例えば、ポリアクリルアミド、アガロース等のゲル化剤を用いたゲルを好適に用いることができる。本実施形態では、生体分子分離媒体１２５は、第１段階分離媒体１２６と、第２段階分離媒体１２７とから構成されている。

第１段階分離媒体１２６は、一般的には、濃縮ゲルと称されることもあり、第２段階分離媒体１２７よりも、ゲル化剤の濃度が低いものが用いられる。上述したように、第１段階分離媒体１２６は、生体分子またはそれを含んだ試料の濃縮を目的とするものであり、生体分子の分離を実際に行うのは、第２段階分離媒体１２７であるので、生体分子分離媒体１２５を、第２段階分離媒体１２７のみから構成してもよい。

上述したように、生体分子分離媒体１２５としては一般的なゲルを用いることができる。このとき、図５に示すように、本実施形態では、生体分子分離媒体１２５としてのゲルの重合は、生体分子分離装置１００とは別の場所において行うが、生体分子分離装置１００内で直接作製してもよい。以下、図５を参照して本実施形態における生体分子分離媒体１２５の作製方法の一例を説明する。なお、以下の説明はあくまでも例示であり、本発明はこれに限定されず、上述の構造を有する生体分子分離装置１００を製造し得る方法であれば他の方法を用いてもよい。

まず、生体分子分離媒体１２５として望ましい形状に対応する空洞を内部に有する仮ゲルチップ１６３に対して、適当な接着材料１６４を内部に塗布して、剥離膜１２３および１２４を貼付し５０〜８０℃で乾燥させる（ステップ１）。なお、このステップは、より精度よい形状のゲルを作製するためのものであり、省略してもよい。接着材料１６４としてはＰＶＡ等を用いることができる。

次に、仮ゲルチップ１６３内に、液体状の第２段階分離媒体１２７を充填する（ステップ２）。

第２段階分離媒体１２７がゲル化したら、仮ゲルチップ１６３から取り出す（ステップ３）。

生体分子分離用構造体１０７を組み立てる（ステップ４）。まず、剥離膜１２３および１２４によって挟まれた生体分子分離媒体１２７の下に生体分子吸着膜１２２を配置し、これを多孔質膜１２１によって挟む。得られた分離部積層体１２９を、転写用電極１１０および１１１を備えた分離部筐体１０８および１０９で挟み、接着剤等を用いて、分離部筐体１０８および１０９を組み合わせる。このとき、第１段階分離媒体１２６を形成するために、第１段階分離媒体１２６に対応する空洞を形成するカバー１６５を生体分子分離用構造体１０７に取り付ける。

カバー１６５により形成された上記空洞に液体状の第１段階分離媒体１２６を充填し、ゲル化させる（ステップ５）。一実施形態において、第１段階分離媒体１２６に孔１２８を設ける場合には、カバー１６５が孔１２８に対応する突起部を有していればよい。以上により、生体分子分離媒体１２５を構成することができる。なお、使用前には、カバー１６５は取り外す。

緩衝液１６０としては、電解質であればよく、一般に電気泳動用または転写用に用いられる組成の緩衝液を用いればよい。

分離すべき生体分子としては、電気泳動および転写によって分離または分析すべき物質であればよく、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり、生体分子を含んだ試料としては、生物材料（例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物、または組織断片）からの調製物を好適に用いることができる。なお、上記生体分子は、蛍光物質や放射性同位体等により標識されていてもよい。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

生体分子分離装置１００を作製し、使用した。以下に詳細を示す。

〔転写用電極の作製〕
転写用電極１１０の作製のために６．５ｃｍ×５ｃｍ×３ｍｍの、転写用電極１１１の作製のために６．５ｃｍ×４．８ｃｍ×３ｍｍの、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（基材１１５および１１６）をそれぞれ準備し、片面にスパッタ装置を用いてＣｒのバインダーを成膜した上にさらに、約２０００ÅのＰｔを成膜した。

その後、ＣＯ_２レーザー彫刻機を用いて上記Ｐｔをストライプ状に加工した。転写用電極１１０、１１１についてＰｔの線幅を１００μｍ、線間を１００μｍとした。

〔生体分子分離用構造体（チップ）１０７の筐体の作製〕
転写用電極１１０が設けられた基材１１５を、一端１１２を外部に露出させつつ収納する分離部筐体１０８をポリメチルメタクリレートにて作製した。露出させた端部１１２は、設けられたＰｔ線の方向に沿った端部の片方であり、幅は３ｍｍである。また、同様に、転写用電極１１１が設けられた基材１１６を、一端１１３を外部に露出させつつ収納する分離部筐体１０９をポリメチルメタクリレートにて作製した。なお、分離部筐体１０８および１０９は、重ねて接着することで電気泳動バッファーを投入できる液槽が形成されるように作製した。

〔生体分子吸着膜（転写膜）１２２〕
生体分子吸着膜１２２として、セルロース混合エステル膜であるＰＯＲＡＦＩＬ ＭＶ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いた。

〔生体分子分離用構造体（チップ）１０７の作製〕
分離部筐体１０８および１０９にそれぞれ転写用電極１１０または１１１が設けられた基材１１５または１１６を接着した。転写用電極１１０上に、蒸留水に浸漬させた５×６ｃｍの大きさの生体分子吸着膜１２２を設置し、ろ紙を用いて膜が乾燥しない程度に余分な水分を取り除いた後、分離部筐体１０８に、分離部筐体１０９をＵＶ硬化接着剤により接着した。

多孔質膜１２０として、１１５μｍのろ紙（低灰分硬質定量濾紙Ｎｏ．５０、ワットマン社）を、多孔質膜１２１として、２枚のろ紙をセットした。また、剥離膜１２３および１２４として、２０μｍのポリカーボネート膜（ＩＳＯＰＯＲＥ、ミリポア社）をセットした。

電気泳動用支持体形成領域（分離部筐体１０８および１０９によって形成された空洞）の下端部（緩衝液槽１０４とつながっている部分）を封止した後、上端部（緩衝液槽１０３とつながっている部分）より生体分子分離媒体１２５材料であるポリアクリルアミドゲル溶液を充填し、静置してゲルを重合させて生体分子分離媒体１２５（第２段階分離媒体１２７）を形成した。

このポリアクリルアミドゲル溶液は、１３％アクリルアミド、３７５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．８）、０．１％過硫酸アンモニウム、０．１％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミンを含むポリアクリルアミドゲル溶液を用いた。具体的には、２９．２％アクリルアミド−０．８％メチレンビスアクリルアミド混合溶液を添加して、ポリアクリルアミドゲル中のアクリルアミドの最終濃度が１３％になるように調製した。また、濃縮ゲル（第１段階分離媒体１２６）として、アクリルアミドの最終濃度が３％となる濃縮ゲルを形成した。

〔生体分子を含んだ試料〕
マウス肝臓の水溶性タンパク質画分を蛍光色素Ｃｙ５で標識したものを試料とした。

〔分離工程〕
作製した生体分子分離用構造体１０７を用いて２次元目の電気泳動を行うことにより、生体分子をタンパク質の荷電と分子量ごとに分離した。

１次元目の等電点電気泳動は、（２００Ｖ、５分間）、（２００−１０００Ｖ、５分間）、（１０００Ｖ、５分間）、（１０００−６０００Ｖ、１０分間）、（６０００Ｖ、２０分間）の順に総計４５分間、上記条件で定法に基づいて実施した。

緩衝液（２次元電気泳動バッファー）１６０として、２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシンおよび０．１％ＳＤＳを含む陰極バッファーと、１５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ ８．８）を含む陽極バッファーとを用いた。生体分子分離用構造体１０７の緩衝液槽１０３および１０４に上記バッファーを各５ｍｌ添加し、等電点電気泳動により生体分子が分離されたゲル１６５を第１段階分離媒体１２６（濃縮ゲル）部に接続し、定電流２０ｍＡにおいて３０分間電気泳動を行った。

〔転写工程〕
分離工程（電気泳動）終了後、生体分子分離媒体１２５（電気泳動ゲル）に展開された生体分子をセルロース混合エステル膜（生体分子吸着膜１２２）に転写した。

転写用電極１１０および１１１の露出している２箇所（端部１１２および１１３）をそれぞれシリコンゴムにアルミ箔を貼り付けた冶具で電源１０６に結線し、電圧を印加して生体分子を、生体分子分離媒体１２５から生体分子吸着膜１２２に転写した。印加電圧条件は（１Ｖ、１０分間）、（２Ｖ、１０分間）、（５Ｖ、４０分間）の順に変化させて行った。

〔検出〕
スキャナ（Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ、ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｙ５の蛍光を検出することにより、タンパク質を検出した。

〔結果〕
図６に、本発明に係る生体分子分離装置１００により、電気泳動のみ行った時のゲル中でのタンパク質検出スポットと、電気泳動に連続して本チップで転写まで実施した時の転写膜上でのタンパク質検出スポットをしめす。図６に示すように、電気泳動のみ行った時のゲル中でのタンパク質検出スポットと、電気泳動に連続して本チップで転写まで実施した時の転写膜上でのタンパク質検出スポットとを比較した結果、同様のパターンとなり、電気泳動分離から転写までを本チップ内で連続して実施できることが確認できた。

本発明は、医療、研究、教育等における生体分子の分析装置の製造分野に利用可能である。

図１は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の概略構造を示す模式図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の転写用電極の概略構造を示す模式図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の転写用電極の概略構造を示す模式図である。 図４は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の動作を説明する模式図であり、（ａ）は、分離工程における動作を説明し、（ｂ）は、転写工程における動作を説明する。 図５は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の製造方法の一例を説明する図である。 図６は、本発明の一実施形態に係る生体分子分離装置の使用結果を示す写真である。

符号の説明

１００ 生体分子分離装置
１０１ 分離用電極（第１分離用電極）
１０２ 分離用電極（第２分離用電極）
１０３ 緩衝液槽（第１緩衝液槽）
１０４ 緩衝液槽（第２緩衝液槽）
１０５ 分離部（保持部）
１１０ 転写用電極（第１転写用電極）
１１１ 転写用電極（第２転写用電極）
１１５ 基材（第１基材）
１１６ 基材（第２基材）
１２２ 生体分子吸着膜
１２５ 生体分子分離媒体
１２０、１２１ 多孔質膜
１６０ 緩衝液

Claims (6)

1. 生体分子を分離するための生体分子分離装置であって、
   緩衝液を貯め、第１分離用電極が配置される第１緩衝液槽と、
   緩衝液を貯め、第２分離用電極が配置される第２緩衝液槽と、
   片側が第１緩衝液槽に露出しており、反対側が第２緩衝液槽に露出している、該生体分子を分離するための生体分子分離媒体と、
   該生体分子を吸着する生体分子吸着膜と、
   第１緩衝液槽および第２緩衝液槽によって規定される第１方向に並べられた、第１方向に直交する直交方向に伸びる複数の線状の導電体からなる第１転写用電極および第２転写用電極と、
   第１緩衝液槽および第２緩衝液槽の間に配置され、第１転写用電極、該生体分子吸着膜、該生体分子分離媒体、および第２転写用電極を、この順に積層して保持する保持部と、
   第１転写用電極および該生体分子吸着膜の間に配置された、緩衝液が浸透するろ紙と、
   該生体分子分離媒体および第２転写用電極の間に配置された、緩衝液が浸透するろ紙と、
   を備えており、
   該ろ紙は何れも、片側が第１緩衝液槽に露出しており、反対側が第２緩衝液槽に露出しており、第１緩衝液槽および第２緩衝液槽から該保持部内に該緩衝液を浸透させるようになっていることを特徴とする生体分子分離装置。
2. 第１転写用電極が第１基材上に設けられており、
   第２転写用電極が第２基材上に設けられており、
   上記保持部は、第１基材および第２基材を保持していることを特徴とする請求項１に記載の生体分子分離装置。
3. 第１基材および第２基材が、樹脂または紙からなることを特徴とする請求項２に記載の生体分子分離装置。
4. 第１転写用電極および第２転写用電極が、上記保持部上に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の生体分子分離装置。
5. 第１転写用電極の上記直交方向における片方の端部と、
   第２転写用電極の該直交方向における該端部とは反対側の端部と
   が、上記保持部から露出していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体分子分離装置。
6. 第１転写用電極および第２転写用電極のうち陰極側に配置された上記ろ紙の厚さが、陽極側に配置された上記ろ紙の厚さの二倍であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体分子分離装置。