JP2008113576A - 核酸のブロッティング方法およびブロッティング用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】短時間で鮮明にブロッティング可能な核酸のブロッティング方法およびそのブロッティング用キットを提供する。
【解決手段】電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルｃの下部に、ブロッティング用緩衝液ａを飽和状態に含ませてなる吸水性物質Ｂを含む密閉系の緩衝液槽を配置し、電気泳動ゲルｃの上にブロッティング用膜ｄを重層し、さらにその上部に吸水性物質ｆを配置し、該上部に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液ａを吸水させ、該電気泳動ゲル上に分離した核酸を該ブロッティング用膜ｄに転写させる方法。
【選択図】図２
【解決手段】電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルｃの下部に、ブロッティング用緩衝液ａを飽和状態に含ませてなる吸水性物質Ｂを含む密閉系の緩衝液槽を配置し、電気泳動ゲルｃの上にブロッティング用膜ｄを重層し、さらにその上部に吸水性物質ｆを配置し、該上部に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液ａを吸水させ、該電気泳動ゲル上に分離した核酸を該ブロッティング用膜ｄに転写させる方法。
【選択図】図２
Description
本発明は、短時間に処理可能な核酸のブロッティング方法及びブロッティング用キットに関する。
電気泳動法で分離したＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を、ナイロンメンブレンなどのブロッティング用膜にブロッティング（転写）して核酸を解析する方法として、サザンブロッティング法やノザンブロッティング法が知られている。核酸をブロッティングする方法として、毛細管現象を利用したキャピラリーブロッティング方法又は特殊な装置を用いたバキュームブロッティング方法が用いられている。
毛細管現象を利用したキャピラリーブロッティング方法が一般的な方法であり、教科書的に示された方法により行われている（非特許文献１）。実際の方法は、ブロッティング用緩衝液を含む緩衝液槽（バス）に足場を設け、該足場にろ紙を配置して緩衝液を毛細管現象により吸水し、その上に電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置し、該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜を重層し、さらに該ブロッティング用膜の上に吸水性物質を配置し、該上に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液を吸水させてブロッティングを行っていた（図１参照）。この方法ではブロッティングのための装置は殆ど身近にある物を利用することができるが、緩衝液をためる大きな容器（バス）が必要で、緩衝液は通常１〜２リットル必要である。また、毛細管現象を利用して緩衝液槽からブロッティング用膜まで緩衝液を吸い上げることを必要とするため、ブロッティングにも通常６〜７時間を要し、実験計画が立てにくく、一昼夜放置することが必要な場合もある。
さらに、ブロッティングに使用した緩衝液槽などは、洗浄することで再利用するのが通常であるが、洗浄が十分でない場合には、続く実験においてコンタミネーション等の不都合を生じる場合がある。特に、ラジオアイソトープでラベルした核酸をブロッティング用膜に転写して吸着させる場合などは、コンタミネーションの問題が大きい。
バキュームブロッティング方法は、陰圧ポンプにより電気泳動ゲルからＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をブロッティング用膜に陰圧により吸着させる方法である。この方法では、短時間で効率よく核酸をブロッティングすることができ、３０分程度でブロッティング可能な場合もある。しかしながら、本方法ではその原理上、陰圧を電気泳動ゲル全体にかけるために、ゲルに穴が空いていたり割れていたりする等の損傷がある場合はブロッティングを行うことができない。また、陰圧をかけることによるゲルの損傷が生じる場合も起こりうる。さらに、ブロッティングに使用したポンプなどは、洗浄することで再利用するのが通常であるが、洗浄が十分でない場合には、続く実験においてコンタミネーション等の不都合を生じる場合がある。特に、ラジオアイソトープでラベルした核酸をブロッティング用膜に転写して吸着させる場合などは、コンタミネーションの問題が大きい。
近年では、電気泳動用ゲルとして電気泳動装置とセットで使用可能なものが、例えば商品名Mupid(R)-2 Mini-Gelのように市販されているが、ブロッティング方法については特に改良されてはいなかった。
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989
本発明は、短時間で鮮明にブロッティング可能な核酸のブロッティング方法及びそのブロッティング用キットを提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、毛細管現象を利用したキャピラリーブロッティング方法において、ブロッティング用緩衝液を含む緩衝液槽を工夫することにより、電気泳動により分離した核酸を短時間で鮮明にブロッティングしうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した緩衝液槽の上部に、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置し、該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜を重層し、さらに該ブロッティング用膜の上に吸水性物質を配置し、該上に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液を吸水させ、該電気泳動ゲル上に分離した核酸を該ブロッティング用膜に転写させる方法であって、
該電気泳動ゲルを該緩衝液槽の上部に配置した状態において、該緩衝液槽が密閉系とすることを特徴とする核酸のブロッティング方法。
２．緩衝液槽に配置した吸水性物質１ｇあたりに、ブロッティング用緩衝液を２〜３０ｍｌ含ませてなる前項１に記載の核酸のブロッティング方法。
３．ブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、緩衝液槽に配置した吸水性物質との関係において、電気泳動ゲル１ｃｍ２あたりに、０．００１〜１．０ｍｌ／６０分の割合で緩衝液の移動を可能とする吸水性を有する物質である、前項１又は２に記載の核酸のブロッティング方法。
４．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質及びブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、紙、布及び吸水性ポリマーから選択されるいずれかである前項１〜３の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
５．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質と電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルの間に、液体透過性の層を含む前項１〜４の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
６．ブロッティング用膜と上部に配置した吸水性物質の間に、液体透過性の層を含む前項１〜５の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
７．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽、ブロッティング用膜及びブロッティング用緩衝液を吸水可能な吸水性物質、を含むことを特徴とする核酸のブロッティング用キット。
８．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽の上部を開封することで、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置可能とする前項７に記載の核酸のブロッティング用キット。
９．前項１〜６の何れかに記載の核酸のブロッティング方法に用いることを特徴とする前項７又は８に記載の核酸のブロッティング用キット。
１．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した緩衝液槽の上部に、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置し、該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜を重層し、さらに該ブロッティング用膜の上に吸水性物質を配置し、該上に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液を吸水させ、該電気泳動ゲル上に分離した核酸を該ブロッティング用膜に転写させる方法であって、
該電気泳動ゲルを該緩衝液槽の上部に配置した状態において、該緩衝液槽が密閉系とすることを特徴とする核酸のブロッティング方法。
２．緩衝液槽に配置した吸水性物質１ｇあたりに、ブロッティング用緩衝液を２〜３０ｍｌ含ませてなる前項１に記載の核酸のブロッティング方法。
３．ブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、緩衝液槽に配置した吸水性物質との関係において、電気泳動ゲル１ｃｍ２あたりに、０．００１〜１．０ｍｌ／６０分の割合で緩衝液の移動を可能とする吸水性を有する物質である、前項１又は２に記載の核酸のブロッティング方法。
４．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質及びブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、紙、布及び吸水性ポリマーから選択されるいずれかである前項１〜３の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
５．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質と電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルの間に、液体透過性の層を含む前項１〜４の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
６．ブロッティング用膜と上部に配置した吸水性物質の間に、液体透過性の層を含む前項１〜５の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
７．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽、ブロッティング用膜及びブロッティング用緩衝液を吸水可能な吸水性物質、を含むことを特徴とする核酸のブロッティング用キット。
８．ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽の上部を開封することで、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置可能とする前項７に記載の核酸のブロッティング用キット。
９．前項１〜６の何れかに記載の核酸のブロッティング方法に用いることを特徴とする前項７又は８に記載の核酸のブロッティング用キット。
本発明の核酸のブロッティング方法は、毛細管現象を利用したキャピラリーブロッティング方法によるものであるが、使用するブロッティング用緩衝液の量を削減しつつも３〜４時間でブロッティングを行うことができる。従来のキャピラリーブロッティング方法によると、ブロッティングに長時間要するにもかかわらず、必要時間以上放置しておくと、ブロッティング用膜に必要以上の緩衝液が通過することなり、いったん吸着された核酸が、またブロッティング用膜からはがれたり、移動したりするなどして、鮮明なブロッティング像を得ることができない。しかしながら、本発明の方法によると、下部の吸水性物質と上部の吸水性物質との間で緩衝液が平衡状態を保つため、鮮明なブロッティング像を得ることができる。さらに、本発明のブロッティング用キットは使い捨てが可能であるため、周囲の汚染やサンプルへのコンタミネーションなど軽減化させることも可能である。
本発明の核酸のブロッティング方法は、サザンブロッティング法又はノザンブロッティング法に利用することができる。本発明のブロッティング方法は、キャピラリーブロッティング方法の変法に関する。したがって、本発明は本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で、自体公知のキャピラリーブロッティング方法に種々の応用が可能である。具体的には使用しうる緩衝液、電気泳動ゲル、ブロッティング用膜等は、自体公知あるいは今後開発されるあらゆる組成、材料、部材からなるものを適用することができる。
本発明における「ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質」とは、例えば図２又は３におけるＢで例示することができ、吸水性物質にブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませたものをいう。以下、「下部の吸水性物質」という場合がある。ここにおいて、吸水性物質とは、吸水性の性質を有する物質であれば良く特に限定されない。具体的には、吸水性物質１ｇあたりに、ブロッティング用緩衝液を２〜３０ｍｌ、好ましくは３〜１５ｍｌ、より好ましくは４．５〜７ｍｌ含み、飽和状態となりうる物質であれば良い。このような物質として、紙、布及び吸水性ポリマーから選択されるあらゆる物質を用いることができる。特に好適には、ペーパータオルを複数枚数重層したものを利用することができる。
本発明における「ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した緩衝液槽」とは、例えば図２又は３おけるＡで例示することができ、前記下部の吸水性物質を保持する槽をいう。以下単に、「緩衝液槽」という。本発明では、電気泳動したゲルを該緩衝液槽の上部に配置した状態において、該緩衝液槽を密閉系とすることを特徴とする。
該緩衝液槽を密閉系としうるものであれば、槽の部材は特に限定されない。槽の部材としては水分非透過性の物質であればよく、例えばフィルム状の部材とすることができる。具体的には、プラスチックフィルムやゴムフィルムなどを挙げることができ、プラスチックフィルムとしては、ポリエチレン製のフィルムを例示することができる。
該緩衝液槽を密閉系とすることにより、ブロッティング用緩衝液が蒸散しないので、使用する緩衝液の量を低減化させることができる。本発明の緩衝液槽の大きさは、使用する電気泳動ゲルの大きさに応じて適宜決定することができる。
該緩衝液槽の上部に、電気泳動したゲルを配置することにより、電気泳動ゲルにブロッティング用緩衝液を供給することができる。電気泳動ゲルは、緩衝液槽の上部に直接配置しても良いが、ゲルを平らに保持することができるように、緩衝液槽と電気泳動ゲルの間に、液体透過性の層を重層してもよい。このような液体透過性の層とは、効果的かつ均一に電気泳動ゲルに緩衝液を供給することができるように、電気泳動ゲルを平らに保持しうるものであれば良い。そのようなものの例として、ろ紙を挙げることができる。
配置した電気泳動ゲルに上に、ブロッティング用膜を重層する。ブロッティング用膜は、図２又は３においてｄで示される。このとき、ブロッティングを効果的に行うため、即ち電気泳動ゲルとブロッティング用膜の間にひずみやゆがみが生じたり、気泡が入るのを防ぐために、ブロッティング用膜にガラス棒などで一般的な方法により平らに処理することができる。この場合において、電気泳動ゲル及びブロッティング用膜は、特に限定されない。
ブロッティング用緩衝液は、緩衝液槽から電気泳動ゲルに供給され、ブロッティング用膜に供給されることにより、電気泳動ゲル上に分離したＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を、ブロッティング用膜に転写し、吸着させることができる。その際、余分な緩衝液をブロッティング用膜から吸収除去するために、ブロッティング用膜の上に吸水性物質を配置する。以下、該吸水性物質を「上部の吸水性物質」という場合がある。該上部の吸水性物質は、図２又は３においてｆで示される。該上部の吸水性物質の毛細管現象により、余分な緩衝液が吸水除去される。この場合、下部の吸水性物質と上部の吸水性物質の関係は、効果的に緩衝液の移動（トランスファー）がなされるものであれば良い。具体的には、電気泳動ゲルの単位面積（１ｃｍ２）あたり、０．００１〜１．０ｍｌ／６０分、好ましくは０．０５〜０．３ｍｌ／６０分、より効果的には０．０６〜０．１５ｍｌ／６０分の割合で上部の吸水性物質に緩衝液が移動されるものであれば、効果的にブロッティングがなされる。このような性質を保持するため、使用前の上部の吸水性物質は乾燥状態であることが好ましい。
上記のような上部の吸水性物質は、上記の性質を有するものであれば下部の吸水性物質と同じ材料であっても良いし、異なる材料であってもよい。このような物質として、紙、布及び吸水性ポリマーから選択されるあらゆる物質を用いることができる。特に好適には、ペーパータオルを複数枚数重層したものを利用することができる。
上記ブロッティング用膜の上に、直接上部の吸水性物質を配置することができるが、このときブロッティングを効果的に行うため、ブロッティング用膜の上部に液体透過性の層を重層することができる。さらには、液体透過性の層を重層した後、ガラス棒などで一般的な方法により平らに処理することができる。
上部の吸水性物質を配置することにより、ブロッティングを効果的に行うことができるが、更に効果的に行うために、電気泳動ゲルの大きさや、吸水性物質の性質などにより、上部の吸水性物質の上部に、例えばガラス板やアクリル板などの平板を重ねることもできるし、更にその上に重りを乗せることもできる。
本方法により、核酸のブロッティングは、５時間以下で行うことができ、通常２〜３時間で行うことができる。また、一昼夜放置する場合であっても、下部の吸水性物質が密閉系であり、上部の吸水性物質と平衡状態を維持することができるため、下部の緩衝液が過剰に上部に供給されることなく、また常識的な時間内の放置により乾燥することもない。これにより、一昼夜放置するなどの長時間放置した場合であっても、ブロッティングした核酸の像は、鮮明な状態で観察することができる。
ブロッティングした後のＤＮＡ又はＲＮＡなどの目的の核酸は、ラジオアイソトープで標識したプローブの核酸断片とハイブリダイゼーション（会合）させることにより、多くの核酸の中から目的の核酸のみをアイソトープで標識する事が可能になる。これを、フィルムに感光させたり、高感度放射線検出装置などで検出することで、通常の分析方法により分析することができる。
本発明は、上述した核酸のブロッティング方法の他、該ブロッティング方法に使用するブロッティング用のキットにも及ぶ。このようなキットの構成として、ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質（下部の吸水性物質）を配置した密閉系の緩衝液槽、ブロッティング用膜及びブロッティング用緩衝液を吸水可能な吸水性物質（上部の吸水性物質）、を少なくとも含めることができる。ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽は、例えば使用するまで、密閉系のフィルムで覆われたものであり、用時該フィルムを開封することにより、電気泳動ゲルを配置できるようにしていれば、使用に便利である。このような緩衝液槽の大きさは、電気泳動ゲルの大きさに合わせたものであれば便利である。例えば、市販の電気泳動ゲルとセットにして使用可能なキットとすることもできる。
本発明のブロッティング用キットに含まれる緩衝液槽は、従来、バスで使用していたものに比べてコンパクトであり、使用後はそのまま廃棄することができるので、バスの洗浄を省略することもできるし、バスの洗浄不足による核酸のコンタミネーション、あるいはラジオアイソトープラベルした核酸を電気泳動した時の、ラジオアイソトープによるコンタミネーションを防ぐことも可能である。
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）サザンブロッティング
１．電気泳動
Mupid(R)-2ミニゲル・システム（アドバンス社製）を用いてＤＮＡを電気泳動した。ゲルの大きさは、５．５ｃｍ×６．０ｃｍであった。
１．電気泳動
Mupid(R)-2ミニゲル・システム（アドバンス社製）を用いてＤＮＡを電気泳動した。ゲルの大きさは、５．５ｃｍ×６．０ｃｍであった。
ゲノムＤＮＡはヒトの血液試料から得た。ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、Eco RI およびHin dIIIの二種類の制限酵素を用いて消化した。消化したゲノムＤＮＡ濃度を吸光光度計により測定し、７．５μｇのＤＮＡをMupid(R)-2ミニゲル・システムにより、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス・アセテート（１ｍＭ ＥＤＴＡ：pH 8.0））を使用して１００Ｖで３０分間電気泳動を行った。
また、プラスミドにサブクローニングした、ＣＳＴＢ遺伝子のエクソン２とエクソン３をＤＮＡプローブとして用いた。
また、プラスミドにサブクローニングした、ＣＳＴＢ遺伝子のエクソン２とエクソン３をＤＮＡプローブとして用いた。
２．サザンブロッティング
図２に示す方法によりサザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液（ａ）として、アルカリ変性処理した緩衝液（０．５Ｍ：ＮａＯＨ、１．５Ｍ：ＮａＣｌ）を用いた。１ｇあたりに４．７７ｍｌのブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）をポリエチレンラップ（Ａ）によって底面及び側面を覆い、ブロッティング用緩衝液が外部に漏れないようにした。ポリエチレンラップにより覆われたペーパータオル部位は、本発明における緩衝液槽に該当する。
図２に示す方法によりサザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液（ａ）として、アルカリ変性処理した緩衝液（０．５Ｍ：ＮａＯＨ、１．５Ｍ：ＮａＣｌ）を用いた。１ｇあたりに４．７７ｍｌのブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）をポリエチレンラップ（Ａ）によって底面及び側面を覆い、ブロッティング用緩衝液が外部に漏れないようにした。ポリエチレンラップにより覆われたペーパータオル部位は、本発明における緩衝液槽に該当する。
ポリエチレンラップ（Ａ）に覆われたペーパータオル（Ｂ）の上にろ紙（ｂ）を重層し、さらにその上に上記電気泳動を行った電気泳動ゲル（ｃ）を重層した。該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜（ｄ）としてのナイロンメンブレン（Hybond N+：アマシャム製）を重ね、その上にろ紙（ｅ）及び乾いたペーパータオル（ｆ）を重ね、さらにその上部にガラス板（ｇ）を重層し、ブロッティング操作を行った。ブロッティング操作は、４時間行った。このとき、ブロッティング用緩衝液は、ブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）から乾いたパーパータオル（ｆ）へ、電気泳動ゲル１ｃｍ２あたり０．０６７５〜０．１２６ｍｌ／６０分移動することが観察された。
電気泳動からブロッティングによりＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンと、３２Ｐで標識されたｄＣＴＰを用いたラベリングシステムにより調製された標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション前処理及びハイブリダイゼーションはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含まない、チャーチのハイブリダイゼーション緩衝液（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, New York:Wiley; 2005）を用いて行った。
ブロットはハイブリダイゼーションを行ったブロッティング膜を洗浄操作後、イメージングプレート上に置いて、バンドの放射活性をBAS2000システム(フジフィルム社)で測定した。その結果を図４（ｂ）に示した。
（実施例２）ノザンブロッティング
１．電気泳動
totalＲＮＡをRNeasyミニ・キット（Qiagen社）を用いてルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫）培養細胞から抽出し、濃度を分光光度計で測定した。その後１−１０μｇのtotalＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含まないＴＡＥ緩衝液を使用し、Mupid(R)-2ミニゲル・システムを用いて１％のアガロースゲル中で、電気泳動を行った。
１．電気泳動
totalＲＮＡをRNeasyミニ・キット（Qiagen社）を用いてルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫）培養細胞から抽出し、濃度を分光光度計で測定した。その後１−１０μｇのtotalＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含まないＴＡＥ緩衝液を使用し、Mupid(R)-2ミニゲル・システムを用いて１％のアガロースゲル中で、電気泳動を行った。
２．ノザンブロッティング
その後、実施例１に示す方法と同手法にてノザンブロッティングを行った（図２）。ブロッティング用緩衝液として２０×ＳＳＣ緩衝液を用いた。１ｇあたりに６．７３ｍｌのブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）をポリエチレンラップ（Ａ）によって底面及び側面を覆い、ブロッティング用緩衝液が外部に漏れないようにした。
その後、実施例１に示す方法と同手法にてノザンブロッティングを行った（図２）。ブロッティング用緩衝液として２０×ＳＳＣ緩衝液を用いた。１ｇあたりに６．７３ｍｌのブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）をポリエチレンラップ（Ａ）によって底面及び側面を覆い、ブロッティング用緩衝液が外部に漏れないようにした。
実施例１と同手法にて、ポリエチレンラップ（Ａ）に覆われたペーパータオル（Ｂ）の上にろ紙（ｂ）を重層し、さらにその上に上記電気泳動を行った電気泳動ゲル（ｃ）を重層した。該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜（ｄ）としてのナイロンメンブレン（Hybond N+：アマシャム製）を重ね、その上にろ紙（ｅ）及び乾いたペーパータオル（ｆ）を重ね、さらにその上部にガラス板（ｇ）を重層し、ブロッティング操作を行った。ブロッティング操作は、４時間行った。このとき、ブロッティング用緩衝液は、実施例１と同様に、ブロッティング用緩衝液を含むペーパータオル（吸水性物質：Ｂ）から乾いたパーパータオル（ｆ）へ、電気泳動ゲル１ｃｍ２あたり０．０６７５〜０．１２６ｍｌ／６０分移動することが観察された。
さらに、実施例１と同様に、転写後のナイロンメンブレンに３２Ｐで標識されたｄＣＴＰを用いたラベリングシステムにより調製された標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズし、その後ナイロンメンブレンを洗浄操作して、イメージングプレート上に置いて、バンドの放射活性をBAS2000システム(フジフィルム社)で測定した。その結果を図５（ｂ）に示した。
（比較例１）従来法によるサザンブロッティング
１．電気泳動
５．５ｃｍ×１４ｃｍのゲルを用いてＤＮＡを電気泳動した。実施例１と同様にゲノムＤＮＡはヒトの血液試料から得た。ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を実施例１と同様にEco RI およびHin dIIIの二種類の制限酵素を用いて消化した。消化したゲノムＤＮＡ濃度を吸光光度計により測定し、７．５μｇのＤＮＡをＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス・アセタート（１ｍＭ ＥＤＴＡ：pH 8.0））を使用して４０Ｖで４２０分間電気泳動を行った。
また、実施例１と同様にプラスミドにサブクローニングしたＣＳＴＢ遺伝子のエクソン２とエクソン３をＤＮＡプローブとして用いた。
１．電気泳動
５．５ｃｍ×１４ｃｍのゲルを用いてＤＮＡを電気泳動した。実施例１と同様にゲノムＤＮＡはヒトの血液試料から得た。ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を実施例１と同様にEco RI およびHin dIIIの二種類の制限酵素を用いて消化した。消化したゲノムＤＮＡ濃度を吸光光度計により測定し、７．５μｇのＤＮＡをＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス・アセタート（１ｍＭ ＥＤＴＡ：pH 8.0））を使用して４０Ｖで４２０分間電気泳動を行った。
また、実施例１と同様にプラスミドにサブクローニングしたＣＳＴＢ遺伝子のエクソン２とエクソン３をＤＮＡプローブとして用いた。
２．サザンブロッティング
図１に示す方法で、サザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液は、実施例１と同様のものを調製し、バスに２リットル加えた。ブロッティング操作は、８時間行った。
図１に示す方法で、サザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液は、実施例１と同様のものを調製し、バスに２リットル加えた。ブロッティング操作は、８時間行った。
ＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンに、実施例１と同様に３２Ｐで標識されたｄＣＴＰを用いたラベリングシステムにより調製された標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション前処理及びハイブリダイゼーションは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含まないチャーチのハイブリダイゼーション緩衝液（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, New York:Wiley; 2005）を用いて行った。
その後ナイロンメンブレンを洗浄操作して、イメージングプレート上に置いて、バンドの放射活性をBAS2000システム(フジフィルム社)で測定した。その結果を図４（ａ）に示した。
（比較例２）従来法によるノザンブロッティング
１．電気泳動
５．５ｃｍ×１４ｃｍのゲルを用いてtoal ＲＮＡを電気泳動した。totalＲＮＡはルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫）培養細胞から抽出した。電気泳動は、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルを用いた。１×ホルムアルデヒドのゲルラニング緩衝液（ホルムアルデヒド濃度１７．５％、最終濃度５０％）に加え、攪拌及び遠心分離を行い、６５℃で５分間インキュベーションした。１０％のホルムアルデヒドを含む電気泳動用緩衝液を使用して３０Ｖで５時間電気泳動を行った
１．電気泳動
５．５ｃｍ×１４ｃｍのゲルを用いてtoal ＲＮＡを電気泳動した。totalＲＮＡはルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫）培養細胞から抽出した。電気泳動は、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルを用いた。１×ホルムアルデヒドのゲルラニング緩衝液（ホルムアルデヒド濃度１７．５％、最終濃度５０％）に加え、攪拌及び遠心分離を行い、６５℃で５分間インキュベーションした。１０％のホルムアルデヒドを含む電気泳動用緩衝液を使用して３０Ｖで５時間電気泳動を行った
２．ノザンブロッティング
図１に示す方法で、ノザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液は、実施例２と同様のものを調製し、バスに２リットル加えた。ブロッティング操作は、８時間行った。
図１に示す方法で、ノザンブロッティングを行った。ブロッティング用緩衝液は、実施例２と同様のものを調製し、バスに２リットル加えた。ブロッティング操作は、８時間行った。
さらに、実施例１と同様に、転写後のナイロンメンブレンに３２Ｐで標識されたｄＣＴＰを用いたラベリングシステムにより調製された標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズし、その後ナイロンメンブレンを洗浄操作して、イメージングプレート上に置いて、バンドの放射活性をBAS2000システム(フジフィルム社)で測定した。その結果を図５（ａ）に示した。
上記各実施例および比較例の結果、本発明のブロッティング方法は、短時間でブロッティングすることができ、鮮明な画像を得ることができ、コンタミネーションも無く優れていることが判明した。
以上詳述したように、本発明のブロッティング方法によると、実験時間の短縮を図ることができ、鮮明なブロッティング像を得ることができるため、効果的な実験結果を得ることができる。さらに、本発明のブロッティング用キットは使い捨てが可能であるため、周囲の汚染やサンプルへのコンタミネーションなど軽減化させることも可能である。したがって本発明のブロッティング用キット使用することにより、効果的な実験結果を得ることができる。
Ａ 緩衝液槽を密閉するための部材
Ｂ 緩衝液槽に含まれる吸水性物質
ａ ブロッティング用緩衝液
ｂ 液体透過性の層
ｃ 電気泳動ゲル
ｄ ブロッティング用膜
ｅ 液体透過性の層
ｆ 吸水性物質
ｇ 平板
ｈ 重り
Ｂ 緩衝液槽に含まれる吸水性物質
ａ ブロッティング用緩衝液
ｂ 液体透過性の層
ｃ 電気泳動ゲル
ｄ ブロッティング用膜
ｅ 液体透過性の層
ｆ 吸水性物質
ｇ 平板
ｈ 重り
Claims (9)
- ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した緩衝液槽の上部に、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置し、該電気泳動ゲルの上にブロッティング用膜を重層し、さらに該ブロッティング用膜の上に吸水性物質を配置し、該上に配置された吸水性物質の毛細管現象によりブロッティング用緩衝液を吸水させ、該電気泳動ゲル上に分離した核酸を該ブロッティング用膜に転写させる方法であって、
該電気泳動ゲルを該緩衝液槽の上部に配置した状態において、該緩衝液槽を密閉系とすることを特徴とする核酸のブロッティング方法。 - 緩衝液槽に配置した吸水性物質１ｇあたりに、ブロッティング用緩衝液を２〜３０ｍｌ含ませてなる請求項１に記載の核酸のブロッティング方法。
- ブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、緩衝液槽に配置した吸水性物質との関係において、電気泳動ゲル１ｃｍ２あたりに、０．００１〜１．０ｍｌ／６０分の割合で緩衝液の移動を可能とする吸水性を有する物質である、請求項１又は２に記載の核酸のブロッティング方法。
- ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質及びブロッティング用膜の上部に配置した吸水性物質が、紙、布及び吸水性ポリマーから選択されるいずれかである請求項１〜３の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
- ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質と電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルの間に、液体透過性の層を含む請求項１〜４の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
- ブロッティング用膜と上部に配置した吸水性物質の間に、液体透過性の層を含む請求項１〜５の何れかに記載の核酸のブロッティング方法。
- ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽、ブロッティング用膜及びブロッティング用緩衝液を吸水可能な吸水性物質、を含むことを特徴とする核酸のブロッティング用キット。
- ブロッティング用緩衝液を飽和状態に含ませてなる吸水性物質を配置した密閉系の緩衝液槽の上部を開封することで、電気泳動により分離した核酸を含む電気泳動ゲルを配置可能とする請求項７に記載の核酸のブロッティング用キット。
- 請求項１〜６の何れかに記載の核酸のブロッティング方法に用いることを特徴とする請求項７又は８に記載の核酸のブロッティング用キット。
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|---|---|---|---|
| JP2006297806A JP2008113576A (ja) | 2006-11-01 | 2006-11-01 | 核酸のブロッティング方法およびブロッティング用キット |
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|---|---|
| JP (1) | JP2008113576A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010096595A (ja) * | 2008-10-15 | 2010-04-30 | Toppan Printing Co Ltd | 生体分子分離装置 |
-
2006
- 2006-11-01 JP JP2006297806A patent/JP2008113576A/ja not_active Withdrawn
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