CN117147662A - 一种大肠杆菌活性的电化学检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌活性的电化学检测方法，包括：将大肠杆菌接种到M9培养基中进行培养，然后获取菌液上清液，最后采用三电极系统对菌液上清液中氢醌的含量变化进行电化学检测即可。本发明选取氢醌作为大肠杆菌的电化学活性标记物，并以特定的M9培养基进行大肠杆菌的培养，使得大肠杆菌中的内源性电化学活性物质氢醌进行主动分泌，进而采用三电极系统检测大肠杆菌活体分泌的内源性氢醌。通过本方法可真实且正常的反映大肠杆菌的生理状态，而且不需要外源电子介体介导或进行电极修饰，可直接进行电化学检测获取氢醌的电化学信号，电化学活性标记物响应快，准确度较高，具有直接检测活性病原菌的潜力。

Description

一种大肠杆菌活性的电化学检测方法

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌活性的电化学检测方法。

背景技术

大肠杆菌是人或动物肠道中的重要细菌种类，对食物的正常消化具有重要作用。近年来，大肠杆菌已被广泛用作食品卫生质量检验的指示菌，快速、准确、活性地检测大肠杆菌对于预防控制和确定有效的治疗策略至关重要，而且也有助于解释其感染与作用机制。

目前大肠杆菌活性的检测方法主要包括平板计数法、分光光度法、流式细胞仪计数法。其中，平板计数法是国家标准中最常用的方法，但耗时费力，出现症状的患者往往首先接受广谱抗生素治疗，这导致大肠杆菌对抗生素的耐药性增加，进而大肠杆菌感染难以治疗；分光光度法容易受到介质的干扰，且无法区分细菌的死活；流式细胞仪计数法所需设备与试剂昂贵，对检测人员操作水平有较高要求。

近年来，电化学方法由于高灵敏度、响应快速和操作简单的特点在检测领域应用广泛，但许多电化学方法依赖于外源添加电子穿梭体介导微生物电子传递链，容易受到复杂体系的干扰。针对上述问题，中国专利文献CN114047241A公开了一种细菌活性电化学检测方法，其采用嘌呤作为电化学活性标记物，但细菌分泌至少2小时后释放的嘌呤含量才可检测出峰信号，耗时长且响应较低，其虽采用水浴加热促进检测细菌释放嘌呤，再通过悬液中嘌呤含量和种类的变化来检测细菌活性，但是水浴加热不仅会导致部分细菌菌体裂解死亡、氧化应激、进入活的不可培养的状态等特殊生理状态，而且无法区分所检测到的物质是细菌主动分泌还是裂解导致的胞内物质泄漏或是来源于菌体表面的胞外聚合物，干扰影响较大，准确度低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有细菌活性电化学检测方法准确度低且电化学活性标记物响应慢的缺陷，从而提供一种大肠杆菌活性的检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种大肠杆菌活性的电化学检测方法，包括：将大肠杆菌接种到M9培养基中进行培养，然后获取菌液上清液，最后采用三电极系统对菌液上清液中氢醌的含量变化进行电化学检测即可。

优选的，所述培养的温度为28-37℃；

和/或，所述培养的振荡转速为100-200rpm/min。

优选的，所述获取培养基上清液的过程包括：离心、过滤、除氧。

优选的，所述离心的转速为4000-8000rpm/min，离心的时长为10-15min；

和/或，所述离心的温度为4-10℃。

优选的，所述过滤采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。

优选的，所述除氧为通入氮气10min。

优选的，所述三电极系统包括工作电极、参比电极和辅助电极。

优选的，所述工作电极为碳电极、玻碳电极、金电极、铂电极中的一种；

和/或，所述工作电极在进行电化学检测前还进行打磨保养处理。

优选的，所述打磨保养处理的步骤包括：将电极在抛光绒布上用粒径为0.3μm的氧化铝抛光粉上进行镜面抛光，用超纯水冲洗电极表面以除去氧化铝粉末和其他杂质，用打磨好的电极检测浓度为5mM的铁氰化钾溶液，当其循环伏安法曲线的氧化还原电势差在100mV以内表示电极状态良好，可用于后续电化学测试。

优选的，所述参比电极为Ag/AgCl电极或甘汞电极。

优选的，所述辅助电极为铂丝电极。

优选的，所述电化学检测采用伏安法进行。

优选的，所述伏安法包括循环伏安法、方波伏安法、微分脉冲伏安法。

在本发明中，所述M9培养基为一种培养大肠杆菌的已知培养基，主要成分为葡萄糖和矿物盐。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.一种大肠杆菌活性的电化学检测方法，包括：将大肠杆菌接种到M9培养基中进行培养，然后获取菌液上清液，最后采用三电极系统对菌液上清液中氢醌的含量变化进行电化学检测即可。本发明选取氢醌作为大肠杆菌的电化学活性标记物，并以特定的M9培养基进行大肠杆菌的培养，使得大肠杆菌中的内源性电化学活性物质氢醌进行主动分泌，进而采用三电极系统检测大肠杆菌活体分泌的内源性氢醌。通过本方法可真实且正常的反映大肠杆菌的生理状态，而且不需要外源电子介体介导或进行电极修饰，可直接进行电化学检测获取氢醌的电化学信号，电化学活性标记物响应快，准确度较高，具有直接检测活性病原菌的潜力。

2.本发明提供的大肠杆菌活性的电化学检测方法，可以和其他技术联合使用，包括实时在线检测活细菌中物质的氧化还原反应并进行机理探究，应用前景好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中大肠杆菌生长后M9培养基以及未接种的M9培养基的微分脉冲伏安曲线图；

图2是本发明实施例2中大肠杆菌生长后M9培养基的微分脉冲伏安曲线图；

图3是本发明实施例3中大肠杆菌生长后M9培养基的微分脉冲伏安曲线图；

图4是本发明实施例4中采用分光光度法的对照组2以及采用平板计数法的对照组3的大肠杆菌生长曲线图；

图5是本发明实施例4中采用电化学方法检测的氢醌峰电流以及平板计数法的对照组3的大肠杆菌生长曲线图；

图6是本发明实施例5中不同浓度抑菌剂对电化学方法检测大肠杆菌的氢醌峰电流的微分脉冲伏安曲线图；

图7是本发明实施例5中在不同浓度抑菌剂作用后大肠杆菌活菌数和氢醌峰电流变化图；

图8是本发明实施例6中在大肠杆菌M9培养基上清液中添加1mM氢醌标品前后的方波伏安曲线图；

图9是本发明实施例6中通过液相色谱法检测氢醌标品与经过高效液相制备系统纯化后的大肠杆菌M9培养基上清液所得的液相色谱图；

图10是本发明实施例6中气相色谱-质谱检测氢醌标品所得的质谱图；

图11是本发明实施例6中气相色谱-质谱检测经过高效液相制备系统纯化后的大肠杆菌M9培养基上清液所得的质谱图；

图12是对比例1中大肠杆菌生长后LB培养基以及未接种的LB培养基的微分脉冲伏安曲线图；

图13是对比例2中大肠杆菌生长后且进行水浴加热预处理的M9培养基以及未接种的M9培养基的微分脉冲伏安曲线图；

图14是对比例3中采用大肠杆菌以外的其他细菌生长后的M9培养基以及未接种的M9培养基的微分脉冲伏安曲线图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例提供一种大肠杆菌活性的电化学检测方法，包括如下步骤：

1)先将工作电极在抛光绒布上采用粒径为0.3μm的氧化铝抛光粉进行镜面抛光，随后采用超纯水冲洗工作电极表面以除去氧化铝粉末和其他杂质，再采用打磨好的电极检测浓度为5mM的铁氰化钾溶液，打磨至循环伏安法曲线的氧化还原电势差不高于100mV；

2)将大肠杆菌ATCC 25922接种到M9培养基中，初始大肠杆菌浓度OD600为0.008，同时设置一组未接种大肠杆菌的M9培养基进行空白对照，随后置于恒温摇床中进行培养，所述培养的温度为37℃，振荡转速为150rpm/min，然后培养16h取菌液5mL，随后在4℃的温度下，以5000rpm/min的转速进行离心10min，然后采用孔径为0.22μm的滤膜过滤以去除大肠杆菌菌体，随后通入氮气10min以去除菌液上清液中的氧气，最后通过三电极系统并采用微分脉冲伏安法对上述菌液上清液以及空白对照组的菌液上清液进行电化学检测，记录氢醌的峰电流值ip，其中氢醌的电位为+0.25V，本实施例的三电极系统中，采用玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。

根据图1可知，相比于未接种的M9培养基，大肠杆菌生长后的M9培养基在+0.25V出现明显峰信号，其中+0.25V电位为氢醌的电位。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，接种的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，培养温度为28℃，培养的振荡转速为100rpm/min，离心的转速为4000rpm/min，离心的时长为15min，离心的温度为10℃，培养8h，采用方波伏安法进行检测，其他条件与实施例1相同，氢醌峰电流检测结果如图2所示。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，接种的大肠杆菌为大肠杆菌CMCC 44102，培养的振荡转速为200rpm/min，离心的转速为8000rpm/min，培养12h，采用方波伏安法进行检测，其他条件与实施例1相同，氢醌峰电流检测结果如图3所示。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h、32h取菌液5mL进行氢醌检测；

其中，还设置两组对照组进行对照试验，对照组1采用分光光度法检测大肠杆菌活性，具体步骤为：取菌液进行吸光度测定时，记录菌液在600nm下的吸光度；对照组2采用平板计数法检测大肠杆菌活性，具体步骤为：取菌液进行平板计数，采用倾注法，平板置于恒温培养箱中培养24h，记录平板活菌数，计算每毫升菌液的活菌数lg值，检测结果如图4和图5所示。

根据图4可知，平板计数法测得的活菌数在0-12h持续增长、12-24h保持稳定，24-32h呈现下降趋势，分光光度法测得的吸光度虽在0-12h同平板计数法测得的活菌数的持续增长趋势相近、但在12-32h区间一直保持稳定，由此可见，分光光度法不能区分死菌与活菌，无法反映大肠杆菌的真实活性。

根据图5可知，通过本发明的电化学检测方法测得的氢醌的峰电流与平板计数法所绘制的生长曲线的整体趋势大致接近，均在24-32h出现下降趋势，由此证明本发明采用电化学检测方法比分光光度法更加准确，可用于细菌活性检测，且较于平板计数法更快速、简便。

实施例5

本实施例采用本发明的电化学检测方法对抑菌剂处理后的大肠杆菌进行药物抑菌性评价试验，具体包括如下步骤：

1)先将工作电极在抛光绒布上采用粒径为0.3μm的氧化铝抛光粉进行镜面抛光，随后采用超纯水冲洗工作电极表面以除去氧化铝粉末和其他杂质，再采用打磨好的电极检测浓度为5mM的铁氰化钾溶液，打磨至循环伏安法曲线的氧化还原电势差不高于100mV；

2)将大肠杆菌接种到铜离子浓度分别为0μmol/L、12.5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的M9培养基中，初始大肠杆菌浓度为0.3，同时设置一组未接种大肠杆菌的M9培养基进行空白对照，随后置于恒温摇床中进行培养14h，所述培养的温度为37℃，振荡转速为150rpm/min，取菌液5mL，随后在4℃的温度下，以5000rpm/min的转速进行离心10min，然后采用孔径为0.22μm的滤膜过滤以去除大肠杆菌菌体，随后通入氮气10min以去除菌液上清液中的氧气，最后通过三电极系统并采用微分脉冲伏安法对上述菌液上清液以及空白对照组的菌液上清液进行电化学检测，记录氢醌(+0.25V)的峰电流值ip，本实施例的三电极系统中，采用玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。

其中，还设置一组对照组进行对照试验，对照组通过平板计数法来进行药物抑菌性评价，具体步骤为：将大肠杆菌接种到含浓度分别为0μmol/L、12.5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L铜离子的M9培养基中，随后置于恒温摇床中进行培养16h，所述培养的温度为37℃，振荡转速为150rpm/min，取菌液进行平板计数，采用倾注法，平板置于恒温培养箱中培养24h，记录平板活菌数，计算每毫升菌液的活菌数lg值。

根据图6可知，随着抑菌剂浓度增大，上清液峰电流值也逐渐下降，根据图7可知，随着抑菌剂浓度增大，活菌数lg值逐渐下降，表明本发明的电化学检测方法与平板计数法的趋势大致相似，证明本发明的电化学检测方法检测大肠杆菌培养液可用于大肠杆菌活性的表征和药物抑菌性的评价。

实施例6

本实施例将氢醌标准品与大肠杆菌M9培养基上清液进行对比，采用方波伏安法、液相色谱法、气质联用确证+0.25V氧化峰归因于氢醌；

按照实施例1中的方法取大肠杆菌M9培养基上清液，玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，采用方波伏安法对培养8h的大肠杆菌M9培养基上清液进行电化学测试，然后往M9培养基上清液中添加1mM氢醌标品，测试结果如图8所示，观察到+0.25V氧化峰升高，说明M9培养基上清液中的+0.25V氧化峰归因于氢醌，+0.15V氧化峰归因于氢醌的中间态(半醌)，这是由于氢醌标品与细菌活体中的氢醌存在氧化还原状态差异；

进一步地，通过高效液相色谱制备系统分离出具有+0.25V氧化峰的物质，与氢醌标品对比，通过分析液相和气质进行鉴定，具体条件如下：

制备液相色谱条件：仪器Waters Prep 150LC，色谱柱Sunfire Prep C18OBD(19×250mm，5μm)，流动相10％甲醇+90％水(0.5％乙酸)，进样量1mL，15mL/min等度洗脱，2D通道270nm；

分析液相色谱条件：仪器岛津LC-20AT，色谱柱Sepax Bio-C18(4.6×250mm，5μm)，流动相43％甲醇+56％水+1％乙酸，进样量20μL，0.7mL/min等度洗脱，检测波长270nm；

气质条件：仪器Agilent 5977B MSD质谱仪连接Agilent 7890B GC系统，色谱柱Agilent HP-5(30m×250μm×0.25μm)，进样口温度260℃，GC条件：初始温度70℃，以15℃/min的速度升温至200℃，再以20℃/min的速度升温至300℃，保持1min，总运行14.667min，采集以全扫模式进行；

检测结果：分析液相色谱图如图9所示，氢醌标品的保留时间为4.929min，大肠杆菌M9培养基上清液中存在保留时间一致的物质，说明其中含有氢醌。气相色谱-质谱联用检测氢醌标品，如图10所示，氢醌的特征离子为109.95、80.94、52.98，同样的，对大肠杆菌M9培养基上清液进行检测，如图11所示，特征离子为109.95、80.94、52.98，进一步说明大肠杆菌M9培养基上清液中含有氢醌。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，采用常规LB培养基替换M9培养基，其他条件与实施例1相同，电化学测试结果如图12所示；

根据图12可知，在LB培养基中测不到+0.25V的氢醌。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，对细菌混悬液进行检测前水浴加热处理，水浴加热温度为50℃，水浴时间为10min，其他条件与实施例1相同，电化学测试结果如图13所示；

根据图13可知，未见氢醌的氧化峰，说明此法无法进行氢醌的检测。

对比例3

将蜡样芽孢杆菌ATCC 14579、荧光假单胞菌ATCC 13525、金黄色葡萄球菌ATCC25923从LB琼脂斜面上接种至M9培养基，随后置于恒温摇床中进行培养，所述培养的温度分别为30、30、37℃，振荡转速为150rpm/min，然后培养16h取菌液5mL，随后在4℃的温度下，以5000rpm/min的转速进行离心10min，然后采用孔径为0.22μm的滤膜过滤，随后通入氮气10min以去除菌液上清液中的氧气，最后通过三电极系统并采用方波伏安法对上述菌液上清液以及空白对照组的菌液上清液进行电化学检测，采用玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。电化学测试结果如图14所示；

结果发现，这三种细菌都无法在M9培养基中生长，也没有检测到氢醌的氧化峰，说明M9培养基存在一定的选择性，本发明M9培养基和大肠杆菌的组合产生氢醌，进而实现活性检测，是培养基与菌群双向选择产生的结果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌活性的电化学检测方法，其特征在于，包括：将大肠杆菌接种到M9培养基中进行培养，然后获取菌液上清液，最后采用三电极系统对菌液上清液中氢醌的含量变化进行电化学检测即可。

2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，所述培养的温度为28-37℃；

和/或，所述培养的振荡转速为100-200rpm/min。

3.根据权利要求1或2所述的电化学检测方法，其特征在于，所述获取培养基上清液的过程包括：离心、过滤、除氧。

4.根据权利要求3所述的电化学检测方法，其特征在于，所述离心的转速为4000-8000rpm/min，离心的时长为10-15min；

和/或，所述离心的温度为4-10℃。

5.根据权利要求1-4任一项所述的电化学检测方法，其特征在于，所述三电极系统包括工作电极、参比电极和辅助电极。

6.根据权利要求5所述的电化学检测方法，其特征在于，所述工作电极为碳电极、玻碳电极、金电极、铂电极中的一种。

7.根据权利要求5或6所述的电化学检测方法，其特征在于，所述参比电极为Ag/AgCl电极或甘汞电极。

8.根据权利要求5-7任一项所述的电化学检测方法，其特征在于，所述辅助电极为铂丝电极。

9.根据权利要求1-8任一项所述的电化学检测方法，其特征在于，所述电化学检测采用伏安法进行。

10.根据权利要求9所述的电化学检测方法，其特征在于，所述伏安法包括循环伏安法、方波伏安法、微分脉冲伏安法。