CN107677716A - 一种基于AuPdCu/N‑GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于AuPdCu/N‑GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于AuPdCu/N‑GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用。采用基于AuPdCu/N‑GQDs@PS构建电化学免疫传感器，实现了对乙型病毒性肝炎标志物的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，对乙肝疾病的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用，属于新型功能纳米材料、免疫分析以及生物传感检测技术领域。
背景技术
目前，在世界范围内仍有许多疾病困扰着人类，其中由乙型肝炎病毒（HBV）引起的乙型病毒性肝炎在发展中国家发病率高，严重威胁着人类的健康。据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者超过2.8亿，其中我国约占1.3亿。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是HBV感染后第一个出现的血清学标志物，也是诊断乙肝炎的重要指标之一，由于乙型病毒性肝炎的特点为起病较缓，不易被发现，因此在临床研究上，采用快速、简便、灵敏地检测的方法对乙型病毒性肝炎的早期诊断、预防和治疗具有十分重要的意义。
目前对于乙型肝炎表面抗原的检测方法很多，如目前常用于检测HBsAg的免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附方法、放射免疫法、荧光标记物方法和电化学发光免疫分析方法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高。因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的临床意义。
免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，使它具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等活性生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。
以1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）作为前驱物合成的聚合物纳米微球（PS），具有良好的生物相容性及导电性，能够很好的固定抗体并加速电子传递，且具有较大的比表面积，能够有效地负载氮掺杂石墨烯量子点功能化金钯铜三合金(AuPdCu/N-GQDs)；氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）有丰富的含氧基团，具有良好的水溶性，与金钯铜三合金纳米粒子（AuPdCu NPs）产生良好的协同作用，合成的AuPdCu/N-GQDs具有良好的催化性能，对于提高传感器灵敏度具有重要作用。
本发明提供了一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对乙型肝炎病毒标记物的灵敏检测。
发明内容
本发明的目的之一是基于功能性纳米材料AuPdCu/N-GQDs@PS，构建了一种快速超灵敏的无标记型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将基于AuPdCu/N-GQDs@PS构建的无标记型电化学免疫传感器应用于乙型肝炎病毒标记物的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，其制备步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、2.0 ~ 4.0 mg/mL的AuPdCu/N-GQDs@PS溶液滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原HBsAg溶液滴涂在上述修饰好的电极上，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器。
2. 如权利要求1所述一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，所述AuPdCu/N-GQDs@PS的制备，包括以下几个步骤：
（1）PS的制备：5 mg的1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）溶解与5 mL甲醇中，超声分散至均匀，然后将溶液暴露在阳光下照射2 h，分解为缺质子化的Fc-COO–和Fe3+，配位聚合后，溶液颜色由黄色变为褐色，产生沉淀，离心，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空干燥6 h，然后将PS保存在PBS（pH = 6.98）中为进一步使用；
（2）N-GQDs的制备：2 g柠檬酸和1 g的双氰胺混合，加入5 mL超纯水，然后，将混合物转移到25 mL的不锈钢高压反应釜中，在反应温度160 ~ 200 ℃，加热10 ~ 14 h，最终将产品分散在100 mL超纯水中，以10000 rpm转速，离心10 min，除去粒径大的粒子，收集上清溶液，得到N-GQDs；
（3）AuPdCu/N-GQDs的制备：13.9 mg氯化铜，10.6 mg氯化钯和0.5 mL的氯金酸（1 wt%）溶解在2.5 mL盐酸（0.5 mol/mL）中，超声30 min，然后将3 ~ 7 mL的N-GQDs溶液（20 mg/L）混合至上述溶液中，在磁力搅拌下用氢氧化钠调节pH为10，将混合物转移至高压反应釜中，反应温度160 ~ 200 ℃，反应时间为4 ~ 8 h，得沉淀物，以8000 rpm转速，每次10 min离心洗涤3次，30 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs；
（4）AuPdCu/N-GQDs@PS的制备：AuPdCu/N-GQDs通过静电引力固定在PS上，首先，1.0 mL带负电荷的PS溶液和1.0 ~ 3.0 mL带正电荷的聚乙烯亚胺溶液分散在5.0 mL超纯水中，摇动1 h，离心分离得到带正电荷的PS溶液，再加入0.5 ~ 1.5 mL制备好的带负电荷的AuPdCu/N-GQDs溶液，摇动1 h，然后用超纯水离心洗涤，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs@PS。
3. 如权利要求1所述的制备方法制备一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器，用于乙型肝炎表面抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.84 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 6.81磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
4. 如权利要求1、2、3和4所述的乙型肝炎表面抗原，其特征在于，所述乙型肝炎标志物选自下列之一：乙型肝炎表面抗原HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBcAg、乙肝病毒e抗原HBeAg。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人首次将AuPdCu/N-GQDs@PS引入到乙型肝炎表面抗原的电化学免疫传感器的制备当中，利用AuPdCu/N-GQDs@PS优异的生物相容性和催化性能，使得所制作的传感器具有高的灵敏度和宽的检测范围，对不同乙型肝炎病毒标志物进行检测，其中对乙型肝炎表面抗原HBsAg的检测线性范围为10 fg/mL～100 ng/mL，检测限为3.3 fg/mL，对乙肝病毒e抗原HBeAg的检测线性范围为15 fg/mL ~ 80 ng/mL，检测限为5.0 fg/mL；对乙肝病毒核心抗原HBcAg的检测线性范围为8.0 fg/mL ~ 50 ng/mL，检测限为2.7 fg/mL，表明一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器可以达到准确测定乙型肝炎病毒标志物的目的。
（2）采用了具有良好生物相容性的PS作为负载材料，一方面能够很好的固定捕获抗体，另一方面作为电子媒介体可以加速电子转移速率，进一步提高了传感器的稳定性。
（3）采用AuPdCu/N-GQDs纳米材料，具有良好的导电性，且对过氧化氢有优异的催化作用，从而提高了传感器的灵敏度。
（4）AuPdCu/N-GQDs与PS通过静电引力结合形成稳定结构AuPdCu/N-GQDs@PS，在检测抗原过程中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了检测乙型肝炎表面抗原制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，操作步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、2.0 mg/mL的AuPdCu/N-GQDs@PS溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 µg/mL乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续将3 µL、0.5 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 µL、10 fg/mL～100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴涂在上述修饰好的电极上，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器。
实施例2. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，操作步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、3.0 mg/mL的AuPdCu/N-GQDs@PS溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、10 µg/mL乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 µL、10 fg/mL～100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原HBsAg溶液滴涂在上述修饰好的电极上，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器。
实施例3. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、4.0 mg/mL的AuPdCu/N-GQDs@PS溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、12 µg/mL乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续将3 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 µL、10 fg/mL～100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原HBsAg溶液滴涂在上述修饰好的电极上，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器。
实施例4. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述，AuPdCu/N-GQDs的制备包括以下步骤：
（1）N-GQDs的制备：2 g柠檬酸和1 g的双氰胺混合，加入5 mL超纯水，然后，将混合物转移到25 mL的不锈钢高压反应釜中，在160 ℃加热10 h，最终将产品分散在100 mL纯水中，以10000 rpm转速，离心10 min，除去粒径大的粒子，收集上清溶液，得到N-GQDs；
（2）AuPdCu/N-GQDs的制备：13.9 mg氯化铜，10.6 mg氯化钯和0.5 mL的氯金酸（1 wt%）溶解在2.5 mL盐酸（0.5 mol/mL）中，超声30 min，然后将3 mL的N-GQDs（20 mg/L）混合至上述溶液中，在磁力搅拌下用氢氧化钠调节pH为10，将混合物转移至高压反应釜中在160 ℃，反应4 h，反应得沉淀物，以8000 rpm转速，每次10 min离心洗涤3次，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs。
实施例5. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述AuPdCu/N-GQDs的制备包括以下步骤：
（1）N-GQDs的制备：2 g柠檬酸和1 g的双氰胺混合，加入5 mL超纯水，然后，将混合物转移到25 mL的不锈钢高压反应釜中，在180 ℃加热12 h，最终将产品分散在100 mL纯水中，以10000 rpm转速，离心10 min，除去粒径大的粒子，收集上清溶液，得到N-GQDs；
（2）AuPdCu/N-GQDs的制备：13.9 mg氯化铜，10.6 mg氯化钯和0.5 mL的氯金酸（1 wt%）溶解在2.5 mL盐酸（0.5 mol/mL）中，超声30 min，然后将5 mL的N-GQDs（20 mg/L）混合至上述溶液中，在磁力搅拌下用氢氧化钠调节pH为10，将混合物转移至高压反应釜中，在180℃，反应6 h，反应得沉淀物，以8000 rpm转速，每次10 min离心洗涤3次，25 ℃真空干燥12h，得到AuPdCu/N-GQDs。
实施例6. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述AuPdCu/N-GQDs的制备，包括以下步骤：
（1）N-GQDs的制备：2 g柠檬酸和1 g的双氰胺混合，加入5 mL超纯水，然后，将混合物转移到25 mL的不锈钢高压反应釜中，在200 ℃加热14 h，最终将产品分散在100 mL纯水中，以10000 rpm转速，离心10 min，除去粒径大的粒子，收集上清溶液，得到N-GQDs；
（2）AuPdCu/N-GQDs的制备：13.9 mg氯化铜，10.6 mg氯化钯和0.5 mL的氯金酸（1 wt%）溶解在2.5 mL盐酸（0.5 mol/mL）中，超声30 min，然后将7 mL的N-GQDs（20 mg/L）混合至上述溶液中，在磁力搅拌下用氢氧化钠调节pH为10，将混合物转移至高压反应釜中，在200℃，反应8 h，反应得沉淀物，以8000 rpm转速，每次10 min离心洗涤3次得到产品，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs。
实施例7. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述AuPdCu/N-GQDs@PS的制备，包括以下步骤：
（1）PS的制备：5 mg的1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）溶解于5 mL甲醇中，超声分散至均匀，然后将溶液暴露在阳光下照射1 h，在阳光的照射下分解为缺质子化的Fc-COO–和Fe3+，配位聚合后，溶液颜色由黄色变为褐色，产生沉淀，离心，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空干燥6h，然后将PS保存在PBS（pH = 6.98）中为进一步使用；
（2）AuPdCu/N-GQDs@PS的制备：AuPdCu/N-GQDs通过静电引力固定在PS上，首先，1.0 mL带负电荷的PS溶液和1.0 mL带正电荷的聚乙烯亚胺溶液分散在5.0 mL超纯水中，摇动1h，离心分离得到带正电荷的PS溶液，再加入0.5 mL制备好的带负电荷的AuPdCu/N-GQDs溶液，摇动1 h，然后用超纯水离心洗涤，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs@PS。
实施例8. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述AuPdCu/N-GQDs@PS的制备，包括以下步骤：
（1）PS的制备：5 mg的1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）溶解于5 mL甲醇中，超声分散至均匀，然后将溶液暴露在阳光下照射2 h，在阳光的照射下分解为缺质子化的Fc-COO–和Fe3+，配位聚合后，溶液颜色由黄色变为褐色，产生沉淀，离心，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空干燥6h，然后将PS保存在PBS（pH = 6.98）中为进一步使用；
（2）AuPdCu/N-GQDs@PS的制备：AuPdCu/N-GQDs通过静电引力固定在PS上，首先，1.0 mL带负电荷的PS溶液和2.0 mL带正电荷的聚乙烯亚胺溶液分散在5.0 mL超纯水中，摇动1 h，离心分离得到带正电荷的PS溶液，再加入1.0 mL制备好的带负电荷的AuPdCu/N-GQDs溶液，摇动1 h，然后用超纯水离心洗涤，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs@PS。
实施例9. 一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法中所述AuPdCu/N-GQDs@PS的制备，包括以下步骤：
（1）PS的制备：5 mg的1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）溶解于5 mL甲醇中，超声分散至均匀，然后将溶液暴露在阳光下照射3 h，在阳光的照射下分解为缺质子化的Fc-COO–和Fe3+，配位聚合后，溶液颜色由黄色变为褐色，产生沉淀，离心，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空干燥6h，然后将PS保存在PBS（pH = 6.98）中为进一步使用；
（2）AuPdCu/N-GQDs@PS的制备：AuPdCu/N-GQDs通过静电引力固定在PS上，首先，1.0 mL带负电荷的PS溶液和2.0 mL带正电荷的聚乙烯亚胺溶液分散在5.0 mL超纯水中，摇动1 h，离心分离得到带正电荷的PS溶液，再加入1.5 mL制备好的带负电荷的AuPdCu/N-GQDs溶液，摇动1 h，然后用超纯水离心洗涤，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs@PS。
实施例10. 所构建的免疫传感器，用于乙型肝炎表面抗原HBsAg的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.84 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 6.81磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与乙型肝炎表面抗原HBsAg浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得其线性范围为10 fg/mL ~ 100 ng/mL，检测限为3.3 fg/mL。
乙肝病毒e抗原HBeAg的检测：
绘制工作曲线步骤同实例10，按照绘制工作曲线的方法对乙肝病毒e抗原HBeAg进行样品分析，测得其线性范围为15 fg/mL ~ 80 ng/mL，检测限为5.0 fg/mL。
乙肝病毒核心抗原HBcAg的检测：
绘制工作曲线步骤同实例10，按照绘制工作曲线的方法对乙肝病毒核心抗原HBcAg进行样品分析，测得其线性范围为8.0 fg/mL ~ 50 ng/mL，检测限为2.7 fg/mL。

Claims (5)

1.一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，其特征包括以下几个步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、2.0 ~ 4.0 mg/mL的AuPdCu/N-GQDs@PS溶液滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL乙型肝炎表面抗体anti-HBs溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）将6 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原HBsAg溶液滴涂在上述修饰好的电极上，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，所述AuPdCu/N-GQDs的制备，步骤如下：
（1）N-GQDs的制备：2 g柠檬酸和1 g的双氰胺混合，加入5 mL超纯水，然后，将混合物转移到25 mL的不锈钢高压反应釜中，在反应温度160 ~ 200 ℃，加热10 ~ 14 h，最终将产品分散在100 mL超纯水中，以10000 rpm转速，离心10 min，除去粒径大的粒子，收集上清溶液，得到N-GQDs；
（2）AuPdCu/N-GQDs的制备：13.9 mg氯化铜，10.6 mg氯化钯和0.5 mL的氯金酸（1 wt%）溶解在2.5 mL盐酸（0.5 mol/mL）中，超声30 min，然后将3 ~ 7 mL的N-GQDs溶液（20 mg/L）混合至上述溶液中，在磁力搅拌下用氢氧化钠调节pH为10，将混合物转移至高压反应釜中，反应温度160 ~ 200 ℃，反应时间为4 ~ 8 h，得沉淀物，以8000 rpm转速，每次10 min离心洗涤3次，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs。
3.如权利要求1所述的一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器的制备方法，所述PS和AuPdCu/N-GQDs@PS的制备，步骤如下：
（1）PS的制备：5 mg的1,1'-二茂铁二甲酸（FcCOOH）溶解于5 mL甲醇中，超声分散至均匀，然后将溶液暴露在阳光下照射1 ~ 3 h，在阳光的照射下分解为缺质子化的Fc-COO–和Fe3+，配位聚合后，溶液颜色由黄色变为褐色，产生沉淀，离心，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空干燥6 h，将PS保存在PBS（pH = 6.98）中为进一步使用；
（2）AuPdCu/N-GQDs@PS的制备：AuPdCu/N-GQDs通过静电引力固定在PS上，首先，1.0 mL带负电荷的PS溶液和1.0 ~ 3.0 mL带正电荷的聚乙烯亚胺溶液分散在5.0 mL超纯水中，摇动1 h，离心分离得到带正电荷的PS溶液，再加入0.5 ~ 1.5 mL制备好的带负电荷的AuPdCu/N-GQDs溶液，摇动1 h，然后用超纯水离心洗涤，25 ℃真空干燥12 h，得到AuPdCu/N-GQDs@PS。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于AuPdCu/N-GQDs@PS的免疫传感器，用于乙型肝炎表面抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.84 ~ 8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 6.81的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
5.根据权利要求1、2、3和4所述的乙型肝炎表面抗原，其特征在于，所述乙型肝炎病毒标志物选自下列之一： 乙型肝炎表面抗原HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBcAg、乙肝病毒e抗原HBeAg。
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