CN107024520A - 一种基于碳点检测atp的修饰电极及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法，属电致化学发光生物传感器及其制备技术领域。该修饰电极仅由未经标记的三磷酸腺苷ATP适配体和氮掺杂碳量子点NCQDs构成；制备过程包括将NCQDs悬浊液和ATP适配体溶液依次滴涂到玻碳基础电极上即可，没有使用成膜剂；该修饰电极具有组成结构及制备过程简单、无标记等优势，可用于快速灵敏地检测ATP，并具有检测限低、线性范围宽等优势。

Description

一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种基于碳点检测ATP的修饰电极及其制备方法。
背景技术
三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“能量通货”，它在细胞代谢和细胞生理生化途径中起重要作用。ATP的浓度和及其消耗率是许多疾病的指示剂，例如缺氧、低血糖和帕金森氏病等。因此，ATP的快速高效测定，在生物化学研究与临床医学诊断中都有非常重要的意义。
近年来，适配体(aptamer)作为识别元件能高效、特异性地结合目标生物小分子，为化学生物学和生物医学提供了一种新的研究平台。由于其自身稳定性好、制备合成相对简单、易获得、易功能化修饰与标记等优势，在生物传感器设计中成为研究热点。
在文献(1) 中国发明专利公开号CN 101936945 A中，徐国宝等人设计了一种检测ATP的传感器，其修饰电极的设计原理如下：将ATP适配体链分成两个序列，分别为DNA单链和部分DNA双链中第一链3’末端，提供部分DNA双链中第二链，其与所述部分DNA双链中第一链5’末端互补，从而可形成部分DNA双链。将表面固定有DNA单链的金电极浸入所述部分DNA双链与待测样品的混合液中后，以钌化合物作为电化学发光探针对所述金电极进行电致化学发光(ECL)检测。由于钌化合物配体较大的芳香环具有嵌入DNA双链结构的功能，因此，在不存在ATP的情况下，所述DNA单链与所述部分DNA双链相互间不结合，因此很少有钌化合物到达电极表面，从而不产生或产生微弱的ECL信号；当有ATP存在时，在ATP诱导下DNA单链和部分DNA双链及ATP结合，在电极表面形成复合物。作为ECL探针，钌化合物通过嵌入DNA双链结构到达电极表面，产生较强的ECL信号，实现对ATP的检测。但该工作采用将探针分子钌化合物嵌入到DNA双链结构与单链DNA共同作用实现对ATP的检测，会导致适配体与ATP结合力下降的问题，并且电极制备及测试操作过程较复杂。
在文献(2) Analytical Chemistry, 2014, 86: 8735-8741中，Yueting Liu等人设计了一种“三明治”结构的传感器来检测ATP，其修饰电极的设计原理如下：“三明治”结构是通过两个杂交反应来实现，首先玻碳电极表面固定上量子点的DNA1与ATP适配体杂交，然后修饰有DNA2的信号探针与适配体杂交，从而形成三明治结构。当目标检测物ATP不存在时，信号探针可以消耗溶解氧导致共反应试剂的消耗，使得ECL强度降低，当目标检测物ATP存在时，ATP与适配体结合，导致适配体脱离电极表面，因此信号探针在电极表面有较低的负载量，实现了目标分析物诱导的结构转换，引起ECL强度的增加，从而实现ATP的检测。该工作采用信号探针标记的方法设计了一种“三明治”结构来检测ATP，但该方法利用两次杂交使适配体与其互补链互补，导致适配体与ATP结合力下降，同时采用标记物标记，测试操作过程较复杂。
在文献(3) Biosensors and Bioelectronics, 2013, 47: 271-277中，JuanjuanLu等人利用ATP适配体设计了一种检测ATP的传感器，其修饰电极的设计原理如下：将ATP适配体分成两段分别为DNA1与DNA2（DNA2的3’末端修饰上二氧化硅与石墨烯量子点GQDs的复合物），首先DNA1通过金硫键固定于金电极表面，将电极用巯基乙醇行封闭，再将电极浸入含有DNA2与ATP的溶液中，在ATP存在的情况下，DNA1、DNA2和ATP结合在一起，因此GQDs固定于电极表面，引起ECL强度的增加，ATP浓度越高，电极表面石墨烯量子点负载量越多，因此ECL强度越高，据此实现对ATP的检测。该方法中GQDs具有低毒性和较好生物相容性，但该方法需要对ATP适配体链末端进行修饰，以将量子点修饰到适配体链上产生信号，此操作引起适配体与ATP结合力降低的问题，且测试操作过程较复杂。
发明内容
在已报道的基于ATP适配体检测ATP的文献中，修饰电极测试原理及修饰电极制备过程均较复杂，亟需设计制备测试原理简单、制备过程简便、无标记且成本低廉的修饰电极。
因此本发明提出了一种基于ATP适配体检测ATP的修饰电极的新设计原理，如图1所示。修饰上氮掺杂碳量子点NCQDs的玻碳电极在含有共反应试剂K2S2O8的磷酸缓冲液PBS中，有较强的ECL响应，当在电极表面继续修饰ATP适配体后，由于适配体与NCQDs间的π-π作用及分子间相互作用，适配体平铺在电极表面，使得NCQDs与K2S2O8接触大幅降低，从而引起ECL强度下降，当ATP存在时，由于适配体与ATP特异性结合，导致适配体卷曲或者脱离电极表面，使得NCQDs暴露在电极表面，从而与K2S2O8接触，引起ECL强度增加，因此，在一定范围内，随着ATP浓度的增加，ECL强度不断增加。
本发明的目的在于提供一种利用上述设计原理且基于碳点检测ATP的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有NCQDs和ATP适配体；其中，NCQDs负载量为8.6×10-4~4.3×10-2 g/cm2，ATP适配体负载量为4.3×10-4~8.6×10-1 g/cm2。该修饰电极仅由未经标记的ATP适配体和NCQDs碳点构成，甚至没有使用到成膜剂，具有组成结构简单、无标记等优势。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述基于碳点检测ATP的修饰电极的方法，其特征在于，包括如下步骤。
(1) NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于去离子水中，配制成质量浓度为0.1~0.3 g/mL的浊液；将浊液置于190~230 ℃的烘箱中反应8~10 h，至浊液变成黄色固体；按照黄色固体与去离子水的固液比为0.01~0.10 g/mL的比例将黄色固体分散于去离子水中，以8000×g~10000×g的离心力离心，取上清液于30 kDa~40 kDa的高截留分子量超滤管中以4000×g~6000×g的离心力离心，将下层滤液用3 kDa~4 kDa的低截留分子量超滤管以4000×g~6000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所获得的上层滤液中继续加入去离子水以4000×g~6000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤6~10次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.01~0.5 mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4 ℃冰箱中备用。
(2) ATP适配体溶液的配制：将ATP适配体用去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为0.5~9 mg/mL的ATP适配体溶液。
(3) 玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0 μm、0.3μm、0.03 μm的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1 mol/L KCl的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80 mV以下，电极方可使用。
(4) 修饰电极的制备：用10 μL移液枪取6 μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电极表面，将电极置于4 ℃的冰箱中至电极表面微干，然后在电极表面滴加6 μL步骤(2)中制备的ATP适配体溶液，置于4 ℃的冰箱中晾干备用。
将上述制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，构成三电极体系，将三电极体系浸入pH为6~8的磷酸缓冲液PBS底液中，底液中含有浓度为0.8~1.2mol/L的共反应试剂K2S2O8，采用ECL进行检测，扫描电位范围为0 ~-1.9 V。待ECL信号强度稳定后，依次向底液中注入不同浓度的ATP溶液，继续进行测试，以ATP浓度的对数（Log(CATP)）为横坐标，ECL强度为纵坐标作图，建立标准工作曲线。本发明修饰电极用于ATP的检测，检测限低至pmol/L量级，且具有较宽的线性检测范围，检测性能高于大多数基于ATP适配体检测ATP的文献。
电极的修饰过程及对ATP的识别结合过程，可以通过阻抗谱(EIS)进行监测，如图2所示；可以看出，从裸玻碳电极到修饰上适配体，每一步修饰均会引起EIS的增加，直到将一定浓度的ATP加入到检测底液(含5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl)中后，由于ATP与适配体的结合导致EIS的降低。同样，将电极修饰过程的每一步与识别ATP过程进行ECL测试，如图3所示；可以看出，裸玻碳电极几乎没有ECL响应，当NCQDs作为电致发光材料修饰到玻碳电极上，在共反应试剂K2S2O8存在的条件下，其ECL强度达到最强，随着适配体修饰到电极上，其ECL强度大幅下降，后由于ATP与适配体特异性结合，使得ECL强度增加。
本发明的特点及优势在于：(1) 本发明的修饰电极仅由未经标记的ATP适配体和NCQDs构成，修饰电极结构及其制备过程简单，并且所制备的修饰电极具有较低的检测限及较宽的线性范围；(2) NCQDs作为电致发光材料，具有无毒、生物相容性好、低制备成本和强且稳定的电化学信号等优势。
附图说明
图1为本发明基于碳点检测ATP的修饰电极设计原理图。
图2为本发明基于碳点检测ATP的修饰电极制备过程及其应用于检测浓度为40nmol/L的ATP的阻抗表征。其中，横坐标为阻抗谱Z实部，单位：欧姆 (ohm)，纵坐标为阻抗谱-Z虚部，单位：欧姆 (ohm)。其中，曲线A为裸玻碳电极在检测底液(含5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl)中的阻抗谱曲线；曲线B为修饰上NCQDs的玻碳电极在检测底液(含5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl)中的阻抗谱曲线；曲线C为修饰上NCQDs与适配体的玻碳电极在检测底液(含5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl)中的阻抗谱曲线；曲线D为修饰上NCQDs与适配体后的玻碳电极在含有40 nmol/LATP的检测底液(含5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl)中的阻抗谱曲线。
图3为本发明基于碳点检测ATP的修饰电极制备过程及其应用于检测浓度为40nmol/L的ATP的ECL强度-时间（ECL-t）响应图。 其中，横坐标为时间（t），单位：秒（s），纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位（a.u.），曲线A为裸玻碳电极在含有1.0 mol/L K2S2O8的PBS溶液中的ECL曲线；曲线B为修饰上NCQDs的玻碳电极在含有1.0 mol/L K2S2O8的PBS溶液中的ECL曲线；曲线C为修饰上NCQDs与适配体的玻碳电极在含有1.0 mol/L K2S2O8的PBS溶液中的ECL曲线；曲线D为修饰上NCQDs与适配体的玻碳电极在含有40 nmol/L ATP与1.0 mol/LK2S2O8的PBS溶液中的ECL曲线。
图4为实施例1中基于碳点检测ATP的修饰电极对ATP检测的ECL强度-时间（ECL-t）图。其中，图中标注数字为ATP浓度，单位：皮摩尔/升 ( pmol/L )，横坐标为时间t，单位：秒(s)，纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位（a.u.）。
图5为实施例1中基于碳点检测ATP的修饰电极对ATP检测的标准曲线图。其中，横坐标为ATP浓度的对数（Log(CATP)），单位：无量纲，纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位（a.u.）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
实施例1
(1) NCQDs悬浊液的制备：取2 g二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于20 mL去离子水中，配制成质量浓度为0.1 g/mL的浊液；将浊液置于230 ℃的烘箱中反应9小时，至浊液变成黄色固体；取1.8 g黄色固体溶于20 mL去离子水中配制成质量浓度为0.09 g/mL的浊液，以9055×g的离心力离心，取上清液于30 kDa的高截留分子量超滤管中以5000×g的离心力离心，将下层滤液用3 kDa的低截留分子量超滤管以5000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所得的上层滤液中继续加入去离子水以5000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤8次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.2 mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4℃冰箱中备用。
(2) ATP适配体溶液的配制：取9.9 mg ATP适配体用4.95 mL去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为2 mg/mL的ATP适配体溶液。
(3) 玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0 μm、0.3 μm、0.03 μ的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1 mol/L KCl的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80 mV以下，电极方可使用。
(4) 修饰电极的制备：用10 μL移液枪取6 μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电极表面，将电极置于4 ℃的冰箱中至电极表面微干，然后在电极表面滴加6 μL步骤(2)中制备的ATP适配体溶液，置于4 ℃的冰箱中晾干备用。
以上述制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，构成三电极体系。将三电极体系浸入pH为7.2的磷酸缓冲液PBS底液中，底液中含有浓度为1.0 mol/L的共反应试剂K2S2O8，采用ECL方法进行检测，设置扫描电位范围为0 ~ -1.9 V，待ECL信号强度稳定后，向底液中注入浓度从低到高的ATP溶液，进行ECL测试，结果如图4所示。以ATP浓度的对数（Log(CATP)）为横坐标，ECL强度为纵坐标作图，建立标准曲线如图5所示，在ATP浓度为1~228 pmol/L时，ECL强度与ATP浓度的对数呈现良好的线性关系（R2= 0.997），检测限为：0.7 pmol/L。
实施例2
(1) NCQDs悬浊液的制备：取2 g二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于20 mL去离子水中，配制成质量浓度为0.1 g/mL的浊液；将浊液置于230 ℃的烘箱中反应9小时，至浊液变成黄色固体；取1.8 g黄色固体溶于20 mL去离子水中配制成质量浓度为0.09 g/mL的浊液，以9055×g的离心力离心，取上清液于30 kDa的高截留分子量超滤管中以5000×g的离心力离心，将下层滤液用3 kDa的低截留分子量超滤管以5000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所得的上层滤液中继续加入去离子水以5000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤8次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.1 mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4℃冰箱中备用。
(2) ATP适配体溶液的配制：取9.9 mg ATP适配体用1.98 mL去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为5 mg/mL的ATP适配体溶液。
(3) 玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0 μm、0.3 μm、0.03 μm的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1 mol/L KCl的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80 mV以下，电极方可使用。
(4) 修饰电极的制备：用10 μL移液枪取6 μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电极表面，将电极置于4 ℃的冰箱中至电极表面微干，然后在电极表面滴加6 μL步骤(2)中制备的ATP适配体溶液，置于4 ℃的冰箱中晾干备用。
以上述制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，构成三电极体系。将三电极体系浸入pH为7.2的磷酸缓冲液PBS底液中，底液中含有浓度为0.8 mol/L的共反应试剂K2S2O8，采用ECL方法进行检测，设置扫描电位范围为0 ~ -1.9V，待ECL信号强度稳定后，向底液中注入浓度从低到高的ATP溶液，进行ECL测试，得出在ATP浓度为10~190pM时，ECL强度与ATP浓度的对数呈现良好的线性关系（R2= 0.990），检测限为：7.6 pM。
实施例3
(1) NCQDs悬浊液的制备：取2 g二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于20 mL去离子水中，配制成质量浓度为0.1 g/mL的浊液；将浊液置于230 ℃的烘箱中反应9小时，至浊液变成黄色固体；取1.8 g黄色固体溶于20 mL去离子水中配制成质量浓度为0.09 g/mL的浊液，以9055×g的离心力离心，取上清液于30 kDa的高截留分子量超滤管中以5000×g的离心力离心，将下层滤液用3 kDa的低截留分子量超滤管以5000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所得的上层滤液中继续加入去离子水以5000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤8次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.5 mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4℃冰箱中备用。
(2) ATP适配体溶液的配制：取9.9 mg ATP适配体用4.95 mL去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为2 mg/mL的ATP适配体溶液。
(3) 玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0 μm、0.3 μm、0.03 μm的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1 mol/L KCl的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80 mV以下，电极方可使用。
(4) 修饰电极的制备：用10 μL移液枪取6 μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电极表面，将电极置于4 ℃的冰箱中至电极表面微干，然后在电极表面滴加6 μL步骤(2)中制备的ATP适配体溶液，置于4 ℃的冰箱中晾干备用。
以上述制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，构成三电极体系。将三电极体系浸入pH为7.5的磷酸缓冲液PBS底液中，底液中含有浓度为1.0 mol/L的共反应试剂K2S2O8，采用ECL方法进行检测，设置扫描电位范围为0 ~ -1.9V，待ECL信号强度稳定后，向底液中注入浓度从低到高的ATP溶液，进行ECL测试，得出在ATP浓度为30~210pM时，ECL强度与ATP浓度的对数呈现良好的线性关系（R2= 0.992），检测限为：18.91 pM。

Claims (2)

1.一种基于碳点检测三磷酸腺苷ATP的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有氮掺杂碳量子点NCQDs和ATP适配体；其中，NCQDs负载量为8.6×10-4~4.3×10-2 g/cm2，ATP适配体负载量为4.3×10-4~8.6×10-1 g/cm2。
2.一种制备权利要求1所述基于碳点检测ATP的修饰电极的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸DTPA白色粉末溶于去离子水中，配制成质量浓度为0.1~0.3 g/mL的浊液；将浊液置于190~230 ℃的烘箱中反应8~10小时，至浊液变成黄色固体；按照黄色固体与去离子水的固液比为0.01~0.10 g/mL的比例将黄色固体分散于去离子水中，以8000×g~10000×g的离心力离心，取上清液于30 kDa~40 kDa的高截留分子量超滤管中以4000×g~6000×g的离心力离心，将下层滤液用3 kDa~4 kDa的低截留分子量超滤管以4000×g~6000×g的离心力离心进一步离心，在该超滤管中所获得的上层滤液中继续加入去离子水以4000×g~6000×g的离心力离心分离，从而除去无机盐和低分子量的荧光小分子，重复该离心洗涤步骤6~10次，直到上层滤液变浅至微黄，则上层滤液为NCQDs悬浊液，将该NCQDs悬浊液配成浓度为0.01~0.5 mg/mL的NCQDs悬浊液，储存于4 ℃冰箱中备用；
(2) ATP适配体溶液的配制：将ATP适配体用去离子水溶解并充分震荡，配制成浓度为0.5~9 mg/mL的ATP适配体溶液；
(3) 玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极在麂皮上分别用1.0 μm、0.3 μm、0.03 μm的抛光粉Al2O3抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗，彻底洗涤后，在含有0.1 mol/L KCl的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，所得循环伏安图中的氧化峰和还原峰的电位差在80 mV以下，电极方可使用；
(4) 修饰电极的制备：用10 μL移液枪取6 μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(3)处理好的玻碳电极表面，将电极置于4 ℃的冰箱中至电极表面微干，然后在电极表面滴加6 μL步骤(2)中制备的ATP适配体溶液，置于4 ℃的冰箱中晾干备用。
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