CN108956732A - 一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法，属于电致化学发光传感器及其制备技术领域。该传感器的修饰电极是由氮掺杂碳量子点(NCQDs)与修饰了氨基的Pb2+适配体构成；制备过程包括将NCQDs悬浊液滴涂到玻碳电极表面、活化羧基、修饰了氨基的Pb2+适配体溶液滴涂到玻碳电极表面即可。该修饰电极的优点在于：制备过程方便简单、没有使用成膜剂，减少干扰，可用于快速高效灵敏地检测Pb2+、检测范围较宽、检测限低。该制备方法将NCQDs、Pb2+适配体与电致化学发光技术结合，实现了Pb2+简便、高效、快速检测。

Description

一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法
技术领域
本发明属于传感器技术领域，特别涉及一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法。
背景技术
重金属污染对大气、土壤、食品、水资源带来严重影响。其中Pb2+就是其中一种带来严重污染的重金属。Pb2+在人体中含量超标会导致中枢神经系统损伤、高血压、肾毒病等疾病；儿童体内Pb2+含量超标会导致儿童认知缺陷。因此，对Pb2+的快速灵敏度检测，在环境保护、医疗研究等方面有重要意义。
适配体是一段经体外筛选的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行强特异性和亲和性的结合。由于其制备过程较简单，易修饰与标记，因此在生物传感器中得以广泛应用。本研究适配体与目标Pb2+特异性结合，形成“G-四联体”结构，从而特异检测Pb2+。
在文献(1)中国发明专利公开号CN 105758922 A中，梁刚等人设计了一种基于光电化学DNA测定Pb2+的生物传感器。其设计原理如下：将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于氧化铟锡(ITO)电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光化学信号的降低，实现了对Pb2+的检测。
在文献(2)中国发明专利公开号CN 104237361 A中，周元斌等人设计了一种基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时检测Cd2+、Pb2+的电化学方法。其设计原理如下：首先选取氧化石墨烯为原料，通过控制氧化石墨与肼反应温度与反应时间，利用化学还原法制得纳米级片层结构的石墨烯制得石墨烯修饰电极；接着在所制得的石墨烯修饰电极表面进一步电聚合上L-半胱氨酸，制得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；最后，选取L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，利用差示脉冲阳极溶出伏安法对Pb2+和Cd2+同时进行电化学测定。
发明内容
本发明提出了一种基于Pb2+适配体检测Pb2+的修饰电极的新设计原理。如图1所示。在玻碳电极表面修饰的氮掺杂碳量子点(NCQDs)，当在含有共反应试剂K2S2O8的磷酸缓冲液(PBS)中，产生较强的光电致化学(ECL)信号，NCQDs表面羧基活化与适配体的氨基共价连接，使得适配体修饰在NCQDs表面，使得NCQDs与K2S2O8接触面积降低，引起ECL信号下降，当Pb2+存在时，由于适配体与Pb2+特异性结合，形成“G-四联体”结构，进一步阻碍NCQDs与K2S2O8接触，使得ECL信号进一步下降，并且在一定范围内，随着Pb2+的浓度的增加，ECL信号不断下降。
本发明的目的在于提供一种利用上述原理且基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有NCQDs和修饰氨基的Pb2+适配体；其中NCQDs负载量为3.54×10-2～7.08×10-1g/m2，Pb2+适配体负载量为7.08×10-3～7.08×10-1g/m2。该修饰电极仅由NCQDs碳量子点和Pb2+适配体构成，NCQDs碳量子点粒径仅为2～3nm，比表面积大，与电极表面有很强的吸附作用，而且Pb2+适配体与NCQDs碳量子点为化学连接，所以在不使用萘酚、壳聚糖等成膜剂等条件下Pb2+适配体仍能牢固修饰在电极表面，避免过度成分引入对传感器检测的准确性造成干扰，具有结构简单、稳定等优势。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极的制备方法，其工艺步骤如下：
(1)NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸(DTPA)白色粉末置于去离子水中，配制成质量为0.1～0.5g/mL的悬浊液；将悬浊液在180～230℃反应6～10.h，直至悬浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中混匀，以6000×g～10000×g的离心力离心，以去除未反应的DTPA，重复上述离心步骤，直到无沉淀，则获得NCQDs悬浊液，冻干，将冻干NCQDs粉末配成浓度为0.05～0.5mg/mL的NCQDs悬浊液，4℃保存备用；
(2)Pb2+适配体溶液的配制：将Pb2+适配体用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mg/mL的Pb2+适配体溶液。
(3)羧基活化溶液配制：将碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/mL EDC溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/mL的NHS溶液；将2-吗啉乙磺酸(MES)用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mol/L的MES缓冲液。将上述步骤配制好的EDC溶液、NHS溶液、MES缓存液混合均匀，备用。
(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min；
(5)修饰电极的制备：取5～10μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到3.54×10-2～7.08×10-1g/m2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液溶液中，孵育30～120min，将电极取出后用去离子水冲洗晾至微干，然后在电极表面滴加5～10μL步骤(2)中制备的Pb2+适配体溶液，使其负载量达到7.08×10-3～7.08×10-1g/m2，晾干，即为基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极，备用。
将上述制备的修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到pH为6～8，含有浓度为0.8～1.2mol/L的K2S2O8的PBS底液中。采用ECL进行检测，扫描电位范围为0～-1.8V，扫描速率为100mV/s，光电倍增管高压为800V。待ECL信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的Pb2+溶液，继续进行ECL检测，根据检测结果，以Pb2+溶液浓度的对数值即Log(CPb 2+)为横坐标，ECL强度为纵坐标作图，建立标准工作曲线。本发明修饰电极用于Pb2+检测，检测限较低，且线性检测范围较宽，检测性能高于大多数基于Pb2+适配体检测Pb2+的文献。
电极的修饰及对Pb2+的识别结合，可以通过阻抗谱(EIS)进行检测，如图2所示：随着电极的每一步修饰和Pb2+的加入与适配体特异性结合，都引起了EIS的增加。同样，如图3所示：将电极的每一步修饰和识别Pb2+的过程进行ECL测试，可以看出；裸玻碳电极基本没有ECL信号，修饰了NCQDs，ECL信号达到17000，进一步修饰Pb2+适配体，ECL信号下降至15000左右，当Pb2+加入到反应底液中，因Pb2+与适配体特异性结合，导致ECL信号进一步下降。
本发明的优点在于：制备过程仅使用NCQDs和Pb2+适配体修饰电极，没有使用成膜剂，修饰过程方便、简单、快捷；并且可以高效快速灵敏地检测Pb2+、检测范围较宽、检测限低，无干扰。该修饰电极将NCQDs、Pb2+适配体与电致化学发光技术结合，提出了一种检测Pb2 +修饰电极的制备新策略，实现了Pb2+简便、高效、快速的检测。
附图说明
图1为本发明基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极设计原理图。
图2为本发明基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极的修饰过程及其检测80nmol/L的Pb2+的阻抗表征。横坐标为阻抗谱Z实部，单位：欧姆(ohm)，纵坐标为阻抗谱-Z虚部，单位：欧姆(ohm)。其中曲线a表示裸电极阻抗谱曲线；曲线b是修饰有NCQDs的电极阻抗谱曲线；曲线c是基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极阻抗谱曲线；曲线d是基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极在含有80nmol/L Pb2+的阻抗谱曲线，上述检测底液为5mmol/LK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/LKCl。
图3为裸电极(a)、NCQDs电极(b)、基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极(c)及基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极在含有80nmol/L Pb2+的ECL强度-时间(ECL-t)响应图。横坐标为时间(t)，单位：秒(s)，纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位(a.u.)。其中曲线a、b、c检测底液为1.0mol/L的K2S2O8的PBS溶液，曲线d检测底液为除上述溶液外含有80nmol/L Pb2+。
图4为实施例1中基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极在不同Pb2+浓度条件下ECL强度-时间(ECL-t)图。其中标注数字为Pb2+浓度，单位：纳摩尔/升(nmol/L)，横坐标为时间(t)，单位：秒(s)，纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位(a.u.)。
图5为实施例1中基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极检测Pb2+的标准曲线图。其中，横坐标为Pb2+浓度的对数(Log(CPb 2+))，单位：无量刚，纵坐标为ECL强度，单位：绝对单位(a.u.)。
具体实施方式
实施例1：
(1)NCQDs悬浊液的制备：取2g DTPA置于20mL去离子水中，配制成质量0.1g/mL的浊液；将悬浊液置于烘箱中，230℃反应8.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以10000×g的离心力离心，以去除未反应的DTPA沉淀，则上层液为NCQDs悬浊液，将NCQDs悬浊液冻干成NCQDs粉末，将NCQDs粉末配成浓度为0.2mg/mL的NCQDs悬浊液，4℃保存。
(2)Pb2+适配体溶液的配制：取0.8mg Pb2+适配体用8mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.1mg/mL的Pb2+适配体溶液。
(3)羧基活化溶液配制：将0.1g EDC用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为10mg/mL EDC溶液；将0.1g NHS用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为10mg/mL的NHS溶液；将0.2132g MES用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.1mol/LMES缓存液。将上述步骤配制好的EDC溶液、NHS溶液、MES缓存液各取1mL混合均匀，备用。
(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。
(5)修饰电极的制备：取6μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到1.70×10-1g/m2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育30min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加6μL步骤(2)中制备的Pb2+适配体溶液，使其负载量达到8.49×10-2g/m2，晾干，备用。
将上述制备的修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到pH为7，含有浓度为1.0mol/L的K2S2O8的磷酸盐缓冲液PBS底液中。采用ECL进行检测，扫描电位范围为0～-1.8V，扫描速率为100mV/s，光电倍增管高压为800V。待ECL信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的Pb2+溶液，继续进行ECL检测，结果如图4所示。根据检测结果，以Pb2+溶液浓度的对数值(Log(CPb 2+))作为横坐标，ECL强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，Pb2+检测范围为0.05～387.9nmol/L，ECL强度与Pb2+浓度的对数呈现良好的线性关系(R2＝0.998)，检测限为：18.9pmol/L。
实施例2：
(1)NCQDs悬浊液的制备：取2g DTPA置于20mL去离子水中，配制成质量0.1g/mL的浊液；将悬浊液置于烘箱中，200℃反应10.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以8000×g的离心力离心，以去除未反应的DTPA沉淀，则上层液为NCQDs悬浊液，将NCQDs悬浊液冻干成NCQDs粉末，将NCQDs粉末配成浓度为0.2mg/mL的NCQDs悬浊液，4℃保存。
(2)Pb2+适配体溶液的配制：取0.4mg Pb2+适配体用8mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.05mg/mL的Pb2+适配体溶液。
(3)羧基活化溶液配制：将0.2g EDC用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为20mg/mL EDC溶液；将0.2g NHS用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为20mg/mL的NHS溶液；将0.4264g MES用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.2mol/LMES缓存液。将上述步骤配制好的EDC溶液、NHS溶液、MES缓存液各取1mL混合均匀，备用。
(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。
(5)修饰电极的制备：取8μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到2.26×10-1g/m2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育60min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加8μL步骤(2)中制备的Pb2+适配体溶液，使其负载量达到5.66×10-2g/m2晾干，备用。
将上述制备的修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到pH为6，含有浓度为1.2mol/L的K2S2O8的磷酸盐缓冲液PBS底液中。采用ECL进行检测，扫描电位范围为0～1.8V，扫描速率为100mV/s，光电倍增管高压为800V。待ECL信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的Pb2+溶液，继续进行ECL检测，结果如图4所示。根据检测结果，以Pb2+溶液浓度的对数值(Log(CPb 2+))作为横坐标，ECL强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，Pb2+检测范围为6～196.7nmol/L，ECL强度与Pb2+浓度的对数呈现良好的线性关系(R2＝0.998)，检测限为：2.06nmol/L。
实施例3：
(1)NCQDs悬浊液的制备：取10g DTPA置于20mL去离子水中，配制成质量0.5g/mL的浊液；将悬浊液置于烘箱中，180℃反应6.h，直至浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以6000×g的离心力离心，以去除未反应的DTPA沉淀，则上层液为NCQDs悬浊液，将NCQDs悬浊液冻干成NCQDs粉末，将NCQDs粉末配成浓度为0.075mg/mL的NCQDs悬浊液，4℃保存。
(2)Pb2+适配体溶液的配制：取0.4mg Pb2+适配体用8mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.05mg/mL的Pb2+适配体溶液。
(3)羧基活化溶液配制：将0.5g EDC用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为50mg/mL EDC溶液；将0.5g NHS用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为50mg/mL的NHS溶液；将1.066g MES用10mL去离子水充分溶解，配制成浓度为0.5mol/LMES缓存液。将上述步骤配制好的EDC溶液、NHS溶液、MES缓存液各取1mL混合均匀，备用。
(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗1min。
(5)修饰电极的制备：取10μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到1.06×10-1g/m2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育120min，将电极取出后用去离子水冲洗后4℃晾至微干，然后在电极表面滴加10μL步骤(2)中制备的Pb2+适配体溶液，使其负载量达到7.07×10-2g/m2，晾干，备用。
将上述制备的修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，构成三电极体系，将三电极体系插入到pH为8，含有浓度为0.8mol/L的K2S2O8的磷酸盐缓冲液PBS底液中。采用ECL进行检测，扫描电位范围为0～-1.8V，扫描速率为100mV/s，光电倍增管高压为800V。待ECL信号稳定后，向反应底液中加入不同浓度的Pb2+溶液，继续进行ECL检测，结果如图4所示。根据检测结果，以Pb2+溶液浓度的对数值(Log(CPb 2+))作为横坐标，ECL强度作为纵坐标作图，建立标准工作曲线如图5所示，Pb2+检测范围为20～98.2nmol/L，ECL强度与Pb2+浓度的对数呈现良好的线性关系(R2＝0.998)，检测限为6.0nmol/L。

Claims (2)

1.一种基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极及其制备方法，其特征在于，该修饰电极以玻碳电极为基础电极，负载有氮掺杂碳量子点NCQDs和修饰了氨基的Pb2+适配体；其中NCQDs负载量为3.54×10-2～7.08×10-1g/m2，Pb2+适配体负载量为7.08×10-3～7.08×10-1g/m2。
2.一种制备权利要求1所述基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)NCQDs悬浊液的制备：取二乙烯三胺五乙酸(DTPA)白色粉末溶于去离子水中，配制成质量为0.1～0.5g/mL的浊液；将悬浊液置于烘箱中，180～230℃反应6～10.h，直至悬浊液变成褐色蓬松状固体；将褐色固体置于去离子水中，以6000×g～10000×g的离心力离心，以去除未反应的DTPA沉淀，则上层液为NCQDs悬浊液，将NCQDs悬浊液冻干成NCQDs粉末，将NCQDs粉末配成浓度为0.05～0.5mg/mL的NCQDs悬浊液，4℃保存；
(2)Pb2+适配体溶液的配制：将Pb2+适配体(其碱基序列为：5'-GGGTGGGTGGGT-(CH2)6-NH2-3')用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mg/mL的Pb2+适配体溶液。
(3)羧基活化溶液配制：将碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/mL EDC溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用去离子水充分溶解，配制成浓度为1～50mg/mL的NHS溶液；将2-吗啉乙磺酸(MES)用去离子水充分溶解，配制成浓度为0.01～0.5mol/L的MES缓存液。将上述步骤配制好的EDC溶液、NHS溶液、MES缓存液混合均匀，备用。
(4)玻碳电极的抛光处理：将玻碳电极抛光至光滑，每次抛光后先洗去表面污物，然后用超纯水、乙醇和超纯水依次超声清洗；
(5)修饰电极的制备：取5～10μL步骤(1)中配制的NCQDs悬浊液，滴在经步骤(4)处理好的玻碳电极表面，使其负载量达到3.54×10-2～7.08×10-1g/m2，晾至微干，然后将电极插入步骤(3)中配制好的羧基活化溶液中，孵育30～120min，将电极取出后用去离子水冲洗后晾至微干，然后在电极表面滴加5～10μL步骤(2)中制备的Pb2+适配体溶液，使其负载量达到7.08×10-3～7.08×10-1g/m2，晾干，即为基于碳量子点检测Pb2+的修饰电极，4℃保存、备用。
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