CN115184428A - 一种检测突变型braf基因的电化学发光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器及其制备方法和应用,该电化学发光传感器由表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极,含DNA2探针的金纳米枝晶组成;所述DNA1探针为修饰有氨基的发夹型DNA1,所述DNA2探针为修饰有羧基,并进一步修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2。本发明制备的表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极、待测样品与修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针共同孵育,通过催化发夹自组装策略和金纳米枝晶的局域表面等离子体共振效应,随着目标溶液中突变型BRAF基因浓度增大,碳量子点上连接的金纳米枝晶增多,电化学发光信号逐渐增强,实现了对突变型BRAF基因的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域,具体涉及一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器及其制备方法和应用。
背景技术
B-type Raf kinase(BRAF)基因编码B-Raf蛋白,在细胞分裂、分化和分泌中起重要作用,BRAF基因突变后会影响细胞的正常功能,导致细胞异常。BRAF基因的突变与多种疾病相关,如甲状腺癌、黑色素瘤等。现有检测突变型BRAF基因方法主要是基于聚合酶链式反应(PCR),存在对罕见靶点突变检测灵敏度不足缺陷。电化学发光分析检测法是一种高灵敏的检测方法,其检测仪器已商业化用于临床免疫分析检测。因此,开发电化学发光分析法用于高灵敏检测突变型BRAF基因非常重要。
碳量子点是一种尺寸小于10nm的新兴碳纳米材料,因其具有合成原料来源广泛、光学性能优异和生物相容性好等优点,在各领域被广泛开发应用。合成表面具有氨基和羧基易与电极和生物分子连接,且具有优异电化学发光性能的碳量子点,对于开发用于生物分析检测的电化学发光传感器非常重要。
因此,表面富含氨基和羧基的碳量子点作为电化学发光体,构建一种高灵敏检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器在生物医学分析检测领域非常重要。
发明内容
发明目的:针对现有技术繁琐耗时、灵敏度低和成本高等缺点,本发明提供了一种高灵敏、低成本检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,本发明的电化学发光传感器结合了局域表面等离子体共振效应和催化发夹自组装策略实现了电化学发光信号放大。
本发明还提供了所述检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和应用。
技术方案:为了实现上述目的,本发明提供一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,由表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极,含DNA2探针的金纳米枝晶组成;所述DNA1探针为修饰有氨基的发夹型DNA1,所述DNA2探针为修饰有羧基,并进一步修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2。
其中,所述发夹型DNA1探针为:NH2-GATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGAAGCTAGACCAAAATCTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACC;所述发夹型DNA2探针为:HOOC-CACAGAAAATCTCGAGATTTTGGTCTAGCTTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATC。
其中,所述碳量子点由2-氨基对苯二甲酸与四羟甲基硫酸磷混合反应形成。
本发明所述的电化学发光传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)将氨基化金纳米枝晶修饰到发夹型DNA2探针上,得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
(2)制备表面富含氨基和羧基的碳量子点;
(3)将玻碳电极打磨与清洗;
(4)将碳量子点修饰到玻碳电极表面;
(5)将发夹型DNA1探针修饰到步骤(4)得到的玻碳电极上得到修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;与步骤(1)得到的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针组成检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器。
其中,步骤(1)中将1~4μM的发夹型DNA2探针溶液与EDC溶液和NHS溶液混合,室温孵育10~40分钟,再加入氨基化的金纳米枝晶溶液在低温条件继续孵育5~10小时,发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,离心洗涤,沉淀分散PBS缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液。
作为优选,步骤(1)中175~1050μL浓度为1~4μM的发夹型DNA2探针溶液中加入12.5~75μL浓度为40mM的EDC溶液和12.5~75μL浓度为20mM的NHS溶液,孵育10~40分钟。
更优选地,875μL浓度为4μM的发夹型DNA2探针溶液中加入62.5μL浓度为40mM的EDC溶液和62.5μL浓度为20mM的NHS溶液,孵育30分钟。
作为优选,步骤(1)发夹型DNA2探针溶液中加入EDC溶液和NHS溶液孵育后,接着加入100~600μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育5~10小时。
更优选地,发夹型DNA2探针溶液中加入EDC溶液和NHS溶液孵育后,接着加入500μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育8小时。
作为优选,步骤(1)发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速3000~6000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS(pH=7.5)缓冲溶液洗涤两次,沉淀分散在300~600μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹DNA2探针溶液。
更优选地,转速5000rpm离心5分钟,沉淀分散在500μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中。
其中,步骤(2)中将2-氨基对苯二甲酸溶于超纯水中并与四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;反应前体溶液经过高温加热得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;碳量子点溶液一通过离心、过滤、透析纯化,冷冻干燥制备出固体,再分散到PBS缓冲溶液中得到碳量子点溶液二。
作为优选,步骤(2)中0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液,反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一。碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二。
其中,步骤(3)中将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次。
其中,步骤(4)中将清洗干净的玻碳电极浸在碳量子点溶液中进行嫁接;所述嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数为1~6次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上。
作为优选,步骤(4)中将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为1~3mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接。作为优选,扫描次数为5次。
更优选地,清洗干净的玻碳电极浸在浓度为2.5mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接。
其中,步骤(5)中将步骤(4)中修饰有碳量子点的玻碳电极浸在EDC和NHS混合溶液中孵育后,再浸在浓度为1~4μM的发夹型DNA1溶液中,低温条件下孵育5~9小时,孵育后用BSA封闭未结合位点,冲洗后得到修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;与步骤(1)得到的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针组成检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器。
作为优选,步骤(5)是将步骤(4)中修饰有碳量子点的玻碳电极浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为4μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育8小时,孵育后用BSA封闭未结合位点,用0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗。
作为优选,将步骤(5)所得的修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与目标物溶液和修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育。
进一步地,测试步骤(5)修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与目标物溶液和修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液孵育前后的电化学发光信号强度值,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.02~0.2M的过硫酸钾,通过测试目标物孵育后的电化学发光信号增加值实现定量检测。
作为优选,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.1M的过硫酸钾。
本发明所述的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器在突变型BRAF基因定量检测中的应用。本发明所述的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器可以用于制备突变型BRAF基因定量检测工具。
其中,所述定量检测的过程为:表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0;表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与目标物溶液和修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电化学发光强度值,记为ECL1;电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0,ΔECL与目标物浓度成线性关系,实现对目标物的定量检测。
本发明修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针与检测目标物共同孵育。本发明所述传感器其碳量子点和发夹型DNA1探针先修饰在玻碳电极上,DNA2探针是检测时候通过检测的目标物触发催化发夹自组装连接到电极上的(图1所示)。
本发明的电化学发光传感器利用碳量子点表面的氨基通过碳-氮键嫁接到玻碳电极表面,同时,碳量子点表面的羧基能够进一步与修饰有氨基的发夹型DNA1探针共价连接,与修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针组成检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器。本发明通过催化发夹自组装策略和金纳米枝晶的局域表面等离子体共振效应,随着目标溶液中突变型BRAF基因浓度增大,碳量子点上连接的金纳米枝晶增多,电化学发光信号逐渐增强,实现了对突变型BRAF基因的检测。
本发明提供了一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,能够实现高灵敏、低成本检测突变型BRAF基因。本发明检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器结合了局域表面等离子体共振效应和催化发夹自组装策略实现电化学发光信号放大。其中所用的电化学发光体为表面富含氨基和羧基的碳量子点,此碳量子点作为本发明电化学发光传感器的发光体,具有易修饰在电极表面,易与生物分子连接的优点,不需要导电性差的辅助试剂;并且作为电化学发光体的碳量子点,制备过程简易,原料新颖、可大量制备。
本发明的电化学发光传感器以玻碳电极为工作电极,碳量子点为电化学发光体,金纳米枝晶为电化学发光信号放大体,结合局域表面等离子体共振效应和催化发夹自组装策略实现了电化学发光信号放大。碳量子点为表面富含氨基和羧基的碳量子点,金纳米枝晶为氨基化的金纳米枝晶。本发明电化学发光传感器利用碳量子点表面的氨基通过碳-氮键嫁接到玻碳电极表面,同时,碳量子点表面的羧基能够进一步与修饰有氨基的发夹型DNA1探针共价连接,制备修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极。本发明制备的表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与目标物溶液和修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育,通过催化发夹自组装策略和金纳米枝晶的局域表面等离子体共振效应,随着目标物溶液中突变型BRAF基因浓度增大,电极上的碳量子点连接的金纳米枝晶增多,电化学发光信号逐渐增强,实现了对突变型BRAF基因的检测。本发明的电化学发光传感器在制备过程中发光体通过碳-氮键连接到电极表面,无需壳聚糖等导电性较差的辅助试剂,且固定牢固。而且,本发明的电化学发光传感器用于突变型BRAF基因的检测具有灵敏度高、线性范围宽等优点。
本发明合成的碳量子点表面富含氨基和羧基,利用氨基通过碳-氮键把碳量子点修饰在了玻碳电极表面,而现有的在电极上修饰量子点都需要导电性较差的辅助剂(如壳聚糖),而本发明不需要辅助剂,可以直接修饰;另外,碳量子点表面的羧基易与生物分子(即发夹型DNA1探针)连接。因此,本发明所合成的碳量子点易直接修饰在电极表面且易与生物分子连接。此外,本发明传感器的制备是结合了催化发夹自组装(CHA)策略和金纳米枝晶的局域表面等离子体共振效应,实现非常好的检测效果。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、本发明制备的电化学发光传感器所用的发光体是碳量子点,成本低,表面富含氨基和羧基,不需要导电性差的辅助试剂即可修饰在电极表面,并且易与生物分子连接。
2、本发明提出的一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,传感器构建过程较简便,结合了催化发夹自组装策略和局域表面等离子体共振效应实现了电化学发光信号放大。本发明的电化学发光传感器用于突变型BRAF基因的检测,检测具有灵敏度高、线性范围宽、特异性好、稳定性强等优点。
3、本发明制备的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器在生物分析检测和医学检验领域具有潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明制备的电化学发光传感器检测原理示意图;
图2为本发明制备的碳量子点的透射电镜图;
图3为本发明制备的碳量子点的傅里叶变换红外光谱图;
图4为本发明制备的碳量子点的电化学发光光谱图和氨基化金纳米枝晶的紫外-可见吸收光谱图;
图5为本发明制备的电化学发光传感器的发光信号强度差值(ΔECL)与突变型BRAF基因序列浓度对数值的线性关系图;
图6为本发明制备的电化学发光传感器的特异性图;
图7为本发明制备的电化学发光传感器的电化学发光信号稳定性。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂家建议的条件。
实施例中氨基化金纳米枝晶参照已报道文献Analytical Chemistry 2018,90,1340-1347,Plasmon-Enhanced Electrochemiluminescence for Nucleic AcidDetection Based on Gold Nanodendrites中实验部分的第3-4段,不同之处在于:1、本发明在长金纳米枝晶时所用量为:在圆底烧瓶中加入10mL浓度为0.25mM的HAuCl4溶液,用NaOH(1M)溶液调到pH=11.4。将此圆底烧瓶放置在30℃水浴中,将80μL浓度为40mM的NH2OH·HCl溶液和800μL的金种子(Au seeds)溶液加入。2、最后收集、洗涤氨基化金纳米枝晶时,离心条件为5000rpm离心5min,洗涤后分散在1.0mL PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中,即得到本发明实施例所用的氨基化金纳米枝晶溶液。
2-氨基对苯二甲酸(>98.0%,HPLC)固体,厂家:上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
四羟甲基硫酸磷(75%水溶液),厂家:上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
核酸序列,厂家:生工生物工程(上海)股份有限公司。
发夹型DNA1:NH2-GATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGAA
GCTAGACCAAAATCTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACC
发夹型DNA2:HOOC-CACAGAAAATCTCGAGATTTTGGTCTAGC
TTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATC
突变型BRAF基因序列:TCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATC
野生型BRAF基因序列:TCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATC
N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),厂家Sigma-AldrichChemical Co.(USA)。
N-羟基丁二酰亚胺(NHS),厂家:Sigma-Aldrich Chemical Co.(USA)。
实施例中电化学发光信号测试时:本发明修饰或者孵育后的玻碳电极为工作电极,银/氯化银电极为参比电极,铂丝为对电极,其中玻碳电极直径3mm。
实施例1
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和测试,包括以下步骤:
S1、175μL浓度为1μM的发夹型DNA2探针溶液中加入12.5μL浓度为40mM的EDC溶液和12.5μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育10分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入100μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育5小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速3000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液(pH=7.5)洗涤两次,沉淀分散在300μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、将0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为1mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数1次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为1μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育5小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育10分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.02M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
实施例2
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和测试,包括以下步骤:
S1、350μL浓度为2μM的发夹型DNA2探针溶液中加入25μL浓度为40mM的EDC溶液和25μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育10分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入200μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育6小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速4000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液(pH=7.5)洗涤两次,沉淀分散在400μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为1.5mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数2次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为2μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育6小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育30分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.04M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
实施例3
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法的测试,包括以下步骤:
S1、525μL浓度为3μM的发夹型DNA2探针溶液中加入37.5μL浓度为40mM的EDC溶液和37.5μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育20分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入300μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育7小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速5000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液(pH=7.5)洗涤两次,沉淀分散在500μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为2mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数3次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为3μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育7小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育60分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.06M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
实施例4
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和测试,包括以下步骤:
S1、700μL浓度为4μM的发夹型DNA2探针溶液中加入50μL浓度为40mM的EDC溶液和50μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育30分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入400μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育8小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速5000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤两次,沉淀分散在500μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为2.5mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数4次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为4μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育8小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育90分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.08M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
实施例5
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和测试,包括以下步骤:
S1、875μL浓度为4μM的发夹型DNA2探针溶液中加入62.5μL浓度为40mM的EDC溶液和62.5μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育30分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入500μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育8小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速5000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤两次,沉淀分散在500μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为2.5mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数为5次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温下孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为4μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育8小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育120分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.1M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
本实施例合成的碳量子点(S6)的透射电镜图如图2所示,表明碳量子点的成功合成。
本实施例合成的碳量子点(S6)的傅里叶变换红外光谱图如图3所示,波数为3285cm-1和1750cm-1显示出明显的红外吸收峰,表明所合成的碳量子点表面富含丰富的氨基和羧基,易修饰在玻碳电极表面,且易与生物分子(如发夹型DNA1探针)连接。
本实施例采用的氨基化的金纳米枝晶的紫外-可见吸收光谱和本实施例合成的碳量子点的电化学发光谱如图4所示,结果显示氨基化的金纳米枝晶的紫外-可见吸收光谱与碳量子点的电化学发光谱明显重合,表明能够产生局域表面等离子体共振效应。
本实施例制备的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,与浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L2×10-9mol/L的突变型BRAF基因序列和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育。依据本实施例S11-S13测试步骤,同一浓度平行测试3次,计算各浓度平行测试3次所得ΔECL的平均值和标准偏差,以ΔECL为纵坐标,突变型BRAF基因序列浓度的对数值为横坐标,绘制出如图5所示的检测突变型BRAF基因的标准曲线。线性方程为ΔECL=1419.3LogCBRAF+704.4,R2=0.998,检测线性范围为5×10-13mol/L到2×10-9mol/L,检出限(LOD)为3.4×10-13mol/L(S/N=3)。因此,本发明制备的的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器具有线性范围宽(5×10-13mol/L-2×10-9mol/L),灵敏度高(LOD=3.4×10-13mol/L)的优点。
本实施例制备检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的特异性检测:0.01MPBS(pH=7.5)作为空白液,相同浓度(1×10-10mol/L)野生型BRAF基因序列溶液和突变型BRAF基因序列溶液,及野生型BRAF基因序列和突变型BRAF基因序列的混合液分别作为目标物溶液,依据本实施例S11-S13测试步骤,同一溶液平行测试3次,计算各溶液平行测试3次所得ΔECL的平均值和标准偏差。如图6结果显示,突变型BRAF基因序列溶液及混合液的ΔECL值远大于空白液和野生型BRAF基因序列溶液的,表明本发明制备的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器具有优异的特异性。
本实施例制备的的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的电化学发光强度稳定性测试:依据本实施例S11-S13测试步骤,测试浓度为1×10-10mol/L的突变型BRAF基因的电化学发光信号,如图7结果显示,连续测试10圈,电化学发光信号保持稳定(相对标准偏差RSD=0.65%),表明本发明所述的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器具有优异的稳定性。
综上,本发明制备的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器检测具有灵敏度高、线性范围宽、特异性好、稳定性强等优点。
实施例6
检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的制备方法和测试,包括以下步骤:
S1、1050μL浓度为4μM的发夹型DNA2探针溶液中加入75μL浓度为40mM的EDC溶液和75μL浓度为20mM的NHS溶液,室温孵育40分钟;
S2、发夹型DNA2探针溶液中加入EDC和NHS溶液孵育后,接着加入600μL氨基化的金纳米枝晶溶液在4℃条件继续孵育8小时;
S3、发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,转速6000rpm离心5分钟,用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤两次,沉淀分散在600μL的PBS(0.01M,pH=7.5)缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
S4、0.073g 2-氨基对苯二甲酸溶于20mL超纯水中并与0.47mL四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;
S5、反应前体溶液在180℃条件下反应8小时得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;
S6、碳量子点溶液一在5000rpm条件下离心5分钟,去除大颗粒后的溶液用0.22μm滤膜过滤,滤液用浓度为2M的氢氧化钠溶液调到pH=7,然后用剪切分子量500-1000Da的透析袋在室温下透析24小时得透析液一,透析液一用剪切分子量3500Da的透析袋在室温下透析72小时得透析液二,透析液二在60℃恒温下进行旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥制备出固体,分散到PBS(0.1M,pH=7.5)缓冲溶液中得到碳量子点溶液二;
S7、将玻碳电极打磨抛光后依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗三次;
S8、将清洗干净的玻碳电极浸在浓度为3mg/mL的碳量子点溶液二中进行嫁接;
S9、嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数6次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上;
S10、修饰有碳量子点的玻碳电极室温下干燥后浸在EDC(20mM)和NHS(10mM)混合溶液中室温孵育30分钟,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后浸在浓度为4μM的发夹型DNA1溶液中,4℃条件下孵育8小时。随后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗电极,然后在电极表面滴加10μLBSA(0.2wt%),室温下孵育30分钟封闭未结合位点,0.01M的PBS(pH=7.5)冲洗后即得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;
S11、在所得表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极表面滴加5μL不同浓度突变型BRAF基因序列溶液和5μL S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液,在37℃条件下孵育150分钟,孵育后用0.01M PBS(pH=7.5)冲洗并用氮气吹干;
S12、所得的电化学发光传感器电极在电化学发光分析仪上进行电化学发光信号测试,测试所用电解液为PBS(0.1M,pH=7.5)中含有0.2M的过硫酸钾,扫描范围为-0.2V到-1.8V,扫描速率0.1V/s,记录表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0(S10);表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与突变型BRAF基因序列溶液和S3所得的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电极电化学发光强度值,记为ECL1(S11);电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0。
S13、建立定量检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器的标准曲线,突变型BRAF基因序列的浓度分别为5×10-13mol/L,1×10-12mol/L,1×10-11mol/L,1×10-10mol/L,5×10-10mol/L,1×10-9mol/L,2×10-9mol/L。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gattttggtc tagctacaga gaaatctcga agctagacca aaatctcgag atttctctgt 60
agctagacc 69
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacagaaaat ctcgagattt tggtctagct tcgagatttc tctgtagcta gaccaaaatc 60
Claims (10)
1.一种检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器,其特征在于,所述电化学发光传感器由表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极,含DNA2探针的金纳米枝晶组成;所述DNA1探针为修饰有氨基的发夹型DNA1,所述DNA2探针为修饰有羧基,并进一步修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2。
2.根据权利要求1所述的电化学发光传感器,其特征在于,所述DNA1探针为:NH2-GATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGAAGCTAGACCAAAATCTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACC;所述DNA2探针为:HOOC-CACAGAAAATCTCGAGATTTTGGTCTAGCTTCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATC。
3.根据权利要求1所述的电化学发光传感器,其特征在于,所述碳量子点由2-氨基对苯二甲酸与四羟甲基硫酸磷混合反应形成。
4.一种权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将氨基化金纳米枝晶修饰到发夹型DNA2探针上,得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针;
(2)制备表面富含氨基和羧基的碳量子点;
(3)将玻碳电极打磨与清洗;
(4)将碳量子点修饰到玻碳电极表面;
(5)将发夹型DNA1探针修饰到步骤(4)得到的玻碳电极上得到修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极;与步骤(1)得到的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针组成检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中将1~4μM的发夹型DNA2探针溶液与EDC溶液和NHS溶液混合,室温孵育10~40分钟,再加入氨基化的金纳米枝晶溶液在低温条件继续孵育5~10小时,发夹型DNA2探针溶液与氨基化的金纳米枝晶溶液孵育后,离心洗涤,沉淀分散PBS缓冲溶液中得到修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中将2-氨基对苯二甲酸溶于超纯水中并与四羟甲基硫酸磷混合形成反应前体溶液;反应前体溶液经过高温加热得到表面富含氨基和羧基的碳量子点溶液一;碳量子点溶液一通过离心、过滤、透析纯化,冷冻干燥制备出固体,再分散到缓冲溶液中得到碳量子点溶液二。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中将清洗干净的玻碳电极浸在碳量子点溶液中进行嫁接;所述嫁接过程采用循环伏安法,扫描范围为0.2-1.6V,扫描速率为0.1V/s,扫描次数为1~6次,扫描后冲洗干燥即碳量子点修饰到了玻碳电极上。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中将步骤(4)中修饰有碳量子点的玻碳电极浸在EDC和NHS混合溶液中孵育后,再浸在浓度为1~4μM的发夹型DNA1溶液中,低温条件下孵育5~9小时,孵育后用BSA封闭未结合位点,冲洗后与步骤(1)得到的修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针组成检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器。
9.一种权利要求1所述的检测突变型BRAF基因的电化学发光传感器在突变型BRAF基因定量检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,所述定量检测的过程优选为:表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极的电化学发光强度值,记为ECL0;表面修饰碳量子点和DNA1探针的玻碳电极与目标物溶液和修饰有金纳米枝晶的发夹型DNA2探针溶液共同孵育后的电化学发光强度值,记为ECL1;电化学发光强度差值ΔECL=ECL1-ECL0,ΔECL与目标物浓度成线性关系,实现对目标物的定量检测。
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