CN102419370A - 用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法。免疫磁小体由抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体包被，颗粒大小50nm；制备方法是通过超声破碎和磁性吸附，获得趋磁细菌的纯化磁小体，将佐剂溶合Bt杀虫蛋白后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体，将抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体。用本发明的免疫磁小体，经化学发光EIA检测，发光单位为83kcounts/μg磁小体；发光强度和Bt蛋白浓度相关性表明，随着蛋白浓度的不断增加，发光强度不断下降，范围在1-10³ng/ml，最小检测浓度1ng/ml；用于实际检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白含量灵敏度较高，结果稳定性强且操作简单，显示了良好的应用前景。

Description

用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法。 

背景技术

趋磁细菌是一类具有趋磁性行为的细菌，体内含有由膜包被的纳米磁性颗粒-磁小体(Magnetosome)。磁小体为单磁畴晶体，具永磁性，大小为几十个纳米，多数为磁铁矿(Fe₃O₄)性质，少数为硫铁矿(Fe₃S₄)性质。通常多个磁小体在菌内排列成链，形成一个生物磁罗盘，在地磁场中使趋磁细菌取向，由此简化它们搜寻适合的微好氧环境以利于生长。与人造的磁纳米材料相比，磁小体的一些特点比较明显，譬如受生物矿化机制的严格控制，晶体大小高度均一；颗粒外包裹脂质双分子膜，颗粒不易聚集，离散性高；实验表明，磁小体比人造磁颗粒具有更强的剩磁和矫顽力；脂质膜和磁晶体结合牢固，磁小体生物相容性好，细胞毒性较小，亲水作用强，便于与其它分子相连接，等等。 

随着众多转Bt基因抗虫作物的商品化和在生产上的大面积推广使用，其对环境潜在的生态风险性问题引起了人们的广泛关注。转Bt基因作物在大田种植过程中它们的植株残体、根系分泌物和花粉等通过田间耕作不断地向土壤中释放的这些外源高度特化了的Bt杀虫蛋白在进入土壤后的情况如何，是否会在土壤中积累和产生级联效应，是否对非目标动物造成危害，进而影响土壤生态系统的安全，已成为人们关心的一个重要问题。 

转Bt基因作物对于非目标小型动物如鼠类的实际影响问题，国内外研究鲜有报道。目前，广泛使用的Bt杀虫蛋白检测ELISA试剂盒(由美国EnviroLogix公司生产)一般只用于定性研究，在定量检测应用上有较大误差，且检测限只能到μg级。而专门针对小鼠组织如肝脏、肾脏、胰腺和肠道内的Bt杀虫蛋白残留的检测方法未见报道，故迫切需要开发高效、准确、快速的针对小鼠组织Bt杀虫蛋白残留的新型免疫检测技术和产品。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种取材简单、操作方便；制备方 法细致严谨，重复性高；所制备的免疫磁小体粒径小而均匀，品相端正，检测灵敏度高的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体及其制备方法。 

本发明目的的实现方式为，用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体，由抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体包被，包被比例为5×10⁹个磁小体/100μg抗体，颗粒大小50nm，最小检测Bt杀虫蛋白浓度为1ng/ml。 

用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，具体步骤如下： 

(1)将湿重25±0.5g冻存的趋磁细菌细胞解冻融化后，悬浮于100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0的缓冲液中，超声振荡破碎10min，超声振荡在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行， 

(2)悬浮液离心15min，离心速度为8000转/g，得到的沉淀用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液重新悬浮后，再次超声处理；超声处理在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行，处理10min； 

(3)离心后的上清液汇集于烧杯中，置于条形磁铁上1h，吸去非磁性的液体，磁铁吸附的磁小体用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液小心悬浮； 

(4)重复上述步骤至少10次，纯化的磁小体用8,000×g离心15min收集，沉淀用10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液悬浮，贮存在-80℃，上述纯化步骤都在4℃下进行： 

(5)将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体； 

(6)将鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体； 

步骤(1)所述趋磁细菌是Magnetospirillum magneticum AMB-1，编号700264。 

本发明的优点在于：本发明的一种用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体制备方法，采用趋磁细菌内源性纳米磁小体为基质材料，用化学偶联方法偶联抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体获得，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫磁小体粒径小而均匀，品相端正，检测灵敏度高，其最小检测Bt蛋白浓度是1ng/ml。 

附图说明

图1是磁小体JEOL扫描电镜照片； 

图2 Bt杀虫蛋白抗体Western Blotting检测分析； 

图3是抗血清效价测定； 

图4是免疫磁小体(化学发光EIA法)检测Bt杀虫蛋白。 

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明。 

1、制备磁小体的具体步骤如下： 

(1)将湿重24.5g、25g或25.5g冻存的趋磁细菌细胞解冻融化后，悬浮于100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0的缓冲液中，超声振荡破碎10min，超声振荡在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行，趋磁细菌是Magnetospirillum magneticum AMB-1，购自ATCC，编号700264； 

(2)悬浮液离心15min(8,000×g)，得到的沉淀用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液重新悬浮后，再次超声处理；超声处理在Branson model 450、20kHz；80W条件下进行，处理10min； 

(3)离心后的上清液汇集于烧杯中，置于2.5cm×12cm条形磁铁上1h，吸去非磁性的液体，磁铁吸附的磁小体用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液小心悬浮； 

(4)重复上述步骤至少10次，纯化的磁小体用8,000×g离心15min收集，沉淀用10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液悬浮，贮存在-80℃，上述纯化步骤都在4℃下进行： 

制备出的磁小体形态和大小如图1所示。 

2、将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的具体步骤如下： 

(1)将Bt杀虫蛋白与弗氏佐剂按体积1∶1混合后，充分乳化，采用背部多点注射法免疫BALB/c小鼠，每次免疫的抗原量约10μg，免疫三次，每次免疫两周后经尾动脉取血检测抗体效价； 

(2)以500μg/ml的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜； 

(3)洗涤后，加入待检的血清样品，100μl/孔，37℃1小时；设阴性对照孔； 

(4)洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色15分钟；用2M H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值，通过分析各孔 的A490值，检测制备的鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的效价。 

对制备的Bt杀虫蛋白抗体做Western Blotting分析，结果见图2。经ELISA法检测，抗体能与Cry1Ab/Cry1Ac蛋白特异性结合，其相关系数达到显著水平，效价＞1∶6000，结果见图3。 

3、由鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体制备免疫磁小体的具体步骤如下： 

(1)用30mM、pH＝5的MES缓冲液在外加磁场作用下清洗纳米磁小体，使纳米磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml； 

(2)取纳米磁小体100μl，依次加入50mM EDC、50mM NHS溶液各50μl，室温震荡30min； 

(3)在磁感应强度30mT的磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次； 

(4)取1.09mg/ml抗Bt杀虫蛋白的多克隆抗体100μl，加入已活化的纳米磁小体，室温震荡30min； 

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到免疫磁小体。 

步骤(4)所述的Bt杀虫蛋白由美国Agdia公司订制生产。 

4、通过羧基-氨基化学偶联法偶联免疫磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的具体步骤如下： 

(1)首先用30mM、pH＝5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗免疫磁小体，使免疫磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml； 

(2)取100μl免疫磁小体缓冲液，依次加入50m碳化二亚胺、50mN-羟基丁二酰亚胺溶液各50μl，室温震荡30min； 

(3)在磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次； 

(4)取1.09mg/ml多克隆抗体100μl，加入已活化的免疫磁小体，室温震荡30min； 

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体。 

采用本发明制备的检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体，颗粒大小50nm。经化学发光EIA检测，Bt抗体蛋白包被的磁小体其发光单位为83kcounts/μg 磁小体；发光强度和Bt蛋白浓度相关性表明，随着蛋白浓度的不断增加，发光强度的数值不断减小，范围在1-10³ng/ml，最小检测浓度是1ng/ml，结果见图4。 

通过实际检测不同小鼠组织内的Bt蛋白含量，其结果见表1。 

表1利用免疫磁小体测定小鼠组织内Bt杀虫蛋白含量 

从表中可见，采用本发明所制备的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体灵敏度高(ng级)，经多次检测后结果稳定性强且操作简单，显示了良好的应用前景。 

Claims (5)

1.用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体，其特征在于由抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体包被，包被比例为5×10⁹个磁小体/100μg抗体，颗粒大小50nm，最小检测Bt杀虫蛋白浓度为1ng/ml。

2.权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于制备磁小体的具体步骤如下：

(1)将湿重25±0.5g冻存的趋磁细菌细胞解冻融化后，悬浮于100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0的缓冲液中，超声振荡破碎10min，超声振荡在Bransonmodel 450、20kHz；80W条件下进行，

(2)悬浮液离心15min，离心速度为8000转/g，得到的沉淀用100ml的10mMTris-HCl、pH 8.0缓冲液重新悬浮后，再次超声处理；超声处理在Branson model450、20kHz；80W条件下进行，处理10min；

(3)离心后的上清液汇集于烧杯中，置于条形磁铁上1h，吸去非磁性的液体，磁铁吸附的磁小体用100ml的10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液小心悬浮；

(4)重复上述步骤至少10次，纯化的磁小体用8,000×g离心15min收集，沉淀用10mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液悬浮，贮存在-80℃，上述纯化步骤都在4℃下进行：

(5)将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体；

(6)将鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体；

步骤(1)所述趋磁细菌是Magnetospirillum magneticum AMB-1，编号700264。

3.根据权利要求2所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于将弗氏佐剂与Bt杀虫蛋白按体积1∶1混合后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的具体步骤如下：

(1)将Bt杀虫蛋白与弗氏佐剂按体积1∶1混合后，充分乳化，采用背部多点注射法免疫BALB/c小鼠，每次免疫的抗原量为10μg，免疫三次，每次免疫两周后经尾动脉取血检测抗体效价；

(2)以500μg/ml的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；

(3)洗涤后，加入待检的血清样品，100μl/孔，37℃1小时；设阴性对照孔；

(4)洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色15分钟；用2M H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值，通过分析各孔的A490值，检测制备的鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体的效价。

4.根据权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于由鼠抗Bt杀虫蛋白多克隆抗体制备免疫磁小体的具体步骤如下：

(1)用30mM、pH＝5的MES缓冲液在外加磁场作用下清洗纳米磁小体，使纳米磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml；

(2)取纳米磁小体100μl，依次加入50mM EDC、50mM NHS溶液各50μl，室温震荡30min；

(3)在磁感应强度30mT的磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次；

(4)取1.09mg/ml抗Bt杀虫蛋白的多克隆抗体100μl，加入已活化的纳米磁小体，室温震荡30min；

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到免疫磁小体。

5.根据权利要求1所述的用于检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的制备方法，其特征在于通过羧基-氨基化学偶联法偶联免疫磁小体，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体的具体步骤如下：

(1)首先用30mM、pH＝5的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液在外加磁场作用下清洗免疫磁小体，使免疫磁小体分散于MES缓冲液中，终浓度为40mg/ml；

(2)取100μl免疫磁小体缓冲液，依次加入50m碳化二亚胺、50mN-羟基丁二酰亚胺溶液各50μl，室温震荡30min；

(3)在磁场作用下弃上清液，用MES溶液清洗3次；

(4)取1.09mg/ml多克隆抗体100μl，加入已活化的免疫磁小体，室温震荡30min；

(5)磁性分离，收集上清液，用0.02M磷酸缓冲液多次洗涤，得到检测小鼠组织内Bt杀虫蛋白的免疫磁小体。

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