CN103412031A - 一种能重复使用的无酶葡萄糖检测装置及方法 - Google Patents
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Abstract
一种能重复使用的无酶葡萄糖检测装置及方法,属于电化学生物传感器领域。本发明传感器采用修饰了铂纳米粒子的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl或3mol/L KCl作为参比电极的三电极系统,把三电极系统在电解槽中工作,电解槽内加入浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,Pt电极、工作电极和参比电极分别连接上电化学分析仪即可检测;完成检测后,在紫外光下照射30分钟,即可实现检测功能恢复;葡萄糖检测限的下限为4×10-5mmol/L。本发明与传统的有酶方法相比,检测限提高90%以上,提供一种新颖、简便、快速、低成本、稳定、能循环使用的无酶葡萄糖检测方法。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物检测装置领域,特别涉及一种能重复使用的无酶葡萄糖检测装置及方法。
背景技术
葡萄糖在人体新陈代谢中起着重要作用,正常人尿液中一般不含游离葡萄糖,糖尿病患者尿液中葡萄糖的含量变化较大,血液或尿液中游离葡萄糖含量的测定,是临床常规检验的一个重要项目。目前大部分安培生物传感器对葡萄糖的检测是基于与特定氧化酶反应释放过氧化氢来进行电化学检测。虽然酶法检测通常表现出良好的选择性和高灵敏度,但由于酶内在的不稳定,易失活的缺点,该类检测装置目前面临最严重的问题是缺乏长期稳定性。本发明基于铂纳米粒子修饰二氧化钛纳米管的自清洁特性为葡萄糖无酶检测方法提供了一个新颖、简便、快速、低成本、稳定和可循环使用的检测平台。
发明内容
针对现有酶检测装置技术的不足,本发明提供一种新颖、简便、快速、低成本、稳定、可循环使用的无酶葡萄糖检测方法。
二氧化钛作为电化学检测装置的优点:二氧化钛纳米管阵列具有高度有序、取向一致、比表面积大、吸附能力强、纳米管孔径可调、材料表面形貌均一、生物兼容性好、无定型状态下导电性好等特点,是一种理想的基底材料,可用于构建新颖的纳米生物检测装置。
在二氧化钛上修饰铂的原因:二氧化钛是窄带半导体,能带间隙较窄,不利于电子空穴对的产生和转移,且容易发生复合,而在其管壁和管底部修饰上导电性能极好的铂及其他贵金属后能提高其导电性,从而提高电子空穴对的形成与传输能力,并减小其在与葡萄糖反应之前发生复合的几率。
二氧化钛带负电,而铂粒子带正电,所以铂粒子可以由于静电作用吸附在二氧化钛纳米管上。铂粒子很小,一般5~10纳米,而纳米管管径一般为70~120nm,所以铂纳米粒子可以吸附在纳米管壁和底部。修饰量太少不能显著提高电子空穴对的传输,太多则会堵塞管口,也会影响电子空穴对的传输。
葡萄糖在修饰有Pt的TiO2纳米管表面发生化学反应形成一个反应中间体,然后再次再次发生反应形成葡糖酸内酯或葡糖酸,而在这个过程中发生电子对的转移在溶液中可以产生电流的变化,从而产生电流响应,不同浓度的葡萄糖反应产生电子对的转移数量不同从而实现对不同浓度葡萄糖的检测。
而经紫外光照射后,检测装置进行自清洁处理,恢复性能。自清洁的原理是检测葡萄糖后吸附在TiO2纳米管表面的Pt粒子的活性位被反应产物所覆盖,经紫外光照射后,这些反应产物被分解清除,使Pt粒子的活性位重新释放,所以可实现重复使用,见图6。
本发明的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置,该装置是将电解槽固定于水平平台上,使电解槽底部和水平平台连为一体,一个锥型圆孔穿透电解槽底部和水平平台,该锥型圆孔的锥顶方向竖直向下,锥型圆孔孔径的最小值小于工作电极的长度或宽度,横跨电解槽顶部设有固定支架,将结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl或3mol/L的KCl作为参比电极,组成三电极系统,电极间距离为4~10mm,参比电极通过固定支架竖直放于电解槽内,对电极通过固定支架水平悬于电解槽底部的圆孔上方,工作电极水平固定于电解槽的圆孔底部,位置与对电极相对,电解槽内加入浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,参比电极、对电极和工作电极分别通过导线与电化学分析仪连接。完成检测后,将工作电极取出,在紫外光下照射30分钟,即可实现检测功能恢复。
本发明结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜的制备过程为:
(a)钛片的处理:首先将纯度为95~99.8%的钛片,采用异丙醇、丙酮、乙醇和去离子水进行清洗,每次在超声清洗仪中处理3~10分钟,将处理好的钛片用氮气吹干备用;
(b)钛片的阳极化处理:电解槽内为浓度0.135mol/L的NH4F和0.2mol/L的(NH4)2SO4电解液或其他含氟电解液,钛片作为阳极,铂片作为阴极,加直流电压30~60V,反应2~10小时,然后再将其300~600℃退火处理1~3小时,即可得到附着于钛基底上的二氧化钛纳米管阵列薄膜,二氧化钛纳米管阵列薄膜的管径为70~120nm,管长为0.5~25μm;二氧化钛纳米管阵列薄膜的管长不同,在循环伏安曲线中氧化还原峰电流不同,如图3,二氧化钛纳米管阵列薄膜的管长在4μm为效果最佳。
(c)二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子:铂纳米粒子的修饰采用光化学一步法,或两步光照法。
其中,采用两步光照法,二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子的过程为:将H2PtCl6在水和乙醇体积比为4:1的混合液中稀释,使其浓度为0.9mmol/L,用500W中压汞灯照射上述溶液0.5~12小时;将二氧化钛纳米管阵列薄膜样品浸入上述混合液中4~24小时,用去离子水冲去表面混合液,再用紫外光照射10~60分钟,如紫外光可选300W中等压力的汞灯;然后在空气中80~160℃加热1~5小时,铂纳米粒子均匀的修饰于二氧化钛纳米管管壁和管底部,修饰在二氧化钛纳米管阵列薄膜上的铂纳米粒子的量为0.05~2.0mg/cm2。在修饰在二氧化钛纳米管阵列薄膜上的铂纳米粒子的量,在循环伏安曲线中氧化还原峰电流不同,如图4,二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子的量在为0.8mg/cm2时效果最佳。
钛基底上铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜的扫描电子显微镜图见图2。
采用本发明能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的进行检测的方法为:将结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl或3mol/L的KCl作为参比电极的三电极系统,电极间距离为4~10mm。此三电极系统在电解槽中工作,电解槽内加入50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,Pt电极、参比电极和工作电极分别通过导线连接电化学分析仪。在磁力搅拌速率为200rpm条件下进行。检测运用的电压范围为-0.2~1.0V。待测液也可以是是含抗坏血酸、尿酸或对乙酰氨基酚等的环境,对葡萄糖浓度的检测影响见图5。
首先,制得氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准检测曲线,其次,对待测液进行检测,通过循环伏安图获得氧化还原峰电流;再次,对应先前制得的氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准检测曲线,由测得的氧化还原峰电流值得出待测液体中葡萄糖的浓度,从而完成对葡萄糖浓度的测定。最后,每次检测完成后,对工作电极进行紫外光照射30分钟,完成自清洁恢复原有性能。
(1)检测的准备:制备100mL的浓度为1mol/L的H2SO4,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为500mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为50mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为5mmol/L的H2SO4葡萄糖的混合溶液;
(2)氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线的测定:先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入电解槽中,每次取10~100μL不同浓度H2SO4葡萄糖的混合溶液,滴加入电解槽中,用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测,从而获得氧化电流值与葡萄糖浓度之间的关系曲线;
(3)待测液的检测:先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入电解槽中,在电解槽里连续加入待测液体,用电化学分析仪进行循环伏安检测,记录其氧化还原峰电流,然后,对应氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线,得到葡萄糖的浓度;
(4)检测完成后,对工作电极进行紫外光照射30分钟,完成自清洁恢复原有性能。
通过铂纳米粒子的修饰,可提高葡萄糖催化氧化效率,同时提高二氧化钛纳米管阵列薄膜的导电性,实现响应电流的双重放大,从而提高了对葡萄糖的检测灵敏度。葡萄糖检测限的下限为4×10-5mmol/L,与传统的有酶方法相比,检测限提高90%以上。由于二氧化钛具有良好的光催化性能,可通过紫外光照的方法实现自清洁,所以该检测设备具有自清洁功能,可用于多次重复检测。检测时使用电化学工作站测量氧化还原电流,实现对葡萄糖浓度的测定。与传统方法相比,具有更高的灵敏度、能重复使用的特性。而且,该葡萄糖无酶检测方法设备简单、成本低廉、检测快速、使用方便。
附图说明
图1:本发明能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的装置图,其中:1为固定支架,2为结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜,3为铂片,4为参比电极,5为电化学分析仪;
图2:钛基底上铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜的扫描电子显微镜图;
图3:钛基底上修饰有铂纳米粒子的不同管长的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,在50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液和浓度为50mmol/L的葡萄糖溶液的混合液中的循环伏安响应图,其中铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极;
图4:钛基底上修饰不同含量铂纳米粒子的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,在50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液和浓度为50mmol/L的葡萄糖溶液的混合液中的循环伏安响应图,其中铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,右上角曲线为工作电极中含有不同量的铂纳米粒子,所对应的氧化还原峰电流值曲线;
图5:含有抗坏血酸、尿酸或对乙酰氨基酚环境的待测液对葡萄糖浓度检测结果的影响的柱形图,其中AA是抗坏血酸,UA是尿酸,AP是P-乙酰氨基苯酚;
图6:结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极首次使用时和紫外光自清洁后,在浓度为50mmol/L的葡萄糖中的循环伏安响应图和浓度为1mol/L的H2SO4中的循环伏安响应图,其中铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极;
图7:实施例2中,结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,在不同浓度的葡萄糖和50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液的混合液中的时间电流曲线(A)和氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线(B)。
具体实施方式
实施例1
本发明的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置,如图1所示,将电解槽固定于水平平台上,使电解槽底部和水平平台连为一体,一个锥型圆孔穿透电解槽底部和水平平台,该锥型圆孔的锥顶方向竖直向下,锥型圆孔孔径的最小值为10mm,横跨电解槽顶部设有固定支架,将结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,组成三电极系统,电极间距离为6mm,参比电极通过固定支架竖直放于电解槽内,对电极通过固定支架水平悬于电解槽底部的圆孔上方,工作电极水平固定于电解槽的圆孔底部,位置与对电极相对,电解槽内加入浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,参比电极、对电极和工作电极分别通过导线与电化学分析仪CHI660E连接。完成检测后,在紫外光下照射30分钟,即可实现检测功能恢复。
本发明的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法为,结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜的制备过程:
(a)首先依次将纯度为99.6%钛片,大小大约为15mm×15mm×0.1mm,浸入异丙醇一次、丙酮一次、乙醇两次和去离子水两次,每次在超声清洗仪中处理10分钟再进行下一步操作,然后将处理好的钛片用氮气吹干;
(b)对钛片进行阳极氧化处理:电解槽内为浓度为0.135mol/L的NH4F和0.2mol/L的(NH4)2SO4的电解液,钛片作为阳极,铂片作为阴极,接通电源在40V电压下反应4小时。然后再将其在450℃温度下退火处理1小时即得钛基底上的二氧化钛纳米管阵列薄膜样品,管长为4μm。
(c)在二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子:将H2PtCl6在体积比为4:1的水和乙醇的混合液中稀释,使其浓度为0.9mmol/L,然后在紫外光下照射45分钟。将二氧化钛纳米管阵列薄膜样品浸入上述混合液中16小时,用去离子水轻微的冲去表面混合液,再用300W中等压力的汞灯照射30分钟。然后在空气中120℃下保持2小时;
实施例2
利用实施例1制得的结合在钛基底上铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极的三电极系统,电极间距离为6mm。此三电极系统在电解槽中工作,电解槽内加入50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,Pt电极、工作电极和参比电极连接上电化学分析仪CHI660E。检测条件为:在磁力搅拌速率为200rpm,使用的电压范围-0.2~1.0V。采用循环伏安法,对不同浓度的葡萄糖溶液进行检测。完成检测后,在紫外光下照射30分钟,即可实现检测功能恢复。
(1)检测准备:
制备100mL的浓度为1mol/L的H2SO4,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为500mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为50mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为5mmol/L的H2SO4葡萄糖的混合溶液;
(2)氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线测定:
先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入检测装置中,每过30秒依次滴加20μL葡萄糖浓度为50mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液10次,每次滴加完成后,都用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测;再每过30秒滴加50μL葡萄糖浓度为50mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液6次,每次滴加完成后,都用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测;再每过30秒滴加10μL葡萄糖浓度为500mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液5次,每次滴加完成后,都用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测;再每过30秒滴100μL葡萄糖浓度为500mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液13次,每次滴加完成后,都用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测。从而完成氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线测定,见图7,其中,图7(A)中箭头所指为,在时间电流曲线中通过计算,不同电流值所对应的葡萄糖浓度。
(3)待测液的检测:先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入电解槽中,在电解槽里连续加入待测液体,用电化学分析仪进行循环伏安检测,记录其氧化还原峰电流,然后,对应氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线,得到葡萄糖的浓度;葡萄糖的检测范围为4×10-5~26mmol/L。
(4)检测完成后,对工作电极进行紫外光照射30分钟,完成自清洁恢复原有性能。
Claims (8)
1.一种能重复使用的无酶葡萄糖检测装置,其特征在于:该装置是将电解槽固定于水平平台上,使电解槽底部和水平平台连为一体,一个锥型圆孔穿透电解槽底部和水平平台,该锥型圆孔的锥顶方向竖直向下,锥型圆孔孔径的最小值小于工作电极的长度或宽度,横跨电解槽顶部设有固定支架,将结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl或3mol/L的KCl作为参比电极,组成三电极系统,电极间距离为4~10mm,参比电极通过固定支架竖直放于电解槽内,对电极通过固定支架水平悬于电解槽底部的圆孔上方,工作电极水平固定于电解槽的圆孔底部,位置与对电极相对,电解槽内加入浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,参比电极、对电极和工作电极分别通过导线与电化学分析仪连接。
2.如权利要求1所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法,其特征在于:所述结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜的制备过程为:
(a)钛片的处理:首先将纯度为95~99.8%的钛片,采用异丙醇、丙酮、乙醇和去离子水进行清洗,每次在超声清洗仪中处理3~10分钟,将处理好的钛片用氮气吹干备用;
(b)钛片的阳极化处理:电解槽内为含氟电解液,钛片作为阳极,铂片作为阴极,加直流电压30~60V,反应2~10小时,然后再将其300~600℃退火处理1~3小时,即可得到附着于钛基底上的二氧化钛纳米管阵列薄膜,二氧化钛纳米管阵列薄膜的管径为70~120nm,管长为0.5~25μm;
(c)二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子:铂纳米粒子的修饰采用光化学一步法,或两步光照法。
3.如权利要求2所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法,其特征在于:步骤(b)中含氟电解液为浓度0.135mol/L的NH4F和0.2mol/的(NH4)2SO4的电解液。
4.如权利要求2所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法,其特征在于:步骤(b)中二氧化钛纳米管阵列薄膜管长为4μm。
5.如权利要求2所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法,其特征在于,在步骤(c)中,采用两步光照法,二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰铂纳米粒子的过程为:将H2PtCl6在水和乙醇体积比为4:1的混合液中稀释,使其浓度为0.9mmol/L,用500W中压汞灯照射上述溶液0.5~12小时;将二氧化钛纳米管阵列薄膜样品浸入上述混合液中4~24小时,用去离子水冲去表面混合液,再用紫外光照射10~60分钟;然后在空气中80~160℃加热1~5小时,铂纳米粒子均匀的修饰于二氧化钛纳米管管壁和管底部,修饰在二氧化钛纳米管阵列薄膜上的铂纳米粒子的量为0.05~2.0mg/cm2。
6.如权利要求5所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的制备方法,其特征在于:二氧化钛纳米管阵列薄膜上修饰的铂纳米粒子量为0.8mg/cm2。
7.采用权利要求1所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的检测方法,其特征在于,使用结合在钛基底上的铂纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列薄膜作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl或3mol/L的KCl作为参比电极的三电极系统,电极间距离为4~10mm,电解槽内加入50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液作为电解液,Pt电极、工作电极和参比电极分别通过导线连接上电化学分析仪,电压范围为-0.2~1.0V,搅拌条件为200rpm,采用循环伏安法,对不同浓度的葡萄糖溶液进行检测,具体步骤包括:
(1)检测的准备:制备100mL的浓度为1mol/L的H2SO4,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为500mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为50mmol/L的H2SO4葡萄糖混合溶液,20mL的H2SO4浓度为1mol/L和葡萄糖浓度为5mmol/L的H2SO4葡萄糖的混合溶液;
(2)氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线的测定:先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入电解槽中,每次取10~100μL不同浓度H2SO4葡萄糖的混合溶液,滴加入电解槽中,用电化学分析仪连续进行时间电流曲线检测,从而获得氧化电流值与葡萄糖浓度之间的关系曲线;
(3)待测液的检测:先将50mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液放入电解槽中,在电解槽里连续加入待测液体,用电化学分析仪进行循环伏安检测,记录其氧化还原峰电流,然后,对应氧化电流值与葡萄糖浓度之间的标准曲线,得到葡萄糖的浓度;
(4)检测完成后,对工作电极进行紫外光照射30分钟,完成自清洁恢复原有性能。
8.如权利要求7所述的能重复使用的无酶葡萄糖检测装置的检测方法,其特征在于,待测液可以是含抗坏血酸、尿酸或对乙酰氨基酚的环境。
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