CN105021575A - 基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器。该生物传感器将半导体材料金属氧化物修饰到氧化铟锡电极(ITO)上，之后将肯普肽、PKA、探针层层组装到电极上，由于探针中含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌，在可见光的照射下，光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子，贵金属纳米粒子在光子的激发下发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物导带上从而产生光电流。该生物传感器定量检测的依据是不同浓度的PKA使肯普肽磷酸化程度不同，使得探针连接到修饰电极的量也不同从而导致光电流的变化。该方法具有很高的灵敏度和选择性，对酶的抑制性实验也表明，此方法达到了高效灵敏检测激酶PKA活性的目的。

Description

基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器

技术领域：

本发明涉及光电化学传感器领域，尤其涉及基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器。

背景技术：

激酶(PKA)调节的蛋白磷酸化在新陈代谢和细胞传导通路中起着重要的作用。蛋白激酶的过表达会引起多种疾病比如肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默症等。在生物化学领域中，对激酶活性及其抑制剂的检测能够阐述信号传导的分子机制，在临床医学及载药领域，对早期发现激酶表达活性异常也有利于疾病的预防和治疗。

基于局域表面等离子体共振效应的光电生物传感器利用半导体金属氧化物(例如：氧化钛TiO₂、氧化锌ZnO)的性质将光信号转变成电信号用来检测激酶PKA活性，仪器简单、操作容易。由于TiO₂/ZnO为宽禁带氧化物，需要高能量紫外光才能激发，而紫外对生物分子的活性又有影响，因此不能直接应用于对生物分子的检测。

然而，现有的生物传感器中的工作电极主要为玻碳电极或金电极，其中，玻碳电极不能直接进行物理方法或者化学方法固载酶，只能通过在玻碳电极表面进行其他处理，例如化学交联或者溶胶凝胶使得玻碳电极表面固载少量酶。由于玻碳电极的固载酶量低，使得其灵敏度未能达到理想水平。而金电极通常只对含有或者修饰有特定基团比如巯基的酶进行固载，有一定的局限性。此外，玻碳电极及金电极在使用之前都要打磨抛光及活化处理，过程比较繁琐。因此，提供一种酶固载量高、分析灵敏度高且简单快速的工作电极具有重要的现实意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种基于贵金属纳米粒子局域表面等离子共振效应检测蛋白激酶活性的光电传感器。该方法具有很高的灵敏度和选择性，对酶的抑制性实验也表明，此方法达到了高效灵敏检测激酶PKA活性的目的。

当光线入射到贵金属纳米粒子(纳米金、纳米银、纳米钯或纳米铂)上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒自由电子的集体震荡频率相匹配，贵金属纳米粒子就会对光子能量产生强吸收作用，同时发生局域表面等离子体共振。在本发明中，将贵金属纳米粒子与一端为磷酸基团的DNA双链组成探针，肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于 蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于金属锆离子对磷酸基团具有配位作用，含有磷酸基团的探针与磷酸化的肯普肽被锆离子连接到一起从而将贵金属纳米粒子进一步修饰到对应的金属氧化物半导体之上。在入射光下，当贵金属纳米粒子发生局域等离子体共振时，自由电子不断振荡到达光激发态。即使金属氧化物没有吸收任何光子，激发电子仍会被源源不断注入金属氧化物的导带之中，从而被氧化铟锡电极捕捉并记录光电流。本发明利用贵金属纳米粒子的局域表面等离子效应将金属氧化物的吸收范围扩大到可见光区，同时由于金属氧化物半导体本身对可见光无响应及性质稳定，因此又能够显著的降低背景信号，极大地提高了检测限，从而能够灵敏的检测PKA的活性。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器，包括工作电极、对电极、参比电极，所述工作电极包括ITO玻璃基底，在基底上依次制备有金属氧化物半导体层、在金属氧化物半导体层表面硅烷化和接枝戊二醛形成的立体网络结构层、固定化酶膜，DNA/纳米金属层。

优选的是，所述DNA/纳米金属层上镶嵌有光敏剂。探针中含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌，在可见光的照射下，光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子，贵金属纳米粒子在光子的激发下发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物(例如TiO₂/ZnO)导带上从而产生光电流。

一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器的工作电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)特异性DNA经杂交孵育后，再与贵金属纳米粒子偶联制得DNA/纳米金属溶胶；

2)在ITO玻璃片之上加半导体金属氧化物，高温干燥，即得半导体金属氧化物/ITO电极；

3)将半导体金属氧化物/ITO电极浸入有机硅烷化试剂进行硅烷化，反应完成后，再浸入戊二醛溶液中进行接枝共聚，得接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极；

4)在黑暗条件下，在接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极表面修饰多肽，脱除电极表面多余的液体后得多肽修饰的电极；

5)将含有生物酶和三磷酸腺苷的缓冲溶液滴加到多肽修饰的电极，使多肽发生磷酸化；并将步骤1)得到的DNA/纳米金属溶胶滴加到电极上，再用光敏剂对电极进行修饰，即得工作电极。

优选的是，步骤1)中，所述特异性DNA的基因序列为：

DNA₁：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′；

DNA₂：3′-GCAAATCCTAAAC。通过特异性DNA检测探针的设计，精确检测酶活性。

优选的是，所述的半导体金属氧化物为氧化钛TiO₂或氧化锌ZnO。利用半导体金属氧化物(例如：氧化钛TiO₂、氧化锌ZnO)的性质将光信号转变成电信号。

优选的是，步骤3)中，所述有机硅烷化试剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。增强材料的湿态电气性能，并改善材料在聚合物中的润湿性和分散性，增加两种材料的粘接性。

优选的是，步骤4)中，所述多肽为肯普肽。肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。

优选的是，步骤4)中，将所述多肽修饰的电极用6-氨基己酸进行封闭。

优选的是，步骤5)中，所述光敏剂为三联吡啶钌。在可见光的照射下，光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子，贵金属纳米粒子在光子的激发下发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物(例如TiO₂/ZnO)导带上从而产生光电流。

优选的是，所述贵金属纳米粒子为纳米金、纳米银、纳米钯或纳米铂。当光线入射到贵金属纳米粒子(纳米金、纳米银、纳米钯或纳米铂)上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒自由电子的集体震荡频率相匹配，贵金属纳米粒子就会对光子能量产生强吸收作用，同时发生局域表面等离子体共振

本发明还提供了一种光电传感器，包括上述的基于贵金属纳米粒子局域表面等离子共振效应检测蛋白激酶活性的工作电极、对电极、参比电极。

实验原理： 

肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于金属锆离子对磷酸基团的配位作用，因此，含有磷酸基团的探针与磷酸化的肯普肽被锆离子连接到一起。探针中含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌，在可见光的照射下，光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子，贵金属纳米粒子在光子的激发下发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物(例如TiO₂/ZnO)导带上从而产生光电流。抗坏血酸在此方法中作为电子供体，其电子不断补充到贵金属纳米粒子的价带空穴，使得纳米金属电子不断注入半导体金属氧化物导带参与光电转换反应，从而产生连续、稳定的光电流。由右侧能级图可见，上述半 导体金属氧化物为宽禁带半导体，贵金属纳米粒子在可见光的照射下在发生局域表面等离子体共振效应之后其电子均可注入上述半导体的导带之中，从而产生光电流。当蛋白激酶活性高时，肯普肽被磷酸化的程度高，而被链接上的探针数量也会随之增加多，从而导致光电流增大，反之则减小。因此，随着激酶活度的不同，光电流的变化也会随之变化，由此达到灵敏高效检测蛋白激酶的目的(图1)。

上述的光电传感器可用于检测蛋白磷酸化和蛋白激酶抑制剂的活性。

本发明的有益效果：

1、本发明是利用贵金属纳米粒子的局域表面等离子体效应和宽禁带半导体性质构建光电传感器，此光电传感器首次用来检测蛋白激酶PKA的活性。

2、本发明采用金属氧化物半导体材料(TiO₂/ZnO)作为电极基底。半导体金属氧化物具有良好的光稳定性能，但是其禁带较宽，只能在紫外光的可见下有光电响应而在可见光的照射下没有光电响应。将贵金属纳米粒子修饰到半导体金属氧化物上可以利用贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振效应将其光的吸收范围扩大到可见光区，同时又利用其本身在可见光下无光响应的特点，可以大大减小试验中的背景电流，从而使得实验的灵敏度得到了极大的提高。

3、本实验光敏剂染料三联吡啶钌可以嵌在DNA双链的特性，将三联吡啶钌修饰到探针上，这样可以捕获更多的光子，增强贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振效应，从而极大的提高光电传感器的光电转换效率。

4、光电流在可见光下随着蛋白激酶活度的不同而大小不同，达到了超灵敏检测激酶活性的效果。

附图说明

图1：实验原理图

图2：纳米金(a)、DNA修饰纳米金(b)紫外吸收峰谱图

图3：氧化钛(a)和纳米金/氧化钛(b)紫外漫反射谱图

图4：不同电极组装时阻抗图，其中：a为裸ITO电极阻抗；b为TiO₂修饰到ITO电极阻抗c为修饰有肯普肽之后的电极阻抗；d为PKA磷酸化之后的电极阻抗；e为滴加探针之后电极阻抗。

图5：条件优化图：pH；ATP浓度；磷酸化时间；孵育温度

图6：不同浓度的PKA下的电流响应图

图7：不同抑制物浓度下的电流相应图

具体实施方式

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。

实施例1

光电传感器的制备

1、探针的制备：

纳米金的合成：100ml 0.01％(w/v)的氯金酸水溶液置于磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，之后0.5mL 1％(w/v)柠檬酸钠水溶液快速加入沸腾的氯金酸溶液中，当溶液变为酒红色时，停止加热得到纳米金，将其置于4℃保存备用。紫外可见分光光度计证明其吸收峰在529nm处，对应粒径46nm(图2)。

2、DNA对纳米金修饰：

DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米金溶液中，室温搅拌24小时之后，将150uL 1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，老化24小时，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。将修饰有DNA的纳米金在紫外下进行表征，可以看到，纳米金的紫外吸收峰由529nm红移到533nm，这是由于杂交链的DNA修饰到纳米金所引起的，由此证明DNA/纳米金的成功组合(图2)。

3、传感器的组装：

TiO₂/ITO电极的硅烷化：ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1：1v/v)溶液、水中超声清洗15分钟，然后将其放在90℃烘箱中12h。之后取出，滴加1mg/mL的氧化钛50μL于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上干燥之后继续重复滴加5次，之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO₂/ITO放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到TiO₂的表面，将硅烷化的TiO₂/ITO放入110℃1h之后浸入5％戊二醛，于37℃下反应1h。

TiO₂/ITO电极硅烷化后，将50μL浓度500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12小时使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极。1mM 的6-氨基己酸封闭空白位点30分钟以减轻非特异性吸附。含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl and 20mM MgCl₂，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80分钟后滴加50uL的Zr⁴⁺溶液。之后将探针DNA/纳米金滴加到电极上反应，氮气吹干之后将50μM的[Ru(NH₃)₆]³⁺溶液滴加到电极上反应10min，之后用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

实验现象的表征

以下光电化学检测条件均为：光电系统用到的光源为氙灯，采用460nm以上波长的可见光滤光片，辐照强度为190mW/cm²。光电实验由上海辰华电化学工作站进行，使用三电极体系(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：铂丝电极，工作电极：ITO电极)，以含有0.1M抗坏血酸为电子供体的PBS磷酸盐溶液为反应溶液。

1、纳米金的局域表面等离子体效应由紫外可见分光光度计进行表征(图3)，由图3可见，组装后的纳米金/TiO₂探针电极在可见光区域(波长>420nm)与单独的TiO₂电极相比具有明显的吸收峰，这是由于纳米金的局域表面等离子共振效应引起的，从而能够证明实验理论的可行性。

2、交流阻抗表征以频率的变化来测量电极的阻抗值，从而来监控电极组装的过程。本发明涉及的电极的组装过程的电化学交流阻抗由普林斯顿Parstat2273电化学工作站进行表征，并以5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为氧化还原探针并含有0.5M KCl的电解质溶液中进行，频率为10mHz～100kHz(图4)。在图中，裸ITO为可以忽略的半圆，随着TiO₂的滴加，半径变大，当肯普肽修饰上之后，阻抗进一步增加，这是因为肯普肽作为一种多肽不利于电子的传递，当滴加PKA之后，阻抗小幅度增加，最后修饰上探针，阻抗明显减小，这是由于纳米金具有良好的导电性，有利于电子的传递。传感器组装个阶段的电阻大小的变化反应出了电极的组装情况。

3、pH值、ATP浓度、磷酸化的时间及温度对光电流强度变化的影响(图5)。pH值、ATP浓度、磷酸化的时间及温度对光电流强度变化的影响对生物传感器有着重要的影响。本发明优化了以上的影响因素，如图所示，当缓冲溶液pH值为8.0时，光电流变化值最大；作为磷酸根的供体，ATP的浓度100mM时光电流变化值得到最大，随着ATP的浓度继续增加，光电流变化值不再变化，随着磷酸化时间的延长，光电流的变化值逐渐增大，当磷酸化时间达到80min时达到最大，之后不再变化，因为本发明选择80min的磷酸化时间。温度对于酶反应影响巨大，温度过高或者过低都会影响酶的活性，由图可见，当温度37℃时达到最佳反应 浓度。温度低于或者高于37℃时光电流的变化值都减小。

4、PKA的光电化学表征(图6)。本发明的线性关系是通过在最优条件下，加入不同浓度的PKA来检测到的光电流的变化值来表征，由图可见，随着PKA浓度的增加，光电流的变化值逐渐增大，当浓度达到50U/mL时候光电流变化值达到最大。其中在PKA的浓度在0.008～1U/mL范围内，其浓度对数与光电流的变化值呈线性关系，其检测限为0.0051U/mL。

5、PKA的抑制性实验分析。将制备好的生物传感器用于蛋白激酶的抑制剂的分析中。如图所示，随着鞣花酸的浓度从0-12μM不断增加，光电流不断变小，当其浓度达到8μM时，光电流的信号不再有变化(图7a)。而当实验用络氨酸激酶TyrphostinAG1478时，随着TyrphostinAG1478浓度的变化，其光电流的大小并没有明显的变化(图7b)，由此可以说明，该传感器可以用于对抑制剂的筛选(图7)。

6、本发明对基于纳米金属局域表面等离子共振效应检测PKA激酶活性的光电生物传感器的重现性进行了考察，利用十二根相同组装的电极对同一活度(1U)的PKA进行检测，测得其RSD＝8％，证明其具有重复性。

实施例2

光电传感器的制备

1、探针的制备：

纳米钯的合成：100ml 0.01％(w/v)的新鲜配制的Pd(NH₃)₂Cl₂溶液与0.5g/L保护剂聚乙烯吡咯烷酮混合于10ml比色管中，机械搅拌下加入还原剂聚乙二醇，密封，放入60℃恒温水浴锅中，随着反应的进行，溶液颜色开始变化，当溶液变为黑色且不在变化时停止加热得到纳米钯混合溶液。将混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，得到纳米钯颗粒。将纳米钯重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中纳米银，将其置于4℃保存备用。将其置于4℃保存备用。

2、DNA对纳米钯修饰：

DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米钯溶液中。由于DNA一端链含有巯基功能团，可以使得DNA双链连接到钯颗粒上。室温搅拌24小时之后，将150uL 1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，老化24小时，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。得到DNA修饰的纳米钯。

3、传感器的组装：

TiO₂/ITO电极的硅烷化：ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1：1v/v)溶液、水中超声清洗15分钟，然后将其放在90℃烘箱中12h。之后取出，滴加1mg/mL的氧化钛50μL于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上干燥之后继续重复滴加5次，之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO₂/ITO放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到TiO₂的表面，将硅烷化的TiO₂/ITO放入110℃1h之后浸入5％戊二醛，于37℃下反应1h。

TiO₂/ITO电极硅烷化后，将50μL浓度500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12小时使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极。1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30分钟以减轻非特异性吸附。含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl and 20mM MgCl₂，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80分钟后滴加50uL的Zr⁴⁺溶液。之后将探针DNA/纳米钯滴加到电极上反应，氮气吹干之后将50μM的[Ru(NH₃)₆]³⁺溶液滴加到电极上反应10min，之后用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

实施例3

光电传感器的制备

1、探针的制备：

纳米银的合成：0.01g牛血清蛋白加入蒸馏水中搅拌至牛血清蛋白完全溶解形成澄清无色溶液后，将5ml0.5M的硝酸银水溶液加入其中置于磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加入一定量氨水配成银氨溶液，，之后将0.2g抗坏血酸水溶液快速加入银氨溶液中，继续搅拌10min。混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，得到纳米银颗粒。将纳米银重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中纳米银，将其置于4℃保存备用。

2、DNA对纳米银修饰：

DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米银溶液中，室温搅拌24小时之后，将150uL1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，老化24小时，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中，得到 DNA修饰的纳米银。

3、传感器的组装：

TiO₂/ITO电极的硅烷化：ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1：1v/v)溶液、水中超声清洗15分钟，然后将其放在90℃烘箱中12h。之后取出，滴加1mg/mL的氧化钛50μL于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上干燥之后继续重复滴加5次，之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO₂/ITO放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到TiO₂的表面，将硅烷化的TiO₂/ITO放入110℃1h之后浸入5％戊二醛，于37℃下反应1h。

TiO₂/ITO电极硅烷化后，将50μL浓度500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12小时使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极。1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30分钟以减轻非特异性吸附。含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl and 20mM MgCl₂，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80分钟后滴加50uL的Zr⁴⁺溶液。之后将探针DNA/纳米银滴加到电极上反应，氮气吹干之后将50μM的[Ru(NH₃)₆]³⁺溶液滴加到电极上反应10min，之后用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

实施例4

光电传感器的制备

1、探针的制备：

纳米铂的合成：1ml 100mmol/L的K₂PtCl₆水溶液与7ml水混合均匀，加入0.8gKBr置于磁力搅拌器上搅拌1h，然后加入2ml 0.5mol/l的聚吡咯烷酮水溶液，使反应也的总体积保持在10ml，K₂PtCl₆的最终浓度为10mmol/l，之后将溶液转入25ml的反应釜中，升温至130℃之后保持3h，冷却到室温之后得到深棕色的混合溶液。混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，得到纳米铂颗粒。将纳米铂重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中纳米银，将其置于4℃保存备用。

2、DNA对纳米铂修饰：

DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米铂溶液中，室温搅拌24小时之后，将150uL1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，老化24小时，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次， 撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。最终得到DNA修饰的纳米铂。(图2)。

3、传感器的组装：

TiO₂/ITO电极的硅烷化：ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1：1v/v)溶液、水中超声清洗15分钟，然后将其放在90℃烘箱中12h。之后取出，滴加1mg/mL的氧化钛50μL于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上干燥之后继续重复滴加5次，之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO₂/ITO放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到TiO₂的表面，将硅烷化的TiO₂/ITO放入110℃1h之后浸入5％戊二醛，于37℃下反应1h。

TiO₂/ITO电极硅烷化后，将50μL浓度500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12小时使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极。1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30分钟以减轻非特异性吸附。含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl and 20mM MgCl₂，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80分钟后滴加50uL的Zr⁴⁺溶液。之后将探针DNA/纳米铂滴加到电极上反应，氮气吹干之后将50μM的[Ru(NH₃)₆]³⁺溶液滴加到电极上反应10min，之后用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

实施例5

光电传感器的制备

1、探针的制备：

纳米金的合成：100ml 0.01％(w/v)的氯金酸水溶液置于磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，之后0.5mL 1％(w/v)柠檬酸钠水溶液快速加入沸腾的氯金酸溶液中，当溶液变为酒红色时，停止加热得到纳米金，将其置于4℃保存备用。紫外可见分光光度计证明其吸收峰在529nm处，对应粒径46nm(图2)。

2、DNA对纳米金修饰：

DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米金溶液中，室温搅拌24小时之后，将150uL 1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，老化24小时，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。将修 饰有DNA的纳米金在紫外下进行表征，可以看到，纳米金的紫外吸收峰由529nm红移到533nm，这是由于杂交链的DNA修饰到纳米金所引起的，由此证明DNA/纳米金的成功组合(图2)。

3、传感器的组装：

ZnO/ITO电极的硅烷化：ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1：1v/v)溶液、水中超声清洗15分钟，然后将其放在90℃烘箱中12h。之后取出，滴加1mg/mL的氧化锌50μL于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上干燥之后继续重复滴加5次，之后将其放入200℃环境中15h。取出将ZnO/ITO放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到ZnO的表面，将硅烷化的ZnO/ITO放入110℃1h之后浸入5％戊二醛，于37℃下反应1h。

ZnO/ITO电极硅烷化后，将50μL浓度500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12小时使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极。1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30分钟以减轻非特异性吸附。含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl and 20mM MgCl₂，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80分钟后滴加50uL的Zr⁴⁺溶液。之后将探针DNA/纳米金滴加到电极上反应，氮气吹干之后将50μM的[Ru(NH₃)₆]³⁺溶液滴加到电极上反应10min，之后用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

上述实施例2-5制备的光电生物传感器性能与实施例1基本相同。 

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器，包括工作电极、对电极、参比电极，所述工作电极包括ITO玻璃基底，在基底上依次制备有金属氧化物半导体层、在金属氧化物半导体层表面硅烷化和接枝戊二醛形成的立体网络结构层、固定化酶膜，DNA/纳米金属层。

2.如权利要求1所述的基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器，其特征在于，所述的DNA/纳米金属层上镶嵌有光敏剂。

3.一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器，其特征在于，包括如下步骤：

1)特异性DNA经杂交孵育后，再与贵金属纳米粒子偶联制得DNA/纳米金属溶胶；

2)在ITO玻璃片之上加半导体金属氧化物，高温干燥，即得半导体金属氧化物/ITO电极；

3)将半导体金属氧化物/ITO电极浸入有机硅烷化试剂进行硅烷化，反应完成后，再浸入戊二醛溶液中进行接枝共聚，得接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极；

4)在黑暗条件下，在接枝戊二醛的半导体金属氧化物/ITO电极表面修饰多肽，脱除电极表面多余的液体后得多肽修饰的电极；

5)将含有蛋白激酶、三磷酸腺苷ATP、镁离子的Tris缓冲溶液滴加到多肽修饰的电极，使多肽发生磷酸化；并将步骤1)得到的DNA/纳米金属溶胶滴加到电极上，再用光敏剂对电极进行修饰，即得工作电极。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述特异性DNA的基因序列为：

DNA₁：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′；

DNA₂：3′-GCAAATCCTAAAC。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的半导体金属氧化物为氧化钛TiO₂或氧化锌ZnO。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述多肽为肯普肽，将所述多肽修饰的电极用6-氨基己酸进行封闭。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述光敏剂为三联吡啶钌。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述贵金属纳米粒子为纳米金、纳米银、纳米钯或纳米铂。

9.如权利要求1或2所述的光电传感器在检测蛋白激酶活性的应用。

10.如权利要求1或2所述的光电传感器在对抑制剂的筛选方面的应用。