CN115006526A - 一种光动力TiO2复合纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光动力TiO2复合纳米粒子及其制备方法和应用。本发明的光动力TiO2复合纳米粒子，由Ru配合物共价修饰TiO2纳米粒子，再进一步负载HIF‑1αsiRNA制得。通过上述方法，制得的TiO2@Ru@siRNA，使TiO2的可见光的光谱光敏化，作为电子受体诱导光电子从价带转移到TiO2的高能导带，实现高效的电子‑空穴分离，有利于电子和氧之间的反应产生单线态氧，而空穴与水分子之间的反应产生强氧化性羟基自由基，从而以获得更优的光催化活性。

Description

一种光动力TiO2复合纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米生物医学技术领域，更具体的，涉及一种光动力TiO2复合纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
典型的口腔鳞状细胞癌(OSCC)治疗方法是外科手术治疗，部分病例需辅助放射治疗或化学治疗。为了尽可能地去除肿瘤组织，通常会扩大切除相邻的正常功能组织，这种治疗策略往往会造成患者的严重损伤、生活质量的降低等。尽管OSCC患者接受多种治疗，5年总体生存率仍为50％～60％，因此探求新的高效、低毒、靶向性强的药物制剂及方法成为医学界的研究热点。
光动力治疗(PDT)是一种治疗浅表肿瘤(如食道癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤)等疾病有效的临床治疗方法。PDT利用光敏制剂经激光(或其他光源)激发后催化肿瘤内部的氧气，生成具有细胞毒性的活性氧(ROS)，诸如单线态氧(1O2)、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(·O2-)等，破坏细胞和细胞器的结构与功能，杀伤癌细胞，达到治疗肿瘤的目的。相比手术与放化疗，PDT是一种无创、毒副作用小、选择性好、精准度高的治疗技术。
然而，在大多数实体瘤中，由于肿瘤的生长速度远大于其内部血管的生成速度，肿瘤微环境长期处于乏氧状态。而光动力疗法作为一种氧依赖性治疗，肿瘤内部的乏氧状态极大的影响活性氧量，降低对肿瘤细胞杀伤作用，因此传统光动力治疗明显受到肿瘤乏氧的限制而无法发挥最大的疗效。
近年来，以纳米技术为基础发展起来的纳米药物递送体系在肿瘤研究领域得到了广泛的关注。相比传统小分子光敏剂的水溶性差，光稳定性差，合成纯化繁琐，机体清除缓慢等，纳米粒子的优势在于其纳米级尺寸，具有较低的毒副作用、高的靶向性，良好的生物相容性等。
二氧化钛(TiO2)是人类生活中使用最广泛的纳米材料之一。然而，TiO2的光响应范围仅限于紫外线区域，由于紫外线渗透性差，TiO2纳米粒子的光催化活性较差，对深度肿瘤治疗的影响不太显著，使得TiO2纳米粒子用于光动力治疗的效果受限。
因此，需要开发一种光响应范围更宽、光催化活性更高的光动力TiO2纳米粒子。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的光响应范围窄、光催化活性低的缺陷，提供一种光动力TiO2复合纳米粒子，通过Ru配合物共价修饰TiO2纳米粒子，再进一步负载HIF-1αsiRNA，制得了TiO2@Ru@siRNA，使TiO2的可见光的光谱光敏化，作为电子受体诱导光电子从价带转移到TiO2的高能导带(CB)，实现高效的电子-空穴分离，有利于电子和氧之间的反应产生单线态氧(1O2)，而空穴与水分子之间的反应产生强氧化性羟基自由基(·OH)，从而以获得更优的光催化活性。一方面HIF-1α在缺氧条件下高表达，促进肿瘤组织新血管形成，推进肿瘤的发生发展。抑制HIF-1α的表达，改善乏氧条件；另一方面光照产生大量ROS，主要包括超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧等，克服乏氧条件发挥I型和II型光动力效果，杀死肿瘤细胞。
本发明的另一目的在于提供上述光动力TiO2复合纳米粒子的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述光动力TiO2复合纳米粒子的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种光动力TiO2复合纳米粒子，由如下方法制备得到：
S1.合成Ru配合物：
将[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP分散于甲醇中，经氩气鼓吹溶剂后，进行微波处理，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到固体产物，经脱去甲醇，得到[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)，即Ru配合物；
S2.Ru配合物修饰TiO2：
将TiO2纳米粒子分散于有机溶剂中，得到悬浮液；将烷基偶联剂和氨水加至有机溶剂中，得到反应液；将悬浮液滴加至反应液中，经搅拌、过滤得到偶联改性TiO2；
将偶联改性TiO2分散于有机溶剂中，超声处理后加入Ru配合物、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)与N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，室温反应后，经后处理，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
S3.负载HIF-1αsiRNA：
将TiO2@Ru纳米颗粒和HIF-1αsiRNA分散在pH缓冲液中，经0～4℃静置反应0.5～1h，经离心、洗涤，得到TiO2@Ru@siRNA，即所述光动力TiO2复合纳米粒子。
所述[Ru(dimbpc)2Cl2]是甲醇酯为配体的Ru化合物，CAS号为854527-66-5。所述TTIP为2-([2,2':5',2″-terthiophen]-5-yl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline，CAS号为1070190-39-4。
本申请的光动力TiO2复合纳米粒子，通过Ru配合物共价修饰TiO2纳米粒子，再进一步负载HIF-1αsiRNA制得。
一方面通过Ru配合物和TiO2的光电协同效应构建稳定的纳米颗粒TiO2@Ru，Ru配合物中，引入了含有三噻吩的双齿配体，赋予配合物超长的三线态寿命。Ru配合物具有优异的光物理和生物特性即长发光寿命、高水溶性、高细胞吸收、高(光)稳定性等，可在可见光区域内产生更长的波长。
通过Ru配合物和TiO2之间的光致电子转移作用，Ru配合物中的光激发电子主要注入TiO2的导带，增加电子活性，被水中溶解氧所捕获生成单线态氧(1O2)，并增加TiO2残留的空穴，产生强氧化性的羟基自由基(·OH)，增加活性氧产率从而提高光敏剂在生理条件下的穿透性和相容性，实现对肿瘤部位的被动靶向。
另一方面，引入了小分子HIF-1αsiRNA，在激光照射下由于溶酶体的损伤，导致纳米颗粒电荷由正到负的变化，促使HIF-1αsiRNA从溶酶体逃逸至胞质，有效改善肿瘤的乏氧环境，最大限度地增大光动力疗效。
发明人研究发现，步骤S1.中，Ru配合物和TTIP仅适用于分散在甲醇中。对于别的醇类，虽然也可能可以分散Ru配合物和TTIP，但在后续微波反应时会发生酯交换反应，不利于产物提纯。用甲醇作溶剂可保证所得产物都为甲醇酯。
优选地，步骤S1.中，所述[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP摩尔比为1:(0.8～1.2)。
更优选地，步骤S1.中，所述[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP摩尔比为1:1。
优选地，步骤S1.中，所述微波处理的条件为：温度120～150℃，时间10～60min。更优选地，步骤S1.中，所述微波处理的条件为：温度150℃，时间10min。
优选地，步骤S1.中，所述纯化是指柱层析纯化，柱层析纯化的条件为：以200～300目硅胶色谱柱，经乙腈水流动相洗脱纯化。
优选地，所述乙腈水流动相的组成为包括乙腈、H2O、20％KCl，三者体积比为90:10:1。
优选地，步骤S1.中，所述脱去甲醇的方法为：固体产物分散于碱溶液中，加热回流；冷却后再用酸溶液调节pH以析出固体；经过滤、洗涤，得到Ru配合物。
上述脱去甲醇的过程中，先将固体产物分散于碱溶液中，加热回流，目的是将化合物中的甲醇酯水解转变为羧酸；再经碱提酸沉，去除未反应的酯化物原料，纯化配合物。
可选地，所述[Ru(dimbpc)2Cl2]的制备方法为：
将Dimethyl[2,2'-bipyridine]-4,4'-dicarboxylate(dimbpc)与[RuCl2(DMSO)4]分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，经加热回流、去除DMF后，加入预冷的丙酮，并在0°静置以析出固体，固体经过滤、洗涤，得到[Ru(dimbpc)2Cl2]。
所述dimbpc的CAS号为71071-46-0；所述[RuCl2(DMSO)4]的CAS号为89395-66-4。
具体的，所述[Ru(dimbpc)2Cl2]通过如下方法制备得到
将dimbpc(1.36g，5.00mmol)与[RuCl2(DMSO)4](1.21g，2.50mmol)分散于DMF(20mL)，加热回流6h，然后蒸发DMF，加入50mL预冷丙酮；将溶液在0°静置2h，析出固体，将固体过滤后分别用用丙酮和水清洗，得到[Ru(dimbpc)2Cl2]。
具体的，步骤S1.可以为：
将[Ru(dimbpc)2Cl2](723.53mg，1.00mmol)与TTIP(446.60mg，1.00mmol)分散于4mL甲醇中，经氩气鼓吹溶剂后，进行微波处理，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到固体产物[Ru(dimbpc)2(TTIP)](Cl)2(Rua)；
粉末状固体产物(118.3mg，0.1mmol)分散于1N的NaOH溶液中，加热回流1h；反应结束后冷却至0°，用1N HCl溶液调节pH至3左右，析出固体；将固体过滤后使用10mL甲醇清洗，再用1N NaOH溶解固体去除不可溶性杂质，抽滤后用甲醇清洗固体，避光干燥后得[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)，即Ru配合物。
可选地，步骤S2.中，所述烷基偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTEs)和/或3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMs)。
优选地，步骤S2.中，所述烷基偶联剂为APTEs。
使用APTEs修饰TiO2纳米粒子，可以使TiO2纳米粒子具有较高的电势。与zeta电位为-7.41±1.22的TiO2相比，偶联改性TiO2的zeta电位为+27.65±2.46。表面正电荷不仅有利于肿瘤细胞对纳米粒子的吸收，而且容易装载siRNA等负生物分子。
优选地，步骤S2.中，所述TiO2纳米粒子、Ru配合物的质量比为(3～4):1。
发明人研究发现，偶联改性TiO2对Ru的最大负载能力为0.315mg/mg。负载率为最大负载能力的80％时，可以最优地保持纳米粒子表面的正电荷。
优选地，步骤S2.中，所述室温反应的条件为：20～25℃，20～24h。更优选地，步骤S2.中，所述室温反应的条件为：25℃，24h。
优选地，步骤S2.中，所述后处理包括离心、洗涤、干燥。
具体的，步骤S2.可以为：
将2.1mg TiO2纳米粒子分散于7mL甲醇中，超声分散15min，得到TiO2悬浮液；在14mL甲醇溶液中加入1mL APTEs，再加入0.7mL氨水溶液搅拌15min，得到反应液；然后将TiO2悬浮液滴入反应液中，大力搅拌，室温搅拌24h，形成偶联改性TiO2；
将偶联改性TiO2(67mg)分散于有机溶剂(10mL)中，超声处理后加入Ru配合物(16.9mg，0.015mmol)、HATU(11.4mg，0.03mmol)与DIPEA(10.8μL，0.06mmol)，20～25℃室温反应24h后，经离心、洗涤、干燥，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
优选地，步骤S3.中，所述TiO2@Ru纳米颗粒与HIF-1αsiRNA的质量浓度比为1mg/mL:10～30μmol/L。
更优选地，步骤S3.中，所述TiO2@Ru纳米颗粒与HIF-1αsiRNA的质量浓度比为1mg/mL:15～20μmol/L。
优选地，步骤S3.中，所述离心为冷冻离心，在0～5℃条件下进行离心处理。
siRNA的稳定性较差，在低温下冷冻离心可保证HIF-1αsiRNA的稳定性
优选地，步骤S3.中，所述PH缓冲液为pH＝6～7的PBS缓冲液。
TiO2@Ru纳米颗粒上的游离羧基在生理环境(pH＝7.4)下可以解离，可以降低纳米系统的净电位，加速siRNA的解离。因此，在酸性条件下(pH＝6～7)负载带负电荷的HIF-1αsiRNA具有更高的负载效率。
本发明还保护上述光动力TiO2复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成Ru配合物：
将[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP分散于甲醇中，经氩气鼓吹溶剂后，进行微波处理，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到固体产物，经脱去甲醇，得到[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)，即Ru配合物；
S2.Ru配合物修饰TiO2：
将烷基偶联剂与分散于有机溶剂的TiO2纳米粒子混合，经加热回流，过滤得到偶联改性TiO2；
将偶联改性TiO2分散于有机溶剂中，超声处理后加入Ru配合物、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)与N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，室温反应后，经后处理，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
S3.负载HIF-1αsiRNA：
将TiO2@Ru纳米颗粒和HIF-1αsiRNA分散在pH缓冲液中，经0～4℃静置反应0.5～1h，经离心、洗涤，得到TiO2@Ru@siRNA，即所述光动力TiO2复合纳米粒子。
本发明还保护上述光动力TiO2复合纳米粒子在制备抗肿瘤材料和/或抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请创造性地开发了一种光动力TiO2复合纳米粒子，即TiO2@Ru@siRNA。TiO2@Ru@siRNA的平均水合粒径为100nm，Zeta电位为1.14±0.37mV，呈立方体形，大小均一，在水溶液体系中分散性良好。
偶联改性TiO2对Ru的最大负载能力为0.315mg/mg，2.0μM的HIF-1αsiRNA可以完全负载到0.2mg/mL的TiO2@Ru上。TiO2@Ru@siRNA在生理条件下相对稳定，药物包封率高，大大提高了药物递送的有效性与安全性。
TiO2@Ru@siRNA对细胞的暗毒性较低，其光毒性指数超过2000，生物安全性良好，并且能被肿瘤细胞选择性摄取，进一步靶向肿瘤细胞内溶酶体。在激光照射下TiO2@Ru@siRNA能够生成大量ROS，发挥强效的PDT作用，有效杀伤HN6口腔癌细胞。
TiO2@Ru@siRNA可以在光照条件下调控多种免疫途径，其诱导的溶酶体损伤下调HMGB1-NF-κB的表达，进一步抑制PD-L1，从而减轻肿瘤微环境中的免疫抑制；另一方面，流式细胞计数结果显示低表达HMGB1诱导IL-24分泌上调，激活CD4+和CD8+T细胞并促进IFN-γ分泌，增强局部免疫反应。同时，通过体外实验在蛋白水平证明，缺氧通路的关键因子缺氧诱导因子HIF-1α被抑制表达，TiO2@Ru@siRNA能够改善肿瘤微环境乏氧，具有非常突出的光动力治疗效果，且具备免疫调节功能。
附图说明
图1为本发明光动力TiO2复合纳米粒子制备方法步骤S1.的合成路线。
图2为本发明光动力TiO2复合纳米粒子制备方法步骤S2.的合成路线。
图3为实施例1制得的光动力TiO2复合纳米粒子的TEM图片。
图4为实施例1制得的光动力TiO2复合纳米粒子的水合粒径图。
图5为实施例1制得的TiO2@Ru和TiO2@Ru@siRNA在不同pH下的Zeta电位图。
图6为实施例1制得的纳米颗粒TiO2@Ru@siRNA在不同浓度下的ROS产量图。
图7为实施例1制得的光动力TiO2复合纳米粒子对HN6细胞的RNA测序图；图中(a)为差异表达火山图；(b)为差异表达基因GO富集分析图。
图8为实施例1制得的光动力TiO2复合纳米粒子对HN6细胞的RT-qPCR测试结果。
图9为流式细胞术分析CD4+T细胞与CD8+T细胞IFN-γ表达量结果。
图10为流式细胞术分析TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后HMGB1表达量。
图11为Western blot检测细胞中HIF-1α、PD-L1、NF-κB的表达结果。
图12为TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后透射电镜下细胞形态图。
图13为TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后WB检测乏氧细胞中GSDMD的表达。
图14为PDX模型研究TiO2@Ru@siRNA介导的PDT作用对口腔癌的治疗效果，图中(a)为治疗结束后肿瘤组织图；(b)为治疗结束后肿瘤组织重量分析；(c)为肿瘤生长曲线；(d)为HE和IHC染色分析PDX模型研究TiO2@Ru@siRNA介导的PDT作用对口腔癌的治疗过程中的肿瘤组织；Scale bars:50μm。
图15小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)HE切片；Scale bars:100μm。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
此外，若有“第一”、“第二”等术语仅用于描述目的，主要是用于区分不同的装置、元件或组成部分(具体的种类和构造可能相同也可能不同)，并非用于表明或暗示所指示装置、元件或组成部分的相对重要性和数量，而不能理解为指示或者暗示相对重要性。
实施例中的原料均可通过市售得到；
dimbpc，采购自阿拉丁，D154591；
RuCl2(DMSO)4，采购自西格玛，733210-1G；
TTIP，采购自阿拉丁，T105736；
NH4PF6，采购自阿拉丁，A196203；
TiO2，采购自阿拉丁，T306008；
APTEs，采购自阿拉丁，A107147；
APTMs，采购自阿拉丁，A100943；
HATU，采购自阿拉丁，H109327；
DIPEA，采购自阿拉丁，B356476；
HIF-1αsiRNA，采购自锐博生物，产品编号siB160505051827-1-5；
PBS缓冲液，采购自索莱宝，P1010。
[Ru(dimbpc)2Cl2]通过如下方法制备得到
将dimbpc(1.36g，5.00mmol)与[RuCl2(DMSO)4](1.21g，2.50mmol)分散于DMF(20mL)，加热回流6h，然后蒸发DMF，加入50mL预冷丙酮；将溶液在0°静置2h，析出固体，将固体过滤后分别用用丙酮和水清洗，得到[Ru(dimbpc)2Cl2]。
核磁分析的设备为：Bruker Advance III 400MHz spectrometer(Germany)。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
本实施例提供一种光动力TiO2复合纳米粒子，制备方法如下：
S1.合成Ru配合物：
将[Ru(dimbpc)2Cl2](1.0mmol)与TTIP(1.0mmol)分散于甲醇中，经氩气鼓吹溶剂15min后，进行微波处理，微波处理条件为150℃、10min，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到粉末状固体产物[Ru(dimbpc)2(TTIP)](Cl)2(记作Rua)；
将所得粉末状固体(118.3mg，0.1mmol)分散于1N的NaOH溶液中，加热回流1小时；反应结束后冷却至0°，用1N HCl溶液调节pH至3左右，析出固体；将固体过滤后使用10mL甲醇清洗，再用1N NaOH溶解固体去除不可溶性杂质，抽滤后用甲醇清洗固体，避光干燥后得粉末状固体[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)(Ru)(bpc＝[2,2'-bipyridine]-4,4'-dicarboxylicacid)，即Ru配合物(记作Ru)。
对Rua和Ru配合物进行核磁共振分析，结果如下：
Rua：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)14.60(s,1H),9.41(d,J＝7.2Hz,4H),9.04(d,J＝6.1Hz,2H),8.13–8.06(m,4H),7.96(d,J＝3.6Hz,2H),7.90(dd,J＝5.6Hz and1.2Hz,2H),7.85(d,J＝6.0Hz,2H),7.75(d,J＝7.2Hz,1H),7.58(d,J＝12.0Hz,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.46(d,J＝2.8Hz,1H)7.40(dd,J＝3.8,0.7Hz,1H),7.35(d,J＝2.8Hz,1H),7.14(dd,J＝3.8and 2.8Hz,1H),4.01(s,6H),3.94(s,6H).13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)163.90,163.81,157.27,157.00,152.95,152.56,147.60,138.63,138.11,137.99,136.48,135.60,134.12,130.77,128.46,126.64,126.17,126.08,125.12,124.61,123.87,53.29,53.23.ESI-MS m/z(CH3OH)＝556.44([M-2(Cl)]2+,C53H38N8O8RuS3 2+,556.05),1111.46([M-2(Cl)-H]+,C53H37N8O8RuS3 2+，1111.09).
Ru：1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.13(dd,J＝8.3,1.0Hz,2H),9.11–9.03(m,4H),8.00(d,J＝5.8Hz,2H),7.91–7.85(m,4H),7.81(d,J＝3.8Hz,1H),7.74–7.63(m,6H),7.33(dd,J＝5.1,0.9Hz,1H),7.30–7.20(m,3H),7.16(d,J＝3.8Hz,1H),7.05(dd,J＝5.1,3.7Hz,1H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ170.19,159.01,158.82,158.72,152.87,152.49,148.71,148.59,148.41,145.56,140.07,139.79,138.23,137.78,137.60,137.35,131.75,129.07,127.91,127.74,127.43,126.66,126.07,125.73,125.54,125.28,124.83,124.66,124.61.ESI-MSm/z(CH3OH)＝528.35([M-2(Cl)]2+,C49H30N8O8RuS3 2+,528.02),1055.13([M-2(Cl)-H]+,C49H29N8O8RuS3 2+,1055.03).
S2.Ru配合物修饰TiO2：
将2.1mg TiO2纳米粒子分散于7mL甲醇中，超声分散15min，得到TiO2悬浮液；在14mL甲醇溶液中加入1mL APTEs，再加入0.7mL氨水溶液搅拌15min，得到反应液；然后将TiO2悬浮液滴入反应液中，大力搅拌，室温搅拌24h，形成偶联改性TiO2。
将67mg偶联改性TiO2分散于10mL DMF，超声分散30min；加入Ru配合物Ru(16.9mg，0.015mmol)、HATU(11.4mg，0.03mmol)DIPEA(11.4mg，0.03mmol)，25℃室温反应24h后，经离心、洗涤、干燥，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
S3.负载HIF-1αsiRNA：
将TiO2@Ru纳米颗粒和HIF-1αsiRNA分散在pH缓冲液(pH＝6.5)中，TiO2@Ru纳米颗粒浓度为0.2mg/mL，HIF-1αsiRNA浓度为2μM；经4℃静置反应0.5h，经10000g、4℃冷冻离心10min，pH＝6.5PBS缓冲液洗涤三次，得到TiO2@Ru@siRNA，即光动力TiO2复合纳米粒子。
TiO2@Ru@siRNA的TEM图像见图3；对实施例1的纳米颗粒TiO2@Ru@siRNA进行DLS检测，结果见图4；对实施例1的纳米颗粒TiO2@Ru@siRNA在不同pH下的Zeta电位进行检测，结果见图5。
TEM检测方法为：将含TiO2@Ru@siRNA的PBS缓冲液滴加在200mesh的铜网上，风干，上机TEM(T12，FEI Tecnai G2 Spirit，Holland)。
DLS检测方法为：采用动态光散射法测量TiO2@Ru@siRNA悬浮液(0.5mg/mL)的流体动力学直径；测量的散射光强度显示为光子计数率，单位为每秒千粒计数(kcps)；散射角设置为90°；对于每个样品悬浮液，在固定的运行时间(60秒)下进行三次DLS测量；使用Zetasizer Nano instrument DLS system。
根据图3的TEM图像可以观察到TiO2@Ru@siRNA呈立方体形状，大小基本一致，在水中分散性良好。
根据图4的DLS检测结果，TiO2@Ru纳米颗粒和TiO2@Ru@siRNA的水合粒径约为80nm和100nm。
根据图5，TiO2@Ru@siRNA在pH为7.4时，电位为1.14±0.37。
实施例2细胞毒性评价
利用MTT法探究药物在常氧及乏氧条件下联合光动力治疗对口腔鳞状细胞癌的细胞的毒性作用。将常氧细胞和乏氧细胞接种于96孔板，每孔接种3000个细胞，乏氧组放入低氧培养箱中(37℃，1％O2)，常氧组正常培养至细胞贴壁。随后吸走原培养液，在细胞中分别加入含有不同浓度药物，每孔100μL，设4个平行孔，同时设空白培养基及未加药细胞作为对照孔。加药培养24后，用525nm激光源(15mW cm-2)光照30min，继续孵育24h。每孔加入20ulMTT 37℃孵育4h，加入150ul DMSO溶解甲瓒后利用多功能酶标仪在595nm处测定每孔的吸光度值(OD)。细胞存活率计算公式为：细胞存活率％＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)
使用Ru、以及实施例1中制得的TiO2@Ru纳米颗粒和TiO2@Ru@siRNA在体外对人舌鳞状细胞癌(HN6、HSC-6)和人口腔黏膜癌前细胞(DOK)的光动力活性进行了评价。结果见表1(单位：μg/mL)。
表1细胞毒性评价结果
Figure BDA0003645917640000111
无论在常氧或缺氧条件下，其光毒性依次为:TiO2@Ru@siRNA＞TiO2@Ru纳米颗粒＞Ru，在三种细胞株中的光毒性HN6比其他细胞大。Ru、TiO2@Ru和TiO2@Ru@siRNA在没有PDT的情况下对所有细胞系都是无毒的，在常氧条件下，TiO2@Ru@siRNA介导的PDT在HN6细胞中的PI约比Ru高4倍。同样的，在乏氧条件下，TiO2@Ru@siRNA介导的PDT依旧保持良好的光毒性，且PI值(PI：纳米颗粒在黑暗条件下和光照条件下所得到的的IC50值的比值)超过2000。这些结果表明，TiO2@Ru@siRNA可以克服肿瘤的乏氧环境并且可以产生I型和II型光动力效果。
实施例3细胞ROS的产生
取生长状态良好的HN6细胞，常规漂洗、消化并计数，以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，37℃低氧培养箱培养过夜使细胞贴壁。加入含一定浓度的TiO2@Ru@siRNA(0.4,0.8μg/mL)，每组设3个复孔，放入37℃低氧培养箱避光培养24h。525nm激光照射30min，避光孵育半小时后加入10μM DCFH-DA染料，37℃避光孵育20min。PBS洗涤，用不含EDTA的胰酶消化细胞2min，加入培养基终止消化，收集细胞悬液，1000g，离心3min，弃上清，悬浮细胞，再次离心，弃上清后，每管加入500μL Binding buffer悬浮细胞后上流式细胞仪。
根据图6的ROS实验结果：TiO2@Ru@siRNA(0.4,0.8μg/mL)经PDT可诱导ROS生成，在0.8μg/mL的浓度下TiO2@Ru@siRNA使细胞DCF荧光提高到20倍左右。
实施例4 RNA测序
对HN6细胞加药(TiO2@Ru@siRNA，0.4μg/mL)后24h给予光照30min，放入低氧培养箱4h后trizol法提取RNA，然后进行RNA测序。
RNA测序的具体方法为：
通过高通量测序技术完成6个样品的转录组分析，共获得34.90Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到5.41Gb，Q30碱基百分比在92.33％及以上。分别将各样品的CleanReads与指定的参考基因组进行序列比对，比对效率从92.97％到94.53％不等，筛选差异性表达RNA。基于比对结果，进行可变剪接预测分析、基因结构优化分析以及新基因的发掘，发掘新基因4813个，其中1705个得到功能注释。根据基因在不同样品中的表达量识别差异表达基因，并对其进行功能注释和富集分析。实验流程包括样品检测、文库构建及其质量控制和上机测序。
结果显示如图7所示。RNA-seq表明IL-24、HSPA1A和HSPA1B基因的表达量显著增加并影响多种肿瘤免疫通路。IL-24是一种多功能的抗癌细胞因子，属于白细胞介素IL-10细胞因子家族，被认为是一个肿瘤抑制相关基因，它可以选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡并发挥免疫调节和抗血管新生的作用。热休克蛋白70(HSPA1A/HSPA1B)具有诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞反应的佐剂能力。
RT-qPCR实验的方法具体为：
1)RNA提取：对HN6细胞加药(TiO2@Ru@siRNA，0.4μg/mL)后24h给予光照半小时，放入低氧培养箱4h后trizol法提取RNA；
2)cDNA合成:使用PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa，China)试剂盒.逆转录反应是每10μl体积可逆转RNA 500ng；具体反应体系如下：样本RNA 500ng，5X PrimeScriptRT Master Mix 2μl，最后加ddH2O至总体10μl；PCR仪按以下程序设置逆转录反应的条件：37℃5分钟，85℃15秒；
3)由SYBR Green Master Mix(11201ES08，Yeasen，China)和LightCycler96System(Roche，Germany)机器进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析；PCR反应程序如下：95℃预变性5min；第二阶段：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环；72℃延伸10min，间隔30s绘制溶解曲线。
4)反应结束后根据各目的基因的Ct值变化，确定每个目的基因的相对表达量。
根据图8的PCR实验结果，同样的，IL-24、HSPA1A和HSPA1B基因的表达显著增加。
实施例4抗肿瘤效果
(一)收集PDT下TiO2@Ru@siRNA(0.4μg/mL)处理的HN6细胞上清液作为条件培养基，与PBMC共培养，采用流式细胞计数法检测IFN-γ的表达，以探究TiO2@Ru@siRNA在肿瘤免疫微环境中的作用。为了探讨IL-24是否能影响抗肿瘤免疫应答，同时还检测了外源性IL-24对OSCC PBMC中IFN-γ表达的影响。
结果见图9。可以看出，与对照组相比，细胞上清液中含有生物活性分子混合物，增强了CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ的表达。同时外源性IL-24显著提高了CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ的表达。因此结果表明，TiO2@Ru@siRNA诱导IL-24上调，促进IFN-γ分泌，IFN-γ具有多种不同的抗肿瘤活性机制，其表达增加刺激肿瘤微环境从而导致抗肿瘤能力增强。
(二)为了验证TiO2@Ru@siRNA-PDT降低HMGB1表达，取生长状态良好的HN6细胞，以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，37℃低氧培养箱培养过夜使细胞贴壁。PBS洗涤后加入0.2μg/mL,0.4μg/mL,0.8μg/mL三个浓度的TiO2@Ru@siRNA，每组设3个复孔，放入37℃培养箱避光培养24h。525nm激光照射30min，孵育4h后，收集细胞，PBS洗涤3次，4％PFA室温固定15min。随后，0.1％Triton X-100在室温下渗透细胞15min，然后与Alexa
Figure BDA0003645917640000141
Rabbit单克隆抗体HMGB1在4℃下孵育12h。流式细胞仪上机分析，条件为：λex＝488nm，λem＝525±30nm。
结果如图10。流式细胞术显示TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后HMGB1表达下降，并随药物浓度的下降表达下降。
(三)为验证TiO2@Ru@siRNA-PDT降低HIF-1α、PD-L1、NF-κB表达，将HN6细胞分别与TiO2@Ru@siRNA(0.1,0.2,0.4,0.8μg/mL)在37℃低氧培养箱中培养24h后，525nm激光照射30min，4h后收集细胞。收集的细胞用含有100μg/mL PMSF的RIPA缓冲液加冰溶解30min。用BCA定量蛋白浓度，上样电泳转膜后封闭，然后与一抗4℃孵育过夜。洗涤后二抗孵育。上机曝光采集图像，并使用ImageJ软件分析。
结果如图11所示。TiO2@Ru@siRNA-PDT可以在缺氧条件下抑制HIF-1α浓度依赖性，降低HIF-1α的表达，同时也下调PD-L1和NF-κB的表达。
(四)使用透射电镜观察TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后细胞形态的变化。结果如图12所示。与对照组相比(未加药，光照)，经TiO2@Ru@siRNA-PDT处理的细胞表现出明显典型的细胞焦亡超微结构特征，包括细胞肿胀，细胞膜破裂，形成大量的小泡，释放细胞内的内容物，诱导炎症反应。WB结果(图13所示)进一步证实TiO2@Ru@siRNA-PDT处理后，随着药物浓度的增加(0.1,0.2,0.4,0.8μg/mL)，焦亡的关键蛋白GSDMD表达上调。
(五)以PDX模型，评价TiO2@Ru@siRNA-PDT抗肿瘤作用
BALB/c-nu雌性裸鼠、4-6周龄，饲养于中山大学SPF级屏障系统中，饲料和饮水由动物房经灭菌处理后供动物自由饮食。
在BALB/c小鼠中建立PDX模型，联合光动力治疗。当肿瘤体积约200mm3时将其随机分成生理盐水(50μL)、生理盐水(50μL)+光照、TiO2@Ru组(50μL)、TiO2@Ru(50μL)+光照组、TiO2@Ru@siRNA(50μL)、TiO2@Ru@siRNA(50μL)+光照共6组。每组5只，在第0天与第7天给药，剂量为20mg/kg，每只小鼠瘤内注射50μL。对于PDT组，在给药半小时后对小鼠肿瘤区域使用525nm激光发射器(15mW/cm2，1h)进行光照。实验中每隔一天记录小鼠肿瘤体积和体重，23天后处死。
实验结果见图14。根据肿瘤曲线可见生理盐水对照组、生理盐水+光照和TiO2@Ru组之间，肿瘤大小没有显著差异。而TiO2@Ru+光照组和TiO2@Ru@siRNA+光照组肿瘤生长较其他组有明显的抑制作用。在监测的23天内没有观察到肿瘤有复发的迹象。HE结果显示TiO2@Ru@siRNA+PDT组坏死灶较多，IHC结果显示TiO2@Ru+PDT显著降低了肿瘤ki67和HIF-1α的阳性率且TiO2@Ru@siRNA +PDT处理的肿瘤细胞增殖显著降低。此外，从小鼠的体重曲线可以看出，在治疗过程中所有组别的小鼠体重均无明显变化，未出现短期内体重的急剧减少或增加。
根据图15小鼠主要脏器HE切片并没有发现明显的毒性副作用，这说明本研究中采用的药物剂量及光照强度合理，各种治疗方法生物安全性较高。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，由如下方法制备得到：
S1.合成Ru配合物：
将[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP分散于甲醇中，经氩气鼓吹溶剂后，进行微波处理，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到固体产物，经脱去甲醇，得到[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)，即Ru配合物；
S2.Ru配合物修饰TiO2：
将TiO2纳米粒子分散于有机溶剂中，得到悬浮液；将烷基偶联剂和氨水加至有机溶剂中，得到反应液；将悬浮液滴加至反应液中，经搅拌、过滤得到偶联改性TiO2；
将偶联改性TiO2分散于有机溶剂中，超声处理后加入Ru配合物、HATU与DIPEA，室温反应后，经后处理，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
S3.负载HIF-1αsiRNA：
将TiO2@Ru纳米颗粒和HIF-1αsiRNA分散在pH缓冲液中，经0～4℃静置反应0.5～1h，经离心、洗涤，得到TiO2@Ru@siRNA，即所述光动力TiO2复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，所述[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP的摩尔比为1:(0.8～1.2)。
3.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，所述微波处理的条件为：温度120～150℃，时间10～60min。
4.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，步骤S1.中，所述纯化是指柱层析纯化，柱层析纯化的条件为：以200～300目硅胶色谱柱，经乙腈水流动相洗脱纯化。
5.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，步骤S2.中，所述烷基偶联剂为APTEs和/或APTMs。
6.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，步骤S2.中，所述TiO2纳米粒子、Ru配合物的质量比为(3～4):1。
7.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，步骤S3.中，所述TiO2@Ru纳米颗粒与HIF-1αsiRNA的质量浓度比为1mg/mL:10～30μmol/L。
8.根据权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子，其特征在于，步骤S3.中，所述离心为在0～5℃条件下进行离心处理。
9.权利要求1所述光动力TiO2复合纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.合成Ru配合物：
将[Ru(dimbpc)2Cl2]与TTIP分散于甲醇中，经氩气鼓吹溶剂后，进行微波处理，过滤后向滤液中加入饱和NH4PF6溶液，过滤、纯化后得到固体产物，经脱去甲醇，得到[Ru(bpc)2(TTIP)](Cl2)，即Ru配合物；
S2.Ru配合物修饰TiO2：
将TiO2纳米粒子分散于有机溶剂中，得到悬浮液；将烷基偶联剂和氨水加至有机溶剂中，得到反应液；将悬浮液滴加至反应液中，经搅拌、过滤得到偶联改性TiO2；
将偶联改性TiO2分散于有机溶剂中，超声处理后加入Ru配合物、HATU与DIPEA，室温反应后，经后处理，得到TiO2@Ru纳米颗粒；
S3.负载HIF-1αsiRNA：
将TiO2@Ru纳米颗粒和HIF-1αsiRNA分散在pH缓冲液中，经0～4℃静置反应0.5～1h，经离心、洗涤，得到TiO2@Ru@siRNA，即所述光动力TiO2复合纳米粒子。
10.权利要求1～8任一项所述光动力TiO2复合纳米粒子在制备抗肿瘤的材料和/或药物中的应用。
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