CN108693224A - 基于氧化物纳米阵列的光电生物传感器及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及材料与分析化学领域，具体涉及一种基于氧化物纳米阵列材料的光电生物传感器及其制备方法和应用。本发明提供了一种基于半导体氧化物纳米阵列的光电生物传感器，其包含基底，所述基底上设置有氧化物纳米阵列电极、设置在所述电极上的多肽层、以及与多肽层连接的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针，其中，所述探针通过锆离子与多肽配位连接。本发明利用一维半导体氧化物纳米阵列材料作为基底电极构建光电生物传感器，并利用此光电生物传感器检测蛋白激酶活性，所述的半导体氧化物纳米阵列具有合成简单安全、比表面积高、电子迁移速率快等特点，在此基础上构建的光电生物传感器具有构建简单，经济易得，安全且易于推广的优点。

Description

基于氧化物纳米阵列的光电生物传感器及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及材料与分析化学领域，具体涉及一种基于氧化物纳米阵列材料的光电生物传感器及制备方法和应用。
背景技术
一维半导体氧化物纳米阵列，具有较大的长径比、大比表面积、优异的机械长度，优异的光电性质以及热点性质等，在染料敏化太阳能电池、光催化、纳米发电机等领域有广泛的应用。由于半导体氧化物纳米阵列材料还能够有效传输载流子，以及具有良好的生物相容性和优异的稳定性等优点，因此在生物传感领域也具有较大的发展潜力。但氧化钛、氧化锌、氧化锡等是宽禁带的半导体材料，需要高能量紫外光才能激发。紫外线会影响对生物分子的活性，进而影响实验结果的准确性，因此需要将其受激发的光范围拓展到可见光区域才可应用于生物分子的检测。
目前染料敏化、量子点嵌入或者贵金属掺杂是主要的提高半导体氧化物可见光利用率的方法。但是，染料敏化的效率不高，量子点存在一定的毒性以及稳定性较差等缺点。贵金属纳米粒子(纳米金、纳米铂、纳米银等)具有优良的电化学特性、荧光特性、生物相容性以及稳定性等。尤其在可见光的激发下，贵金属纳米粒子可发生局域表面等离子体效应产生自由电子，可以传导至半导体氧化物形成光电流。因此，通过贵金属纳米粒子掺杂从而提高半导体氧化物可见光吸收率是一种重要的参考。
受蛋白激酶调控的蛋白磷酸化过程是细胞信号传导中重要的组成环节，细胞内的大部分重要的生命过程比如新陈代谢、基因转录与翻译、细胞衰亡等均涉及到了蛋白的磷酸化。因此，当蛋白激酶的活性发生异常时(通常为表达过度)，会使得蛋白磷酸化过程发生错误，进一步导致多种疾病的发生。目前在疾病诊断中，蛋白激酶的活性已经成为了重要的生物标志物之一。因此，发明一种准确且快速的对蛋白激酶的活性进行检测的方法至关重要。
中国专利(CN105021575A)公开了一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电生物传感器。虽然具有比较好的检测效果，但其操作过程比较复杂，需要高温煅烧、染料嵌入等环节。存在耗时较长且染料修饰效率不高，非特异性吸附较多等缺点，因此不仅影响检测效果的准确性，而且具有一定的危险性。
发明内容
为此，本发明针对上述问题提供了一种基于氧化物纳米阵列的光电生物传感器及其制备方法和应用。
本发明提供了一种基于半导体氧化物纳米阵列的光电生物传感器，所述光电生物传感器包含基底，所述基底上设置有氧化物纳米阵列电极、设置在所述电极上的多肽层、以及与多肽层连接的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针，其中，所述探针通过锆离子与多肽层配位连接。
本发明还提供了一种上述光电生物传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)在氧化物纳米阵列电极上加入多肽得到多肽修饰的电极；
(2)将锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针添加到步骤(1)修饰的电极上得到光电生物传感器。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种基于半导体氧化物纳米阵列的光电生物传感器，其包含基底，所述基底上设置有氧化物纳米阵列电极、设置在所述电极上的多肽层、以及与多肽层连接的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针，其中，所述探针通过锆离子与多肽层配位连接。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，所述贵金属纳米粒子选自于纳米金、纳米银或纳米铂中的一种或一种以上。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，所述DNA的序列为：
DNA1：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′；
DNA2：3′-GCAAATCCTAAAC。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，所述氧化物纳米阵列电极选自于氧化钛、氧化锌或氧化锡纳米阵列电极中的一种。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，所述多肽层为肯普肽。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，还包含参比电极和对电极。
优选的，对于所述的光电生物传感器，其中，所述多肽层为磷酸化的多肽层。
本发明提供了一种所述光电生物传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)在氧化物纳米阵列电极上加入多肽得到多肽修饰的电极；
(2)将锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针添加到步骤(1)修饰的电极上得到光电生物传感器。
优选的，对于所述的制备方法，在步骤(1)中，在加入多肽之前，包含将所述氧化物纳米阵列电极进行硅烷化的步骤。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述硅烷化为使用有机硅烷化试剂对氧化物纳米阵列电极进行硅烷化处理，所述有机硅烷化试剂优选为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在将氧化物纳米阵列电极硅烷化后，在加入多肽之前，还包含加入交联剂的步骤。
优选的，对于所述的制备方法，其中，所述交联剂选自于戊二醛，乙二醛，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯或者乙二醇二缩水甘油醚中的一种，优选为戊二醛。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，在锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针添加到步骤(1)修饰的电极之前，还包含将蛋白激酶及ATP加入到步骤(1)所述多肽修饰的电极中以使多肽磷酸化的步骤。
本发明所述的光电生物传感器或上述方法所制备得到的光电生物传感器在检测蛋白激酶活性中的应用。
优选的，对于所述的应用，其中，使用光电生物传感器进行检测时，使所述光电生物传感器与包含蛋白激酶及ATP的样品接触，从而使多肽磷酸化并通过锆离子将探针与多肽层配位连接，以便进行检测蛋白激酶的活性。
本发明所述的光电生物传感器或上述方法所制备得到的光电生物传感器在筛选蛋白激酶抑制剂中的应用。
本发明所取得的有益效果是：
本发明利用一维半导体氧化物易合成、比表面积大且能够有效传输载流子的特点，构建了基于一维半导体氧化物的基底电极，并在此基础上设计了光电化学生物传感器。所述的光电化学生物传感器用于检测蛋白激酶的活性，本发明提供的光电生物传感器具有构建简单，经济易得，安全且易于推广的优点。
附图说明
图1是光电生物传感器的组装及实验原理图；
图2-1是实施例一制备得到的氧化锌纳米阵列的扫描电子显微镜俯视图；
图2-2是实施例一制备得到的氧化锌纳米阵列的扫描电子显微镜横截面图；
图3为实施例一制备得到的光电生物传感器与ZnO纳米阵列/ITO电极的紫外吸收表征对比图；其中，a为实施例一所制备得到的光电生物传感器，b为ZnO纳米阵列/ITO电极；
图4为是实施例一所制备得到的光电生物传感器与DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极的光电流对比图，其中，a为实施例一所制备的光电生物传感器，即DNA@AuNPs/磷酸化肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极，b为DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极；
图5是不同酶活度的PKA激酶所对应的光电流的示意图。
具体实施方式
图1是光电生物传感器的组装及实验原理图。氧化锌纳米阵列电极硅烷化后，浸入戊二醛溶液进行反应，之后将肯普肽溶液滴加到电极表面，使得肯普肽中的氨基与戊二醛中的醛基相连接，从而得到肯普肽修饰的电极，然后在肯普肽修饰的电极上滴加PKA和ATP的缓冲溶液，在ATP与金属镁离子的存在下，由于蛋白激酶的催化，肯普肽上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生磷酸化。金属锆离子对磷酸基团有配位作用，因此锆离子会将含有磷酸基团的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针与磷酸化的肯普肽连接到一起，得到本发明所述的光电生物传感器。在可见光的激发下，贵金属纳米粒子会发生局域表面等离子体共振效应，使得其表面的自由电子跃迁到半导体氧化物纳米阵列上从而产生光电流。当蛋白激酶的活性高时，肯普肽被磷酸化的程度高，从而使得DNA修饰的贵金属纳米粒子探针数量也会随之增加，继而光电流增大，反之当蛋白激酶活性小时，探针的链接数量则减小，从而使得可见光下产生的光电流减小。因此通过光电流的变化可以判断蛋白激酶活性的大小。
图2-1是实施例一所制备得到的氧化锌纳米阵列的扫描电镜俯视图，由图可见，氧化锌纳米柱垂直生长在ITO玻璃电极上且排列有序，长度约为15μm；图2-2是实施例一所制备得到的氧化锌纳米阵列的扫描电子显微镜横截面图，由图可见，氧化锌纳米柱表面光滑，顶端为六边形对称；可见，在ITO玻璃上成功地生长了长度均匀、排列整齐的氧化锌纳米阵列。
图3为实施例一制备得到的光电生物传感器与ZnO纳米阵列/ITO电极的紫外吸收表征对比图；其中，a为实施例一所制备得到的光电生物传感器，b为ZnO纳米阵列/ITO电极；由图3可以看出，与ZnO纳米阵列/ITO电极相比，实施例一所制备得到的光电生物传感器在520nm-560nm左右出现了新的吸收锋，这是由AuNPs的等离子共振效应引起的。不仅表明AuNPs以及DNA@AuNPs的成功合成，而且证明DNA@AuNPs已经被成功的修饰到了电极上。
图4是实施例一所制备得到的光电生物传感器与DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极的光电流对比图，从图中可以看出，当经过蛋白激酶PKA的催化后，磷酸化的肯普肽能够有效的将探针DNA@AuNPs修饰到电极上，从而产生了较大的光电流，而没有PKA催化时，探针并没有连接到电极上，因此产生的光电流可以忽略。
图5是不同酶活度的PKA激酶所对应的光电流的示意图，从图中可以看出，随着PKA酶活度的增加，光电流逐渐增大，在PKA的酶活度为0.05～2U/mL的范围内，光电流的大小与PKA的酶活度呈线性关系，线性方程为I＝18.1×C+4.01，相关系数R＝0.9931，其中I为光电流强度，C为蛋白激酶PKA的酶活度，检测限为0.027UmL-1。
如上所述，本发明提供了一种基于氧化物纳米阵列的光电生物传感器，其包含基底，所述基底上设置有氧化物纳米阵列电极、设置在所述电极上的多肽层、以及与多肽层连接的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针，其中，所述探针通过锆离子与多肽层配位连接。
在本发明优选的一种实施方式中，所述贵金属纳米粒子选自于纳米金、纳米银或纳米铂中的一种或一种以上。
所述氧化物纳米阵列电极选自于氧化钛、氧化锌或氧化锡纳米阵列电极中的一种。
所述DNA的序列为：
DNA1：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′；
DNA2：3′-GCAAATCCTAAAC。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述氧化物纳米阵列电极上修饰的肯普肽与锆离子的摩尔比为0.1-1:1-10。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述氧化物纳米阵列电极为硅烷化的氧化物纳米阵列电极。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述硅烷化的氧化物纳米阵列电极与多肽之间通过交联剂连接，所述交联剂选自于戊二醛，乙二醛，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯或者乙二醇二缩水甘油醚中的一种，优选为戊二醛。
本发明提供了一种基于氧化物纳米阵列的光电生物传感器，其包含下述步骤：
(1)在氧化物纳米阵列电极上加入多肽得到多肽修饰的电极；
(2)将锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针加到步骤(1)修饰的电极上得到光电生物传感器。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(1)中，在加入多肽之前，包含将所述氧化物纳米阵列电极进行硅烷化的步骤。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(1)中，所述硅烷化为使用有机硅烷化剂将氧化物纳米阵列电极进行硅烷化处理，优选的，所述有机硅烷化试剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(1)中，在将氧化物纳米阵列电极硅烷化后，在加入多肽之前，还包含加入交联剂的步骤，使所述硅烷化的氧化物纳米阵列电极与多肽通过交联剂进行连接。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，所述交联剂选自于戊二醛，乙二醛，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯或者乙二醇二缩水甘油醚中的一种，优选为戊二醛。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(1)中，所述多肽为肯普肽，在得到肯普肽修饰的电极后，加入6-氨基己酸封闭空白位点以减轻非特异性吸附。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(2)中，在多肽修饰的电极上滴加Zr4+之前，滴加PKA和ATP的溶液，以使多肽磷酸化。
在本发明优选的一种具体实施方式中，本发明提供了氧化物纳米阵列的制备方法，其包含下述步骤：将ITO或FTO玻璃预处理，然后将种子溶液种植在ITO或FTO玻璃上，接着将含有种子的ITO或FTO玻璃置于氧化物对应的生长液中继续生长，从而得到氧化物纳米阵列电极。
在本发明优选的一种具体实施方式中，本发明提供了一种DNA修饰的贵金属纳米粒子探针的制备方法，其包含下述步骤：将DNA1与DNA2进行杂交，然后将杂交后的DNA双链加入到贵金属纳米粒子溶液中，离心分离得到DNA修饰的贵金属纳米粒子探针。
在采用本发明所制备得到的光电生物传感器进行试验时，光电系统用到的光源为氙灯，采用460nm以上波长的可见光滤光片，辐照强度为190m W/cm2；光电试验在CHI802B电化学工作站上进行，使用三电极体系(参比电极：Ag/AgCl，对电极：铂丝电极，工作电极：ITO或FTO电极)，以含有0.1M抗坏血酸为电子供体的PBS磷酸盐溶液为反应溶液进行试验。
下面通过实施例对本发明所述的光电生物传感器及其制备方法和应用作进一步说明。实施例所用的试剂，未特殊说明的，均为常规的试剂，其中，实施例所用到的原料信息及实验设备的信息分别如表1和表2所示：
表1本发明所用到的原料信息
原料 纯度 生产厂家
蛋白激酶PKA - Sigma公司
肯普肽 - 吉尔生化公司
DNA1 - 上海生工
DNA2 - 上海生工
ATP 鼎国生物试剂公司
HAuCl4·3H2O 上海化学试剂公司
其他试剂由北京化学品公司提供。
表2本发明所用的实验设备的信息
设备 型号 生产厂家
扫描电子显微镜 SU8010 日本Hitachi公司
电化学工作站 CHI802B 上海辰华
紫外吸收分析仪 UV-3900 日本Hitachi公司
实施例一 光电生物传感器的制备
(1)DNA修饰的纳米金探针(DNA@AuNPs)的合成：
a.100ml 0.01％(w/v)的氯金酸溶液搅拌加热至沸腾，然后将1％(w/v)柠檬酸钠溶液迅速加入氯金酸溶液中，当溶液变为酒红色时，停止加热，冷却后得到纳米金(AuNPs)；
b.DNA1：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′和DNA2：3′-GCAAATCCTAAAC分别配置成10-6M的溶液，在37℃下杂交孵育，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米金溶液中，室温搅拌24h之后，缓慢加入150μL 1M的氯化钠溶液，放置24h后，混合溶液在10000rpm每分钟的转速下进行离心15min，撇去上清液，得到DNA@AuNPs。
(2)氧化锌纳米阵列的制备
ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min，然后将其放在90℃的烘箱中12h，烘干备用；
Zn(CH3COO)2·2H2O溶于乙醇中配制成浓度为0.005M的种子溶液，随后将10μL的种子溶液均匀滴加到预处理干净的ITO玻璃之上，烘干，重复滴加3-8次，然后，将滴加有种子液的ITO玻璃竖直贴壁放置于反应釜中，反应釜中溶剂为Zn(NO3)2·6H2O与六亚甲基四胺的混合水溶液(混合溶液总体积30mL，二者的最终浓度分别为0.05M，0.05M)。然后将反应釜放入95℃烘箱中反应4H，反应之后将电极取出，用水洗涤，得到氧化锌纳米阵列电极。将制备得到的氧化锌纳米阵列电极使用扫描电子显微镜进行扫描分析，如图2-1及图2-2所示，其中，图2-1是氧化锌纳米阵列的扫描电镜俯视图，从图2-1可以看出，氧化锌纳米柱垂直生长在ITO玻璃电极上且排列有序，长度约为15μm；图2-2是氧化锌纳米阵列的扫描电子显微镜横截面图，从图2-2可以看出，氧化锌纳米柱表面光滑，顶端为六边形对称；可见，在ITO玻璃上成功地生长了长度均匀、排列整齐的氧化锌纳米阵列。
(3)电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应
氧化锌纳米阵列电极的硅烷化：将氧化锌纳米阵列电极放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到氧化锌纳米阵列的表面，之后将硅烷化的氧化锌纳米阵列电极放入110℃的真空烘箱中，1h之后浸入5％的戊二醛中，于37℃下反应1h；
将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到上述电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极，然后用1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，清洗之后，将含有PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl和20mM MgCl2，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应约80min后继续滴加50uL0.5mmol的Zr4+溶液，然后将探针DNA@AuNPs滴加到电极上反应，约60min后用缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到光电生物传感器。
效果验证
(1)将实施例一所制备得到的光电生物传感器和ZnO纳米阵列/ITO电极进行紫外吸收分析，其中，a为实施例一所制备得到的光电生物传感器，b为ZnO纳米阵列/ITO电极的紫外吸收图，如图3所示。由图3可以看出，与ZnO纳米阵列/ITO电极相比，实施例一所制备得到的光电生物传感器在520nm-560nm左右出出现了新的吸收锋，这是由AuNPs的等离子共振效应引起的。不仅表明AuNPs以及DNA@AuNPs的成功合成，而且证明DNA@AuNPs已经被成功的修饰到了电极上。
(2)将实施例一制备的光电生物传感器与DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极进行光电化学实验
将实施例一制备的光电生物传感器与DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极进行光电化学实验，如图4所示，其中，a为实施例一所制备的光电生物传感器，即DNA@AuNPs/磷酸化肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极，b为DNA@AuNPs/肯普肽/ZnO纳米阵列/ITO电极；从图中可以看出，当经过蛋白激酶PKA的催化后，磷酸化的肯普肽能够有效的将探针DNA@AuNPs修饰到电极上，从而产生了较大的光电流，而没有PKA催化时，探针并没有连接到电极上，因此产生的光电流可以忽略，说明此光电生物传感器对蛋白激酶有比较好的检测效果。
(3)不同酶活度的蛋白激酶所对应的光电流
采用实施例一制备得到的光电生物传感器对蛋白激酶PKA活性进行分析，即采用不同酶活度的PKA激酶进行分析，结果如图5所示。
从图5中可以看出，随着PKA酶活度的增加，光电流逐渐增大，在PKA的酶活度为0.05～2U/mL的范围内，光电流的大小与PKA的酶活度呈线性关系，线性方程为I＝18.1×C+4.01，相关系数R＝0.9931，其中I为光电流强度，C为蛋白激酶PKA的酶活度，检测限为0.027UmL-1。
实施例二 光电生物传感器的制备
(1)DNA修饰的纳米金探针(DNA@AuNPs)的合成操作与实施例一相同；
(2)二氧化钛纳米阵列的制备
将FTO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min，然后将其放在90℃的烘箱中12h，烘干备用；
以35mL稀释后的浓盐酸(浓盐酸：水＝1:1)为溶剂，在磁力搅拌的情况下逐滴加入1mL钛酸四丁酯，搅拌20min后加入聚四氟乙烯反应釜中，将FTO玻璃竖直贴壁放置于聚四氟乙烯反应釜中，然后将反应釜放入150℃真空箱中4h，之后将电极取出，用水洗涤后置于60℃下干燥得到氧化钛纳米阵列电极。
(3)电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应
氧化钛纳米阵列电极的硅烷化：将氧化钛纳米阵列电极放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到氧化钛纳米阵列的表面，之后将硅烷化的氧化钛纳米阵列电极放入110℃的真空烘箱中，1h之后浸入5％的戊二醛中，于37℃下反应1h；
将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到上述电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极，然后浸入1mM的6-氨基己酸中30min以减轻非特异性吸附，清洗之后，将含有PKA和ATP的缓冲溶液(50mMTris-HCl和20mM MgCl2，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应约80min继续滴加50uL0.5mmol的Zr4+溶液，然后将探针DNA@AuNPs滴加到氧化钛纳米陈列修饰电极上反应，约60min后用缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到光电生物传感器。
实施例三 光电生物传感器的制备
(1)DNA修饰的纳米银探针(DNA@Ag NPs)的合成
a.取1.7g硝酸银溶解配置成浓度为0.2M的硝酸银溶液，加入表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，使得硝酸银与PVP的物质的量比为1:1.5，并搅拌均匀，将配置好的上述溶液与2ml的氨水、100ml的乙二醇同时加入反应釜中，在120℃下反应4h，自然冷却到室温之后将混合溶液在10000rpm/min的转速下进行离心，离心15min，撇去上清液，得到纳米银(AgNPs)；
b.DNA1：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′和DNA2：3′-GCAAATCCTAAAC分别配置成10-6M的溶液，在37℃下杂交孵育一个小时后加入1mL的Ag NPs溶液室温搅拌36h，继续缓慢加入150μL 1M的氯化钠溶液，放置24h后，将混合溶液在10000rpm每分钟的转速下进行离心15min，撇去上清液，将DNA修饰的纳米银重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCl溶液中备用。
(2)氧化锌纳米阵列的制备，其制备操作与实施例一相同。
(3)电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应
氧化锌纳米阵列电极的硅烷化：将氧化锌纳米阵列电极放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到氧化锌纳米阵列的表面，之后将硅烷化的氧化锌纳米阵列电极放入110℃的真空烘箱中，1h之后浸入5％的戊二醛中，于37℃下反应1h；
将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到上述电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极，然后用1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，清洗之后，将含有PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl和20mM MgCl2，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应后约80min继续滴加50uL0.5mmol的Zr4+溶液，然后将探针DNA修饰的纳米银滴加到电极上反应，约60min后用缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到光电生物传感器。
实施例四 光电生物传感器的制备
(1)DNA修饰的纳米铂探针(DNA@PtNPs)的合成
a.配置30mL CTAB与K2PtCl6混合溶液，使其最终浓度分别为150mM CTAB与1.5mM的K2PtCl6。在H2氛围下加入NaBH4溶液(7.5mM)还原，反应温度在50℃，反应时间为5h。还原之后混合溶液在10000rpm/min的情况下离心10min，撇去上清液并重新超声分散在去离子水中得到纳米铂溶液，将其于4℃保存备用。
b.DNA1(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA2(3′-GCAAATCCTAAAC)分别配置成10-6M的溶液，之后在37℃杂交孵育一个小时。将杂交后的DNA双链加入1mL的纳米铂溶液中，室温搅拌24h之后，缓慢加入150μL 1M的氯化钠溶液，放置24h后，混合溶液在10000rpm每分钟的转速下进行离心15min，撇去上清液，最终得到DNA修饰的纳米铂探针。
(2)氧化锡纳米阵列的制备
ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min，然后将其放在90℃的烘箱中12h，烘干备用；
0.4g SnCl2·2H2O溶解于30mL纯净水中，搅拌均匀之后逐滴加入3mL草酸与CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，CTAB最终浓度10mM，得到的混合溶液加入10mL 4M NaOH溶液。将所得溶液移至反应釜内，将预处理干净的ITO玻璃放置于反应釜中，之后在烘箱内120℃反应12小时，冷却至室温，洗净得到氧化锡纳米阵列电极。
(3)电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应
氧化锡纳米阵列电极的硅烷化：将氧化锡纳米阵列电极放入5wt％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min，使得氨基连接到氧化锡纳米阵列的表面，之后将硅烷化的氧化锡纳米阵列电极放入110℃的真空烘箱中，1h之后浸入5％的戊二醛中，于37℃下反应1h；
将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到上述电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极，然后用1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，清洗之后，将含有PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl和20mM MgCl2，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应约80min后继续滴加50uL0.5mmol的Zr4+溶液，然后将探针DNA@PtNPs滴加到电极上反应60min，用缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到光电生物传感器。
实施例二至四所制备得到的光电生物传感器的光电性能与实施例一所制备得到的光电生物传感器基本相同。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种基于半导体氧化物纳米阵列的光电生物传感器，其包含基底，所述基底上设置有氧化物纳米阵列电极、设置在所述电极上的多肽层、以及与多肽层连接的DNA修饰的贵金属纳米粒子探针，其中，所述探针通过锆离子与多肽层配位连接。
2.根据权利要求1所述的光电生物传感器，其中，所述贵金属纳米粒子选自于纳米金、纳米银或纳米铂中的一种或一种以上。
3.根据权利要求1或2所述的光电生物传感器，其中，所述DNA的序列为：
DNA1：5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′；
DNA2：3′-GCAAATCCTAAAC。
4.根据权利要求1-3任一项所述的光电生物传感器，其中，所述氧化物纳米阵列电极选自于氧化钛、氧化锌或氧化锡纳米阵列电极中的一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的光电生物传感器，其中，所述多肽层为肯普肽。
6.根据权利要求1-5任一项所述的光电生物传感器，其中，所述多肽层为磷酸化的多肽层。
7.一种权利要求1-6任一项所述的光电生物传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)在氧化物纳米阵列电极上加入多肽得到多肽修饰的电极；
(2)将锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针添加到步骤(1)修饰的电极上得到光电生物传感器。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在加入多肽之前，包含将所述氧化物纳米阵列电极进行硅烷化的步骤。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述硅烷化为使用有机硅烷化试剂对氧化物纳米阵列电极进行硅烷化处理，所述有机硅烷化试剂优选为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在将氧化物纳米阵列电极硅烷化后，在加入多肽之前，还包含加入交联剂的步骤。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述交联剂选自于戊二醛，乙二醛，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯或者乙二醇二缩水甘油醚中的一种，优选为戊二醛。
12.根据权利要求7-11任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，在锆离子及DNA修饰的贵金属纳米粒子探针添加到步骤(1)修饰的电极之前，还包含将蛋白激酶及ATP加入到步骤(1)所述多肽修饰的电极中以使多肽磷酸化的步骤。
13.权利要求1-6任一项所述的光电生物传感器或权利要求7-12任一项所述的方法制备得到的光电生物传感器在检测蛋白激酶活性中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，使用光电生物传感器进行检测时，使所述光电生物传感器与包含蛋白激酶及ATP的样品接触，从而使多肽层磷酸化并通过锆离子将探针与多肽层配位连接，以便进行检测蛋白激酶的活性。
15.权利要求1-6任一项所述的光电生物传感器或权利要求7-12任一项所述的方法制备得到的光电生物传感器在筛选蛋白激酶抑制剂中的应用。
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