CN114235922A - 一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法。首先合成具备识别磷酸根功能的聚合物，然后利用偶联反应将功能聚合物接枝到人工纳米通道内表面。通道内聚合物与磷酸化产物磷酸化肽具有特异性相互作用，并会造成聚合物层发生不同程度的收缩，导致在施加电压下流经通道的离子电流发生相应的变化，进而实现对磷酸化的检测。并随着磷酸化反应的进行(即磷酸化产物——磷酸化肽的量逐渐增多)，该功能纳米通道的电流也发生随时间的相应变化，因此实现实时的磷酸化监测。该功能纳米通道方法操作简单、成本低、无需标记，能够实时监测激酶磷酸化发生，为小分子激酶抑制剂的筛选提供了一种新手段。

Description

一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法

技术领域

本发明涉及一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，具体涉及聚合物修饰功能纳米通道的构筑、磷酸化肽识别和磷酸化反应监测领域。

背景技术

蛋白质磷酸化是迄今为止最丰富和最普遍的蛋白质翻译后修饰，控制着几乎所有细胞过程。真核生物中的蛋白磷酸化通常发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，并且由催化磷酸化的磷酸激酶和去磷酸化的磷酸酯酶精确控制。许多疾病与磷酸化(或去磷酸化)失调直接相关，包括各种癌症、神经系统疾病和糖尿病等严重危及人类健康的疾病。例如，慢性粒细胞白血病是由酪氨酸激酶的异常活化而导致蛋白质发生过度酪氨酸磷酸化所引起的疾病。目前，治疗磷酸化异常所造成疾病的一种有效手段是服用小分子激酶抑制剂，其能有效的降低相应激酶的活性，截至目前已经有50多种小分子激酶抑制剂被批准上市。

小分子激酶抑制剂研发的主要工作在于检测在抑制剂存在下激酶能否催化底物发生磷酸化。目前最常用的检测手段是采用[γ-³²P]标记的三磷酸腺苷作为底物，激酶催化磷酸化后，相应的[γ-³²P]被转移到磷酸化产物上，检测产物的放射性即实现磷酸化的检测进而证明磷酸化确已发生。然而这一方法通常会造成放射性废物的产生。另外，一些特异性抗体被用于磷酸化检测和激酶抑制剂研发，但是高成本的抗体限制了其广泛使用。近十几年来，一些光学探针法(包括荧光和冷光)也被开发用来检测磷酸化，然而需要对底物进行标记的操作依然限制了这一类方法的发展。因此，一种绿色免标记的检测方法对于磷酸化的检测和激酶抑制剂的筛选则显得十分重要。

近年来，仿生离子纳米通道的研究日趋繁荣，这种人工纳米通道能够模拟生物离子通道开-关进而引起通过的离子电流变化，这种特性提供了一种分子识别传感的策略。因此，本发明中，我们将纳米通道用于磷酸化肽的检测，开发了一种实时监测磷酸化反应的方法，在激酶抑制剂的筛选中具有潜在应用价值。

发明内容

本发明旨在开发一种功能纳米通道实现检测磷酸化肽和实时监测激酶磷酸化反应。首先合成具备识别磷酸根功能的聚合物，然后利用偶联反应将功能聚合物接枝到人工纳米通道内表面。通过在纳米通道内部接枝对磷酸根具有特异性识别作用的功能聚合物，磷酸化肽分子能够诱导接枝的聚合物发生不同程度的收缩，进而引起流经纳米通道的离子电流发生变化，因此实现对磷酸化肽的检测。激酶催化底物肽发生磷酸化，随着反应的进行(即磷酸化产物——磷酸化肽的量逐渐增多)，产物磷酸化肽逐渐增多，离子电流变化的幅度逐渐增大，遂实现磷酸化实时检测。该功能纳米通道方法操作简单、成本低、无需标记，能够实时监测激酶磷酸化发生，为小分子激酶抑制剂的筛选提供了一种新手段。

本发明采用技术方案具体如下：

一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，将功能纳米通道固定于电化学池的模具中，其中纳米通道膜作为隔膜允许电解质离子穿过，在电压驱动下电化学池中的离子会穿过纳米通道产生电流；将以多肽为底物混合相应蛋白激酶配制而成的磷酸化反应溶液加入功能纳米通道两侧电化学池中开始磷酸化反应，该功能纳米通道能够识别磷酸化产生的磷酸化肽，进而诱导通道电流发生变化；随着反应的进行，通道电流随之而发生变化，因此通过实时测试电流的变化则实现了对磷酸化的实时监测。

其中电化学池中间两个聚四氟乙烯模块，夹具是不锈钢的，用螺丝紧紧夹紧中间的聚四氟模块。

所述功能纳米通道包括纳米通道和接枝到纳米通道内表面的功能聚合物。

所述纳米通道为聚对苯二甲酸乙二酯多孔膜或单孔膜一种，或聚酰亚胺多孔膜或单孔膜中的一种。

所述功能聚合物的分子结构如下：

其中，接枝量为1～99％(以伯氨基数量为基数)，n为20～120。

所述磷酸化为蛋白激酶催化的在多肽基底上发生的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸磷酸化。

所述蛋白激酶为丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶。

磷酸化反应溶液的缓冲液为pH为7.5的Tris盐酸盐缓冲液，并包含50μM的三磷酸腺苷，2mM的二硫苏糖醇，10mM氯化镁，10mM的氯化钠。

利用电极在电化学池两端施加-2～+2V的线性扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压(I-V)曲线。

功能纳米通道的制备方法具体为：首先在主链聚合物链上修饰功能识别单元苯基胍，然后将带有苯基胍的聚合物接枝到纳米通道内表面，具体步骤：称取0.5～1.5g对胍基苯甲酸盐酸盐溶于30mL水/二甲基亚砜(v/v＝2/1),再加入0.5～2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.4～1.5g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌0.5～4小时。取0.5～2g聚乙烯亚胺溶于20mL水，逐滴加入到上述反应溶液中，室温下反应12～24小时；然后将反应溶液装入透析袋(截留分子量3500)，于水中透析1～5天，冻干制得所需聚合物。将纳米通道膜置入烧杯中，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于MES(2-N-吗啉乙磺酸一水合物)缓冲液(pH5.5，0.1mol/L)，活化有机多孔膜1h；然后用水彻底清洗有机纳米通道膜，再将有机纳米通道膜浸入到5ml溶有25～200mg聚合物的水溶液中，室温条件下反应12～24h，取出用大量水清洗，浸泡于水中，备用。

功能纳米通道检测磷酸化肽的具体步骤如下：

步骤1、将聚合物修饰后的功能纳米通道膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入电解液，静置5～10分钟，在电化学池两端插上电极用皮安计测量其跨膜电流；

步骤2、移除步骤1添加的电解液，重新加入溶解有标准磷酸化肽的电解质溶液，在电化学池两端插上电极用皮安计实时测量其跨膜电流。

所述步骤1和2中电解液为0.01M NaCl溶液。

所述步骤1中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞、石墨或铂丝电极；步骤2中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞或者石墨电极。

所述步骤1和步骤2中采用皮安计测量跨膜离子电流变化时，电源在电极两端施加-2～+2V的扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压曲线。

功能纳米通道实时监测磷酸化的具体步骤：

步骤1、将聚合物修饰后的功能纳米通道膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入电解液，热水浴加热电化学池并维持在37度左右，静置5～10分钟，在电化学池两端插上电极用皮安计测量其跨膜电流；

步骤2、移除步骤1添加的电解液，重新加入溶有底物肽和对应激酶的反应溶液，温度维持37度，在电化学池两端插上电极用皮安计实时测量其跨膜电流。

所述步骤1中电解液为pH为7.5的Tris盐酸盐缓冲液，并包含50μM的三磷酸腺苷、2mM的二硫苏糖醇、10mM氯化镁、10mM的氯化钠，溶剂为超纯水。

所述步骤2中溶有底物肽和对应激酶的反应溶液是将底物肽和激酶溶于pH为7.5且含50μM三磷酸腺苷、2mM二硫苏糖醇、10mM氯化镁、10mM氯化钠的Tris盐酸盐缓冲液。底物肽和激酶的最终浓度分别为10μM和10nM。

所述步骤1中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞、石墨或铂丝电极；步骤2中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞或者石墨电极。

所述步骤1和步骤2中采用皮安计测量跨膜离子电流变化时，电源在电极两端施加-2～+2V的扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压曲线。

本发明技术优点：

(1)绿色无污染。不采用任何放射性标记法，不产生放射性废物污染；

(2)无需标记。底物肽不需经过特殊发色团的标记，大大降低底物肽合成的难度和所需时间。

(3)低成本。有机纳米通道膜的原料和制备过程成本低。相对于抗体方法大大降低了操作成本。

(4)高灵活性。通过设计底物肽和相应激酶，该方法能够针对不同磷酸化(如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化)和相对应激酶实现实时磷酸化监测。

附图说明

图1.功能聚合物的核磁图；

图2.纳米通道在功能聚合物修饰前后XPS图；

图3.测试功能纳米通道电流-电压(I-V)曲线的电化学池示意图；

图4.纳米通道在功能聚合物修饰前后电流-电压(I-V)曲线图；

图5.功能纳米通道检测标准磷酸化肽的电流-电压(I-V)曲线图；

图6.功能纳米通道对激酶催化磷酸化反应实时监测的电流-电压(I-V)曲线图；

图7.功能纳米通道对激酶催化磷酸化反应实时监测的电流变化率图；

图8.激酶催化底物肽发生磷酸化生成磷酸化肽的质谱鉴定图；

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

功能纳米通道的制备：

实施例1

(1)称取0.7g对胍基苯甲酸盐酸盐溶于30mL水/二甲基亚砜(v/v＝2/1)中，再加入0.74g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.45g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后室温下搅拌2小时。取1g聚乙烯亚胺(枝化型，分子量Mw为10000g·moL^-1)溶于20mL水，逐滴加入到上述反应溶液中，室温下搅拌反应24小时；然后将反应溶液装入透析袋(截留分子量3500)，于水中透析4天，冻干制得功能聚合物。

(2)功能聚合物的核磁氢谱如图1所示，可明显看出对胍基苯甲酸修饰所带来的苯环质子峰。

实施例2

(1)纳米通道膜以潜径迹刻蚀后的聚对苯二甲酸乙二酯多孔膜(PET)为例。首先用乙醇彻底清洗PET膜，氮气吹干，置入小烧杯中；称取40mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和25mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于5mL MES(2-N-吗啉乙磺酸一水合物)缓冲液(pH 5.5，0.1mol/L)，加入烧杯中活化PET纳米通道膜2h；然后用大量水彻底清洗PET膜，氮气吹干。再将其浸入到5mL溶有100mg聚合物的水溶液中，室温条件下反应24h。反应完之后取出PET膜，用大量水清洗，浸泡于水中，备用。

(2)功能聚合物修饰PET纳米通道前后的XPS图谱如图2所示，N1s的出现以及C1s/O1s比例的提升都表明了功能聚合物的成功修饰。

(3)针对功能纳米通道，以功能聚合物修饰的PET纳米通道为例，将其紧紧加持在电化学池的两个电化学槽中间，两边充满0.01M氯化钠溶液，插入电极(这里电极以银/氯化银电极为例)，如图3所示。用皮安计测量跨膜的离子电流，电压范围为-2～+2V。聚合物修饰前后的跨膜电流变化如图4所示，可以看出聚合物修饰后，纳米通道的孔径变小导致多孔PET纳米通道的穿孔离子电流变小。

功能纳米通道检测标准磷酸化肽：

实施例3

(1)这里以合成的模型磷酸化肽HpYPIAPSSPSPK(缩写为1pY)作为标准磷酸化肽，以HDPIAPDSPDPK(缩写为NMP)为非磷酸化的标准肽。首先基于0.01M的NaCl溶液，配制1×10^-7M浓度的1pY溶液和NMP溶液。然后往固定有功能纳米通道膜的电化学池两边各加入0.01M的NaCl溶液，插入电极(这里电极以银/氯化银电极为例)，用皮安计测量跨膜的离子电流，电压范围为-2～+2V。然后完全移除NaCl溶液，再各加入1×10^-7M浓度的1pY溶液，插入电极(这里电极以银/氯化银电极为例)，待稳定后用皮安计测量跨膜的离子电流，电压范围为-2～+2V。然后平行测试NMP溶液加入后的跨膜的离子电流。

(2)加入1pY前后功能纳米通道的离子电流的变化如图5所示，在-2电压下的电流值发生了明显的增长，而非磷酸化的标准肽加入后则未发生明显的电流变化。这一结果表面该功能纳米通道可用于检测磷酸化肽。

功能纳米通道实施检测磷酸化反应：

实施例4

(1)这里以酪氨酸激酶c-Abl(BCR/Abl；Abl；c-Abl1；JTK7,p150；v-Abl)、对应底物肽EAIYAAPFAKKK(缩写为EK12)为例。首先配制pH为7.5的Tris盐酸盐缓冲液，其中含50μM的三磷酸腺苷，2mM的二硫苏糖醇，10mM氯化镁，10mM的氯化钠。将底物肽EK12溶于上述缓冲溶液，配制成浓度为10μM的底物肽溶液。将c-Abl激酶加入底物溶液中，配制为反应溶液，c-Abl激酶的最终浓度在10nM。

(2)将固定有功能纳米通道膜的电化学池置于电加热台上，水浴加热并维持在37度。取两毫升左右底物肽溶液加入到电化学池两端加注口中，排除空气，待温度稳定。然后插入电极(这里电极以银/氯化银电极为例)，设置电压范围为-2～+2V，间隔电压0.2V，间隔时间1S，用皮安计测得电流-电压(I-V)曲线。然后彻底倒出溶液，将刚配制好的激酶反应溶液加入到电化学池，使整个装置维持37度温度，同样地设置电压范围为-2～+2V，间隔电压0.2V，间隔时间1S，用皮安计测试I-V曲线，间隔5min测试一次I-V曲线。将所测得不同时间的I-V曲线作图，如图6所示，可以明显看出随着时间延长，测得的I-V产生明显的变化。以-2V的电流绝对值为例，以初始底物肽溶液测得的电流值为初始值I₀，根据(I-I₀)/I₀定义电流变化率。如图7所示，随着反应时间的增长，电流变化率产生明显的增长，到120min左右达到40％的增长率，其后就不在变化。质谱结果鉴定表明底物肽被完全磷酸化(图8所示)。然而对未加c-Abl激酶的底物肽溶液，进行随时间的I-V曲线测试，其在-2V的电流变化率并未发生明显的变化(图6)。以上结果表明，电流的变化是由激酶催化底物发生磷酸化而引起的，即磷酸化肽的产生导致功能纳米通道的离子电流发生明显的变化。因此，根据以上电流测试结果，该功能纳米通道能够实现对激酶催化磷酸化反应进行实时的监测。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：该方法将功能纳米通道固定于电化学池的模具中，将以多肽为底物混合相应蛋白激酶配制而成的磷酸化反应溶液加入功能纳米通道两侧电化学池中开始磷酸化反应，通过实时测试电流的变化实现对磷酸化的实时监测。

2.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述功能纳米通道包括纳米通道和接枝到纳米通道内表面的功能聚合物。

3.根据权利要求2所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述纳米通道为聚对苯二甲酸乙二酯多孔膜或单孔膜一种，或聚酰亚胺多孔膜或单孔膜中的一种。

4.根据权利要求2所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述功能聚合物的分子结构如下：

其中，接枝量为1～99％(以伯氨基数量为基数)，n为20～120。

5.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述磷酸化为蛋白激酶催化的在多肽基底上发生的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸磷酸化。

6.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：所述蛋白激酶为丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶。

7.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：磷酸化反应溶液的缓冲液为pH为7.5的Tris盐酸盐缓冲液，并包含50μM的三磷酸腺苷，2mM的二硫苏糖醇，10mM氯化镁，10mM的氯化钠。

8.根据权利要求1所述的利用功能纳米通道实时监测磷酸化的方法，其特征在于：利用电极在电化学池两端施加-2～+2V的线性扫描电压，间隔电压为0.2V，间隔时间为1S，获得电流-电压(I-V)曲线。

9.一种如权利要求1-8任一所述方法在激酶抑制剂筛选装置中的应用。

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