CN110044994A - 一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法 - Google Patents

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Abstract

针对蛋白质分子印迹过程中蛋白质洗脱时间长，洗脱过程及反应热引起蛋白质变性等问题，本发明提供了一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法。首先制备海藻酸钠和硅酸钠的混合物水溶液，采用丝网印刷工艺将上述混合物水溶液印刷到丝网印刷技术制备的裸碳电极表面，裸碳电极提前经过氨基硅烷处理，然后将其浸泡到氯化钙水溶液中交联，得到负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶负载的裸碳电极。随后将上述含蛋白质的电极作为工作电极浸泡在不同pH值的含铁离子的洗脱液中进行循环伏安扫描，改变pH调控水凝胶的溶胀，调节电势控制蛋白质扩散的速率快速充分无损地洗脱蛋白质，该电极在蛋白质分析检测领域具有广泛应用前景。

Description

一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法
技术领域
本发明涉及一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法，属于功能材料、电化学和生物材料领域。
背景技术
分子印迹聚合物(MIPs)具有对目标分子的特异性选择，可以有效的识别目标分子，已被应用于多种生物传感领域例如分娩、催化、固相萃取、以及诊断和治疗学等。蛋白质印迹聚合物是能够识别蛋白质的新型高分子功能材料，可用于蛋白质组学，也可构建高灵敏度的仿生传感器，对蛋白质进行痕量分析。许多研究者成功地研究了小分子模板的分子印迹聚合物。然而，由于蛋白质结构的复杂性、构象的高度灵活性和蛋白质序列的多样性，对牛血清白蛋白(BSA)、牛血红蛋白(BHb)等大分子模板的分子印迹研究仍是一个巨大的挑战。目前，主要采用微接触印迹、印迹水凝胶和表位介导印迹等多种方法来克服这些问题，提高了蛋白质模板的印迹效率。但由于蛋白质体积大扩散速度慢，较难离开聚合物形成识别空穴。在蛋白质印迹过程中除去模板蛋白质和保持印迹结构的稳定性仍然非常困难。在蛋白质分子洗脱过程中，通常采用与蛋白质分子发生强烈相互作用并导致材料膨胀的表面活性剂，这会造成蛋白质的变性及表面活性剂的残留。有机溶剂会对基体结构造成不可逆的破坏，这种洗脱方法在某种程度上是有效的，但效率很低。因此，开发一种简便的蛋白质洗脱方法是十分必要的。
丝网印刷技术是促进生物传感器实际应用的关键技术之一，基于丝网印刷技术的电化学生物传感器的应用领域涉及医学检验监测、食品成份及安全检测、农产品和环境中农药残留检测等方面。在现代医学诊断与治疗中，快速方便得到某些临床项目检验的分析结果意义重大，尤其对于危重病人、野外救护以及需随时监测生理指标的患者。丝网印刷电极具有设计灵活、成本低和可批量制作的优点，在实验室研究和产品开发上都受到越来越多的关注。水凝胶具有高的含水率和良好的生物相容性，能保持蛋白质构象，可应用于蛋白质的分子印迹。
针对蛋白质分子印迹过程中蛋白质洗脱时间长，洗脱过程及反应热引起蛋白质变性等问题，本发明提供了一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法。首先溶解蛋白质、海藻酸钠和硅酸钠的混合物水溶液，采用丝网印刷工艺将上述混合物水溶液印刷到丝网印刷技术制备的裸碳电极表面，裸碳电极事先经过氨基硅烷处理，然后将其浸泡到氯化钙水溶液中交联，得到负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶负载的裸碳电极。随后将上述含蛋白质的电极作为工作电极浸泡在不同pH值的含铁离子的洗脱液中进行循环伏安扫描，改变洗脱液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制蛋白质扩散的速率快速充分无损地洗脱蛋白质，该电极在蛋白质分析检测领域具有广泛应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是蛋白质分子印迹过程中蛋白质洗脱时间长，洗脱过程及反应热引起蛋白质变性等问题。
本发明解决所述蛋白质分子印迹过程中蛋白质洗脱时间长，洗脱过程及反应热引起蛋白质变性等问题的技术方案是提供一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法。
本发明提供了一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)配制质量百分比浓度为0.01％-2％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中1-24小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制蛋白质质量百分比浓度为0.01％-5％，海藻酸钠质量百分比浓度为1％-5％，硅酸钠质量百分比浓度为0.1％-2％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1％-10％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为20-1000微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液1-24小时，得到负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的洗脱液；
f)以步骤d)得到的负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的洗脱液中进行循环伏安扫描，改变洗脱液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制蛋白质扩散的速率，从而在5～60分钟内快速充分无损地洗脱蛋白质，得到一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板蛋白质的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此蛋白质洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中蛋白质的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起蛋白质构象的变化，洗脱蛋白质的过程也比较温和，因此得到的蛋白质分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在蛋白质快速分析检测领域具有良好的应用前景。
本发明所述的蛋白质为牛血清白蛋白、牛血红蛋白、卵清蛋白、粘连蛋白、转化生长因子、溶菌酶中的任意一种。本发明所述的洗脱液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的任意一种。
具体实施方式
下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实施例1.
a)配制质量百分比浓度为0.01％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中1小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制牛血清白蛋白质量百分比浓度为0.01％，海藻酸钠质量百分比浓度为1％，硅酸钠质量百分比浓度为0.1％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为20微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液1小时，得到负载牛血清白蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的磷酸盐缓冲溶液；
f)以步骤d)得到的负载牛血清白蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，改变磷酸盐缓冲溶液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制牛血清白蛋白扩散的速率，从而在5分钟内快速充分无损地洗脱牛血清白蛋白，得到一种改变pH洗脱牛血清白蛋白的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱牛血清白蛋白的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板牛血清白蛋白的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此牛血清白蛋白洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中牛血清白蛋白的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起牛血清白蛋白构象的变化，洗脱牛血清白蛋白的过程也比较温和，因此得到的牛血清白蛋白分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在牛血清白蛋白快速分析检测领域具有良好的应用前景。
实施例2.
a)配制质量百分比浓度为2％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中24小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制牛血红蛋白质量百分比浓度为5％，海藻酸钠质量百分比浓度为5％，硅酸钠质量百分比浓度为2％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为10％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为1000微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液24小时，得到负载牛血红蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的Tris-HCl缓冲溶液；
f)以步骤d)得到的负载牛血红蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的Tris-HCl缓冲溶液中进行循环伏安扫描，改变Tris-HCl缓冲溶液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制牛血红蛋白扩散的速率，从而在60分钟内快速充分无损地洗脱牛血红蛋白，得到一种改变pH洗脱牛血红蛋白的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱牛血红蛋白的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板牛血红蛋白的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此牛血红蛋白洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中牛血红蛋白的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起牛血红蛋白构象的变化，洗脱牛血红蛋白的过程也比较温和，因此得到的牛血红蛋白分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在牛血红蛋白快速分析检测领域具有良好的应用前景。
实施例3.
a)配制质量百分比浓度为1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中12小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制卵清蛋白质量百分比浓度为2.5％，海藻酸钠质量百分比浓度为2％，硅酸钠质量百分比浓度为1％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为2％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为100微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液12小时，得到负载卵清蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的Tris-HCl缓冲溶液；
f)以步骤d)得到的负载卵清蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的Tris-HCl缓冲溶液中进行循环伏安扫描，改变Tris-HCl缓冲溶液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制卵清蛋白扩散的速率，从而在10分钟内快速充分无损地洗脱卵清蛋白，得到一种改变pH洗脱卵清蛋白的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱卵清蛋白的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板卵清蛋白的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此卵清蛋白洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中卵清蛋白的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起卵清蛋白构象的变化，洗脱卵清蛋白的过程也比较温和，因此得到的卵清蛋白分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在卵清蛋白快速分析检测领域具有良好的应用前景。
实施例4.
a)配制质量百分比浓度为0.5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中2小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制粘连蛋白质量百分比浓度为1％，海藻酸钠质量百分比浓度为2.5％，硅酸钠质量百分比浓度为0.5％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为5％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为500微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液2小时，得到负载粘连蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的硼酸盐缓冲溶液；
f)以步骤d)得到的负载粘连蛋白的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的硼酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，改变硼酸盐缓冲溶液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制粘连蛋白扩散的速率，从而在20分钟内快速充分无损地洗脱粘连蛋白，得到一种改变pH洗脱粘连蛋白的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱粘连蛋白的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板粘连蛋白的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此粘连蛋白洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中粘连蛋白的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起粘连蛋白构象的变化，洗脱粘连蛋白的过程也比较温和，因此得到的粘连蛋白分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在粘连蛋白快速分析检测领域具有良好的应用前景。

Claims (3)

1.一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)配制质量百分比浓度为0.01％-2％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，将丝网印刷技术制备的裸碳电极用无水乙醇清洗干净，然后浸泡到3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中1-24小时，在裸碳电极表面引入氨基；
b)配制蛋白质质量百分比浓度为0.01％-5％，海藻酸钠质量百分比浓度为1％-5％，硅酸钠质量百分比浓度为0.1％-2％的混合物水溶液，静置消泡后放置于无菌容器中备用；
c)配制氯化钙质量百分比浓度为0.1％-10％的氯化钙水溶液；
d)采用丝网印刷工艺，将步骤b)得到的混合物水溶液均匀地印刷到步骤a)得到的表面引入氨基的裸碳电极上，利用氨基与海藻酸钠上的羧基之间的相互作用使海藻酸钠分子结合在裸碳电极表面；控制混合物水溶液的印刷厚度为20-1000微米；立即将裸碳电极浸泡到步骤c)得到的氯化钙水溶液1-24小时，得到负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极；
e)配制含1.0mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾的洗脱液；
f)以步骤d)得到的负载蛋白质的海藻酸钙基水凝胶修饰的裸碳电极作为工作电极，将该工作电极浸泡在步骤e)得到的洗脱液中进行循环伏安扫描，改变洗脱液的pH值为弱碱性调控水凝胶的溶胀，调节电势控制蛋白质扩散的速率，从而在5～60分钟内快速充分无损地洗脱蛋白质，得到一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极；
g)以步骤f)得到的一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极作为工作电极，银电极作为参比电极，铂片作为辅助电极，采用循环伏安法检测模板蛋白质的洗脱程度；由于分子印迹水凝胶修饰电极上的分子印迹水凝胶可做到很薄，且控制弱碱性条件使海藻酸钙基水凝胶快速溶胀，再加上电场的作用，因此蛋白质洗脱快，检测时间短，灵敏度高；通过加入硅酸钠的含量控制海藻酸钙基水凝胶的溶胀，硅酸钠含量越大，海藻酸钙基水凝胶的溶胀越小；通过控制pH的变化和硅酸钠的含量调控海藻酸钙基水凝胶的溶胀，进而控制海藻酸钙基水凝胶中蛋白质的扩散；
h)由于在制备过程中没有引入有毒有害试剂，没有聚合反应热引起蛋白质构象的变化，洗脱蛋白质的过程也比较温和，因此得到的蛋白质分子印迹水凝胶电极生物相容性好，识别选择性高，在蛋白质快速分析检测领域具有良好的应用前景。
2.如权利要求1所述一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法，其特征是所述的蛋白质为牛血清白蛋白、牛血红蛋白、卵清蛋白、粘连蛋白、转化生长因子、溶菌酶中的任意一种。
3.如权利要求1所述一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法，其特征是所述的洗脱液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的任意一种。
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