CN102016064A - 具有与γ磷酸结合的电活性标记的核苷三磷酸 - Google Patents

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Abstract

核苷三磷酸(NTP)参与磷酸化反应，其中磷酸基团通过激酶从NTP转移到底物上。在激酶反应中提供的NTP的γ磷酸结合于电活性标记，导致该γ磷酸-电活性标记结合物从NTP转移到底物。电活性标记是一种有机部分，如醌或硝基杂环，或者是一种金属茂，如二茂铁或二茂钴。一旦γ磷酸-电活性标记结合物通过激酶转移到电极结合的底物，磷酸化的发生就通过循环伏安法进行电化学检测。磷酸化也能够通过对携带了结合电活性标记的γ磷酸的底物进行质谱分析来检测。含有γ磷酸-电活性标记结合物的NTP适用于检测样品中激酶存在的方法，筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，以及适用于诊断与激酶相关的疾病的方法。

Description

具有与γ磷酸结合的电活性标记的核苷三磷酸
在先申请
本申请要求于2007年9月27日提交的美国临时专利申请60/960,388的优先权。
技术领域
本发明涉及一种适用于监测与磷酸化相关的事件的新的电活性核苷三磷酸(nucleotide tiphosphate)。
背景技术
在细胞通信网络中，许多酶和受体在“开(或上去，on”)和“关(或下来，off”)之间转换，或换句话说，是“磷酸化的”和“去磷酸化的”。在磷酸化期间，来自ATP的磷酰基转移至蛋白质特定的丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基。由于这些修饰，蛋白质的功能或定位可以变化，这在一些情况下可以导致肿瘤蛋白的形成1。
异常蛋白质磷酸化是许多疾病，包括癌症、糖尿病和慢性炎性疾病的原因。量化蛋白质激酶活性的分析方法对于理解其在这些疾病的诊断和疗法中的作用是很关键的。目前对于检测蛋白质磷酸化的方法依赖于放射标记的ATP3、基于荧光的方法4、和荧光共振能传递(FRET)5。近来，结合生物素的ATP分子被开发用于检测磷酸化反应6。然而，需要用电活性或光学标记对肽进行其它修饰，这增加了成本并导致了处理过程冗长和耗时。
因此，需要开发一种监测或检测与磷酸化相关的事件的可替换方法，其能够克服当前检测方法的至少一种缺点。
发明内容
现在已经开发了一种新的电活性核苷三磷酸，其适用于监测和/或检测与磷酸化相关的事件，包括磷酸化本身的可替换方法中。
因此，本发明一方面，提供了含有电活性标记的γ磷酸基团的核苷三磷酸结合物(conjugate)。
本发明另一方面，提供了一种检测激酶底物磷酸化的方法，包括：
(a)在电极表面固定底物；
(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；
(c)检测底物的磷酸化。
一方面，磷酸化通过电化学方法检测。另一方面通过光谱法，包括质谱法检测磷酸化。
本发明另一方面，提供了一种检测样品中感兴趣的激酶的方法，包括：
(a)在电极表面上固定对感兴趣的激酶特异的底物；
(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和
(c)检测底物的磷酸化，
其中底物的磷酸化指示样品中激酶的存在。
本发明另一方面，提供了识别候选激酶底物的方法，包括：
(a)在电极表面上固定候选激酶底物；
(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用含激酶的电解液和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和
(c)检测底物的磷酸化，其中候选底物的磷酸化指示所述候选物质是激酶的底物。
本发明另一方面，提供了一种筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，包括：
(a)在电极表面上固定激酶底物；
(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶、候选化合物和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和
(c)检测底物的磷酸化水平，其中，在缺乏所述化合物时，磷酸化水平从一个磷酸化水平实现变化指示所述化合物调节所述激酶的活性。
本发明另一方面，提供了一种高通量筛选样品中存在蛋白激酶的方法，包括：
(a)提供一种包含多个电极的微电极阵列；
(b)将激酶底物固定于阵列中的每一电极上；
(c)用感兴趣的样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带所述用感兴趣的样品固定的底物的所述微电极阵列；和
(d)检测每一电极中底物的磷酸化水平，其中在多个电极中的一种或多种底物的磷酸化指示在样品中存在对一种或多种磷酸化底物特异的激酶。
本发明另一方面，提供了一种诊断对象中与蛋白激酶的水平异常或缺乏相关的疾病的方法，包括：
(a)将与疾病相关的激酶的底物固定于一个或多个电极上；
(b)用来自对象的样品和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定底物的一个或多个电极；
(c)检测每一阵列的电极中底物的磷酸化水平，其中相对于正常对照，在对象样品中的异常磷酸化水平或缺乏磷酸化指示所述对象患有或易于患上所述疾病。
另一方面，提供了一种包含至少一种固定于电极表面的激酶底物的激酶生物传感器，其中所述电极表面浸没于包含具有电活性标记γ磷酸的电活性核苷三磷酸的电解液中。
又一方面，提供了一种筛选激酶磷酸化的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含至少一种激酶底物、电极、含电活性标记的γ磷酸基团的核苷三磷酸结合物和一种激酶。
这些方面的至少一些的一个或多个优点包括：(i)适用于监测和/或检测与磷酸化相关的事件，包括磷酸化本身的新的电活性核苷三磷酸结合物，(ii)与其它监测和/或检测磷酸化的方法相比，新的电活性核苷三磷酸结合物可以以非常低的成本生产，(iii)检测或监测与磷酸化相关的事件，包括磷酸化本身的事件的方法并不需要用电活性或光标记来修饰肽，和(iii)新的电活性核苷三磷酸结合物有助于、简化和加速包括监测和检测磷酸化事件包括磷酸化本身的步骤。具体而言，本发明的新的电活性核苷三磷酸结合物能够用于发现新药，分子诊断剂和分子靶向。
本发明的这些和其它方面通过以下的详细描述和接着的附图会更加清楚，其中：
附图说明
图1是示出了电活性二茂铁-ATP结合物合成的示意图；
图2是示出了电化学检测底物磷酸化的方法中金属茂-ATP结合物用途的示意图；
图3示出了在图2的方法中采用各种二茂铁-ATP浓度(a～d)获得的循环伏安图；
图4示出了在图2的方法中存在(a)和不存在(b)PKC下获得的循环伏安图；
图5示出了在图2的方法中存在(a)和不存在(b)的PKC下获得的方波伏安图；
图6图形示出了电流密度依赖于图2的方法的反应时间的响应；
图7示出了微电极阵列；和
图8(A-D)示出了微电极阵列的用法。
图9(A)示出了在含有(a)过表达(over-expressed)CK2α，(b)内源性CK2水平，(c)过表达激酶-死CK2α，(d)正常表达的CK2α的细胞溶解产物中实施的CK2-催化磷酸化反应的方波伏安图。
图9(B)是检测Hela细胞溶解产物中CK2α过表达状态的图表。
图10(A)是在不同CK2α′浓度的(a)-(e)存在下和在酶不存在(f)下，底物肽的CK2α′-催化的磷酸化的循环伏安图；
图10(B)说明(a)在分析缓冲液中，(b)在HeLa细胞溶解产物存在下和(c)在对照实验中采用底物肽修饰的电极时CK2α′浓度对电流响应的影响。
图11(A)说明在抑制剂，(1)在不同浓度(a)～(e)的TBB(4，5，6，7-四溴-2-氮杂苯并咪唑)存在下和在CK2α不存在的对照(f)实验中，底物肽CK2α-催化的磷酸化的抑制作用的循环伏安图。
图11(B)说明检测CK2α′-催化的磷酸化的动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk plot)。
图11(C)示出了图11(A)的对照实验。
图12(A)示出了在AbI1-T315I(a)-(d)存在下和AbI1-T315I不存在(e)下，用信号转导蛋白(STP)肽对酪氨酸激酶-催化的磷酸化的抑制作用的CV。
图12(B)示出了固定STP肽的AbI1-T315I-催化磷酸化的动力学测定的双倒数作图。
图12(C)示出了在具有STP肽(a)、(b)的HeLa细胞溶解产物存在下和对照实验(c)，阳极电流依赖于AbI1-T315I激酶的量的响应的图。
图12(D)示出了电流依赖于一般蛋白激酶抑制剂(b)和(c)和对照实验(a)浓度的响应的图。
图13(A)示出了在不同浓度(a)、(b)和(c)的HER2/ErbB2存在下，采用FLT3肽的酪氨酸激酶催化磷酸化的抑制作用的循环伏安图。
图13(B)示出了测定HER2/ErbB2-催化的磷酸化的动力学的双倒数作图。
图13(C)示出了底物肽在(a)存在下及(b)和(c)不存在下，阳极电流依赖于HER2/ErbB2激酶的量的响应的图。
图13(D)示出了J依赖于N-苯甲酰基星形孢菌素浓度的响应的图。
图14示出了底物肽的激酶催化磷酸化的质谱(MS)图。
具体实施方式
本发明提供了一种新的电活性核苷三磷酸结合物。该核苷三磷酸包含适用于检测激酶磷酸化活性的方法的电活性-标记γ磷酸。在一个实施方式中，所述方法包括将激酶的至少一种底物固定于电极表面上，在允许检测磷酸化活性和检测底物磷酸化的条件下，用电活性核苷三磷酸结合物在激酶存在下孵育固定的底物。一方面，磷酸化活性通过电化学检测。另一方面，磷酸化活性通过质谱法进行检测。
本文中所使用的术语“电活性”是指可转运的γ磷酸(phosphate)含有在施加电场时可检测的标记。电活性标记的实例包括有机标记和有机金属标记。一方面，电活性标记包括金属茂(metallocene)，包括取代的金属茂或其能与含水环境相容的衍生物。例如，金属茂可以是二茂铁，二茂钴或其衍生物。也可以使用取代的金属茂如卤素-取代的金属茂，含有酰胺基取代环戊二烯的金属茂或其它衍生物如柄型-金属茂化合物，金属茂阳离子如二茂铁离子[Fe(C5H5)2]+，三层络合物(具有三个Cp阴离子和两个交替存在的金属阳离子)。另一方面，电活性标记包括喹啉、硝基杂环、NAD+、NADP+、含氮芳香烃和杂环。
术语“核苷三磷酸(nucleotide tiphosphate)”意思是指腺苷-5′-三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物，例如，包括在6氨基位置的取代腺苷衍生物。例如，取代基可以包括甲氧基、乙氧基，戊基，己基，苄基和取代的苄基，以及含有氨基氮的5-和6-元环结构。
在一个实施方式中，电活性核苷三磷酸可以是含有通过将金属茂或其衍生物结合于ATP而形成的金属茂标记的γ磷酸的金属茂-ATP结合物。金属茂-ATP结合物可以采用合成的方法形成，其中羧化金属茂化合物经过处理而产生与反应形式的ATP结合而生成所需结合物的Boc-保护或N-保护的结合物。金属茂-ATP结合物的识别可以采用已知的技术如NMR光谱或质谱确认以识别γ位置的磷酰胺键。
电活性核苷三磷酸，如金属茂-ATP结合物，可以用于检测激酶催化的磷酸化的方法中。在本发明的一个方面，该方法包括电化学分析，然而，其它方法，包括质谱法都是可能的。结合物适用于检测任何激酶的磷酸化活性，所述激酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶如PKC、KITR、PDFGR、CK2、CDK、CDK2、MKK1、RAF、CHK1、mTOR、ROCK、MLK和P38/SAPK2a，以及包括受体激酶如EGRF、TRKA、TRKC、PDGFR-α和PDGFR-β、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MET、RON、EPHB2和B4、RYK、DDR1、DDR2和ALK的酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶如SRC、SYK、ABL1、BRK、YES1和JAK1-3。
基于靶激酶，合适的底物被选择用于固定于工作电极表面。合适的工作电极表面包括金属如金和铂，半导体表面如掺杂硅或GaAs，和透明传导表面，如石墨、玻璃碳和铟锡氧化物。电极表面，或工作电极可以采取在末梢改性的微米级金属导线形式，或每一工作电极是单个可寻址的芯片基电极阵列。
电极表面用激酶肽底物涂层。在这方面，肽底物可以在其末端改性而包含将会结合到电极表面的部分。改性的性质可以随着电极表面的性质而变化。例如，底物可以经过改性而包括末端半胱氨酸残基而允许底物通过Au-S键接或Pt-S键接分别连接至金属电极表面，如金或Pt。对于ITO电极表面，包括羧化残基的底物改性是合适的。对于含硅的电极表面，可以利用氨烷基三乙氧基硅烷化学和肽偶联方法。偶联到碳表面(玻璃碳和石墨)包括苯甲酸衍生物的重氮偶联，接着激酶底物肽偶联至表面的肽偶联。
激酶底物的实例包括但不限于AKTide-SA、AKTide-2T、Src底物II、CDK1底物II、Cdk5底物、Crebtide、Crosstide、AbI1信号转导蛋白、HER2/ErbB2 FLT3底物、合成肽(Syntide)2、Autocamtide-2、Autocamtide-3和CK2底物。激酶底物可以含有单个或多个磷酸化位点。多个磷酸化位点可以是酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸的任何之一。
在允许检测磷酸化活性的条件下，底物涂覆的电极表面用电活性核苷三磷酸如金属茂-ATP结合物和底物激酶进行孵育，这种磷酸化活性的检测方法如，例如，通过将电极表面浸没于电介质中并在反电极如铂导线，和参比电极如Ag/AgCl或其它参比电极体系如甘汞电极，NHE(普通氢电极)和SHE(标准氢电极)存在下进行电化学法测定。
在图2(A)中图示了在孵育时发生的反应10的示意图提供并图示了激酶20将金属茂-核苷三磷酸结合物40的电活性γ磷酸50递送至底物30。在孵育之后，带有核苷三磷酸40的电活性γ磷酸50的底物30的磷酸化采用合适的电化学技术如循环伏安法，方波伏安法和电化学阻抗光谱测定伏安变化或采用其它合适的技术如质谱(参见图14)进行检测60。
本发明的方法提供了一种识别溶液如细胞溶解产物中存在激酶的方法，以及显示激酶活性的方法。磷酸化反应是化学计量的，因为伏安变化直接与通过电活性标记如金属茂转移测定的磷酸化程度成比例。因此，磷酸化之后所得的电极表面电荷直接与金属茂基团的总表面浓度相关，由此提供了一种以快速和精确的模式测定和检测磷酸化速率的定量方法，并允许实时监测激酶的磷酸化反应曲线。反应也有利地是可逆的，由此允许底物-修饰的电极的多次使用。
另外，本发明的方法可以在候选激酶调节化合物，包括抑制剂化合物或激动剂化合物存在下实施，提供了筛选这种有潜力作为与所给激酶相关的疾病有关的治疗药剂的候选化合物的方法。这种筛选方法，如图2(B)所示，包括以下步骤：将所选激酶20的底物30固定于电极表面70上，用电活性核苷三磷酸40如金属茂-ATP结合物在激酶20和候选化合物80(如，抑制剂)存在下孵育固定的底物30，和通过任何合适的检测方法60如电化学的或通过质谱法检测底物30的磷酸化的水平。从在缺乏候选化合物时的磷酸化水平产生的磷酸化水平变化指示候选化合物80调节了激酶的活性。
另外，本发明的方法可以实施而识别新的蛋白激酶底物。这种方法包括以下步骤：将候选底物固定于电极表面上，用电活性核苷三磷酸如金属茂-ATP结合物在激酶存在下孵育固定的候选底物，和通过任何合适的检测方法如电化学法检测底物的磷酸化水平。候选底物的磷酸化指示候选底物是激酶的底物。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种微电极阵列。该阵列包括一系列电极，连接至不同肽底物，每一底物特异于不同蛋白激酶。阵列的制备，除了其包括随底物变化的多个电极之外，类似于单个肽底物电极，并可以含有每一底物的复制物而产生统计意义上的结果。每一肽底物在C-或N-端之一进行修饰而包括适用于按先前的描述将其连接至电极表面的连接剂。对于本技术领域内技术人员而言应该理解到通过这种电极阵列靶向的激酶并没有特殊限制，而因此电极阵列可以包含任何所选的肽底物。
如所述的微电极阵列适用于激酶分析(kinase profiling)，包括一种或多种激酶的磷酸化特性的检测。在这方面，尤其适用于分析包括组分混合物的细胞溶解产物，而由此适用于用作诊断工具通过对照标准例如由健康个体获得的正常分布来识别细胞溶解产物中的异常活性。阵列也适用于筛选激酶调节剂而测定其在单个筛选中对多种激酶/底物相互作用的影响。
异常蛋白磷酸化是较多疾病的原因，包括癌症，糖尿病和慢性炎性疾病。例如，蛋白激酶CK2、AbI1和HER2就经常在肿瘤或白血病细胞中过表达，而在鼠中呈现出致瘤活性。量化蛋白激酶活性的分析方法对于理解其在诊断和治疗这些疾病中的作用是很关键的。因此，本发明的另一方面是诊断对象中与蛋白激酶水平异常或缺乏相关的疾病的方法。这种方法包括以下步骤：将与疾病相关的激酶底物固定于一个或多个电极；用来自对象的样品和含电活性标记γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定底物的一个或多个电极；和通过任何合适的检测方法如电化学方法检测一个或多个电极中底物的磷酸化水平，其中相对于标准对照，对象样品中磷酸化的水平异常或缺乏指示对象患有或易患这种疾病。
对象包括任何在其系统中含有蛋白激酶的生物，包括动物和植物。
本发明的实施方式参照以下具体实施例进行描述，而不能理解为限制性的。
实施例1-Fc-ATP的合成
Boc-NH(CH2)6N(H)COFc(化合物1)的制备：将二茂铁羧酸(230mg，1mmol)溶解于20mL无水DCM中。然后，按顺序加入1.2当量TEA(0.17mL)和1.2当量HBTU(455mg)。30min后，将Boc-NH(CH2)6NH2加入溶液中并继续搅拌过夜。反应完成后，真空下除去溶剂，而残余物通过快速柱色谱法在硅胶上(DCM-MeOH，95∶5；Rf＝0.25)纯化而得到黄色固体状所需化合物，产率78％(334mg)。1H-NMR(δ，DMSO)：7.74(t，1H，J＝5.2Hz，NH-COFc)，6.78(t，1H，J＝5.4Hz，NH-Boc)，4.78(s，2H，Cp)，4.32(s，2H，Cp)，4.14(s，5H，Cp)，3.15(q，2H，J＝6.4Hz，CH2)，2.90(q，2H，J＝6.4Hz，CH2)，1.23-1.52(m，17H).13C(1H)-NMR(δ，DMSO)：168.57，155.57，77.27，76.94，69.73，69.23，68.06，39.76，38.54，29.50，29.47，28.26，26.17，26.08。IR：vmax＝3363(NH)，3310(NH)，2976(Fc)，2934(Fc)，2861(Fc)，1687(CO-OtBu)，1623(酰胺-1)，1535(酰胺-2)。MS(EI+)m/z：C22H32FeN2O3计算值：428.2；实验值：(M+)428.1。
NH2(CH2)6N(H)COFc(化合物2)的制备：将TFA(5当量)加入10mL DCM的Boc-保护的二茂铁基胺(334mg，1mmol)的混合物中。将混合物搅拌1h之后，真空下除去溶剂。加入三部分DCM并蒸发除去过量的TFA。将残余物溶解于10mLDCM中并加入0.25mLTEA将TFA盐完全转化成游离胺。除去溶剂后，混合物(含有TEAH+盐)无需进一步纯化直接用于下一步骤。为了表征，将混合物溶解于20mL的DCM(含5％TEA)并用盐水和水萃取。除去溶剂后，残余物在高真空下干燥而获得黄色固体。产率90％(295mg)。1H-NMR(δ，DMSO-d6)：7.74(t，1H，J＝5.3Hz，NH-COFc)，4.78(s，2H，Cp)，4.32(s，2H，Cp)，4.14(s，5H，Cp)，3.15(q，2H，J＝6.4Hz，CH2)，2.52(s，2H，CH2)，1.49(t，1H，J＝6.6Hz，CH2)，1.27-1.39(m，6H，CH2).13C(1H)-NMR(δ，DMSO)：168.56，76.95，69.70，69.21，68.05，41.53，38.58，33.23，29.51，26.41，26.24.IR：vmax＝3293.68(NH2)，2962.94(Fc)，2928.63(Fc)，2854.23(Fc)，1624.45(酰胺-1)，1541.51(酰胺-2)。MS(EI)m/z：C17H24FeN2O计算值：328.1；实验值：(M+)328.1。
γ-磷酸Fc-ATP(化合物3)的制备：将腺苷5′-三磷酸二钠盐(100mg，0.18mmol)溶解于10mL 0.1M TEAB缓冲液(pH＝7.5)中并上载到阳离子交换树脂(AG 50W- X8)填充的柱子上，该柱子用0.1M TEAB缓冲液预平衡。收集所需馏分(用UV光监测)并在真空下蒸发。将残余物用10mL干甲醇共蒸馏3次并在氩气下溶解于1.8mL的干DMF中。加入DCC(123mg)并在Ar气中在室温下搅拌混合物3h而形成腺苷-5′-三偏磷酸酯(ATMP)。将ATMP溶液在Ar下被加入到在10mL MeOH和0.25mL TEA中的化合物2(295mg，5当量)的混合物中。将混合物搅拌30min，并倾倒于20mLH2O中。将溶液上载到DEAE-纤维素柱上并用蒸馏H2O冲洗而除去过量的二茂铁-胺。随后，实施线性梯度的TEAB缓冲液(0.1-1M)(洗脱)而得到所需馏分(黄带)，将其冻干成淡黄色粉末。Fc-ATP(TEAH+盐)产率50％，而进一步将TEAH交换成Na形式以供NMR光谱分析。31P(1H)-NMR(δ，D2O)：-0.07(γ)d，J＝21.1Hz；-10.76(α)d，J＝19.9Hz；-22.14(β)t，J＝19.9Hz.1H-NMR(δ，D2O)：8.52(s，1H，H-8)，8.19(s，1H，H-2)，6.10(d，1H，J＝5.5Hz，H-I′)，4.73(s，2H，Cp)，4.74(s，1H，H-2′)，4.53(s，1H，H-3′)，4.46(s，2H，Cp)，4.37(s，1H，H-4′)，4.23(m，2H，H-5′)，4.20(s，5H，Cp)，3.16(t，2H，J＝6.5Hz，CH2)，2.79(q，2H，J＝7.8Hz，CH2)，1.31-1.45(m，4H，CH2)，1.11-1.25(m，4H，CH2)。[H4·M](ESI+)m/z：C27H39FeN7O13P3计算值：818.1；实验值：818.2。
在图1中提供了Fc-ATP结合物合成的示意图。
试剂：所有合成反应除非另外指出都在Ar气下实施。二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素，腺苷-5′-三磷酸(ATP)二钠盐获自Sigma并按照所收到的那样进行使用。Dowex AG 50W-X8获自Bio-RadLaboratories(Ontario，Canada)。N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)获自AdvancedChemTech(KY，USA)。二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)在使用之前用CaH2蒸馏。甲醇在碘存在下调节的镁中蒸馏。二茂铁羧酸7和6-氨基己基氨基甲酸叔丁基酯8根据文献方法进行制备。
实施例2-蛋白激酶C磷酸化的电化学检测
循环伏安法(CV)采用CHInstruments 660系统(Austin，TX)进行实施。具有丝网印刷的金电极(SPEs)的DEP-芯片由BioDeviceTechnology Ltd.(Ishikawa，Japan)友好捐赠并按照文献Li et al.Anal.Chem.2005，77，5766-5769的描述进行制备。SPE的总长为11mm，而工作电极的几何面积为2.64mm2。参比电极为Ag/AgCl浆料电极(Ag/AgCl past electrode)，而反电极是碳电极。
1H，13C，31P NMR实验在Bruker Avance 500MHz光谱仪上进行实施，而化学位移对照残余DMSO(对于1H为2.50ppm而对于13C为39.52ppm)和H2O(4.79ppm)。质谱采用Perkin Elmer-Sciex API365仪器进行实施。
除非另外指出，试剂都购自Merek。所有的溶液采用MilliporeMilli Q系统的超纯水(18.3MΩ-cm)制备和稀释。
1.采用Fc-ATP的蛋白激酶C-催化的磷酸化反应
在整个制备步骤中SPE在室温下在陪替氏培养皿中孵育以避免溶液在表面上快速蒸发。除了另外声明之外，电化学测定对于每一条件实施3次(n＝3)。
2.在SPE上蛋白激酶C底物肽的固定
使得200μM底物蛋白激酶Cζ肽溶液(5μL)的等分试样涂覆到SPE的金工作电极并在4℃下孵育过夜。蛋白激酶Cζ肽(SIYRRGSRRWRKL)购自Calbiochem(EMD Biosciences，USA)并在N-端用半胱氨酸残基修饰。修饰的蛋白激酶Cζ伪底物序列含有Ser119，代替了Ala1199。
在孵育步骤之后，电极用空白TBS冲洗。将肽膜通过浸没于SPE的0.1mM己硫醇的乙醇溶液中5min而稀释，并用空白TBS冲洗表面。
3.SPE表面的PKC-催化磷酸化
激酶分析缓冲液包含20mM Tris、0.5mM EDTA、10mMMgCl2、500μg/mL磷脂酰基丝氨酸(pH 7.5)。Fc-ATP和激酶、PKC的浓度根据最佳实验条件变化。来自鼠脑的蛋白激酶C(E.C.2.7.1.37)购自Sigma，在包含20mM Tris、0.5mM EDTA、0.5mMEGTA、5mM DTT、100mM NaCl、0.02％吐温(Tween)20和1μg/mL亮抑酶肽的50％甘油中。一个单位(U)的PKC每分钟在30℃下将从ATP中转移1hmol磷酸至组蛋白H1中10，11。等分试样(200μL)的最佳分析缓冲液包含100U/mL PKC和100μM Fc-ATP，加入到1.5mL药水瓶中。
将固定底物肽的SPE置于药水瓶中，该药水瓶在30℃下的加热块(VWR Scientific，USA)中孵育1h。在1h的孵育后，将SPE用空白TBS冲洗并除去过量的Fc-ATP和其它试剂，并随后置于电化学工作站中。
4.SPCE表面上的电化学测定
通过在室温下将20μL 0.1M的NaClO4(pH 6.5)涂到SPE的表面上而实施电化学检测。以100mV/s的扫描速率实施循环伏安法(CV)。方波伏安法(SWV)涉及通过15Hz频率下25mV的振幅扫过0～1V的电压而氧化Fc残基。
在图2(A)中示出了采用Fc-ATP作为共-底物检测激酶催化的磷酸化的电化学原理的示意图。底物肽30经由硫键固定于SPE70的表面上。蛋白激酶20C(PKC)-催化的反应将γ-磷酸-Fc基团50转移至肽30的丝氨酸35残基上。连接于肽30的Fc基团50采用CV进行电化学观察。Fc的伏安检测包括0～1V的范围内的电压以100mV/s的速率扫描。由于采用这种电化学方法，Fc-ATP的可逆氧化还原性质就得以监测。图3示出了由Fc-ATP在溶液中以(a)100μM(b)50μM(c)25μM和(d)10μM Fc-ATP的溶液存在下，从CV获得的伏安响应。
氧化峰在～0.26V进行检测而还原峰在～0.22v检测(相对于SPE的以Ag浆料为基础的参比电极)。氧化还原峰电压的分离表明在该过程中涉及到了一个电子。这种电化学行为可从Fc明确的电化学性质预期到。
为了实验条件的优化，一系列测定在改变Fc-ATP浓度和100U/mL PKC存在下采用相同的分析条件进行实施。随着Fc-ATP浓度的增加，肽的磷酸化导致在表面上产生高电流响应。电流响应对于超过100μM的浓度保持恒定。因此将100μM Fc-ATP应用于进一步的激酶分析。当分析缓冲液中不使用ATP-F时，没有获得显著的电流响应，这指示通过按照所述严格冲洗SPE在电极表面上非特异性吸收Fc-ATP的抑制作用。当采用低浓度Fc-ATP时，没有观察到电流响应。
采用表面固定的肽，记录在如图4所示的分析溶液中存在和不存在PKC时的电流密度响应。在图4-a中所示的CV响应显示了如溶液中所观察到的Fc-ATP相似的氧化还原行为，然而，峰电压微微漂移至更高值，指示表面上肽膜的存在，这妨碍了氧化还原过程在低电压下发生。在图4-b中任何氧化还原电流信号的缺乏指示Fc-ATP连接至肽依赖于激酶的存在。而且，在缺乏PKC时没有氧化还原活性表明电极表面上Fc-ATP非特异性吸收的成功抑制作用。
将SWV也应用于检测如图5中所示的PKC低浓度下的Fc氧化电流信号。底物肽和Fc-ATP浓度分别在200μM和100μM下保持恒定。图5-a显示在0.1U/mL PKC存在下获得的电流响应，而同时图5-b显示在0.01U/mL PKC存在下获得电流响应。记录了电流密度响应随着PKC浓度增加而增加的趋势(图5)。
为了优化Fc-ATP响应而监测孵育时间的依赖性。底物肽、PKC和Fc-ATP的浓度分别在200μM，100U/mL和100μM下保持恒定，如图6所示记录了电流依赖于在30℃下的孵育时间的响应。当将分析溶液孵育1h后，峰电流高度达到饱和水平。当使得激酶反应仅仅进行20min时，观察到小电流响应，表明表面-固定的底物肽在100μM Fc-ATP存在下并未发生有效的磷酸化(图6)。
实施例3-酪蛋白激酶2(CK2)和酪氨酸激酶AbI1和 HER2/ErbB2磷酸化的检测
先前已经证实，采用含有电活性标记的γ磷酸基团的核苷三磷酸结合物适用于采用电化学生物传感系统检测蛋白激酶C活性。在该实施例中，核苷三磷酸结合物的效用是用于检测另一充分描述的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、酪蛋白激酶-2(CK2)和两个临床重要的酪氨酸激酶、AbI1和HER2/ErbB2，而用以评价这种用于测定蛋白激酶抑制剂效能的方法。
首先对于丝氨酸/苏氨酸激酶的激酶特异性肽RRRDDDSDDD12的酶修饰，采用Fc-ATP作为共底物的质谱分析对CK2进行评价。
图14示出了对于(A)CK2，(B)AbI1-T315I和(C)HER2/ErbB2采用应用生物系统4700蛋白酶分析仪(Applied Biosystems 4700Proteomics Analyzer)用DHB(2，5-二氢苯甲酸)基质(10mg/niL)和1∶1具有样品的混合物检测底物肽激酶催化磷酸化的MS图。含有磷酸化的肽的样品采用标准磷酸化肽分离试剂盒(ThermoScientific Pierce)的方案进行富集和纯化。
我们的结果(图14A)清楚地表明，CK2将所需的氧化还原基团转移至靶肽(m/z CK2靶肽之前：1264.4359，Fc转移之后：1654.1647)。其它反应采用底物肽对于Abl1-T315I和HER2/ErbB2进行实施，清楚地表明我们的方法对于酪氨酸激酶也有效(图14B&C)。
1.物料和方法
i.在SPE上的底物肽的固定
将底物肽在金微电极表面上采用硫辛酸的琥珀酰亚胺-酯进行共价固定，包括以下步骤：用5mM NHS-硫辛酸酯在乙醇中孵育裸金微电极15h；(b)用底物肽在2mM N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)在0.1M 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES，pH 6)中的溶液存在下孵育N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-硫辛酸-改性的表面2h，(c)用巯基聚乙二醇5′000单甲基醚(PEG-硫醇5′000)在乙醇中的溶液(1∶100v/v)中孵育肽修饰电极10min。
ii.CK2-催化的磷酸化
CK2α和CK2α′激酶分析缓冲液包含50mM Tris HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、150mM NaCl。ATP-Fc浓度为100μM ATP-Fc，总反应体积为25μL。CK2的CK2α和CK2α′形式和肽底物(RRRDDDSDDD)在D.W.Litchfield′s实验室(University of WesternOntario，London，Canada)中制备。将底物肽修饰电极在37℃下孵育2h。在孵育时间之后，电极采用2M NaClO4多次冲洗。在冲洗过程之后，将电极浸没于2M NaClO4中采用Ag/AgCl参比电极进行电化学测定，这经由盐桥用电解质连接，并用Pt导线作为反电极。
iii.Abl1-T315I-催化的磷酸化
Abl1-T315I-激酶分析缓冲液包括60mM HEPES(pH 7.5)、5mMMgCl2、5mM MnCl2、3μM Na3VO4、400μM ATP、肽底物(STP)和激酶，总反应体积为25μL。纯化的重组人体Abl1-T315I-突变激酶和其底物肽信号转导蛋白(STP，EGIYDVP)购自Cell SignallingTechnology(MA，USA)。将底物肽修饰电极在37℃下孵育2h。在按照CK2相同的冲洗过程之后，CV测定采用如上述相同的参数进行记录。
iv.HER/ErbB2催化的磷酸化
HER2/ErbB2激酶的活性采用以下条件进行测定：5mM MOPS(pH 7.2)、2.5mM β-甘油磷酸酯、5mM MnCl2、100μM Fc-ATP在FLT3肽底物和10ng/μL激酶存在下，总反应体积为25μL。纯化的重组人体HER2/ErbB2激酶和FLT3(DNEYFYV)底物肽购自CellSignalling Technology(MA，USA)。将底物肽改性的电极在37℃下孵育2h。在按照以上描述的对于CK2相同的冲洗程序后，采用相同的参数记录CV测定结果。
v.细胞溶解产物的预处理
对于含有细胞溶解产物的反应，20×106HeLa细胞获自D.W.Litchfield′s实验室(University of Western Ontario，London，Canada)，通过旋转10min而溶解于1mL含有1mM苯基甲磺酰氟(PMSF，Pierce，USA)的溶胞缓冲液(50mM Tris(pH 8)，150mM NaCl，10％甘油，0.5％Triton X-100TM)中。在磷酸化反应期间，HaltTM磷酸酶抑制剂混合液(Pierce，USA)按照与细胞溶解产物1∶1比率(v/v)应用于抑制丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸酶活性。细胞碎片在12,000rmp下收集并在4℃下储存上清液直至在随后的反应中使用。对于含有HeLa细胞溶解产物的反应，细胞溶解产物溶液与激酶反应缓冲液按照1∶10(v/v)的比率混合，而如上描述应用于磷酸化反应或去磷酸化反应。
vi.采用电化学数据计算酶活性
CV测定的电化学数据作为每次测试的电荷密度(J)获得。激酶活性测定的Fc-ATP浓度，对于CK2为100μM，而对于Abl1-T315I和HER2-ErbB2为200μM。本文中，计算步骤的详细描述，将给出对于CK2-催化的磷酸化。反应体积为25μL，每次测试产生2.5nmolFc-ATP。然后，Fc-ATP的特异性电-活性(SE)(J/nmole Fc-ATP)按照如下进行计算。
Figure GPA00001075554100221
随后，CK2特异性活性用以下公式进行计算：
Figure GPA00001075554100222
其中ΔJ表示(J样品-J空白)，而Dil是总反应体积20μL随着按min的反应时间和按μL的酶体积(V)的稀释系数。
表观抑制常数Ki′通过拟合实验数据方程(3)进行测定。
( 3 ) - - - V = V 0 1 + [ I ] / K i ′
其中V是速率，V0是在无抑制剂时的速率，[I]是抑制剂浓度，而Ki′是表观抑制常数。真实抑制常数Ki通过根据方程(4)校正Ki′而进行计算：
( 4 ) - - - K i = K i ′ 1 + [ S ] / K m
其中[S]是固定底物肽的表面密度，而Km是米曼氏(Michaelis-Menten)常数。固定底物肽的表面密度条件在1、5、10、15和20pmol/cm2之间变化。测定激酶反应的初始时间对这些变化的肽密度条件的依赖性。磷酸化反应在5、15、30、60、90、120和150min之后终止，而实施连接Fc分子的测定。这些电流值的倒数对肽密度的倒数作图，而得到线性双倒数做图曲线。该曲线的方程定义了动力学数据，其中y截距为1/Vmax。如果y设置为0，而方程对x求解，x截距变成等于-1/Km。
2.结果
图9(A)示出了在细胞溶解产物中实施的CK2-催化的磷酸化反应的方波伏安图。将底物肽修饰的金微电极浸没于含有(a)过表达的CK2α，(b)内源性CK2水平，(c)过表达激酶-死亡的CK2α，(d)正常表达的CK2α的细胞溶解产物中。按照上述进行测定；(B)在细胞溶解产物中检测CK2α过表达状态检测图。电流信号的增长指示激酶过量并相比于其它细胞溶解产物可能导致更大数量的Fc分子连接于肽上。
图10显示：(A)在CK2α′存在下以浓度(a)0.04、(b)0.02、(c)0.008、(d)0.005、(e)0.0025ng/μL，和(f)无酶存在的对照实验下对CK2α′-催化的底物肽(RRRDDDSDDD)的磷酸化的循环伏安图(CV)；(B)采用底物肽对于Abl1-T315I(EGIYDVP)在细胞溶解产物存在下实施CK2α′浓度对采用底物肽修饰的电极(a)在分析缓冲液中，(b)在HeLa细胞溶解产物存在下，和(c)在对照实验中对电流响应的影响。
图11显示：(A)在抑制剂(1)TBB(4，5，6，7-四溴-2-氮杂苯并咪唑)(a)250nM、(b)500nM、(c)750nM和(d)800nM、(e)900nM存在下，和(f)没有CK2α存在的对照实验中用底物肽抑制CK2α-催化的磷酸化的循环伏安图；(B)按照本文中的描述在Au微电极表面上在各种表面密度条件下固定底物肽的CK2α′-催化的磷酸化的动力学测定的双倒数作图；(C)对照试验通过以下方式实施(a)用分析缓冲液滴定表面上的磷酸化底物肽，这显示电化学反应的稳定性，和(b)一旦暴露(1)并未抑制EGIYDVP证实抑制反应的特异性，(c)在(2-二甲基氨基-4，5，6，7-四溴-1H-苯并咪唑)存在下电流响应迅速降低，和(d)在HeLa细胞溶解产物中的(E-3-(2，3，4，5-四溴苯基)丙烯酸)。
图12显示：(A)采用信号转导蛋白(STP)肽(EGIYDVP，表面密度为12pmol.cm-2)在Abl1-T315I下以浓度(a)3，(b)1.5，(c)1，(d)0.75ng/μL和(e)无酶存在下对酪氨酸酶催化的磷酸化抑制的CV。没有观察到电流响应，这指示非特异性吸收的抑制作用；(B)按照本文中的描述在Au微电极表面上在各种表面密度条件下固定STP肽的Abl1-T315I-催化的磷酸化动力学测定的双倒数作图；(C)采用(a)固定于表面上的STP肽，(b)采用FLT3肽(DNEYFYV)的对照实验，这对于在表面密度12.5pmol.cm-2下对于HER2/ErbB2是优选的底物。低电流响应指示FLT3肽和Abl1-T315I之间的不充分的磷酸化，(c)第二对照实验包括在表面密度10pmol.cm-2下的CK2底物肽(RRRDDD SDDD)。没有观察到显著的电流响应，这证明了磷酸化反应的特异性；(D)电流响应对一般蛋白激酶抑制剂浓度的依赖性的曲线图，(b)星形孢菌素和(c)N-苯甲酰基星形孢菌素，对照实验包括在HeLa细胞溶解产物(a)存在下用缓冲滴定液磷酸化STP肽。在电流响应方面没有观察到显著的降低，这指示细胞溶解产物的内容物并未影响电流信号。
图13显示：(A)在HER2/ErbB2以浓度(a)4，(b)0.5，(c)0.25ng/μL存在下用FLT3肽(DNEYFYV，表面密度12.5pmol.cm-2)抑制酪氨酸激酶-催化的磷酸化的循环伏安图；(B)电极表面上在各种表面密度条件下固定的FLT3肽的HER2/ErbB2-催化的磷酸化动力学测定的双倒数作图；(C)采用(a)在HeLa细胞溶解产物存在下，固定于表面上的FLT3肽，(b)采用STP肽(EGIYDVP)的对照实验，导致电流响应微微升高，(c)在表面密度10pmol.cm-2下CK2底物肽(RRRDDDSDDD)是阳极电流对HER2/ErbB2激酶含量响应的依赖性曲线图。(D)对(b)对N-苯甲酰基星型胞菌素浓度的J响应的依赖性曲线图，而(a)固定的FLT3肽的磷酸化在HeLa细胞溶解产物存在下用空白缓冲滴定并未受到影响。
i.在细胞提取物中测定激酶活性
将含有重组CK2和Fc-ATP的溶液应用于HeLa细胞溶解产物，导致固定肽底物发生强磷酸化，如通过表面限定的Fc分子的循环伏安法测定结果所示。如图9A所示，观察到来源于CK2水平升高细胞的细胞溶解产物的方波伏安图(SWV)电流信号的最高强度。相比而言，较低的电流响应获自其它包括未诱导细胞或表达激酶-非活性CK2α的细胞的细胞溶解产物。总之，通过电化学检测获得的激酶活性的测定结果完全对应于先前采用传统CK2活性的放射活性检测而获得的结果。在采用这些细胞溶解产物实施的分析中，氧化的Fc+的还原信号没有观察到(或者漂移到扫描电压窗口之外)，可能是由于存在许多蛋白抑制了还原作用。图9B显示了在相同肽上在细胞溶解产物环境中于相同条件下一组5个测定结果中获得的平均SWV电流响应。
ii.磷酸化的特异性
固定肽的磷酸化采用本发明的核苷三磷酸结合物是特异性的。蛋白酪氨酸激酶(Abl-T315I和HER2)并不催化CK2肽底物的磷酸化(图12C-c和13C-c)，而CK2并不催化是Abl-T315I优选底物的肽的磷酸化(EGIYDVP，Fig.10B-c)。
iii.激酶活性的调节剂
基于证实本发明电化学技术对于检测激酶底物可逆磷酸化的，这种方法适用于评价对这些酶起作用的小分子抑制剂。因此，对肽生物传感器评价三种近来开发的CK2抑制剂的抑制活性的能力进行了评估(图11)。反应采用CK2、Fc-ATP进行实施，而每一抑制剂(浓度为50nM～2.5μM)暴露于CK2底物肽膜上。在37℃下用CK2α孵育2h之后，将生物传感器进行冲洗并通过电化学测定进行分析。表1显示了对于总计四种激酶和5种抑制剂分析Ki值的抑制数据。一般而言，Ki值由电化学数据进行计算，这与采用传统激酶分析获得的文献值是一致的13-17。
表1
蛋白激酶与其固定于金微电极上的底物肽的动力学常数的比较。动力学数据提取自采用固定于表面上的底物肽的各种表面密度条件进行测定的结果。
蛋白激酶      肽             Km(mM)      Vmax            Vmax/Kmax
                                         (μmol.min-1.mg-1)
CK2α         RRRDDDSDDD     0.087       1.97            22.64
CK2α′       RRRDDDSDDD     0.098       1.78            18.16
Abl1-T315I    EGIYDVP        0.182       1.67            9.18
HER2/EΛB2    DNEYFYV         0.208        1.54        7.41
为了评价用于其它激酶分析测定的电化学生物传感器的效用，生物传感器经过修饰而监测Abl1和HER2蛋白酪氨酸激酶。第一个FDA-批准的激酶抑制剂药物，Imatinib(GleevecTM)，已经成功地用于治疗与Bcr-Abl激酶相关的慢性骨髓白血病18。与GleevecTM抗药性相关的最频繁识别的突变是在Abl1激酶结构域中的T315I19，20， 21。另一成功的小分子抑制剂是司徒曼布(Trastuzumab)
Figure GPA00001075554100271
其用作治疗方案的一部分，其包含阿霉素、环磷酰胺和红豆杉醇，用于患有HER2-过表达、节点阳性胸癌的患者的辅助治疗22，23。对于两种CK2异构体形式Abl1和HER2在其底物肽上的特异性活性如表2中所示。显然，通过电化学测定法测定的活性非常有益地与文献值比较。然而，在电化学分析中所见的稍微低的反应速率可以部分通过降低锚定于Au电极表面上的底物肽的可接近性(accessibility)而升高。
表2
比较蛋白激酶上小分子抑制剂与其固定于金微电极上的底物肽的Ki。采用表面上固定的底物肽的各种表面密度条件获得的数据而测定Ki值。
抑制剂(nM)              CK2α    CK2α′    Abl1-T315I   HER2/ErbB2
(1)                     450      380        -            -
(2)                     35       20         -            -
(3)                     50       25         -            -
星形孢菌素              -        -          550          225
N-苯甲酰基星型胞菌素    -        -          600          275
蛋白酪氨酸激酶还与充分定义的一般激酶抑制剂，星型胞菌素和其衍生物，N-苯甲酰基星型胞菌素产生免疫性结合(图12D和13D)，这是具有广谱抑制活性的ATP-竞争性抑制剂。而且，采用电化学分析进行测定的星型胞菌素和其衍生物的Ki值，非常类似于采用传统对Abl119，20，21和HER224的放射分析获得的结果。
实施例4-微电极阵列的制备
图7示出了用于本发明检测多种蛋白激酶的磷酸化特性的方法的微电极阵列700。其制作方案与文献Li et al.2005中的描述是相同的；然而，新的光刻掩模基于如图7中所示的设计进行制备。800nm二氧化硅绝缘层在p-型硅晶片上热生长。金层(200nm)沉积到溅射于Si芯片上的钛粘附层(20nm)。两金属层采用Shipley1813光刻胶740作为掩模层采用图7的掩模进行光刻图案化。按照先前的描述(Li et al.Anal.Chem.2006，78，6096-6101)25实现金属层的蚀刻。单个金微垫(micropad)720具有10μm的直径并通过50μm的距离730相互分隔开。每一微垫720将从外垫710通过微导线(1mm2)750可寻址。微垫720排布成四重有助于单个肽底物的定位。
采用微电极阵列800的实例在图8中示出。
涉及不同激酶820的激酶底物肽被固定于这些微电极阵列800(A)上。在该实施例中，将与胸癌相关的激酶固定于芯片800上：FAK，Src，HER2，Akt，Erk，Crk，CAS。将底物用细胞溶解产物850孵育，而磷酸化反应将在二茂铁(Fc)-结合的ATP的存在下发生。磷酸化反应后，电化学测定将在每一微电极(B)上实施。图8(C)和8(D)示出了采用激酶820组和患有胸癌的个体的空白(图8(D)和健康个体(图8(E))获得的平均方波伏安电流响应。对于胸癌的数据统计评价将不仅有助于诊断癌症或其它疾病状态，而且也测定了小分子抑制剂对磷酸化的影响。健康和癌症个体获得的样品之间的电化学响应的差异将提供快速诊断和后续治疗的可能性。
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Claims (68)

1.一种核苷三磷酸结合物，含有电活性标记的γ磷酸基团。
2.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自包括有机标记的γ磷酸基团和有机金属标记的γ磷酸基团的组。
3.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是金属茂，包括取代的金属茂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述金属茂选自由二茂铁、二茂钴及其任意衍生物组成的组。
5.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自由醌和硝基杂环组成的组。
6.根据权利要求1至5所述的核苷酸，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺苷-5′-三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
7.根据权利要求6所述的核苷酸，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
8.针对权利要求1至7所述的核苷酸的抗体。
9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于所述抗体被标记。
10.一种检测底物磷酸化的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)在电极表面固定所述底物；
(b)用含激酶的电解液和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的所述底物；
(c)检测所述底物的磷酸化。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述底物包含单个或多个磷酸化位点。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位点包括酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述激酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸激酶。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述底物是候选激酶底物，其中所述候选底物的磷酸化指示所述候选物是所述激酶的底物。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自包括有机和有机金属标记的γ磷酸基团的组。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是金属茂，包括取代的金属茂。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述金属茂选自由二茂铁、二茂钴及其任意衍生物组成的组。
18.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自由醌和硝基杂环组成的组。
19.根据权利要求10至18所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺苷-5′-三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
21.根据权利要求10至20所述的方法，其特征在于所述电极选自由丝网印刷金电极、金微电极、金微电极阵列芯片、碳电极和ITO电极组成的组。
22.根据权利要求10至21所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过电化学进行检测。
23.根据权利要求10至21所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过质谱检测。
24.一种检测样品中感兴趣的激酶的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)在电极表面上固定所述感兴趣的激酶的特异性底物；
(b)用所述样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的所述底物；以及
(c)检测所述底物的磷酸化，
其中所述底物的磷酸化指示所述样品中存在所述激酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述底物包括单个或多个磷酸化位点。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位点包括酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述感兴趣的激酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或酪氨酸激酶。
28.根据权利要求24至27所述的方法，其特征在于所述样品是选自由细胞培养物、细胞溶解产物、提取物、体液和纯化的蛋白质溶液组成的组中的一种流体。
29.根据权利要求24至28所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自包括有机和有机金属标记的γ磷酸基团的组。
30.根据权利要求24至28所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是金属茂，包括取代的金属茂。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于所述金属茂选自由二茂铁、二茂钴及其任意衍生物组成的组。
32.根据权利要求24至28所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是有机标记的γ磷酸基团，其中所述有机标记的基团选自由醌和硝基杂环组成的组。
33.根据权利要求24至32所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺苷-5′-三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
35.根据权利要求24至34所述的方法，其特征在于所述电极选自由丝网印刷金电极、金微电极、金微电极阵列芯片、碳电极和ITO电极组成的组。
36.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述方法包括检测所述样品中所述激酶的浓度。
37.根据权利要求24至36所述的方法，其特征在于所述磷酸化进行电化学检测。
38.根据权利要求24至36所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过质谱法进行检测。
39.一种筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)将激酶的底物固定在电极表面上；
(b)用含激酶的电解液、所述候选化合物和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育固定的所述底物；和
(c)检测所述底物的磷酸化水平，其中在缺乏所述化合物时磷酸化水平从一个磷酸化水平产生的变化指示所述化合物调节所述激酶的活性。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于所述候选化合物包括激酶活性的抑制剂。
41.根据权利要求39所述的方法，其特征在于所述候选化合物包括激酶活性的激动剂。
42.根据权利要求39所述的方法，其特征在于所述底物包括单个或多个磷酸化位点。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位点包括酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸残基。
44.根据权利要求39所述的方法，其特征在于所述激酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或酪氨酸激酶。
45.根据权利要求39至44所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团选自包括有机和有机金属标记的γ磷酸基团的组。
46.根据权利要求39至44所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是金属茂，包括取代的金属茂。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于所述金属茂选自由二茂铁、二茂钴及其任意衍生物组成的组。
48.根据权利要求39至44所述的方法，其特征在于所述电活性标记的γ磷酸基团是有机标记的γ磷酸基团，其中所述有机标记的基团选自由醌和硝基杂环组成的组。
49.根据权利要求39至48所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺苷-5′-三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
51.根据权利要求39至50所述的方法，其特征在于所述电极选自由丝网印刷金电极，金微电极，金微电极阵列芯片，碳电极和ITO电极组成的组。
52.根据权利要求39至51所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过电化学进行检测。
53.根据权利要求39至51所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过质谱法进行检测。
54.一种高通量筛选样品中存在蛋白激酶的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)提供一种包含多个电极的微电极阵列；
(b)将激酶底物固定于所述阵列中的每个电极上；
(c)用感兴趣的所述样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定的所述底物的所述微电极阵列；和
(d)检测每个电极中所述底物的磷酸化水平，其中在所述多个电极中的一种或多种底物的磷酸化指示在所述样品中存在特异于所述一种或多种磷酸化底物的所述激酶。
55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于所述激酶的底物是一种特异性蛋白激酶的所述底物。
56.根据权利要求54所述的方法，其特征在于所述激酶的底物包括不同蛋白激酶的底物，其中特定底物磷酸化的缺乏指示针对所述特定底物的所述蛋白激酶的缺乏。
57.根据权利要求54所述的方法，其特征在于所述样品是选自由细胞培养基、细胞溶解产物、提取物、体液、和纯化的蛋白溶液组成的组中的一种流体。
58.根据权利要求54所述的方法，其特征在于所述方法包括测定所述样品中所述蛋白激酶的所述浓度。
59.一种诊断对象中与蛋白激酶水平异常或缺乏相关的疾病的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)将与所述疾病相关的所述激酶的底物固定在一个或多个电极上；
(b)用来自所述对象的样品和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定的所述底物的所述一个或多个电极；
(c)检测每个阵列的所述电极中所述底物的磷酸化水平，其中在对象样品中相对于正常对照的磷酸化水平异常或缺乏指示所述对象患有或易患所述疾病。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于所述对象包括植物或动物。
61.根据权利要求59所述的方法，其特征在于所述对象是哺乳动物。
62.根据权利要求54和59所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过电化学进行检测。
63.根据权利要求54和59所述的方法，其特征在于所述磷酸化通过质谱法进行检测。
64.一种激酶生物传感器，其特征在于所述生物传感器包括至少一种固定于电极表面的激酶底物，其中所述电极表面浸没在包含具有电活性标记的γ磷酸的电活性核苷三磷酸的电解液中。
65.一种用于筛选激酶磷酸化的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含至少一种激酶底物、电极、含有权利要求1至7中任一项所述的电活性标记的γ磷酸基团的所述核苷三磷酸结合物和一种激酶。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，其特征在于所述激酶底物固定于所述电极上。
67.根据权利要求65所述的试剂盒，进一步包括一种或多种用于重构、稀释或溶解所述底物、所述激酶和/或所述电活性核苷三磷酸的缓冲液。
68.根据权利要求65所述的试剂盒，进一步包括一种能够终止所述激酶与所述底物的反应的试剂。
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