CN105911101A - 一种简单灵敏的膜性能检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简单灵敏的膜性能检测方法，该方法是将裸金电极置于含巯基十一酸和巯基丙酸的混合溶液中进行混合自组装，在裸金电极表面修饰混合自组装膜；所述混合自组装膜通过循环伏安法脱附巯基丙酸形成微孔自组装膜；将囊泡铺展在所述微孔自组装膜上后，采用巯基十一酸封闭，即在裸金电极表面构建成磷脂双分子层模型膜；将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极置于含目标检测物的待测溶液中，通过电化学方法检测目标检测物对生物膜性能的影响。该方法操作简单、响应灵敏，在一般实验室条件下即可实现，易于推广应用。

Description

一种简单灵敏的膜性能检测方法
技术领域
本发明涉及一种简单灵敏的膜性能检测方法，特别涉及一种通过构建磷脂双分子层模型膜，以β淀粉样蛋白溶液为待测液，通过电化学方法检测蛋白对生物膜性能的影响的方法，属于生物膜检测技术领域。
背景技术
生物膜包括细胞外周膜和内膜系统，生物膜有多种功能，与生命科学中的许多基本问题密切相关，如神经传导、细胞免疫、细胞识别、细胞分化和增殖等。如果细胞膜在生命的活动中出现异常，就会产生疾病，如癌症、神经退行性疾病(阿茨海默病、拍金森病)等。因此，寻找一种简单灵敏的方法研究膜的性能有重大意义。
目前研究膜性能的技术有膜片钳技术等，传统的膜片钳技术虽然分辨率高，但是对技术要求高，耗时耗力；全自动的膜片钳技术虽然实验操作实现全自动化，对操作者要求低，但其成功率低，且仪器价格昂贵。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种操作简单、灵敏度高的电化学检测膜性能的方法；该方法在一般实验室条件下容易实现，应用范围广，克服了传统膜片钳技术操作技术要求高，耗时耗力，成本高等缺陷。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种简单灵敏的膜性能检测方法，该方法是将裸金电极置于含巯基十一酸和巯基丙酸的混合溶液中进行混合自组装，在裸金电极表面修饰混合自组装膜；所述混合自组装膜通过循环伏安法脱附巯基丙酸形成微孔自组装膜；将囊泡铺展在所述微孔自组装膜上后，采用巯基十一酸封闭，即在裸金电极表面构建成磷脂双分子层模型膜；将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极置于含目标检测物的待测溶液中，通过电化学方法检测目标检测物对生物膜性能的影响。
优选的方案，将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极分别置于一系列不同浓度的所述待测溶液中，通过检测各种待测溶液中磷脂双分子层模型膜的阻抗随时间的变化关系来表征蛋白与磷脂双分子层模型膜之间的相互作用。
较优选的方案，待测溶液为浓度在1～10μM之间的蛋白溶液。
进一步优选的方案，待测溶液包括浓度分别为1μM、5μM和10μM的蛋白溶液；所述的蛋白溶液为β淀粉样蛋白溶液。
优选的方案，含巯基十一酸和巯基丙酸的混合溶液由浓度为4±1mM巯基十一酸和浓度为4±1mM的巯基丙酸按体积比(4±1):1组成。
优选的方案，自组装是在25±2℃温度条件下，反应16±1h。
优选的方案，表面修饰有混合自组装膜的裸金电极置于0.5±0.1M的NaOH溶液中，在扫描电压为-0.1V～-0.9V、扫描速率为50±5mV/S的条件下，使所述混合自组装膜中巯基丙酸脱附，形成微孔自组装膜。
优选的方案，封闭通过浓度为4±1mM的巯基十一酸溶液实现，封闭时间为2±1h。
本发明的技术方案首先在裸金电极表面构建致密、有序的磷脂双分子层模型膜，再以不同浓度的蛋白溶液为检测液(以β淀粉样蛋白溶液为例)，通过电化学法进行检测。大量研究表明：磷脂双分子层模型膜在不同浓度的Aβ溶液随时间变化表现出截然不同的电化学性质变化。当β淀粉样蛋白浓度较低(≤1μM)时，其在磷脂膜表面发生聚集形成寡聚体，导致膜阻抗值增大；其后寡聚体通过与膜融合形成跨膜孔洞，破坏了膜的致密性，从而导致阻抗值降低。而当β淀粉样蛋白浓度较高(≥5μM)时，由于β淀粉样蛋白主要在溶液相发生自聚集，对膜的影响较小，因此膜的阻抗值变化较小。综上研究结果证明该检测方法可灵敏的实时检测蛋白对膜性能的检测。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果：
1)本发明的技术方案中磷脂双分子层模型膜易于构建，构建方法简单、成本低。
2)本发明的技术方案通过电化学方法实现膜性能的检测，响应灵敏度高。
3)本发明的技术方案在一般实验室条件下容易实现，检测方法应用范围广。
附图说明
【图1】为磷脂膜覆盖的自组装膜的制备过程示意图；
【图2】为交流阻抗法表征自组装膜电学性质；
【图3】为不同浓度淀粉样蛋白溶液中的膜电学性能图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
(1)微孔自组装膜的制备方法，步骤如下：
将处理好的裸金电极浸入巯基十一酸与巯基丙酸比例为4:1的混合溶液中，在25℃条件下混合自组装16h，再在0.5M的NaOH溶液中，在-0.1V～-0.9V条件下将巯基丙酸脱附，形成微孔自组装膜。
(2)囊泡的制备方法，步骤如下：
称取2mg的DOPC，溶解在1mL的氯仿溶液中，形成2mg/mL的DOPC溶液，取10μL溶液均匀的铺在ITO玻璃上，真空干燥2h，在4V、10Hz的交流电场条件下，作用2h，形成直径约为7μm的囊泡。
(3)简单灵敏的膜制备方法，步骤如下：
在形成的微孔自组装膜上，将制备好的囊泡铺展，形成磷脂双分子层膜，再用巯基十一酸封闭2h，即得到致密的、有序的磷脂双分子层膜。
(4)简单灵敏的膜性能检测方法的表征，步骤如下：
(1)将表面组装了混合自组装膜的裸金电极置于5mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的比例为1:1的混合液中，其中氯化钾的浓度为0.1M，阻抗值增大，循环伏安图电流减小，表明裸金电极上混合自组装膜致密完好；
(2)表面修饰有混合自组装膜的裸金电极置于0.5M的NaOH溶液中，在扫描电压为-0.1V～-0.9V、扫描速率为50mV/S的条件下，使所述混合自组装膜中巯基丙酸脱附，形成微孔自组装膜，此时，再将电极置于5mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的比例为1:1的混合液中，其中氯化钾的浓度为0.1M，阻抗值减小，循环伏安图电流增大，表明巯基丙酸脱附，形成微孔自组装膜；
(3)将制备好的囊泡铺展在微孔自组装膜上，2h后，将电极置于5mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的比例为1:1的混合液中，其中氯化钾的浓度为0.1M，阻抗值增大，循环伏安图电流减小，表明形成磷脂膜覆盖在微孔自组装膜上；
(4)将(3)中所述的磷脂膜覆盖的电极置于4mM的巯基十一酸中封闭2h，再将电极置于5mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾的比例为1:1的混合液中，其中氯化钾的浓度为0.1M，阻抗值增大，大于(3)中所述阻值，循环伏安图电流减小，小于(3)中所述电流值，表明构建成致密有序的磷脂模型膜；
(5)将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极置于一系列不同浓度(1μM、5μM和10μM)的蛋白溶液中，通过检测在各种蛋白溶液中磷脂双分子层模型膜的阻抗随时间的变化关系来表征蛋白与生物膜之间的相互作用。
从图2可以看出混合自组装膜具有高阻抗值，说明其结构致密、性质稳定；当短链巯基丙酸脱附后，由于表面形成微孔结构，膜阻抗值显著降低；当其上覆盖磷脂膜后，部分微孔被覆盖，膜阻抗值增大；进一步用巯基十一酸将剩余的微孔封闭后，膜阻抗值增至最大。
从图3可以看出磷脂膜覆盖的自组装膜在不同浓度Aβ溶液随时间变化表现出截然不同电学性质改变。当Aβ浓度较低(≤1μM)时，其在磷脂膜表面发生聚集形成寡聚体，导致膜阻抗值增大；其后寡聚体通过与膜融合形成跨膜孔洞，破坏了膜的致密性，从而导致阻抗值降低。而当Aβ浓度较高(≥5μM)时，由于Aβ主要在溶液相发生自聚集，对膜的影响较小，因此膜的阻抗值变化较小。这一结果证明该检测方法可灵敏的实时检测蛋白对膜性能的影响。

Claims (8)

1.一种简单灵敏的膜性能检测方法，其特征在于：将裸金电极置于含巯基十一酸和巯基丙酸的混合溶液中进行混合自组装，在裸金电极表面修饰混合自组装膜；所述混合自组装膜通过循环伏安法脱附巯基丙酸形成微孔自组装膜；将囊泡铺展在所述微孔自组装膜上后，采用巯基十一酸封闭，即在裸金电极表面构建成磷脂双分子层模型膜；将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极置于含目标检测物的待测溶液中，通过电化学方法检测目标检测物对生物膜性能的影响。
2.根据权利要求1所述的一种简单灵敏的膜性能检测方法，其特征在于：将表面构建磷脂双分子层模型膜的裸金电极分别置于一系列不同浓度的所述待测溶液中，通过检测各种待测溶液中磷脂双分子层模型膜的阻抗随时间的变化关系来表征蛋白与磷脂双分子层模型膜之间的相互作用。
3.根据权利要求2所述的一种简单灵敏的膜性能检测方法，其特征在于：所述的待测溶液为浓度在1～10μM之间蛋白溶液。
4.根据权利要求3所述的一种简单灵敏的膜性能检测方法，其特征在于：所述的待测溶液包括浓度分别为1μM、5μM和10μM的蛋白溶液；所述的蛋白溶液为β淀粉样蛋白溶液。
5.根据权利要求1所述的磷脂双分子层模型膜的构建方法，其特征在于：含巯基十一酸和巯基丙酸的混合溶液由浓度为4±1mM的巯基十一酸和浓度为4±1mM的巯基丙酸按体积比(4±1):1组成。
6.根据权利要求1所述的磷脂双分子层模型膜的构建方法，其特征在于：所述的自组装是在25±2℃温度条件下，反应16±1h。
7.根据权利要求1所述的磷脂双分子层模型膜的构建方法，其特征在于：表面修饰有混合自组装膜的裸金电极置于0.5±0.1M的NaOH溶液中，在扫描电压为-0.1V～-0.9V、扫描速率为50±5mV/S的条件下，使所述混合自组装膜中巯基丙酸脱附，形成微孔自组装膜。
8.根据权利要求1所述的磷脂双分子层模型膜的构建方法，其特征在于：所述的封闭通过浓度为4±1mM的巯基十一酸溶液实现，封闭时间为2±1h。
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